JPH04179497A - Monoclonal antibody specifically recognizing human carpine and hybridoma cell strain producing the same, and immunologically measuring method using the same - Google Patents
Monoclonal antibody specifically recognizing human carpine and hybridoma cell strain producing the same, and immunologically measuring method using the sameInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は、ヒトカルパインＩ特異認識モノクローナル
抗体とこれを産生ずるハイブリドーマ細胞株、ならびに
これを用いた免疫学的測定法に関するものである。さら
に詳しくは、この発明は、ヒトカルパイン■のモノクロ
ーナル抗体と、このモノクローナル抗体を特異的に産生
ずるハイブリドーマ細胞株、および筋肉疾患等の診断お
よび治療に有用なこのモノクローナル抗体を用いる生体
液中のカルパインＩの免疫学的測定法に関するものであ
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes human calpain I, a hybridoma cell line that produces the same, and an immunoassay method using the same. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody against human calpain, a hybridoma cell line that specifically produces this monoclonal antibody, and a method for preparing calpain in biological fluids using this monoclonal antibody, which is useful for the diagnosis and treatment of muscle diseases, etc. This invention relates to an immunoassay method for I.
（従来の技術）
Ｃａ”＋依存性システインエンドペプチターセであるカ
ルパインは種々の組織に普遍的に存在し、細胞の細胞質
に不活性前駆体として２種類存在する。これらの２種類
の酵素、カルパインＩおよびカルパイン■は、Ｃａ２＋
要求性を異にしたアイソザイムである。カルパイン前駆
体は、分子量８０にと３０にの２つのサブユニットから
なり、各サブユニットのカルモデユリン様Ｃａ２＋結合
領域にＣａ２＋が結合すると活性化される。カルノくイ
ンによって分解される基質蛋白質には、キナー七などの
細胞内酵素、ホルモン受容体やＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅ
などの膜蛋白質、スペクトリンなどの細胞骨格および関
連蛋白質、膜蛋白質等があり、カルパインは、これらの
蛋白質の崩壊現象と蛋白質機能のオン・オフ現象をひき
起こす。筋ジストロフィーなどの筋疾患でみられる骨格
筋崩壊は、カルパインが筋線維蛋白質の分解を通じて関
与していると考えられている。（石浦章−他、代謝臨時
増刊号「代謝病ハイライトＪ ２５．１９８８）。(Prior art) Calpain, which is a Ca''+-dependent cysteine endopeptidase, is ubiquitously present in various tissues, and exists in two types as inactive precursors in the cytoplasm of cells.These two types of enzymes, Calpain I and calpain ■ are Ca2+
These are isozymes with different requirements. Calpain precursor consists of two subunits with molecular weights of 80 and 30, and is activated when Ca 2+ binds to the calmodulin-like Ca 2+ binding region of each subunit. Substrate proteins degraded by carnoquine include intracellular enzymes such as quinar-7, hormone receptors, and Ca2+-ATPase.
There are membrane proteins such as spectrin, cytoskeletal and related proteins such as spectrin, membrane proteins, etc., and calpain causes the disintegration of these proteins and the on/off phenomenon of protein functions. Calpain is thought to be involved in the breakdown of skeletal muscle seen in muscle diseases such as muscular dystrophy through the decomposition of muscle fiber proteins. (Akira Ishiura et al., special issue of Metabolism "Metabolic Disease Highlights J 25.1988").
カルパイ■とカルパイン■は、生体内の各種組織に広く
分布しており、これらのアイソザイムは臓器または組織
によって存在量が異なり、また、病態等によっても分布
状態がそれぞれ特有に変化する。Calpai ■ and calpain ■ are widely distributed in various tissues in the living body, and the abundance of these isozymes differs depending on the organ or tissue, and the state of distribution changes uniquely depending on the pathological condition.
従って、各組織または生体液中のカルパイン■およびカ
ルパイン■を分別定量し、各々の分布状態を知ることに
より、カルパインの生理機能の把握や、さらには、筋肉
疾患等の診断が可能となる。Therefore, by separately quantifying calpain ■ and calpain ■ in each tissue or biological fluid and knowing the distribution state of each, it becomes possible to understand the physiological function of calpain and furthermore diagnose muscle diseases.
