JPH04183391A - Heat-resistant carbamylase, gene coding the same and production of amino acid - Google Patents

Heat-resistant carbamylase, gene coding the same and production of amino acid

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JPH04183391A
JPH04183391A JP2307221A JP30722190A JPH04183391A JP H04183391 A JPH04183391 A JP H04183391A JP 2307221 A JP2307221 A JP 2307221A JP 30722190 A JP30722190 A JP 30722190A JP H04183391 A JPH04183391 A JP H04183391A
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amino acids
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carbamyl
carbamylase
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Yukio Mukohara
行雄 向原
Takahiro Ishikawa
高広 石川
Takeshi Watabe
健 渡部
Hiroaki Nakamura
浩昭 中村
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Nippon Soda Co Ltd
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Abstract

PURPOSE:To efficiently produce a highly pure L-amino acid by hydrolyzing an N-carbamoyl-L-amino acid in the presence of a specific heat-resistant carbamylase. CONSTITUTION:An N-carbamoyl-L-amino acid is hydrolyzed in the presence of a heat-resistant carbamylase (NSP-HAI) having an amino acid sequence of formula I to produce an L-amino acid. A DNA fragment containing the gene used in the method can be prepared from a thermophilic bacterium having an ability to convert the N-carbamoyl-L-amino acid into the L-amino acid. The production of the L-amino acid from the N-carbamoyl-L-amino acid in the presence of the purified enzyme protein permits to give the L-amino acid highly reduced in the content of contaminants. Many kinds of L-amino acids can be produced by hydrolyzing many kinds of N-carbamoyl-L-amino acids.

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はＮ−カルバミル−し−アミノ酸から対応するＬ
−アミノ酸を製造する方法に関する。　Ｌ−アミノ酸は
飼料添加剤、食品添加剤、医薬品等の原料として広く利
用されている。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to the production of N-carbamyl-amino acids to the corresponding L-amino acids.
-Relating to a method for producing amino acids. L-amino acids are widely used as raw materials for feed additives, food additives, pharmaceuticals, and the like.

［従来の技術］ 従来、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−アミノ酸又はＮ−カルバ
ミル−Ｌ−アミノ酸を微生物又はその微生物を処理して
得られる酵素により、Ｌ−アミノ酸に転換する方法につ
いて多くの特許が出願されている（特開昭　６１−９２
９３号）。これ等はいずれも使用している微生物の当該
酵素の生成量か少なく、反応に長時間を要し、また大型
の設備を要する。[Prior Art] Conventionally, many patents have been applied for methods for converting N-carbamyl-DL-amino acids or N-carbamyl-L-amino acids into L-amino acids using microorganisms or enzymes obtained by treating the microorganisms. (Unexamined Japanese Patent Publication No. 1983-1992)
No. 93). In all of these methods, the amount of the enzyme produced by the microorganism used is small, the reaction takes a long time, and large-scale equipment is required.

これ等に対し、遺伝子組換え技術による酵素生成量を増
大する試みか行われ、それなりに成果を得たと推定され
る（特開昭　６３−２４８９４号）。In response to these problems, attempts have been made to increase the amount of enzyme produced using genetic recombination technology, and it is estimated that some results have been achieved (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-24894).

［この発明か解明しようとする課題］ 従来のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸変換能を有する微
生物では酵素生産量か少なかった。また、遺伝子組換え
の技術により酵素タンパク質の生産量を高めても、耐熱
性が低く、至適ｐＨか中性付近にあることから、使用し
得る条件下では生成するＬ−アミノ酸の溶解度が低く、
効率的な高濃度条件のアミノ酸の生産は期待できないも
のであった。[Problems to be solved by this invention] Conventional microorganisms having the ability to convert N-carbamyl-L-amino acids produced only a small amount of enzyme. Furthermore, even if the production of enzyme proteins is increased through genetic recombination technology, the L-amino acids produced have low solubility under usable conditions because they have low heat resistance and are located at an optimum pH or near neutrality. ,
Efficient production of amino acids under high concentration conditions could not be expected.

本発明はこの様な課題を解決するために、Ｎ−カルバミ
ル−し−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する能力を持つ
好熱性菌から変換能に関与している遺伝子をクローニン
グし、遺伝子増幅、転写、翻訳効率を高めることにより
、耐熱性のＮ−カルバミル−し−アミノ酸変換酵素タン
パク質を大量に得ることを目的とするものである。In order to solve such problems, the present invention clones a gene involved in the conversion ability from a thermophilic bacterium that has the ability to convert N-carbamyl-di-amino acids into L-amino acids, and performs gene amplification and transcription. The purpose is to obtain a large amount of heat-stable N-carbamyl-amino acid converting enzyme protein by increasing translation efficiency.

これらの技術により、高濃度のＮ−カルバミル−し−ア
ミノ酸と酵素タンパク質を反応させることか可能となり
、高純度のＬ−アミノ酸生産の経済性の飛躍的な上昇か
期待出来るものである。These techniques make it possible to react highly concentrated N-carbamyl-amino acids with enzyme proteins, and are expected to dramatically increase the economic efficiency of producing highly purified L-amino acids.

［課題を解決しようとする手段］ 本発明は （１）　　第３図で示されるアミノ酸配列を有すること
を特徴とする、Ｎ−カルバミル−し−アミノ酸を対応す
るＬ−アミノ酸に変換する能力を持つ耐熱性カルハミラ
ーセ（ＮＳＰ−ＨＡＩ）であり、（２）　これをコート
する塩基配列からなるＤ　Ｎ　Ａ断片（第２図の３２０
番目から１５４９番目の塩基配列：　Ｎ５Ｇ−ＨＡ　１
）であり、 （３）　耐熱性力ルバミラーセ（ＮＳＰ−ＨＡＩ）の存
在下にＮ−カルバミル−し−アミノ酸を加水分解するこ
とを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法である。[Means for Solving the Problems] The present invention provides (1) an amino acid having the amino acid sequence shown in FIG. It is a heat-stable calhamylase (NSP-HAI), and (2) a DNA fragment consisting of the base sequence that coats it (320 in Figure 2).
Base sequence from 1549th to 1549th: N5G-HA 1
), and (3) a method for producing L-amino acids, characterized by hydrolyzing N-carbamyl-amino acids in the presence of heat-stable lubamilase (NSP-HAI).

