JPH04234981A - 枯草菌の高密度培養方法および培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は枯草菌の高密度培養方法
に関し、更に詳しくは、枯草菌を培養する際に、培養液
中へのグルコースおよび培地成分である微量金属、リン
酸塩および消泡剤の流加時間または流加速度を調整する
ことにより溶存酸素濃度またはｐＨ値を設定値に保持し
、あるいは、この設定値を段階的に変更することによっ
て、枯草菌を高密度に培養する方法に関するものである
。

【０００２】枯草菌はそれ自身が高い安全性を有するだ
けでなく、プロテアーゼ、アミラーゼ等の蛋白質の高分
泌能、さらに酵素、抗生物質等の醗酵生産にみられるよ
うに工業用微生物としての豊富な使用実績など、優れた
特性があるため、枯草菌を宿主とした遺伝子組換え技術
による異種蛋白分泌生産系の確立が期待されている。こ
の場合、異種蛋白を効率良く生産するために、枯草菌の
組換え菌を高密度に培養する技術が極めて重要となる。

【０００３】

【従来の技術】枯草菌を高密度に培養する技術について
の報告は例えば、Ｒａｐｐｅｎら（“Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
，”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｏｒｌ
ａｎｄｏ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ　４２３ｐｐ．（１９
８６）　）によりなされており、この中ではヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）の枯草菌菌体内生産の例が報告されて
いる。但し、この方法を実施するために必要な詳細な培
養方法については、グルコース流加による溶存酸素濃度
を１０〜５０％の設定範囲内に保持する方法以外の記述
はない。

【０００４】また、枯草菌を培養する際に、培養液中へ
のグルコースや微量金属、リン酸塩などの培地成分およ
び消泡剤の流加時間または流加速度を調整することによ
り溶存酸素濃度またはｐＨを所定量に保持することによ
って、枯草菌を高密度に培養する方法は、本発明者らに
よってすでに報告されており（昭和６３年度日本農芸化
学会講演要旨集）、この方法は最も有効な培養方法の一
つである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述した培地
成分および消泡剤の流加時間または流加速度を調整する
枯草菌の高密度培養方法の実施は、枯草菌の培養管理に
ついて豊富な知識を有する熟練した技術者の経験的な判
断に委ねられており、万人が失敗なく培養することは不
可能であった。しかも、上述した熟練した技術者につい
ても、枯草菌の培養密度のレベルおよびその再現性にお
いても問題があった。

【０００６】枯草菌を高密度に培養するのに困難でかつ
重要な技術は、常時変化する培養液粘度、枯草菌の代謝
機能、さらに外乱に対し影響を受ける培養系全体につい
て、できるだけ枯草菌を増殖させて培養液中の枯草菌密
度を高め、結果として枯草菌によって分泌される有用蛋
白質をいかに多量に生産するかにある。実際上の問題と
しては、例えば流加するグルコースが枯草菌の要求量を
下回った場合には、枯草菌の培養に必要な栄養が不足す
る結果、枯草菌の増殖活性が失われるといった事態を招
く。

【０００７】上述の問題を避けるために過剰のグルコー
スが供給された場合には、培養液中のグルコース濃度が
上昇する結果、未消費のグルコースが酸化し有機酸の形
で培地内に蓄積し、その結果としてｐＨの低下および代
謝活性の抑制を招く。

【０００８】これら必要成分の不足もしくは過剰供給の
問題については、グルコースを流加する際にだけ生じる
のではなく、金属塩、リン酸塩などの培地成分、消泡剤
の流加の際にも同様に生じ、枯草菌の成育に障害をきた
す。これらの問題を解決するために、適切な目標値を定
め、実際の培養条件が目標値を満足するように、培養操
作の迅速かつ厳格な管理が重要になる。

