JPH04207193A

JPH04207193A - 酵素の製造方法

Info

Publication number: JPH04207193A
Application number: JP2223127A
Authority: JP
Inventors: Yoshikazu Morii; 森井　良和; Kiyobumi Kida; 貴田　清文; Masami Shimizu; 雅美清水
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1990-08-24
Publication date: 1992-07-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、油糧種子から目的酵素を効率的に抽出するこ
とに基づく酵素の製造方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕従来、
油糧種子より酵素抽出液を得る技術としては、混合装置
を付帯した槽に、破砕種子と抽出剤を入れ、混合抽出し
た後、種子粕と抽出液に分離する方法がある。

このような混合による抽出方法では、混合による油糧種
子の二次破砕による微細化が起こり、微細粒子は、種子
粕の分離を困難な状態にしていると共に抽出液の濁り発
生の原因となっている。従って微細粒子を分離し透明な
抽出液を得る為に、濾過分離、遠心分離等の方法が取ら
れ、分離設備を必要とした。この濁りは目的酵素以外の
夾雑タンパク由来のものであり、目的酵素であるホスホ
リパーゼＣ、ホスホリパーゼＤは食品の改質用酵素であ
るのでホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ以外のタン
パクは極力少なし・方が品質上好ましい。

本発明の目的は、濁りの無い酵素の製造方法を開発する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

かかる現状にあって、本発明者らは上記課題を解決すべ
（、軽微な抽出設備で、油糧種子破砕物より直接に透明
な酵素抽出液を得る技術の検討を行い、分離操作が不要
で、従来技術で得られた抽出液と同等の酵素活性を有し
、透明な抽出液を得る技術を完成させることに成功し、
本発明に至った。

即ち、本発明は、油糧種子より酵素を製造する方法にお
いて、油糧種子の破砕物を充填塔に充填し、この充填塔
に、温度０〜５０°Ｃ，ｐＨ４〜１０の水又は金属塩水
溶液を油糧種子の破砕物二こ対し１．０〜５０倍量、滞
留時間０．１〜２４時間の流量で連続的に供給して酵素
を抽出すると共に、酵素を含む抽出液を取り出す事を特
徴とする酵素の製造方法を提供するものである。

本発明に用いる好適な油Ｉｉ種子としては、大豆、ナタ
ネ、ヒマワリ、落花生、綿実、紅花、辛子、胡麻、オリ
ーブ、コーン等が挙げられ、目的酵素の抽出効果、価格
、供給面の・ら大豆がより好ましい。

油糧種子の破砕平均粒径については、種子を油糧種子原
料に対し粉砕粒径比９／１０〜１／１０の範囲に破砕し
たものであれば差し支えない。９／１０より大きいと目
的酵素の抽出効率が低下し、ｌ／１０より小さいと抽出
液に微細粒子が混入じ濁りの発生原因となる。粉砕方法
については、当該分野の公知のいかなる装置、方法をも
利用出来る。

油糧種子抽出物は、前記した油糧種子を物理的手段によ
って粉砕し、生成する粉砕物を充填塔に充填し、水或い
は金属塩の１種又は２種以上を含有する水溶液を用いて
抽出する事により得られる。

本発明の抽出に用いる金属塩としては、カルボン酸のア
ルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、無機酸のア
ルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩等が挙げられ
る。

カルボン酸のアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属
塩において、カルボン酸としては炭素数２〜８の直鎖又
は分岐鎖の脂肪族カルボン酸、炭素数７〜１２の芳香族
カルボン酸が挙シヂろれ、例えば酢酸、酪酸、プロピオ
ン酸等の脂肪族カルボン酸、安息香酸等の芳香族カルボ
ン酸を例示できる。また、アルカリ金属塩としてはナト
リウム、カリウム等の塩が挙げられ、アルカリ土類金属
塩としてはバリウム、マグネシウム、カルシウム等の塩
が挙げられる。また無機酸のアルカリ金属塩もしくはア
ルカリ土類金属塩としては、上記アルカリ金属もしくは
アルカリ土類金属のハロゲン化物、炭酸塩、リン酸塩等
が挙げられる。