以下に本発明について具体的に説明する。The present invention will be specifically explained below.

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片は、Ｎ−カルバ
ミル−し−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する能力を持
つ好熱性細菌から調製することが出来る。A DNA fragment containing a gene used in the present invention can be prepared from thermophilic bacteria that have the ability to convert N-carbamyl-amino acids into L-amino acids.

神奈川床の中周温泉の土壌から分離した、バチルス属細
菌Ｎ５１１２２Ａ菌（微工研条寄第３１５４号：ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−３１５４）は、６０℃から７０℃で良く生
育し、且つ、Ｎ−カルバミル−し−アミノ酸をＬ−アミ
ノ酸に変換する能力を持つ好熱性細菌である。このＮ５
１１２２．Ａ菌の全ＤＮＡを単離し、遺伝子供給源とし
た。Bacillus N51122A bacteria isolated from the soil of Kanagawadoko Nakashu Onsen (Feikoken Joyori No. 3154: FER
MBP-3154) is a thermophilic bacterium that grows well at 60°C to 70°C and has the ability to convert N-carbamyl-amino acids to L-amino acids. This N5
1122. The total DNA of Bacterium A was isolated and used as a gene source.

本発明に用いるベクターＤＮＡとしては、宿主細胞内で
自律増殖できるものであれば何れのものでもよいが、酵
素生産量を高めるためにコピー数の多いもの及び強いプ
ロモーター構造を持つものなどが使用出来る。例えば、
大腸菌を宿主細胞とする場合、プラスミドｐＵｃ１９な
どがベクターＤＮＡとして使用できる。The vector DNA used in the present invention may be any DNA as long as it can autonomously propagate within the host cell, but vector DNA with a large number of copies or with a strong promoter structure can be used in order to increase enzyme production. . for example,
When using Escherichia coli as the host cell, plasmid pUc19 or the like can be used as vector DNA.

Ｎ５ｌ１２２Ａ菌の全ＤＮＡを制限酵素によって消化し
、これをベクターＤＮＡにＤＮＡリガーセにより、ライ
ゲーションすることにより組換体プラスミドＤＮＡを得
ることが出来る。例えば制限酵素Ｍｂｏｌで部分消化し
た全ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化したプラスミド
ｐＵＣ１９に連結することが出来る。Recombinant plasmid DNA can be obtained by digesting the total DNA of the N5l122A bacterium with restriction enzymes and ligating it to vector DNA using DNA ligase. For example, total DNA partially digested with the restriction enzyme Mbol can be ligated to plasmid pUC19 digested with the restriction enzyme BamHI.

組換体プラスミドＤＮＡの中から目的の遺伝子を持つも
のを選択するには、組換体プラスミドＤＮＡを用いて大
腸菌なとの宿主微生物を形質転換し、Ｎ−カルバミル−
Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源とする寒天培地にまけばよ
い。例えば、Ｎ−カルバミル−Ｌ−メチオニンを唯一の
窒素源として使用できる。To select a gene of interest from recombinant plasmid DNA, a host microorganism such as E. coli is transformed with the recombinant plasmid DNA, and N-carbamyl-
It can be spread on an agar medium containing L-amino acids as the sole nitrogen source. For example, N-carbamyl-L-methionine can be used as the sole nitrogen source.

この際宿主微生物はアミノ酸なとの栄養要求性の無いも
のが望ましい。In this case, the host microorganism is preferably one that does not have nutritional requirements for amino acids.

目的の遺伝子を含む組換体ＤＮＡを持つ微生物は、Ｎ−
カルバミル−Ｌ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する際
に生成するアンモニウムイオンを窒素源として利用し、
上記の寒天培地で生育し、コロニーを形成するので容易
に分離できる。Microorganisms with recombinant DNA containing the gene of interest are N-
Utilizing ammonium ions generated when converting carbamyl-L-amino acids to L-amino acids as a nitrogen source,
It grows on the above-mentioned agar medium and forms colonies that can be easily isolated.

宿主微生物として生育温度の高いもの、即ち目的の酵素
の至適温度付近で生育するものが望ましいが、大腸菌な
どのように３０℃から３７８Ｃでよく生育するものでも
、長期間の保温によって目的遺伝子を持つ形質転換株を
得ることか出来る。As a host microorganism, it is desirable to use a host microorganism with a high growth temperature, that is, one that grows near the optimum temperature for the target enzyme, but even if it grows well at 30°C to 378°C, such as Escherichia coli, it is difficult to grow the target gene by keeping it warm for a long period of time. It is possible to obtain transformed strains that have the following properties.