【０００９】培養の適切な管理のためには、枯草菌の活
性に重大な影響をおよぼす培養液中のグルコース濃度や
培地成分濃度などを極めて短時間に把握する必要がある
。そのためには、培養液中のグルコース濃度を測定する
ことが最も有効であるが、枯草菌の培養液中で実用的か
つ有効に機能するグルコース濃度計は現状では知られて
いない。これは枯草菌は極めて溶菌し易くグルコース濃
度計の測定部分である膜上に菌体が吸着することにより
測定障害が生じることに起因する。この理由によって、
培養液の溶存酸素濃度およびｐＨを制御量として一定値
に保持することによる培養管理が通常行われる。枯草菌
を最適条件で高密度培養するためには、枯草菌の増殖状
況を溶存酸素濃度またはｐＨより判断して、溶存酸素濃
度またはｐＨを制御するための操作量をグルコース流加
量だけでなく、培地成分や消泡剤の流加量に変更する必
要がある。さらに、溶存酸素濃度が設定値より低濃度の
際に、空気供給量および攪拌速度を漸次増加させる処置
も必要である。このように、常時にこの培養を最適状態
に管理かつ制御するためには、上述したような複雑な処
理を必要とするので実質上極めて困難である。

【００１０】本発明はこのような、本発明者によってな
された考察に基づいてなされたものであり、その目的は
、枯草菌を培養する際に、上述の問題点を排して、枯草
菌を高密度かつ再現性良く培養する方法およびこの方法
に使用する培養装置を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の目
的を達成するために鋭意検討した結果、枯草菌を大量培
養する際に、以下の３種類の処理を並行して同時に実施
することにより、目的が達成されることを見出し、本発
明をなすに至った。 （１）培養液中へのグルコース、微量金属、リン酸塩な
どの培地成分および消泡剤をそれぞれ間欠的に流加し、
さらに流加時間および流加後制御判断するまでの待機時
間をコンピュータによって自動的に調整することにより
溶存酸素濃度を一定値に制御し、培養後期において溶存
酸素濃度による制御が不能となった時、ｐＨを一定値に
制御する。 （２）溶存酸素濃度が設定値より低い場合に、空気供給
量と同時に攪拌速度を漸次所定量増加させる。 （３）培養前期において、枯草菌が増殖活性を保持する
よう、１〜６回定時に所定時間、培地成分の供給を実施
する。

【００１２】このような本発明においては、（１）の処
理で示したように、流加培養の前半において溶存酸素濃
度を制御量とし、培養の後半においてはｐＨを制御量と
する。すなわち、まず、前半の培養操作では、溶存酸素
濃度を制御量とし、設定値を２〜１０％、より好ましく
は４〜６％に設定し、溶存酸素濃度がこの設定値を維持
するよう５〜６０秒、より好ましくは１０〜３０秒の所
定時間グルコース水溶液の流加を間欠的に繰り返す。グ
ルコース水溶液の濃度は５〜５０％、より好ましくは２
０〜４０％に調整する。グルコース水溶液の流加によっ
ても、溶存酸素濃度が低下しない場合は、培地成分が培
養液中に不足し、枯草菌の増殖に悪影響を及ぼしている
ため、グルコースの代替として微量のマグネシウム、マ
ンガン、鉄、カルシウムなどの金属の培地成分を含む水
溶液の流加を１〜１０秒の所定時間、溶存酸素濃度を維
持するよう間欠的に繰り返すことにより、枯草菌の増殖
が継続維持される。さらに、微量金属によっても溶存酸
素濃度の制御が不可能となった場合には、リン酸カルシ
ウム、リン酸カリウムなどリン酸塩の水溶液の形でリン
を培養液に１〜１０秒の所定時間、間欠的に供給する。 さらに、上述のリン酸塩によっても溶存酸素濃度の制御
が不可能になった場合には、消泡剤を培養液に間欠的に
供給する。さらに、消泡剤によっても溶存酸素濃度の制
御が不可能になった場合には、溶存酸素濃度の設定値を
２〜１０％上昇させ、グルコース、金属、リン酸塩、消
泡剤の順に、上述したものと同じ処理を繰り返す。培養
の後期に溶存酸素濃度の設定値が４０〜５０％でも制御
不可能となった時点で、制御量を溶存酸素濃度からｐＨ
に切り換える。ｐＨの制御開始時のｐＨの設定値は６〜
８であり、より好ましくは６．５〜７．５とする。

