JPH0424557A

JPH0424557A - アルツハイマー病の検査方法

Info

Publication number: JPH0424557A
Application number: JP12949690A
Authority: JP
Inventors: Takeo Kato; 丈夫加藤; Hideo Sasaki; 英夫佐々木; Kazumichi Koiwai; 一倫小岩井; Hajime Sasaki; 一佐々木
Original assignee: BIO KAGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: BIO KAGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1990-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1992-01-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明はアルツハイマー病の検査方法に関する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉中年期
〜老年期に発症する老年痴呆に対して、従来、種々の定
義・分類がなされてきたが、これらは病理学的に差異が
ないことから、現在は−括してアルツハイマー病（又は
アルツハイマー型痴呆）と称されている。

アルツハイマー病の診断法としては、アメリカ精神医学
協会が定めた診断マニュアル、ＷＨＯが定めた診断マニ
ュアル等が知られている。これらのマニュアルにおける
アルツハイマー病の診断は、基準に規定された痴呆の概
念と患者の言動とを対比すると共に他の痴呆又は神経性
疾患を除外することにより診断するものである。

そのため、アルツハイマー病患者の検診による診断は、
病理学的もしくは生化学的な診断結果に基づいているわ
けではなく、確定的な診断規準があるというわけではな
い。従って、生前にアルツハイマー病の確定診断をする
ことは困難で、患者の死後、患者脳の病理学的所見が、
現在では、最も確実な診断結果を得る手段である。

アルツハイマー病の病理学的診断規準は、アルツハイマ
ー病患者の脳の病理切片に神経原線維変化と老人斑を認
めることである（例えば、中野今治、「治療学」第２１
巻、第３号、第３１６頁、１９８８年参照）。神経原線
維変化及び老人斑の同定には、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋ
ｙ変法、Ｂｏｄｌａｎ−大塚変法が主に用いられている
。しかし、こられの方法は手順が複雑であり、良好な染
色結果を得るには高い熟練度が要求され、また染色特異
性の点で染色結果の判断が難しいという難点がある。

本発明は、上記従来技術の有する欠点を解決するために
創案されたもので、発明者らが脳の病理切片の神経原線
維変化と老人斑の同定を鋭意研究した結果、塩基性線維
芽細胞成長因子（ＢａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇ
ｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、以下、ｂＦＧＦという）が
神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合する性質を有
するという知見を得、かかる性質を利用して病理切片の
神経原線維変化及び老人斑を同定する方法を見出し、本
発明を完成した。即ち、本発明は、手順が簡便であると
共に染色特異性が高く、判別が容易であるアルツハイマ
ー病の病理学的検査方法を提供することを目的とする。

く課題を解決するための手段及び作用〉上記の課題を解
決すべくなされた本発明のアルツハイマー病の検査方法
は、脳の病理切片の神経原線維変化及び老人斑を同定し
てアルツハイマー病を診断する病理学的検査方法におい
て、脳の病理切片にｂＦＧＦ又は標識化されたｂＦＧＦ
を作用させ、神経原線維変化及び老人斑と当該成長因子
又は標識化された成長因子とを特異的に結合させる工程
を含むことを特徴とする。

本発明は、上記の構成よりなり、ｂＦＧＦは脳の病理切
片の神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合するので
、神経原線維変化及び老人斑と結合したｂＦＧＦを免疫
染色法で染色することにより、神経原線維変化及び老人
斑を同定することができる。また、標識化されたｂＦＧ
Ｆを用いる場合には神経原線維変化及び老人斑を直接的
に染色・同定することができる。

本発明で使用されるｂＦＧＦは、脳下垂体、網膜、黄体
、副腎、腎、胎盤等に存在することが知られている公知
の成長因子であり、アミノ酸配列も明らかにされている
（例えば、日本組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒ
ｔ　Ｉ及びｐａｒｔ　ＩＩ　Ｊ朝食書店発行など参照）
。ｂＦＧＦは、基本的には、分子ｆｆ１ｌ　６ｋＤａ、
ｐ　Ｉ　９．６、アミノ酸１４６個の単鎖ポリペプチド
であるが、神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合す
る性質を保持する限り、ｂＦＧＦのアミノ酸又はアミノ
酸配列の一部が欠落又は置換されたものでもよく、また
ｂＦＧＦの末端に−又は二以上のアミノ酸が付加したも
のでもよい。ｂＦＧＦの由来は特に限定されず、例えば
、ヒト、ウシ、マウス、ラット等から得られたｂＦＧＦ
のいずれも用いることができる。