本発明に於いては、宿主微生物として大腸菌ＪＭ１０３
を、ベクターＤＮＡとしてプラスミドｐＵＣ１９を用い
た。２週間から４週間保温することにより選択培地上に
コロニーか形成される。アンピンリン耐性を指標として
形質転換株を培養し、培養菌体を用いてＮ−カルバミル
−Ｌ−アミノ酸を対応するＬ−アミノ酸に変換する能力
及びプラスミドＤ　Ｎ　Ａの確認を行うことにより、目
的の酵素遺伝子かクローニングされた形質転換株及びそ
のプラスミドＤＮＡを選定することか出来る。　アンピ
シリン耐性であり、プラスミドＤＮＡを含んでおり、更
にＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を対応するＬ−アミノ
酸に変換する能力を持つ形質転換株を数十採得ることか
出来、例えばこのうちの−菌株から調製したプラスミド
ｐＡＨＡＯ８は約５キロ塩基対の挿入ＤＮＡを持ってい
た。　フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー
などの疎水性カラム、ＤＥＡＥセファロースなどのイオ
ン交換カラム、ゲル濾過カラムなどを組み合わせること
により、形質転換株の培養菌体より本酵素タンパク質を
精製することが出来る。In the present invention, Escherichia coli JM103 is used as the host microorganism.
, plasmid pUC19 was used as vector DNA. Colonies are formed on the selection medium by keeping it warm for 2 to 4 weeks. By culturing the transformed strain using ampinrin resistance as an indicator and confirming the ability to convert N-carbamyl-L-amino acids into the corresponding L-amino acids and the plasmid DNA using the cultured cells, the desired enzyme can be obtained. It is possible to select a transformed strain in which the gene has been cloned and its plasmid DNA. It is possible to obtain several dozen transformed strains that are resistant to ampicillin, contain plasmid DNA, and have the ability to convert N-carbamyl-L-amino acids to the corresponding L-amino acids. Plasmid pAHAO8 prepared from pAHAO8 had an insert DNA of approximately 5 kilobase pairs. By combining a hydrophobic column such as phenyl Sepharose column chromatography, an ion exchange column such as DEAE Sepharose, a gel filtration column, etc., the present enzyme protein can be purified from the cultured cells of the transformed strain.

精製した本酵素タンパク質の分子量は約４４．。The molecular weight of the purified enzyme protein is approximately 44. .

００てあり、至適温度は約６０℃であり、また、至適ｐ
ＨはｐＨ８，５付近であった。00, the optimum temperature is about 60℃, and the optimum p
The pH was around 8.5.

また、精製した本酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列
分析を行い、ｋｌ−［−Ｑ−Ｇ−Ｅ−であることを明ら
かにした。Furthermore, the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme protein was analyzed and revealed to be kl-[-Q-G-E-.

いくつかの組換体プラスミドＤＮＡについて制限酵素地
図を作製することにより、制限酵素を使用した様々な欠
失変異プラスミドを作製することか出来る。それらを用
いて大腸菌を形質転換し、培養菌体のＮ−カルバミル−
し−アミノ酸変換能を試験することにより、酵素遺伝子
のおおよその位置を知ることか出来る。例えば、ｐＡＨ
ＡＯ８の酵素遺伝子は、ｓｔＩ側の約１．７キロ塩基対
の範囲内に存在した。By creating restriction enzyme maps for several recombinant plasmid DNAs, various deletion mutant plasmids can be created using restriction enzymes. E. coli was transformed using these, and the cultured cells were transformed into N-carbamyl-
By testing the amino acid conversion ability, the approximate location of the enzyme gene can be determined. For example, pAH
The AO8 enzyme gene was present within about 1.7 kilobase pairs of the stI side.

この領域を含むＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１９ファージな
どにサブクローニングすることにより塩基配列を決定す
ることが出来る。例えばｐＡＨＡＯ８のＰｓｔＩからＫ
ｐｎｌの約２．７キロ塩基対のＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩ
及びＰｓｔＴで消化したＭ１３ｐｍＩ９にサブクローニ
ングする方法がある。これをＥｘｏＩＩ’Ｉ　　Ｎｕｃ
ｌｅａｓｅを用いて様々な大きさに縮め、ジデオキシ法
により塩基配列を決定した。The base sequence can be determined by subcloning a DNA fragment containing this region into M13mp19 phage or the like. For example, from PstI of pAHAO8 to K
The approximately 2.7 kilobase pair DNA fragment of pnl was converted into KpnI.
There is also a method of subcloning into M13pmI9 digested with PstT. This is ExoII'I Nuc
It was reduced to various sizes using lease, and the base sequence was determined using the dideoxy method.

塩基配列とＮ末端アミノ酸配列の分析結果より、４０９
個のアミノ酸から成る分子量４４，２４８のタンパク質
をコートし得るオープンリーディングフレームか存在す
ることか明らかになった。このタンパク質は精製された
酵素の分子量とも一致し、本オープンリーディングフレ
ームか目的のＮ−カルバミル−し−アミノ酸変換酵素の
遺伝子であることか判明した。第２図に本遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の塩基配列を示した。本遺伝子はＴＴＧ　（
ｆＭｅ　ｔ）を開始コドンとしＴＡＡを終止コドンとす
る第３２０番目の塩基から１５４９番目までの塩基配列
である。Based on the analysis results of the base sequence and N-terminal amino acid sequence, 409
It has been revealed that there is an open reading frame that can coat a protein with a molecular weight of 44,248 and consisting of 1,000 amino acids. The molecular weight of this protein matched that of the purified enzyme, and it was determined that this open reading frame was the gene for the desired N-carbamyl-amino acid converting enzyme. Figure 2 shows the base sequence of the DNA fragment containing this gene. This gene is TTG (
This is the base sequence from the 320th base to the 1549th base with fMet) as the start codon and TAA as the stop codon.

開始コドンの上流には典型的な１６ｓリボゾ一ムＲＮＡ
結合配列か存在する（第２図、３０９−ＧＧＡＧＧ−３
１４）。この様にＴＴＧを開始コドンとする遺伝子につ
いては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａの
β−１ａｃｔ’ａｍａｓｅ　（Ｊ。Upstream of the start codon is a typical 16s ribosomal RNA.
There is a binding sequence (Figure 2, 309-GGAGG-3
14). As for the gene having TTG as the start codon, for example, β-1act'amase of Bacillus polymyxa (J.

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　、１６９．　　１５６４〜１
５７０　（１９８７）Ｋａｗａｚｕ　　ｅｔ　　ａｔ、
）などいくつか報告されている。また、第３図に本遺伝
子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の配列を
示した。Bacteriol, , 169. 1564-1
570 (1987) Kawazu et at,
) have been reported. Furthermore, FIG. 3 shows the amino acid sequence of the protein encoded by this gene.