従来より、生体液中のカルパインを定量するためには、
酵素化学的な方法が用いられている。これは、たとえば
カルパインを含む検体をカセインを基質として一定の条
件下で反応させ、トリクロロアセティツクアシッド（Ｔ
ＣＡ）で反応を停止させた後、反応濾液中のペプチド量
を測定してカルパインの活性を決定することにより検体
中のカルパイン含有量を定量するというものである。Traditionally, to quantify calpain in biological fluids,
Enzyme-chemical methods are used. For example, a specimen containing calpain is reacted with casein as a substrate under certain conditions, and trichloroacetic acid (T
After stopping the reaction with CA), the amount of peptide in the reaction filtrate is measured to determine the activity of calpain, thereby quantifying the calpain content in the sample.
（発明が解決しようとする課題）
しかしながら、このような従来の定量法では、測定した
活性値がアイソザイムであるカルパイン■とカルパイン
Ｈのいずれの酵素活性によるのか区別することが不可能
であり、これを明らかにするためには、大量の検体中の
カルパインＩとカルパイン■をクロマトグラフィーによ
って分離する必要かあった。また、このような測定条件
下では、生体液中と異なり、カルパインのＣａ”＋要求
性や自己消化などが酵素活性に影響するという問題点を
有している。(Problem to be Solved by the Invention) However, with such conventional quantitative methods, it is impossible to distinguish whether the measured activity value is due to the enzymatic activity of the isozymes calpain ■ or calpain H; In order to clarify this, it was necessary to separate calpain I and calpain ■ in a large amount of specimens by chromatography. Furthermore, under such measurement conditions, unlike in biological fluids, there is a problem that calpain's Ca''+ requirement, autolysis, etc. affect enzyme activity.
このように、従来のカルパイン■の測定法の場合には、
検体中のカルパインＩの含有量を、生体中とは異なった
条件下での酵素活性により決定するために、測定値が不
正確であるという欠点があった。In this way, in the case of the conventional method for measuring calpain■,
Since the content of calpain I in the specimen is determined by enzyme activity under conditions different from those in the living body, there is a drawback that the measured value is inaccurate.
一般に、生体中の特定の生理活性物質を定量する場合、
その物質の抗体、とくにモノクローナル抗体が同定され
るならば、たとえば標識を結合したその抗体を検体に添
加することにより、目標とする物質を直接的に定量する
免疫学的測定が可能となる。しかしなから、これまでヒ
トカルパインＩに対する特異的なモノクローナル抗体は
存在しなかった。Generally, when quantifying a specific physiologically active substance in a living body,
If an antibody, particularly a monoclonal antibody, for the substance is identified, it becomes possible to directly quantify the target substance in an immunological assay by adding the antibody bound to a label to a sample, for example. However, until now there has been no specific monoclonal antibody against human calpain I.
この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもので
あり、これまで存在しなかったヒトカルパインＩのモノ
クローナル抗体を提供することを目的としている。また
この発明は、この七ツクローナル抗体を特異的に産生ず
るハイブリドーマ細胞株およびこのモノクローナル抗体
を用いるヒトカルパインＩの免疫学的測定法を提供する
ことを目的としている。This invention was made in view of the above circumstances, and aims to provide a monoclonal antibody for human calpain I, which has not existed heretofore. Another object of the present invention is to provide a hybridoma cell line that specifically produces this seven-clonal antibody and an immunoassay method for human calpain I using this monoclonal antibody.
（課題を解決するための手段）
この発明は、以上の課題を解決するものとして、抗原と
してヒトカルパインＩに特異的なアミノ酸配列部位を合
成したペプチドを免疫した哺乳動物より調製したリンパ
球と、ミエローマ細胞株とを融合したハイブリドーマか
ら産生されてなることを特徴とするヒトカルパインＩ特
異認識モノクローナル抗体を提供する。また、この発明
は、ヒトカルパインＩに特異的なアミノ酸配列部位を合
成したペプチドのアミノ酸配列が、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓ ｐ−Ｔ
ｙ ｒ−Ｇ ｌ ｙ−ｃｙ Ｓであることを好ましい態
様としている。(Means for Solving the Problems) The present invention solves the above problems by providing lymphocytes prepared from a mammal immunized with a peptide synthesized with an amino acid sequence site specific to human calpain I as an antigen; A monoclonal antibody that specifically recognizes human calpain I is provided, which is produced from a hybridoma fused with a myeloma cell line. This invention also provides that the amino acid sequence of the peptide synthesized with the amino acid sequence site specific to human calpain I is Asp-Glu-T.
hr-Asp-Asp-Pro-Asp-Asp-T
A preferred embodiment is y r-G ly-cy S.