本発明の検査方法は、上記のｂＦＧＦが神経原線維変化
及び老人斑と特異的に結合する性質を利用するもので、
神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合したｂＦＧＦ
を免疫染色法を用いて染色し、神経原線維変化及び老人
斑を同定する方法（以下、第１の方法という）：標識化
されたｂＦＧＦを用いて直接的に神経原線維変化及び老
人斑を染色・同定する方法（以下、第２の方法という）
に関する。

上記の第１の方法において、ｂＦＧＦの染色に用いられ
る免疫染色法としては、病理学的検査において用いられ
ている種々の方法のいずれも適用することができる。例
えば、抗ｂＦＧＦ抗体を予め積繊化しておく方法（標識
法）、未標識の抗ｂＦＧＦ抗体を用い、抗原であるｂＦ
ＧＦと反応させた後ｂＦＧＦに結合した抗ｂＦＧＦ抗体
を標識化する方法（未標識法）であってもよく、また未
標識法においてｂＦＧＦと結合した抗ｂＦＧＦ抗体を標
識化する方法として、ＩｇＧのＦｃ部分と結合性を有す
るプロティンＡを用いるプロティンＡ法、ビオチンとア
ビジンとの結合性を利用するＢＡ法、ビオチン化ペルオ
キシダーゼとアビジンとの複合体を用いるＡＢＣ法、ペ
ルオキシダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体との複合体を
用いるＰＡＰ法などの方法を用いることができる。また
、標識は、上記の染色方法の種類、所望する染色形態等
に応じて、適宜選択することができ、例えば、螢光色素
（例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミン等
）、酵素（特にペルオキシダーゼが好ましい）、フェリ
チン、ヨード、金等が挙げられる。免疫染色法の好まし
い態様としては、標識として螢光色素を用いる螢光抗体
法、標識として酵素を用いる酵素抗体法が挙げられる。

免疫染色法に関しては、既に多くの底置や文献（例えば
、用生明、「病理と臨床」第２巻、第１４０１頁、１９
８４年；北村ら編「臨床検査マニュアル」文光堂発行、
第１４９４頁の免疫染色法の項等）に詳述されており、
当該記述を参照して行うことができる。

上記の免疫染色法を用いる本発明の検査方法をより明確
にするため、その−例としてＡＢＣ法を用いた酵素抗体
法にて行う場合をもって詳細に説明する。まず、患者の
死後、脳を、ホルマリン固定、ＰＬＰ固定等の慣用の方
法で固定化した後、常法に従って、脱水・パラフィン包
埋し、ミクロトームにて薄切切片を調製する。次いで、
スライドガラスに貼着後、脱パラフィンし、蒸溜水で水
和し、さらに必要に応じて、ブロック血清（例えば、ヤ
ギ血清、ウマ血清等）でブロッキング処理する。かくし
て調製された切片に、ｂＦＧＦ溶液を添加し、放置して
神経原線維変化及び老人斑にｂＦＧＦを結合させた後、
適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、以下、
ＰＢＳという）で洗浄する。次いで、抗ｂＦＧＦ抗体溶
液を添加し、放置し、神経原線維変化及び老人斑に結合
したｂＦＧＦに当該抗体を結合させた後、ＰＢＳ等の緩
衝液で洗浄する。さらに、上記の抗ｂＦＧＦ抗体に対す
る抗体（以下、二次抗体という）にビオチンを結合させ
たビオチン化二次抗体を添加し、放置して抗ｂＦＧＦ抗
体にビオチン化二次抗体を結合させた後、ＰＢＳ等の適
当な緩衝液で洗浄する。

一方、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ等）にビオチンを結合させたビオチン化ベルオ
キダーゼを別途調製しておき、これとアビジンを混合す
ることにより、アビジン−ビオチン化ベルオキダーゼ複
合体（ａｖｌｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｐｅｒｏｘｌｄａｓ
ｅ　ｃｏＩＩｐｌｅｘｓいわゆるＡＢＣ）を調製する。