さらに、本遺伝子の上流に大胆菌のプロモーター様の配
列か見いだされた（第２図、２４２−ＴＴＧＡＡＡ−２
４７：−３５領域、２６５−ＴＡＴＡＡＴ−２７０ニー
１０領域）。酵素遺伝子を持つプラスミドの内、いくつ
かはｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの方向と逆の方向
に挿入されており、また、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
カラクトピラノント（ＩＰＴＧ）の添加の有無に関わら
す酵素タンパク質を発現した。ＮＳ１．１２２Ａ菌由来
のこのプロモーター配列か大腸菌のポリメラーゼにより
認識され、転写が行われているものと考えるのが妥当で
ある。In addition, a promoter-like sequence of Bacillus boldis was found upstream of this gene (Fig. 2, 242-TTGAAA-2
47:-35 area, 265-TATAAT-270 knee 10 area). Some of the plasmids containing enzyme genes were inserted in the direction opposite to that of the lac promoter in pUC19, and some were inserted in the direction opposite to that of the lac promoter in pUC19. expressed the enzyme protein. It is reasonable to assume that this promoter sequence derived from the NS1.122A bacterium is recognized by E. coli polymerase and transcription is performed.

即ち、これらの組換体プラスミドはＩ　ＰＴＧなどの転
写誘導剤の添加を必要とせず、この酵素タンパク質を発
現するものである。That is, these recombinant plasmids express this enzyme protein without requiring the addition of a transcription inducer such as IPTG.

合成ヌクレオチドによる部位特異的変異技術等を利用す
ることによって、プロモーター配列から開始コドン付近
の領域を改良することにより、この酵素タンパク質の発
現量をさらに増大させることか出来る。また、現在では
様々な発現用プラスミドか知られておりそれらのプラス
ミドに連結することによっても発現量を増大させること
か出来る。The expression level of this enzyme protein can be further increased by improving the region from the promoter sequence to the vicinity of the start codon by using site-specific mutagenesis techniques using synthetic nucleotides. Furthermore, various expression plasmids are currently known, and the expression level can be increased by ligation to these plasmids.

この酵素タンパク質を発現した形質転換株の培養菌体を
そのままＮ−カルバミル−し−アミノ酸溶液に懸濁し、
Ｌ−アミノ酸を生産することが出来る。The cultured cells of the transformed strain expressing this enzyme protein were directly suspended in an N-carbamyl-amino acid solution,
Can produce L-amino acids.

しかし、本酵素の至適温度は約６０℃であり、この条件
で変換反応を行うと宿主大腸菌の外膜タンパク質等の変
性により大腸菌自身の持つアミノ酸、タンパク質、脂質
等の夾雑物が反応液中に混入してしまうので、変換酵素
を精製した後、使用することか好ましい。However, the optimum temperature for this enzyme is approximately 60°C, and if the conversion reaction is carried out under these conditions, the E. coli's own amino acids, proteins, lipids, and other contaminants will be released into the reaction solution due to the denaturation of the host E. coli's outer membrane proteins. It is preferable to use the converting enzyme after purifying it.

精製した酵素タンパク質を用いて、Ｎ−カルバミル−し
−アミノ酸からＬ−アミノ酸の生成を行うことにより、
夾雑物の非常に少ないＬ−アミノ酸を得ることか出来る
。第１表に変換反応の結果を示した。多種のＮ−カルバ
ミル−し−アミノ酸を加水分解し、Ｌ−アミノ酸を生成
出来る。By producing L-amino acids from N-carbamyl-cyclo-amino acids using purified enzyme proteins,
It is possible to obtain L-amino acids with very few contaminants. Table 1 shows the results of the conversion reaction. Various N-carbamyl-amino acids can be hydrolyzed to produce L-amino acids.

［実施例］ 次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明する。[Example] Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples.

実施例１．　バチルス属細菌ＮＳ］１２２Ａ菌（ＦＥＲ
〜ＩＢＰ−３１５４）の全り入Ａの調製１００ｍ１のＬ
Ｂ培地（１，０％　Ｔｒｉｐｔ。Example 1. Bacillus NS] 122A (FER
~ IBP-3154) preparation of all A 100ml L
B medium (1.0% Tript.

ｎ、０．５％　Ｙｅａｓｔ　　Ｅｘｔｒａｃｔ。n, 0.5% Yeast Extract.

１．０％　ＮａＣ１、ｐＨ７，４）にバチルス属細菌Ｎ
５１１２２Ａ菌を植菌し、４２°Ｃにて一晩振盪培養し
た（１．９２　０Ｄ６６０／ｍｌ）。遠心により集菌し
、ｌｏｍｌの１．Ｏｍ〜ｉ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＸ　１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｌｏｍＮ’ｌ　　ＮａＣ１，５０ｍ
ｇ／ｍｌ　　リゾチーム、ｐＨ８，０溶液に懸濁し、３
７度Ｃにて１０分間保温した。これに１ｍｌの１０％　
ＳＤＳを加え、更に３７℃にて１０分間保温した。1.0% NaCl, pH 7.4) with Bacillus bacteria N
51122A bacteria were inoculated and cultured with shaking at 42°C overnight (1.92 0D660/ml). Bacteria were collected by centrifugation, and 1.0ml of loml was collected. Om~i Tris-HCIX 1
mM EDTA, lomN'l NaCl, 50m
g/ml lysozyme, suspended in pH 8.0 solution,
It was kept warm at 7 degrees Celsius for 10 minutes. Add this to 1ml of 10%
SDS was added and the mixture was further incubated at 37°C for 10 minutes.