本発明においては、ｐＨ４〜ＩＯの範囲内で抽出を行う
ことが重要であり、ｐＨ４〜８の範囲がより好ましい、
ｐＨ４未満では、目的酵素の抽出効率が悪＜　、ｐＨ１
０より大きいと目的酵素の抽出効率は良くなるが不用な
夾雑タンパクの抽出量も多くなり品質上好ましくない。

また本発明においては、抽出処理温度は０〜５０°Ｃ１
好ましくは５〜３０°Ｃであり、この温度で抽出剤を充
填塔に通液する。５〜３０°Ｃの範囲では目的酵素の抽
出効率、酵素の安定性が特に優れている。抽出処理温度
が０°Ｃより低いと、目的酵素の抽出効率が悪くなり、
５０°Ｃより高いと目的酵素の安定性が悪くなり、また
不用な夾雑タンパクの溶出が多くなる。

本発明において抽出剤量は、充填塔に充填された油糧種
子破砕物に対し重量比で１．０〜５０倍、好ましくは４
〜２０倍である。１．０倍未満では油糧種子破砕物に吸
収され収率が悪くなり、５０倍を越えると目的酵素濃度
は希薄となり使用に際し濃縮処理が必要となる。

抽出剤の塔内滞留時間は０．１〜２４時間、好ましくは
１〜４時間である。０．１時間未満では油糧種子との接
触時間が短（、目的酵素の抽出効率が悪い。また２４時
間を越えると目的酵素の抽出効率は高くなるが夾雑タン
パクの抽出量も多くなり、また酵素の安定性及び腐敗に
問題があり、品質上好ましくない。

充填塔への通液法としては、上部注液、下部注液等、特
に制限されるものでなく、更に循環方式、通過方式につ
いても特に制限されるものではない。

本発明の方法のように充填塔を利用することにより、油
糧種子破砕物の二次破砕を極力抑えることができ、また
充填油糧種子層は、−次破砕時に発生する微量の微細粉
を架橋効果乙こより保持する作用があるため、抽出液に
種子由来の微細粉が混入しない透明な抽出液が得られる
。

〔発明の効果〕

本発明によれば、濾過分離、遠心分離等の設備による精
製を行う事なく、透明で固形分の少ない目的とする酵素
を含む抽出液を製造することができる。

〔実施例］以下、実施例、比較例等をもって本発明方法を詳細に説
明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

実施例−１塔径３４９ｍｍφ、塔長３６８５ｍｍ、塔容積３３４．
ｉの充填塔に、油糧種子として市販大豆（中国産シルキ
ービーン、平均長径８．０ｎｕ＋＋）を粉砕機〔■凸材
機械製作所製、ロールミル〕で粉砕処理した第１図に示
すような粒度分布（平均粉砕粒径２．８３ｍ／ｍ、対原
料粉砕平均粒径比０．３５４）を有するものを９２．５
ｋｇ充填し、２５〜３０°Ｃの抽出剤（５０ｗＭ塩化カ
ルシウム入りの０．４Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸水溶液、
ｐＨ＝６．０）を、充填塔下部より均一な速度２２０　
ｋｇ／時間で３時間、６６０　ｋｇを注液し塔頂より淡
黄色で透明な抽出液３１２ｋｇを得た。

得られた抽出液の酵素活性、タンパク量、固形分含量を
下記測定法（１）〜（４）の方法で測定した。

結果は表−１に示した。

実施例−２塔径３４９ｍｍφ、塔長３６８５ｍｍ、塔容積３３４．
４　Ａの充填塔に、実施例−１と同一の大豆粉砕物を９
２．５ｋｇ充填し、２５〜３０°Ｃの抽出剤（５０ｍＭ
塩化カルシウム入りの０．４Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸水
溶液、ｐＨ＝６．０）を、充填塔下部より均一な速度８
２．５ｋｇ／時間で８時間、６６０ｋｇを注液し、塔頂
より淡黄色で透明な抽出液３７２ｋｇを得た。