かくして調製されたアビジン−ビオチン化ベルオキダー
ゼ複合体を、上記のビオチン化二次抗体で処理がされた
切片に添加する。アビジンは４価の結合性を有するので
、切片上のビオチン化二次抗体にアビジン及びビオチン
を介してペルオキシダーゼが固定化される。次いで、ペ
ルオキシダーゼの適当な基質（例えば、ジアミノベンジ
ジンと過酸化水素水の混合液等）を添加し、必要に応じ
てオスミウム溶液などの反応増強剤を加えると、神経原
線維変化及び老人斑は褐色に染色され、同定されるので
、以下、常法に準じて、水洗、脱水、透徹、封入する。

かくして調製された標本を顕微鏡等で観察し、神経原線
維変化及び老人斑の有無を検査し、アルツハイマー病の
診断を行う。

上記の方法において、ｂＦＧＦ溶液は、ヒト、ラン等か
ら得られたｂＦＧＦをＰＢＳ等の適当な緩衝液に溶解し
たものを用いればよく、必要に応じてヤギ血清等の血清
を添加する。ｂＦＧＦの濃度は、通常、０．５〜５μｇ
　／　１１程度、好ましくは１〜３μｇ　／　７Ｎ程度
に調整される。

また、抗ｂＦＧＦ抗体の調製は常法の抗体産生法やモノ
クロナール抗体作製技術に準じて行うことができ、例え
ば、ｂＦＧＦを生理食塩水で適宜な濃度に希釈し、フロ
イントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｐｒｅ
ｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ、　ＣＰＡ）等のアジュ
バントと混合して懸濁液を調製し、実験動物（例えば、
ウサギ、モルモット等）に適当な間隔をおいて数回投与
して免疫化し、免疫化された実験動物から採血し、遠心
分離等の適当な手段で血清を分離した後、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の手段で精製することにより得
られる。また、二次抗体も同様にして調製することがで
きる。

さらに、ビオチン化二次抗体及びビオチン化ペルオキシ
ダーゼは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド　ビ
オチンエステル等のビオチン化剤を用いる慣用の方法で
調製することができる。

なお、上記の方法は免疫染色法としてＡＢＣ法を用いた
酵素抗体法にて本発明の検査方法を行うものであるが、
他の免疫染色法を用いても本発明の検査方法は行うこと
ができる。その際、使用される抗ｂＦＧＦ及び二次抗体
は上記と同様な方法で調製でき、またその他の必要な試
薬等は前記の文献等に記載された方法に準じて調製する
ことができ、例えば、螢光抗体法を用いる場合、当該方
法で用いられる螢光色素標識と結合した抗体は、イソチ
オシアン酸フルオレセイン、イソチオシアン酸テトラメ
チルローダミン等と抗体とを反応させることにより調製
される。

本発明の検査方法の第２の方法は、標識化されたｂＦＧ
Ｆを用いて、脳の切片の神経原線維変化及び老人斑を染
色・同定するものである。この方法において、標識とし
ては前記第１の方法で例示された標識が挙げられる。ま
た、ｂＦＧＦと標識との結合方法としては、例えば、グ
ルタルアルデヒド法、マレイミド法、イソシアネート法
等の慣用の方法を用いることができる。

この方法の手順としては、前記の第１の方法と同様にし
て調製された脳の薄切切片に、標識化されたｂＦＧＦ溶
液を添加し、神経原線維変化及び老人斑に標識化された
ｂＦＧＦを特異的に結合させて染色・同定し、水洗、透
徹、封入することにより行われる。この際、標識が酵素
の場合には、前記第１の方法と同様に基質を作用させて
発色させればよい。

なお、アルツハイマー病の病理学的検査は、脳の海馬及
び側頭葉皮質を主に観察し、その他の部位としては頭項
葉、前頭葉等を観察する。従って、本発明の検査方法に
おいても、通常、上記の部位について検査される。

また、本発明の検査方法は上記で説明した例に限定され
るものではなく、例えば、抗ｂＦＧＦ抗体として、抗原
認識部位を含む断片［例えば、ＦａｂＳＦａｂ−Ｆ（ａ
ｂ−）２等］を用いるなど、本発明の要旨を変更しない
範囲で適宜変更して実施できる。