２２０ｕｌの５Ｍ　　ＮａＣ１を加えた後、等量のＴＥ
　　Ｂｕｆｆｅｒ　（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で飽和したフェノールを
加え緩やかに撹拌後、遠心した（フェノール抽出）。Ｄ
ＮＡを含む水相を別の容器に移し、同様にフェノール抽
出を繰り返した。更に、ＴＥ　　Ｂｕｆｆｅｒで飽和し
たフェノール・クロロホルム（Ｉ：ｌ）による抽出、ク
ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：　１）によ
る抽出を繰り返した。抽出後、ＤＮＡを含む水相を１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０
ｍＭ　　ＮａＣ１，ｐＨ８゜０を用いて透析した。透析
後、５０ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌ　　ＲＮａｓｅＡを加え
、３７°Ｃにて２時間保温し、更に２５ｕ１の２０ｍｇ
／ｍｌのプロテアーゼＫを加え、３７℃にて１時間保温
した。Add 220ul of 5M NaCl followed by equal volume of TE
Buffer (10mM Tris-HCI,
Phenol saturated with 1mM EDTA, pH 8) was added, gently stirred, and then centrifuged (phenol extraction). D
The aqueous phase containing NA was transferred to another container, and the phenol extraction was repeated in the same manner. Furthermore, extraction with phenol/chloroform (I:l) saturated with TE Buffer and extraction with chloroform:isoamyl alcohol (24:1) were repeated. After extraction, the aqueous phase containing the DNA was
mM Tris-HCI, 1mM EDTA, 10
Dialysis was performed using mM NaCl, pH 8.0. After dialysis, add 50ul of 10mg/ml RNaseA, keep warm at 37°C for 2 hours, and add 25ul of 20mg
/ml of protease K was added and kept at 37°C for 1 hour.

フェノール抽出・フェノール／クロロホルム抽出・クロ
ロホルム／イソアミルアルコール抽出を行った後、２倍
鳳のエタノールを加え、ガラス棒でゆるやかに撹拌し、
巻き付けることにより、ＤＮＡを回収した。これを３ｍ
ｌのＴＥ　　Ｂｕｆｆｅｒに溶解した後、ＴＥ　　Ｂｕ
ｆｆｅｒを用いて透析した。After performing phenol extraction, phenol/chloroform extraction, and chloroform/isoamyl alcohol extraction, add 2 times the amount of ethanol and gently stir with a glass rod.
DNA was recovered by winding. This is 3m
After dissolving in l of TE Buffer, TE Bu
Dialysis was performed using ffer.

このＤＮＡ溶液の吸光度を測定したところ、０Ｄ２６０
１０Ｄ２８０＝１．７７であった。これをＮ５１１２２
Ａ菌の全ＤＮＡ標品として組換体の作製に用いた。When the absorbance of this DNA solution was measured, it was found to be 0D260
10D280=1.77. This is N51122
It was used as a total DNA preparation of Bacterium A for the production of recombinants.

実施例２．　組換体プラスミドの作製 実施例１．て得られたＮ５１１２２Ａ菌の全ＤＮＡ４．
５ｕｇを０．３６単位の制限酵素ＭｂｏＩを用い、３７
℃で１時間処理することにより部分消化した。フェノー
ル抽出・フェノール／クロロホルム抽出を行った後、エ
タノール沈澱し、組換体の作製に用いた。Example 2. Preparation of recombinant plasmid Example 1. Total DNA of N51122A bacteria obtained by 4.
Using 0.36 units of restriction enzyme MboI, 5ug was added to 37
Partial digestion was performed by treatment for 1 hour at °C. After performing phenol extraction and phenol/chloroform extraction, ethanol precipitation was performed and used for production of recombinant.

別に２ｕｇのプラスミドｐＵｃ１９を５０単位の制限酵
素ＢａｍＨＩて消化した後、アルカリフォスファターセ
で処理した。フェノール抽出・フェノール／クロロホル
ム抽出を行った後、エタノール沈澱し、ｐＵｃ１９ヘク
ターＤＮＡ断片を調製した。Separately, 2 ug of plasmid pUc19 was digested with 50 units of restriction enzyme BamHI, and then treated with alkaline phosphatase. After phenol extraction and phenol/chloroform extraction, ethanol precipitation was performed to prepare a pUc19 hector DNA fragment.

両者をライゲーションキット（宝酒造）を用いて、常法
に従ってＤＮＡを結合させ、様々な挿入ＤＮＡを持つ組
換体プラスミドを作製した。Both DNAs were ligated using a ligation kit (Takara Shuzo) according to a conventional method to produce recombinant plasmids having various inserted DNAs.

実施例３．　　目的遺伝子組換体の選定実施例２．で得
られた組換体プラスミド溶液を用い、常法に従って大腸
菌ＪＭ１０３を形質転換し、選択培地（６ｇ／ｌ　　Ｎ
ａ２ＨＰＯ４，３ｇ　／　ＩＫ８２ＰＯ４，０，５ｇ／
ｌ　　ヘａｃｌ、０．１％Ｎ−カルバミル−Ｌ−メチオ
ニン、０．２％　Ｇ１ｙｃｅｒｏ１．２ｍ〜ｌＭｇＳＯ
４、Ｏ，１ｍＭＣａＣｌ　　２．０．００１％　Ｍ　ｎ
　Ｓ　Ｏ４，０，０００１％　　ＦｅＳＯ４、ｌｕｇ／
ｍｌ　　　Ｔｈｉａｍｉｎｅ、１．６％　Ａｇａ　ｒ、
ｐＨ７，４）にまいた。３０℃で２週間から４週間保温
したところ数十個のコロニーが形成された。これらをＬ
Ｂａｍｐ培地（１，０％　Ｔｒｙｐｔｏｎ、　０．５％
　Ｙｅａｓｔ　　Ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％　ＮａＣ１
，５０ｍｇ／ｌ　　Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）を用いて培養
し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌法により調製した
。Example 3. Example 2 of selection of target genetic recombinant. Escherichia coli JM103 was transformed using the recombinant plasmid solution obtained in the conventional method, and selective medium (6 g/l N
a2HPO4,3g / IK82PO4,0,5g/
l hair acl, 0.1% N-carbamyl-L-methionine, 0.2% Glycero1.2m~lMgSO
4, O, 1mM CaCl 2.0.001% Mn
SO4, 0,0001% FeSO4, lug/
ml Thiamine, 1.6% Agar,
Sowed at pH 7.4). When kept at 30°C for 2 to 4 weeks, several dozen colonies were formed. These are L
Bamp medium (1.0% Trypton, 0.5%
Yeast Extract, 1.0% NaCl
, 50 mg/l Ampicilin), and plasmid DNA was prepared by alkaline lysis.