【００１３】本発明において最も重要な処理は上述の（
１）の処理であり、すなわち溶存酸素濃度あるいはｐＨ
の制御であり、常時変化する枯草菌自体の代謝特性、ま
た培養操作上の外乱に対し影響を受ける培養系について
、枯草菌の培養であることからセンサーによる直接的計
測が困難なグルコース濃度や培地成分の濃度を、直接計
測可能な溶存酸素濃度またはｐＨを制御することによっ
て適切に過不足なく管理することにある。すなわち、グ
ルコースが過剰に培養液中に存在した場合には、グルコ
ースの酸化により枯草菌の増殖にとって好ましくない有
機酸の生成を招き、逆に、グルコースが不足した場合に
も枯草菌自体の失活を招くことになり、枯草菌の培養効
率を悪化させることになり、また、培地成分や消泡剤の
過不足によっても枯草菌の増殖が阻害することになるか
らである。

【００１４】また、上述の（２）の処理について述べる
と、枯草菌は好気性の菌であることから、増殖に伴う酸
素消費量の増加、培養液の粘度上昇による酸素吸収効率
の低下、枯草菌自体の培養液中における液分散性を考慮
して、溶存酸素濃度が設定値より低い場合に、漸次に攪
拌速度、供給空気量を所定速度で増加させる。

【００１５】さらに、上述の（３）の処理は、枯草菌の
増殖活性をできるかぎり維持するために、所定回、所定
時間の培地成分および消泡剤の供給を行うことである。

【００１６】

【作用】枯草菌の培養槽において、培養初期にグルコー
ス、培地成分の流加により溶存酸素濃度を制御すると同
時に攪拌速度、空気供給量を漸増させ、さらに、培地成
分の定期的な供給を実施して、培養条件を最適値に常に
コントロールし、溶存酸素濃度を所定値に保つ。また、
培養後期において、このような溶存酸素濃度をパラメー
タとして用いた制御が限界に達した場合には、グルコー
スおよび培地成分の流加によりｐＨを制御することによ
って、グルコースの酸化等に起因する培養活性の阻害要
因を除去するようにする。これにより、枯草菌を高密度
にしかも再現性良く得ることができるようになる。

【００１７】

【実施例】次に、本発明の実施例について図面を参照し
て説明する。図１は本発明の培養方法を実施するための
装置の一例の構成を示す図であり、図２は図１の装置に
おける制御手順を示すフローチャートである。

【００１８】図１の装置は、培養槽Ｂと、培養液の攪拌
機Ｈと、培養液の温度調節用クーラーＣおよびヒーター
Ｄと、培養槽へのグルコース水溶液供給用ポンプＥ１お
よびグルコース水溶液タンクＧ１およびフィードライン
１と、培養槽への金属水溶液供給用ポンプＥ２，タンク
Ｇ２，フィードライン２と、培養槽へのリン酸塩水溶液
供給用ポンプＥ３，タンクＧ３，フィードライン３と、
培養槽への消泡剤供給用ポンプＥ４，タンクＧ４，フィ
ードライン４と、培養槽への空気供給手段（コンプレッ
サ）Ｆ，フィードライン５，空気流量制御バルブ１０と
、培養液の溶存酸素濃度を測定する濃度計６と、培養液
のｐＨを測定するｐＨ計７と、培養液の温度を測定する
温度計８と、培養液の溶存酸素濃度またはｐＨを所定値
に保つように各手段を統括的に制御するコンピュータＡ
とを有している。

【００１９】この装置における上述の（１）の処理手順
を説明する。予め、培地を入れた培養槽Ｂに枯草菌を植
菌し、攪拌機Ｈにより培養液を攪拌し、さらにライン５
より培養液中に空気を気泡状態で供給する。この場合、
空気の代わりに酸素もしくは空気と酸素とを同時に供給
してもよい。培養の進行に伴い、枯草菌がグルコースを
消費する過程で培養液中の酸素を消費し、溶存酸素濃度
が設定値より低下する（ステップ２２）　。まず、この
段階で溶存酸素濃度を制御量とした制御を開始する（ス
テップ２３）　。