〈発明の効果〉本発明の検査方法は、操作が簡便であると共に染色特異
性が極めて高く、神経原線維変化及び老人斑の判別が容
易であるので、検査の迅速化及び精度の向上が図れると
いう効果を奏する。

〈実施例〉以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

実施例アルツハイマー病患者の死後、脳の海馬及び側頭葉をＡ
ＢＣ法を用いた本発明の方法で検査した。

使用した試薬及び実験手順は下記のとおりである。

■試薬（１１ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ溶液ウシｂＦＧＦ　（アマ−ジャム社製）を２０％ヤギ血清
を含むＰＢＳに溶解し、使用時に同ＰＢＳで１〜２．５
μｇ　／　ｘｌに希釈したものを使用した。

（２）抗ｂＦＧＦ抗体溶液ウシｂＦＧＦに対するウサギ抗血清から抗ｂＦＧＦ　　
ＩｇＧを、ウシｂＦＧＦをリガンドとするアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーで精製し、抗ｂＦＧＦ抗体
として使用した。

より詳細には、抗血清はウシｂＦＧＦを１回当たり、１
０μｇをフロイント完全アジュバントと共に、１週おき
に８回注射する。最後の注射から１０日後に全採血し、
抗血清を得、−８０℃に保存した。

アフィニティーカラムは、アフィゲル１０（バイオラッ
ド社製）１１１に１００μｇのウシｂＦＧＦを固定化し
たものを使用し、抗血清２　ｘｌを上記カラムに添加し
、非結合成分をＰＢＳで洗い流した後に、ｐＨ３，０の
０，１Ｍグリシン緩衝液で、ＩｇＧを溶出した。１Ｍ　
　ＴｒｌｓでＩｇＧ溶液を中和し、実験に使用した。

（３）ＡＢＣ試薬組織切片に結合した抗体の検出は、ＡＢＣ法により行っ
た。ＡＢＣ試薬はベクタスティンＡＢＣキット（ベクタ
ーラボラトリ−社製）を使用した。

また、基質として、ジアミノベンジジン５ｍｇ／ｌ　６
１１　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液に３％過酸化水素水２００μｇを
添加したものを使用した。

■実験手順アルツハイマー病患者の脳の海馬及び側頭葉を、常法に
準じて、ホルマリン固定し、６μｍ厚のパラフィン切片
を調製し、脱パラフイン後、蒸溜水で水和し、２０％ヤ
ギ血清を含むＰＢＳでブロッキング処理した。次いで、
ｂＦＧＦ溶液を切片に添加し、室温で２時間放置し、Ｐ
ＢＳで洗浄した。

さらに、抗ｂＦＧＦ抗体溶液を添加し、室温で一晩放置
した後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、二次抗体として、
ビオチン化洗ウサギＩｇＧ抗体溶液を添加し、室温で１
時間放置し、ＰＢＳて洗浄した後、ＡＢＣ試薬を用いて
染色し、常法に準じて、水洗、脱水、透徹、封入した。

かくして得られた標本の顕微鏡写真（倍率９５倍）を第
１図に示す。第１図において、ドーナツ状に見えるのが
老人斑であり、小さい点に見えるのが神経原線維変化で
ある。同図に示されるように、本発明の方法によれば、
神経原線維変化及び老人斑が鮮明に染色されており、ま
たバックグランドも低いので、神経原線維変化及び老人
斑を極めて容易に判別できる。

比較例１実施例で用いた脳パラフィン切片に続いて薄切されたパ
ラフィン切片を、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｖｓｋｙ変法で検査
した。使用した試薬及び実験手順は下記のとおりである
。

■試薬（１）硝酸銀溶液硝酸銀２０ｇを蒸溜水１００１１１に添加したものを用
いた。

（２）現像液下記の成分を混合したものを使用した。

ホルマリン　　　　２０１！蒸溜水　　　　　１００１１濃硝酸　　　　　　　１滴クエン酸　　　　０．５ｇ（３）アンモニア水２８％アンモニア水２００　ｘｌを２０分間蒸発させた
ものを使用した。