得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭＩ０５を
形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして、いて培養
し、遠心により集菌した。培養液の１／１０量の１％　
Ｎ＝カルバミル−し−メチオニン（０，２Ｍ　　ＮＨ４
０Ｈ−ＮＨ２Ｃｌ　　Ｂｕｆｆｅｒ。Escherichia coli JMI05 was transformed using the obtained plasmid DNA, cultured using ampicillin resistance as an indicator, and the cells were collected by centrifugation. 1% of 1/10 volume of culture solution
N=carbamyl-methionine (0,2M NH4
0H-NH2Cl Buffer.

ｐＨ８，５）に懸濁し、６０℃で５時間保温した。pH 8.5) and kept at 60°C for 5 hours.

−遠心上清２ｕｌを薄層クロマトグラフィーにより分析
し、Ｎ−カルバミル−し−メチオニンが消失し、Ｌ−メ
チオニンが生成していることを確かめた。- 2 ul of the centrifugal supernatant was analyzed by thin layer chromatography, and it was confirmed that N-carbamyl-methionine had disappeared and L-methionine had been produced.

また別に培養菌体よりアルカリ溶菌法によってプラスミ
ドＤＮＡを調製し、ｐＡＨＡｏ　１，０２・・・と命名
した。このうちプラスミドｐＡ、ＨＡＯ８は約５キロ塩
基対の挿入ＤＮＡを持っていた。Separately, plasmid DNA was prepared from the cultured bacterial cells by the alkaline lysis method and named pAHAo 1,02.... Among these, plasmids pA and HAO8 had an inserted DNA of approximately 5 kilobase pairs.

プラスミドｐＡＨＡＯ８で形質転換した大腸菌ＪＭ１０
５を、微工研に微工研条寄第３１５５号、ＦＥＲ〜ｒ　
　ＢＰ−３１５５）として寄託した。E. coli JM10 transformed with plasmid pAHAO8
5 to FER-R, FER-r, FER-r.
BP-3155).

実施例４．　組換体Ｎ−カルバミル−し−アミノ酸変換
酵素の精製 実施例３．で得られた形質転換株（ＦＥＲ〜ＩＢＰ−３
１５５）をＬＢａｍｐ培地を用いて培養した。Example 4. Purification of recombinant N-carbamyl-amino acid converting enzyme Example 3. The transformed strain obtained in (FER~IBP-3
155) was cultured using LBamp medium.

遠心によって集菌し、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐＨ８，０に懸濁した後、ソニーケーションにより菌体
を破砕した。遠心により細胞破砕断片や不溶性タンパク
質を除去し、６０％飽和硫安よる沈澱を行った。沈澱物
を水で抽出し、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ　　カ
ラムクロマトグラフィーを行った。Collect bacteria by centrifugation, add 50mM Tris-HCI,
After suspending at pH 8.0, the bacterial cells were disrupted by sonication. Cell fragments and insoluble proteins were removed by centrifugation, followed by precipitation with 60% saturated ammonium sulfate. The precipitate was extracted with water and subjected to phenyl Sepharose CL-4B column chromatography.

５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０で洗浄後、
Ｈ２Ｏて溶出を行った。次に、活性画分をＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムクロマトグラフィーに負荷し、ＯＭから
０，６ＭのＮａＣ１（連続勾配）で溶出を行った。活性
画分をセファデックス　Ｇ−１００スーパーファインを
用いてゲル濾過を行った。After washing with 50mM Tris-HCI, pH 8.0,
Elution was performed with H2O. The active fraction was then loaded onto DEAE-cellulose column chromatography and eluted with 0.6 M NaCl (continuous gradient) from OM. The active fraction was subjected to gel filtration using Sephadex G-100 Superfine.

活性画分について５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気
泳動を行ったところ、分子量的４４，０００の単一のタ
ンパク質として精製されたことか確認された。　また、
精製された酵素のへ末端アミノ酸配列分析を行った結果
、Ｍ−Ｉ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−であることが分かった。When the active fraction was subjected to 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis, it was confirmed that it was purified as a single protein with a molecular weight of 44,000. Also,
Analysis of the terminal amino acid sequence of the purified enzyme revealed that it was M-I-Q-G-E-.

実施例５．　目的遺伝子のサブクローニングと塩基配列
の決定 実施例３．で得られたプラスミドｐＡＨＡＯ８をいくつ
かの制限酵素を用いて制限酵素地図を作製しく第１図）
、これに基づいて欠失変異プラスミドを作製し、Ｎ−カ
ルバミル−Ｌ−メチオニン変換能を調べた。この結果及
び他のプラスミドＤＮＡの制限酵素地図とを併せて検討
したところ、Ｂａ１ＩサイトよりＰｓｔＩ側約１．７キ
ロ塩基対の範囲に目的遺伝子か存在していることか分か
った。Example 5. Subcloning of target gene and determination of base sequence Example 3. A restriction enzyme map was created using several restriction enzymes for the plasmid pAHAO8 obtained in Figure 1).
Based on this, a deletion mutant plasmid was prepared and its N-carbamyl-L-methionine conversion ability was examined. When this result was examined together with restriction enzyme maps of other plasmid DNAs, it was found that the target gene was present within a range of about 1.7 kilobase pairs from the Ba1I site to the PstI side.