【００２０】一方、溶存酸素濃度が設定値より上昇した
時（ステップ２６）、グルコース供給ポンプＥ１により
所定の作動時間１０〜３０秒間、ライン１よりグルコー
スが培養槽Ｂへ供給される（ステップ２７）。もし、作
動時間が経過しない前に溶存酸素濃度が設定値より低下
した場合には、ポンプＥ１を停止し（ステップ３１，３
２）、再びステップ２６の状態に戻り、溶存酸素濃度が
設定値を越えるのを待つ。一方、ステップ２８で作動時
間が設定時間を越えても、溶存酸素濃度が設定値より低
下しない場合は、枯草菌の代謝の遅れが原因と判断し、
ポンプを停止して（ステップ２９）、設定した待機時間
１〜１０秒間溶存酸素濃度が設定値より低下するまで待
機する（ステップ３０，３３）。設定値より低下したら
、再びステップ２０の状態で溶存酸素濃度が設定値を越
えるのを待ち、上述した動作を繰り返す。もし、待機時
間内に溶存酸素濃度が設定値より低下しない場合は、も
はやグルコースのみによる枯草菌の増殖は不可能であり
、他の栄養源が不足していると判断し、ポンプＥ２によ
り微量金属水溶液をライン２によって供給開始する。

【００２１】すなわち、微量金属の供給量を調整するこ
とにより、グルコース水溶液流加の場合と同様に、同じ
溶存酸素濃度の設定値に制御する。さらに、微量金属の
供給量調整により溶存酸素濃度の制御が不可能となった
場合は、リン酸塩水溶液により溶存酸素濃度の制御を行
う。同様に、リン酸塩水溶液による溶存酸素濃度の制御
が不能となった場合は、消泡剤による溶存酸素濃度制御
に切り換える。同じく、消泡剤による溶存酸素濃度の制
御が不可能となった場合は、もはや溶存酸素濃度設定値
のレベルを保持するのには、枯草菌の活性が不足してい
るとみなし、溶存酸素濃度設定値を高くし（ステップ３
４）、設定値が４０％未満であればステップ２６に戻り
、ステップ２６〜ステップ３５の操作を繰り返し、溶存
酸素濃度の設定値が４０％を越える場合は、制御量（パ
ラメータ）を溶存酸素濃度からｐＨに切り換え、ステッ
プ２６〜ステップ３５と同じ操作を培養終了まで繰り返
す。ただし、ｐＨによる制御の段階では、グルコース流
加による制御のみでもほぼ同等の培養結果がえられるた
め、通常、グルコース流加のみのｐＨ制御を行う。

【００２２】この時、溶存酸素濃度、ｐＨはセンサー６
，７によりアナログ信号でコンピュータＡにディジタル
変換して入力し、コンピュータＡ上に組み込まれた制御
用ソフトウエアのシーケンス制御機能により上記の判断
を行い、ポンプＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４を起動するディ
ジタル信号を適宜出力する。

【００２３】また、上述の（２）の制御は、例えば、５
リットルのジャーファーメンタの場合には、溶存酸素濃
度による制御を開始した時点（ステップ２３）より、溶
存酸素濃度が設定値よりも低い時のみ、攪拌機回転数制
御の設定値を３００ｒｐｍの初期値から０．０５〜１．
０ｒｐｍ／ｍｉｎ、より好ましくは０．１０〜０．７０
ｒｐｍ／ｍｉｎ　の変化速度で連続的に増加し（ステッ
プ２４）、さらに供給空気量の設定値を１リットル／ｍ
ｉｎ　の初期値から０〜０．１　リットル／ｍｉｎ　２
の変化速度、より好ましくは、０．０１〜０．０８リッ
トル／ｍｉｎ　２の変化速度で連続的に増加する（ステ
ップ２５）。攪拌機の制御は、攪拌機Ｈよりアナログ信
号１１をコンピュータＡに取込み、アナログ／ディジタ
ル変換処理をし、コンピュータＡに組み込まれた制御用
ソフトウエアのもつフィードバック制御機能によりＰＩ
Ｄ演算を実行し、攪拌機Ｈにディジタル出力信号をディ
ジタル／アナログ変換し、アナログ信号で返すことによ
り攪拌機の動力を調整して実施される。空気供給量につ
いても同様に流量計９によりアナログ信号を取込み、デ
ィジタル量に変換後、コンピュータＡによりＰＩＤ演算
を実行し、攪拌機の場合と同様にアナログ信号を出力し
てライン５のバルブ１０を調節して実施される。この場
合のコンピュータＡの制御手順が図３に示される。溶存
酸素濃度の実測値が設定値より低い場合（ステップ４０
）、空気供給量と攪拌速度を増加させ（ステップ４１）
　、実測値が設定値と一致するか、あるいは設定値を越
えた場合（ステップ４２）　に、空気供給量等を一定値
に戻す（ステップ４３）　。