結果は表−１に示した。

比較例−１実施例−１で用いたものと同じ充填塔に、油糧種子とし
て市販大豆（中国産シルキービーン。

平均長径８．０　＋＊ｍ）の未粉砕品を９２．５ｋｇ充
填し、２５〜３０°Ｃの抽出剤（５０ｍＭ塩化カルシウ
ム入りの０．４Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸水溶液、ｐＦｌ
＝６．０）を、充填塔下部より均一な速度２２０　ｋｇ
／時間で３時間、６６０　ｋｇを注液し塔頂より透明な
抽出液３７２　ｋｇを得た。

結果は表−１に示した。

表−１から明らかなように、未粉砕品を使用した場合は
目的酵素が抽出されなかった。

比較例−２混合装置を備えた槽（容積：３００ｆｆｉ、撹拌翼：６
枚タービン−段、翼径／槽径＝１／３、材ｆ：５ＩＪＳ
３０４　）に、抽出剤（５０ｍＭ塩化カルシウム入りの
０．４Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸水溶液、ｐＨ＝６．０）
１２０　ｋｇと、実施例−１と同一の大豆粉砕物を２゜
ｋｇ入れ、温度２５〜３０°Ｃ１撹拌速度２５０ｒｐｍ
で１時間混合し抽出した後、大豆混合液を、２０ｋｇ／
ｈｒの速度で遠心分離機（■旧型、　ＭＤＩＯ型）で大
豆粕を分離し抽出液９２ｋｇを得た。

結果は表−１に示した。

このような方法では目的酵素が抽出されると同時に、不
要タンパクが抽出されること、及び種子の微破砕物が混
入することにより、抽出液は濁っており、品質的に所望
の抽出液が得られなかった。

表−１注）ｍｌ　ＰＬ−Ｃ：ホスホリパーゼＣ本２　ＰＬ−Ｄ　：ホスホリパーゼＤく測定方法〉（１）ホスホリパーゼＣ（ＰＬ−Ｃ）活性測定法１）試
薬デオキシコール酸ナトリウム　　　東京化成ホスファチ
ジルイノシトールシグマＰ　−６６３６，５０％純度無水酢酸ナトリウム　　　　　　　試薬特級酢酸　　　
　　　　　　　　　　　試薬特級クロロホルム　　　　
　　　　　　試薬特級メタノール　　　　　　　　　　
　試薬特級濃塩酸　　　　　　　　　　　　　試薬特級
リン酸−カリウム　　　　　　　　試薬特級２）試薬の
調整 ■酢酸謹衝液：無水酢酸ナトｉＪウム１５．６ｇを蒸留
本釣４００−に溶かし、酢酸でｐＨ６に調整した後、蒸
留水で正確に５００　ｍ／に希釈する。

■基質・緩衝液：デオキシコール酸ナトリウム５０＋ｓ
ｇを秤取し、蒸留水Ｉｏｎ／に溶解する。

ホスファチジルイノシトール８０ｍｇを正確に秤取し、
この溶液５−を正確に加え、室温で３０分間超音波処理
をする。さらに酢酸緩衝液１０−を正確に加え、室温で
約１０分間超音波処理をする。