そこてプラスミドｐＡＨＡＯ８のＰｓ、ｔｌからＫｐｎ
ｌの約２．７キロ塩基対のＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１９
ファージに組換え、塩基配列の決定に用いた。キロンー
クエンスデレーションキット（宝酒造）を用いて様々な
大きさに縮め、ンーケネース（東洋紡）を用いてジデオ
キシ法により塩基配列を決定した。塩基配列とＮ末端ア
ミノ酸配列分析の結果より、４０９個のアミノ酸から成
る分子量４４，２４８のタンパク質をコートし得るオー
プンリーディングフレームか見つかった。第２図にオー
プンリーディングフレーム及びその近傍の塩基配列を示
した。Therefore, Ps, tl to Kpn of plasmid pAHAO8
The approximately 2.7 kilobase pair DNA fragment of M13mp19
It was recombined into a phage and used to determine the base sequence. They were reduced to various sizes using a Chiron-Quensure Delation Kit (Takara Shuzo), and the base sequences were determined by the dideoxy method using a Nkenase (Toyobo). Based on the results of base sequence and N-terminal amino acid sequence analysis, an open reading frame capable of coating a protein with a molecular weight of 44,248 consisting of 409 amino acids was found. Figure 2 shows the open reading frame and its surrounding nucleotide sequence.

オープンリーディングフレームはＴＴＧ　（ｆＭｅ　ｔ
）を開始コドンとし、ＴＡＡを終止コドンとする第３２
０番目の塩基から第１５４９番目までの塩基配列である
。オープンリーディングフレームにコードされるタンパ
ク質のアミノ酸配列を第３図に示した。The open reading frame is TTG (fMe t
) is the start codon, and TAA is the stop codon.
This is the base sequence from the 0th base to the 1549th base. The amino acid sequence of the protein encoded by the open reading frame is shown in FIG.

このタンパク質は精製された酵素の分子量ともよく一致
し、本オープンリーディングフレームが目的のＮ−カル
バミル−し−アミノ酸変換酵素の遺伝子であることか判
明した。また、このオープンリーディングフレームの上
流に大腸菌のプロモーター配列（第２図、２４２−ＴＴ
ＧＡＡＡ−２４７ニー３５領域、２６５−ＴＡＴＡＡＴ
−２７０ニー１０領域）及び、１６ｓリボゾームＲＮ　
Ａ結合配列に非常によく似た領域（第２図、３０９−Ｇ
ＧＡＧ（、−３１’４）が存在することか分かった。The molecular weight of this protein matched well with the purified enzyme, indicating that this open reading frame was the gene for the target N-carbamyl-amino acid converting enzyme. Additionally, an E. coli promoter sequence (Fig. 2, 242-TT
GAAA-247 knee 35 area, 265-TATAAT
-270 knee 10 region) and 16s ribosomal RN
A region very similar to the A-binding sequence (Fig. 2, 309-G
It was found that GAG (, -31'4) exists.

酵素遺伝子を持つプラスミドの内、いくつかはベクター
プラスミドｐＵｃ１９のｌａｃプロモーターの方向と逆
の方向に挿入されており、また、ＩＰＴＧの添加の有無
に関わらず酵素タンパク質を発現した。Ｎ５１１２２Ａ
菌白米のこのプロモーター配列が大腸菌のポリメラーゼ
により認識され、転写が行われているものと考えるのが
妥当である。即ち、これらの組換体プラスミドはＩＰＴ
Ｏなどの転写誘導剤の添加を必要とせす、この酵素タン
パク質を発現するものである。Among the plasmids containing the enzyme gene, some were inserted in the direction opposite to the direction of the lac promoter of the vector plasmid pUc19, and the enzyme protein was expressed regardless of the presence or absence of addition of IPTG. N51122A
It is reasonable to assume that this promoter sequence of the white rice fungus is recognized by the polymerase of E. coli and transcription is performed. That is, these recombinant plasmids are IPT
Expression of this enzyme protein requires the addition of a transcription inducer such as O.

実施例６．各種へ一力ルバミルーＬ−アミノ酸の変換実
施例４．て精製された酵素を用いて、至適温度、至適ｐ
Ｈについて試験したところ、至適温度は約６０℃であり
、また、至適ｐＨはｐＨ８，５付近であった。Example 6. Example 4: Conversion of lubamil-L-amino acids to various types. Using enzymes purified by
When tested for H, the optimum temperature was about 60°C, and the optimum pH was around pH 8.5.

また、種々のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を基質とし
た変換反応を行った。０．０５　０Ｄ２８０／ｍｌ　　
酵素タンパク質、５ｍｇ／ｍｌ　　（０，５９゜）　Ｎ
−カルバミル−し−アミノ酸、５ｍＭ　ＮｉＣｌ２　　
を含む　０．２Ｍ　　ＮＨ４０Ｈ−ＮＨ４Ｃ１ｂｕｆ　
ｆｅｒ　（ｐＨ８，５）を６０度Ｃにて２時間保温した
。この反応液を薄層クロマトグラフィーを用いて展開し
、ニンヒドリン反応によりアミノ酸の生成を確かめた。Conversion reactions using various N-carbamyl-L-amino acids as substrates were also carried out. 0.05 0D280/ml
Enzyme protein, 5mg/ml (0,59°) N
-Carbamyl-thi-amino acid, 5mM NiCl2
Contains 0.2M NH40H-NH4C1buf
fer (pH 8.5) was kept at 60 degrees C for 2 hours. This reaction solution was developed using thin layer chromatography, and the production of amino acids was confirmed by ninhydrin reaction.