■実験手順脳パラフィン切片を実施例と同様に脱パラフィン及び水
和した後、硝酸銀溶液に２０分入れ、蒸溜水に浸漬した
。次いで、硝酸銀溶液に攪拌しながらアンモニア水を滴
下し、沈澱物がなくなるまでアンモニア水を滴下した。

その後２滴アンモニア水を加える。この溶液に遮光下、
１５分間切片を浸漬した。切片を取り出し、蒸溜水にア
ンモニア水を３温式れたものに浸漬した。上記のアンモ
ニア・硝酸銀溶液に現像液を３７ｍ加えた溶液に切片を
入れ、現像した（現像は３〜５分かかる）。

顕微鏡で観察し、染色の具合を判断し、蒸溜水で洗浄し
た。次いで、ハイポに５分間浸漬し、蒸溜水で洗浄した
後、常法に準じて、水洗、脱水、透徹、封入した。

かくして得られた標本の顕微鏡写真（倍率９５倍）を第
２図に示す。同図に示されるように、神経原線維変化及
び老人斑は染色されているが、バックグランドが高いた
め、神経原線維変化及び老人斑の判別が困難である。

比較例２実施例で用いた脳パラフィン切片に続いて薄切されたパ
ラフィン切片を、Ｂｏｄｉａｎ−大塚変法で検査した。

使用した試薬及び実験手順は下記のとおりである。

■試薬（１）硝酸銀・緩衝液下記の成分を混合したものを用いた。

０．２Ｍ硼酸水溶液　　　　１３１１０．０５Ｍ硼砂水溶液　　　　　７　ｙｌｏ、５％硝酸
銀水溶液　　　　１１！蒸留水　　　　　　　　１００１１ ■実験手順脳パラフィン切片を実施例と同様に脱パラフィン及び水
和した後、２０％硝酸銀水溶液（蓋付容器で）にて３〜
６時間鍍銀し、蒸溜水で洗浄した。

次いで、硝酸銀・緩衝液溶液にて１６〜２０時間鍍銀し
、水洗することなく、直接２５〜３０℃に温めたヒドロ
キノン・亜硫酸ナトリウム液にて５〜１０分間還元した
。流水で切片をよく水洗後、蒸溜水で洗い、１％塩化金
水溶液で１０分間鍍金した。蒸溜水でよく洗った後、２
％蓚酸水溶液に約１０分間浸漬し、流水で洗った後、５
％ハイポ水溶液で３分間定着した。充分に水洗し、鍍銀
を確認した後、脱水、透徹、封入した。

かくして得られた標本の顕微鏡写真（倍率９５倍）を第
３図に示す。同図に示されるように、Ｂｏｄｊａｎ−大
塚変法では神経原線維変化及び老人斑の判別が困難であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は、夫々実施例、比較例１及
び比較例２て得られた標本の顕微鏡写真である。

Claims

【特許請求の範囲】１、脳の病理切片の神経原線維変化及び老人斑を同定し
てアルツハイマー病を診断する病理学的検査方法におい
て、脳の病理切片に塩基性線維芽細胞成長因子又は標識
化された塩基性線維芽細胞成長因子を作用させ、神経原
線維変化及び老人斑と当該成長因子又は標識化された成
長因子とを特異的に結合させる工程を含むことを特徴と
するアルツハイマー病の検査方法。２、脳の病理切片に塩基性線維芽細胞成長因子を作用さ
せ、神経原線維変化及び老人斑と当該成長因子とを特異
的に結合させ、次いで神経原線維変化及び老人斑と結合
した塩基性線維芽細胞成長因子を免疫染色法で染色し、
神経原線維変化及び老人斑を同定する請求項１記載のア
ルツハイマー病の検査方法。３、免疫染色法が酵素抗体法又は螢光抗体法である請求
項２記載のアルツハイマー病の検査方法。４、脳の病理切片に塩基性線維芽細胞成長因子を作用さ
せた後、抗塩基性線維芽細胞成長因子抗体を作用させ、
更に抗塩基性線維芽細胞成長因子抗体に対する抗体であ
ってビオチンが結合した抗体を作用させ、次いで、ビオ
チンが結合したペルオキシダーゼとアビジンとの複合体
を作用させた後、ペルオキシダーゼの基質を添加して染
色し、神経原線維変化及び老人斑を同定する請求項３記
載のアルツハイマー病の検査方法。