■反応停止液：クロロホルム６６ｍ１、メタノール３３
−１濃塩酸１＠！を混合する。

■リン標準液ニリンが正確に０．５ｍＭとなるよう蒸留
水でリン酸−カリウムを溶解する。

３）操　作 ■　試料１００　ＩＩＩを試験管に正確に取る。このと
き、ブランクとしてなにも取らないものを準備し、同時
に分析する。

■　３７℃水浴中で、基質・緩衝液４００　ｍを各々正
確に加えて混合し、加えた時点から３０分間放１する。

■　同時に検量線用に、標準ブランクとして蒸留水５０
０層、標準リンとしてリン標準液５００　ｍを各々正確
に試験管に採っておく。

■　サンプル及び標準の各々に反応停止液２．５１を正
確に加え、よく混合する。

■１０００ｒｐ＋＊Ｔ：　１０分間遠心分離し、上層２
００　ＩＩＩを正確に試験管にとる。

■　採取した上層に硫酸０．２ａ／を正確に加え、混合
したのち沸騰浴中で１０分間放置する。

■　酸化剤１．０　Ｉ１７を正確に加えて混合したのち
、ガラス玉を試験管の上にのせ、沸騰浴中で３０分放置
する。

■　室温で１０分間放冷し、ガラス玉をとる。

■　脱色剤１．Ｏａｆｆを正確に加え、よく撹拌する。

■　発色剤０．２５ｍ１を正確に加え、混合したのち、
３７°Ｃ水浴中で２０分間放置する。

■　流水で１０分間冷却する。

■　吸光度計で６６０層ｍの吸光度を測定する。

４）計　算活性（ｎｍｏｉ１０＋１ｎ−ｔｒｉ　〕測定範囲：０．０２≦（サンプル吸光度−ブランク吸光度）≦０．
１５（２）ホスホリパーゼＤ　（ＰＬ−Ｄ）活性測定法
１）試薬エピクｏ　７５−２００　　　　　Ｌｕｃａｓ　’ｈａ
ｙｅｒ社製ノニデットＰ−４０シグマＮ　　３５１６塩
化カルシウム２水塩　　　　　　試薬特級酢酸　　　　
　　　　　　　　　　試薬特級無水酢酸すｌ−ＩＪウム
　　　　　　　試薬特級塩化コリン　　　　　　　　シ
グマＣ−１８７９トリスヒドロキシアミノメタン　　試
薬特級フェノール　　　　　　　　　　　試薬特級４−
アミノアンチピリン　　　　　試薬特級トリトンＸ−１
００和光純薬ＥＤＴＡ・２ナトリウム・２水塩　　　試薬特級濃塩酸
　　　　　　　　　　　　試薬特級クロロホルム　　　
　　　　　　　試薬特級２）試薬の調整 ■ノニデットＰ−４０水ン容液：ノニデント　ｐ−４０
の濃度が０．１３％になるよう蒸留水で希釈する。

０７５ｍＭ酢酸緩衝液；酢酸ナトリウム５．８５ｇ、塩
化カルシウム１１．０４ｇを約９００献の蒸留水で溶解
し、酢酸でｐＨ６，０；こ調整する。

全量を蒸留水で正確に１０００−に希釈する。

■基質・緩衝液：エビクロンＳ　−２００を０．３ｇ正
確に秤取し、クロロホルム２＠ｌに熔解したのち、窒素
気流下でクロロホルムを除去する。１０−のノニデ７）
Ｐ４Ｑ水溶液を加え、室温で２０分間超音波処理を行う
。７５ｍＭ酢酸緩衝液２０＠１を加え、再度室温で２０
分間超音波処理を行う。本溶液は、経日保存できない。

■反応停止液ニドリスヒドロキシアミノメタン１２．１
２ｇとＥＤＴＡ・２ナトリウム・２水塩５．５８ｇを蒸
留本釣７０−で溶解し、濃塩酸でｐｎｓ、ｏに調整する
。全量を蒸留水で１００ｄに希釈する。本溶液は、４°
Ｃで１ケ月保存できる。

■フェノール・トリス塩酸緩衝液ニドリスヒドロキシア
ミノメタン６．０６ｇとフェノール０．２ｇを約０．Ｉ
Ｎに希釈した塩酸２００〜２４０　ａ／で溶解し、ｐＨ
８，０に調整する。全量を蒸留水で５００−に希釈する
。本溶液は、４°Ｃで１ケ月の保存が可能である。

■発色基質液＝４−アミノアンチピリン６１ｍｇにフェ
ノール・トリス塩酸緩衝液１００＠ｌを加え溶解する。

本溶液は、４°Ｃで約１０日間保存可能である。

■発色液：コリンオキンダーゼ６０ｕｎｉｔｓ　　（約
６ｍｇ）とパーオキシダーゼ９０ｕｎｊｔｓ　　（約Ｉ
ＩＩ１ｇ）を発色基質液１０−に溶解する。本溶液は、
保存不可能である。

■発色停止液ニトリトンＸ−１００を５ｇ秤取し、蒸留
水で５００　＠ｌとする。

■標準塩化コリン溶液：無水酢酸ナトリウム３．９ｇ、
塩化カルシウム７．３６ｇを１留本釣９００−に溶かし
、酢酸でｐＨ６，０に調整する。塩化コリン０．０２８
ｇを秤取し、本溶液に溶解して、全量を蒸留水で正確に
１０００−にする。