【００２４】また、上述の（３）の処理のシーケンス制
御は、培養期間の指定した時期に、所定回数、所定時間
、コンピュータＡからのディジタル信号出力によりポン
プＥ２、Ｅ３、Ｅ４を起動し、それぞれライン２，３，
４によって培地成分および消泡剤の追加供給を行い、枯
草菌の増殖活性を高める。この場合の制御手順の一例を
図４に示す。この制御は、コンピュータＡに予め複数の
命令セットをプログラムしておき、この命令セットをシ
ーケンシャルに実行させることによって行う。１つの命
令セットには、動作させるべきポンプの番号と、制御を
開始した後、どれだけの時間経過後にポンプを動作させ
るかを示す動作開始時間と、そのポンプの作動時間と、
後続する命令セットの有無を示すフラグとが設けられて
おり、初期状態において任意にプログラム可能となって
いる。図示される例では、まず命令セット１が実行され
（ステップ５０）　、続いて命令セット２が実行され（
ステップ５１）　、続いて命令セット３が実行される（
ステップ５２）　。なお、時間カウントは、コンピュー
タＡの内部タイマ（例えば、所定回数のクロックをカウ
ントすると割り込みをかけるソフトタイマ）を用いて行
う。

【００２５】枯草菌の高密度培養は、上述の制御を並行
して実施することで達成される。以下、実施例により本
発明の方法を具体的に説明する。

【００２６】実施例１ ５リットルの培養槽に４×ＬＢ培地および、枯草菌を植
菌し、３００ｒｐｍで培養液の攪拌および１．０　リッ
トル／ｍｉｎ　の流量で培養液中に空気供給を開始した
。このときの溶存酸素濃度は３０％であったが、次第に
低下し、５％以下になったときに０．０２リットル／ｍ
ｉｎ　の流量で３０％グルコース水溶液を２０秒間、間
欠的に流加する溶存酸素濃度の制御を行った。

【００２７】培養開始１０．２時間後、グルコース水溶
液を供給しても溶存酸素濃度が設定値の５％より低下し
なくなったので、グルコース水溶液の代わりに１００　
ｍＭ塩化マンガン水溶液を供給することにより、溶存酸
素濃度は５％以下となり、塩化マンガン水溶液による溶
存酸素濃度の制御が可能となった。その後、再びグルコ
ース水溶液流加による制御を行ったが、１３．５時間後
、グルコース水溶液流加による制御が不可能になったた
め、再び、塩化マンガン水溶液流加による制御に移行し
た。しかしながら、今回は塩化マンガン水溶液を供給し
ても溶存酸素濃度が設定値の５％より低下しなくなった
ので、塩化マンガン水溶液の代わりに１．０　Ｍリン酸
カリウム水溶液を供給することにより、溶存酸素濃度は
５％以下となり、リン酸カリウム水溶液による溶存酸素
濃度の制御が可能となった。

【００２８】その後、再びグルコース水溶液流加による
制御を行ったが、１５．４時間後、グルコース水溶液流
加による制御が不可能になったので、再び塩化マンガン
水溶液流加による制御に移行した。しかしながら、今回
は塩化マンガン水溶液による制御も不可能であり、続く
リン酸カリウム水溶液を供給しても溶存酸素濃度が設定
値の５％より低下しなくなったので、リン酸カリウム水
溶液の代わりに、消泡剤アデカノール（旭電化製）を供
給することにより溶存酸素濃度は５％以下となり、上述
した消泡剤による溶存酸素濃度の制御が可能となった。

【００２９】その後、再びグルコース水溶液流加による
制御を行ったが、１８．１時間後、グルコース水溶液流
加による制御が不可能になったので、再び塩化マンガン
水溶液流加による制御に移行した。しかしながら、今回
は塩化マンガン水溶液による制御、続くリン酸カリウム
水溶液による制御、消泡剤による制御によっても溶存酸
素濃度が設定値の５％より低下しなくなったため、設定
値を１０％に上げて再びグルコースによる制御を可能と
した。