その結果、アラニン・アルキニン・アスパラキン・グル
タミン酸・グリシジ・ヒスチジン・イソロイシン・ロイ
シン・メチオニンやフェニルアラニン・セリン・スレオ
ニン・チロシン・バリンなどのＬ−アミノ酸が生成した
ことを確かめた。As a result, it was confirmed that L-amino acids such as alanine, alkynine, asparaquine, glutamic acid, glycidi, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tyrosine, and valine were produced.

更に、０ＤＳ−８０Ｔ〜１カラム（東ソー）を用いて、
生成したいくつかのＬ−アミノ酸について分離、定Ｉし
た。その結果を第１表に示した。Furthermore, using 0DS-80T~1 column (Tosoh),
Several L-amino acids produced were separated and determined. The results are shown in Table 1.

第１表。Table 1.

Ｎ−カルバミル−し−アミノ酸のアミノ酸への変換生成
アミノ酸　　　　　　　　　生成量ｍｇ／ｍｌ　　　モ
ル収率（％） Ｌ−７ラニン３．４　　　　１０Ｏ Ｌ−アスパラキン　　　　１．５　　　　　４０Ｌ−グ
ルタミン酸　　　　３．４　　　　　　　ｆ３ｆ３グリ
シン　　　　　　　　２．３　　　　　７２Ｌ−イソロ
イシン　　　　２．０　　　　　５３Ｌ−ロイシン　　
　　　　３，４　　　　　９　ＱＬ−メチオニン　　　
　　３．５　　　　　９ＱＬ−フェニルアラニン　　２
，１　　　　　５３Ｌ−セリン　　　　　　　２．４　
　　　　５７Ｌ−スレオニン　　　　　３．０　　　　
　　Ｂ　２゛　Ｌ−バリン３．７　　　　１００ また、０．２　０Ｄ２８０単位の酵素を用いて、１７．
５％濃度のＮ−カルバミル−し−メチオニンを基質とし
て変換反応を行ったところ、６０°Ｃ，１時間で全ての
基質をＬ−メチオニンに変換した。Conversion of N-carbamyl-thi-amino acid to amino acid Amino acid produced Amount mg/ml Molar yield (%) L-7 lanine 3.4 10O L-asparaquine 1.5 40L-glutamic acid 3.4 f3f3 glycine 2. 3 72L-isoleucine 2.0 53L-leucine
3,4 9 QL-methionine
3.5 9QL-phenylalanine 2
,1 53L-serine 2.4
57L-threonine 3.0
B 2゛ L-valine 3.7 100 Also, using 0.2 0D280 units of enzyme, 17.
A conversion reaction was carried out using 5% concentration of N-carbamyl-methionine as a substrate, and all the substrate was converted to L-methionine in 1 hour at 60°C.

［発明の効果］ 本発明によって、約６０°Ｃの至適温度、及び、ｐＨ８
，５付近に至適ｐＨを持つヘーカルハミルーＬ−アミノ
酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素タンパク質を大腸菌で
安定に生産させることが可能になった。また、その精製
酵素を用いた変換反応を行うことか可能となった。[Effect of the invention] According to the present invention, an optimum temperature of about 60°C and a pH of 8
It has now become possible to stably produce in E. coli an enzyme protein that converts hekalhamyl-L-amino acids into L-amino acids, which has an optimum pH around . It has also become possible to perform conversion reactions using the purified enzyme.

この結果、高濃度のＮ−カルバミル−し−アミノ酸と酵
素タンパク質を反応させることが可能となり、高純度の
Ｌ−アミノ酸を効率よ（生産させることが可能となった
。As a result, it became possible to react a high concentration of N-carbamyl-amino acid with an enzyme protein, and it became possible to efficiently produce highly purified L-amino acids.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図はプラスミドｐＡＨＡＯ８の制限酵素地図である
。 ：　ｐｕｃ　１９ ：挿入ＤＮＡ 酵素遺伝子のおおよその領域 第２図（１）、（２）及び（３）はオープンリーディン
グフレーム（耐熱性力ルバミラーセ：Ｎ５Ｐ−ＨＡＩを
コードする塩基配列　Ｎ　Ｓ　Ｃ−ＨＡ、　ｌ　）及び
その周辺の塩基配列を示す図である。 第３図はオープンリーディングフレームのアミノ酸配列
（耐熱性力ルバミラーセ・Ｎ５Ｐ−ＨＡＩ）を−文字記
号で示す図である。 出願人（４３０）日本曹達株式会社FIG. 1 is a restriction enzyme map of plasmid pAHAO8. : puc 19 : Insert DNA The approximate region of the enzyme gene in Figure 2 (1), (2) and (3) is the open reading frame (base sequence encoding thermostable lubamirase: N5P-HAI, NSC-HA, 1) and its surrounding base sequences. FIG. 3 is a diagram showing the amino acid sequence of the open reading frame (heat-stable lubamilase N5P-HAI) with a - letter symbol. Applicant (430) Nippon Soda Co., Ltd.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）下記のアミノ酸配列を有する耐熱性カルバミラー
ゼ。 アミノ酸配列 【遺伝子配列があります】(1) A thermostable carbamylase having the following amino acid sequence. Amino acid sequence [gene sequence is available] （２）特許請求の範囲第１項記載の耐熱性カルバミラー
ゼをコードする遺伝子。(2) A gene encoding the thermostable carbamylase according to claim 1. （３）特許請求の範囲第１項記載の耐熱性カルバミラー
ゼの存在下にＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を加水分解
することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法(3) A method for producing L-amino acids, which comprises hydrolyzing N-carbamyl-L-amino acids in the presence of the thermostable carbamylase described in claim 1.
JP2307221A 1990-11-15 1990-11-15 Heat-resistant carbamylase, gene coding the same and production of amino acid Pending JPH04183391A (en)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2728905A1 (en) * 1994-12-29 1996-07-05 Rhone Poulenc Nutrition Animal New stereospecific, heat-stable amino acid amidohydrolase

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