３）操　作 ■　試料２００ハを試験管に正確に取る。大豆抽出液の
場合は、酢酸緩衝液で５０倍に希釈したものを試料とす
る。このとき、ブランクとしてなにも取らないもの、標
準ブランクとして蒸留水２００　ｕｉを正確にとったも
の、及び標準コリンとして標準塩化コリン溶液２００Ｉ
Ｊｉを正確に取ったものを調整し、同時に分析する。

■　３７°Ｃ水浴中で、基質・緩衝液３００　ｔｌｌを
各々正確に加えて混合し、加えた時点から１０分間放置
する。

■　正確に１０分経過したら、反応停止液２００４を各
々正確に加え、よく混合する。

■　発色液５００−を各々正確に加えて混合し、３７°
Ｃで水浴中で２０分間放置し、発色させる。

■　発色停止液２ｄを各々正確に加えて混合し、吸光度
計で５００ｎｍの吸光度を測定する。

４）計　算活性（ｎＩｌｏｌ／ｒ＠１ｎ−ｒＩＬｌ〕（標準コリン
吸光度−標準ブランク吸光度）測定範囲：０．０３≦（サンプル吸光度−ブランク吸光度）≦０．
２５（３）タンパク量測定法 ■）試薬無水酢酸ナトリウム　　　　　　試薬特級酢酸　　　　
　　　　　　　　　試薬特級塩化カルシウム２水塩　　
　　　試薬特級２）試薬の調整酢酸緩衝液無水酢酸ナトリウム１５．６ｇ及び塩化力ルンウム３．
７ｇを蒸留本釣４００−に溶かし、酢酸にてｐＨ６に調
整する。蒸留水にて全量を５００−に正確に希釈する。

３）操作 ■　サンプルの希釈５０−メスフラスコに大豆抽出液１−を正確にとり、酢
酸緩衝液で標線まで希釈する。

■測　定石英セルにて波長２６Ｏｎ＋ａと２８０ｎｍの吸光度を
測定する。

４）計　算蛋白質＜　ｒａｇ　／　ｄ　３− （４）固形分測定法１）試　料酵素抽出液２）遠心分離機日立工機■製　５ＣＲ２０ＢＡ３）操　作 ■　試料２０．０ｇをボトルに正確に取り、キャップを
した後アングルローターに挿入する。

■　遠心分離機を起動し、７０００ｒｐｍで３０分間遠
心分離した後、ボトル内の上澄液を取り除き、残分を減
圧乾燥させ固形物を求める。

乾燥条件　温　度　　２５〜４０°Ｃ圧　力　　１０ｔｏｒｒ以下時間　１２　ｈｒ

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１〜２及び比較例２で用いた大豆粉砕物
の粒度分布を示すグラフである。出願人代理人　　古　谷　　　馨（外３名）第１図獣ｎ會？ｒ１七艷（ａ／腸］

Claims

【特許請求の範囲】１、油糧種子より酵素を製造する方法において、油糧種
子の破砕物を充填塔に充填し、この充填塔に、温度０〜
５０℃、ｐＨ４〜１０の水又は金属塩水溶液を油糧種子
の破砕物に対し１．０〜５０倍量、滞留時間０．１〜２
４時間の流量で連続的に供給して酵素を抽出すると共に
、酵素を含む抽出液を取り出す事を特徴とする酵素の製
造方法。２、酵素が油糧種子の破砕物より得られるホスホリパー
ゼＣとホスホリパーゼＤの混合物である請求項１記載の
酵素の製造方法。３、油糧種子が、大豆、ナタネ、ヒマワリ、落花生、綿
実、紅花、辛子、胡麻、オリーブ又はコーンであり、こ
れら油糧種子の破砕物が、油糧種子を油糧種子原料に対
し粉砕粒径比９／１０〜１／１０に破砕したものである
請求項１又は３記載の酵素の製造方法。４、金属塩水溶液がカルボン酸のアルカリ金属塩もしく
はアルカリ土類金属塩、無機酸のアルカリ金属塩もしく
はアルカリ土類金属塩の１種又は２種以上の水溶液であ
る請求項１、２又は３記載の酵素の製造方法。