【００３０】上述の操作を設定値を段階的に上げて繰り
返したところ、培養開始後２４時間目に設定値が４０％
でも制御不可能となったので、制御量を溶存酸素濃度か
らｐＨ（設定値７．０）に変更して、溶存酸素濃度によ
る制御と同様、グルコース、塩化マンガン、リン酸カリ
ウム各々の水溶液の流加量を交互に操作量とすることに
より培養を行った。２４時間後、５７０　ｎｍにおける
ＯＤ（光学密度）が１０５　になり、培養液をサンプリ
ングし、実測したところ、乾燥菌体重量ベースで３５．
３ｇ／リットルの枯草菌が得られた。これらの制御は、
すべてコンピュータにより実施した。また、この間、溶
存酸素濃度が設定値より低い場合、攪拌速度を０．１０
〜０．６５ｒｐｍ／ｍｉｎ　の範囲内で増加し、空気量
を０．０１５　〜０．０６５　リットル／ｍｉｎ２で増
加させる処理を並行して実施した。また、この間、塩化
マンガン水溶液を制御開始から５時間目に３秒間供給し
、リン酸水溶液を５時間目と１０時間目にそれぞれ３秒
間供給し、消泡剤を５，８，１０，１２時間目にそれぞ
れ、５秒間供給する処理も並行して実施した。

【００３１】実施例２ 実施例１と同じ培養を再度繰り返したところ、最終的に
得られた培養液の５７０ｎｍ　におけるＯＤ（光学密度
）が１０５　になり、培養液をサンプリングして実測し
たところ、乾燥菌体重量ベースで３４．７ｇ／リットル
の枯草菌が得られており、再現性のある結果が得られた
。

【００３２】比較例１ ５リットルの培養槽に４×ＬＢ培地および、枯草菌を植
菌し、攪拌および空気供給を開始した。このときの溶存
酸素濃度は３０％であり、グルコース１０ｇ、消泡剤（
培養液中に１００ｐｐｍ）を予め供給しておいた。培養
開始後は、グルコース、培地成分、消泡剤の流加は一切
行わなかった。また、攪拌回転数および空気供給量はそ
れぞれ３００ｒｐｍ、２．０　リットル／ｍｉｎ　で培
養期間巾一定とした。培養開始２４時間後、５７０　ｎ
ｍにおけるＯＤ（光学密度）が２０になり、培養液をサ
ンプリングして実測したところ、乾燥菌体重量ベースで
１０．８ｇ／リットルの枯草菌が得られた。

【００３３】比較例２ 実施例１において、すべて手動で制御したところ、結果
としてグルコースおよび培地成分等の供給過剰や供給不
足を生じ、図３に示すように実施例１の場合と比較して
、溶存酸素濃度の変動が大きくなり、最終的に得られた
培養液の５７０ｎｍにおけるＯＤ（光学密度）が４０に
なり、培養液をサンプリングして実測したところ、乾燥
菌体重量ベースで１７ｇ／リットルの枯草菌が得られて
いた。

【００３４】図３から、本発明の培養装置を用いた間欠
的なグルコース供給等の制御によれば、溶存酸素濃度が
規則的に変化し、かつその変化振幅は十分に小さく、グ
ルコース等が過不足なく与えられて枯草菌の順調な培養
が可能であることがわかる。

【００３５】比較例３ 比較例２と同じ培養を繰り返したところ、最終的に得ら
れた培養液の５７０　ｎｍにおけるＯＤ（光学密度）が
３２になり、培養液をサンプリングして実測したところ
、乾燥菌体重量ベースで１２ｇ／リットルの枯草菌が得
られており、再現性のある結果が得られなかった。

【００３６】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、枯
草菌の培養槽において、培養初期にグルコース、培地成
分の流加により溶存酸素濃度を制御すると同時に攪拌速
度、空気供給量を漸増させ、さらに、培地成分の定期的
な供給を実施し、一方、培養後期にはグルコースおよび
培地成分の流加によりｐＨを制御することによって、枯
草菌を高密度にしかも再現性良く得ることができるよう
になり、枯草菌の生産性の向上、安定化が可能となった
。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の枯草菌の培養方法を実施するための装
置の構成例を示す図である。

【図２】図１の装置における、第１の処理（培養液中へ
のグルコース、微量金属、リン酸塩等の流加処理）の制
御手順を示すフローチャートである。

【図３】図１の装置における、第２の処理（空気供給量
と攪拌速度の漸次増加処理）の制御手順を示すフローチ
ャートである。

【図４】図１の装置における、第３の処理（所定回、所
定時間の培地成分および消泡剤の供給処理）の制御手順
を説明するための図である。

【図５】本発明の実施例および比較例における溶存酸素
の変化を示す図である。

【符号の説明】

１　　グルコース水溶液フィードライン２　　金属水溶
液フィードライン ３　　リン酸塩水溶液フィードライン ４　　消泡剤フィードライン ５　　空気フィードライン ６　　培養液溶存酸素濃度計 ７　　培養液ｐＨ計 ８　　培養液温度計 ９　　フィード空気流量計 １０　　フィード空気流量制御用バルブ１１　　攪拌機
回転計 Ａ　　コンピュータ Ｂ　　培養槽 Ｃ　　クーラー Ｄ　　ヒーター Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４　　ポンプ Ｆ　　コンプレッサ Ｇ１　　グルコース水溶液タンク Ｇ２　　金属水溶液タンク Ｇ３　　リン酸塩水溶液タンク Ｇ４　　消泡剤フィードライン Ｈ　　攪拌機 ＤＯ２　　溶存酸素 ［ＤＯ２］　　溶存酸素の測定値 ［ＤＯ２］Ｓ　　溶存酸素の設定値

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　培養液中の溶存酸素濃度またはｐＨを
   特定の値に保持するように、培養槽へのグルコース、培
   地成分などの栄養源の流加時間または流加速度、培養液
   への空気の供給量、および培養液の攪拌速度を調整する
   枯草菌の高密度培養方法であって、溶存酸素濃度または
   ｐＨを制御パラメータとして用いて、コンピュータ制御
   により、流加する栄養源の選択、栄養源の供給時間およ
   び供給空気量、攪拌速度の制御を行うことを特徴とする
   枯草菌の高密度培養方法。
2. 【請求項２】　　以下の第１，第２，第３の処理を並行
   して実施することを特徴とする請求項１記載の枯草菌の
   高密度培養方法。 第１の処理：培養液中へのグルコース、微量金属、リン
   酸塩などの培地成分および消泡剤をそれぞれ間欠的に流
   加し、さらに流加時間および流加後制御判断するまでの
   待機時間をコンピュータによって自動的に調整すること
   により溶存酸素濃度を一定値に制御する。 第２の処理： 溶存酸素濃度が設定値より低い場合に、空気供給量と同
   時に攪拌速度を漸次所定量増加させる。 第３の処理： 培養前期において、枯草菌が増殖活性を保持するよう、
   所定回、所定時間の培地成分および消泡剤の供給を実施
   する。
3. 【請求項３】　　第１の処理において、培養後期におい
   て溶存酸素濃度による制御が不能となった時、ｐＨを一
   定値に制御する処理を行う請求項２記載の枯草菌の高密
   度培養方法。
4. 【請求項４】　　第１の処理において、まず、グルコー
   ス供給による溶存酸素濃度の制御を行い、このグルコー
   スによる制御では不十分となった場合には微量金属供給
   による制御を行い、微量金属供給による制御では不十分
   となった場合にはリン酸塩供給による溶存酸素濃度の制
   御を行い、このリン酸塩供給による制御では不十分とな
   った場合には消泡剤供給による溶存酸素濃度の制御を行
   い、この後、溶存酸素濃度の目標値を変更して同様の処
   理を繰り返すことを特徴とする請求項２記載の枯草菌の
   高密度培養方法。
5. 【請求項５】　　培養槽（Ｂ）と、培養液の攪拌手段（
   Ｈ）と、培養液の温度調節手段（Ｃ，Ｄ）と、培養槽へ
   のグルコース水溶液供給手段（Ｅ１，Ｇ１，１）と、培
   養槽への金属水溶液供給手段（Ｅ２，Ｇ２，２）と、培
   養槽へのリン酸塩水溶液供給手段（Ｅ３，Ｇ３，３）と
   、培養槽への消泡剤供給手段（Ｅ４，Ｇ４，４）と、培
   養槽への空気供給手段（Ｆ，５，１０）と、培養液の溶
   存酸素濃度を測定する濃度測定手段（６）と、培養液の
   ｐＨを測定するｐＨ測定手段（７）と、培養液の温度を
   測定する温度測定手段（８）と、培養液の溶存酸素濃度
   またはｐＨを所定値に保つように各手段を統括的に制御
   する制御手段（Ａ）とを有することを特徴とする培養装
   置。