さらにこの発明は、上記ヒトカルパインＩ特異認識モノ
クローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞株
と、このモノクローナル抗体を用いるヒトカルパインＩ
の免疫学的測定法を提供する。Furthermore, the present invention provides a hybridoma cell line capable of producing the human calpain I-specific monoclonal antibody, and a human calpain I
provides an immunoassay method for
以下、この発明について詳しく説明する。This invention will be explained in detail below.
この発明においては、ヒトカルパイン■のアミノ酸配列
から、カルパインＩに特異的な親水性の高いアミノ酸配
列部位を選択し、たとえばＡｓｐ−Ｇ ｌ ｕ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ｐ ｒ 。In this invention, a highly hydrophilic amino acid sequence site specific to calpain I is selected from the amino acid sequence of human calpain Ⅰ, for example, Asp-G l u-Th.
r-Asp-Asp-Pr.
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓからなるア
ミノ酸配列を有するペプチドを合成して抗原とし、これ
に対するモノクローナル抗体を調製する。このため、ヒ
トの生体液あるいは組織から直接カルパインを採取する
必要がなく、交差性の問題を解決し、カルパイン■を直
接的に定量することを可能にする。A peptide having an amino acid sequence consisting of -Asp-Asp-Tyr-Gly-Cys is synthesized and used as an antigen, and a monoclonal antibody against it is prepared. Therefore, there is no need to collect calpain directly from human biological fluids or tissues, solving the problem of cross-reactivity and making it possible to quantify calpain directly.
したがって、この発明のモノクローナル抗体は、上記の
通りのアミノ酸配列を有する合成ペプチド抗原を免疫し
た哺乳動物より調製したリンパ球と、ミエローマ細胞と
のハイブリドーマを選択、培養することにより得ること
かできるか、生産効率の点からは、上記ハイブリドーマ
のうち、カルパイン■に対するモノクローナル抗体を特
異的に産生ずる細胞を選別し、これをクローン化して細
胞株とした上で、この細胞株の培養によりヒトカルパイ
ン■のモノクローナル抗体を得るのか好ましい。Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by selecting and culturing hybridomas of myeloma cells and lymphocytes prepared from a mammal immunized with a synthetic peptide antigen having the amino acid sequence as described above. From the point of view of production efficiency, we selected cells that specifically produce monoclonal antibodies against calpain ■ from among the above hybridomas, cloned them into cell lines, and cultured these cell lines to produce human calpain ■. It is preferable to obtain monoclonal antibodies.
このような細胞株の作成とモノクローナル抗体の採取法
、およびそのモノクローナル抗体を用いるヒトカルパイ
ンＩの免疫学的測定法は以下の通り行うことができる。The method for creating such a cell line, collecting the monoclonal antibody, and the immunoassay method for human calpain I using the monoclonal antibody can be performed as follows.
（１） ヒトカルパインＩのモノクローナル抗体を特
異的に産生ずるハイブリドーマ細胞株の作成・
まず、ハイブリドーマを作成するため、ヒトカルパイン
Ｉ特異的アミノ酸配列部位合成ペプチド抗原に免疫した
哺乳動物のリンパ球と、これを融合させるミエローマ（
骨髄腫細胞）を用意する。(1) Creation of a hybridoma cell line that specifically produces a human calpain I monoclonal antibody First, in order to create a hybridoma, mammalian lymphocytes immunized with a synthetic peptide antigen having a human calpain I specific amino acid sequence site, Myeloma that fuses this (
Prepare myeloma cells).
このうち、上記リンパ球を採取するには、ます、ヒトカ
ルパインＩ特異的アミノ酸配列部位合成ペプチドと担体
タンパク質を共有結合させた複合体（以下、カルパイン
ニーキャリアと記載する）からなるカルパイン■抗原を
作成し、これを哺乳動物、好ましくはマウスまたはラッ
トに免疫する。In order to collect the lymphocytes mentioned above, first, a calpain antigen consisting of a complex of a synthetic peptide with a human calpain I-specific amino acid sequence and a carrier protein (hereinafter referred to as a calpain knee carrier) is used. and immunize a mammal, preferably a mouse or rat, with this.
抗原の使用量、投与部位、アジュバントの使用等、免疫
の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずればよい。例え
ば、マウスを用いる場合、マウス１匹あたり１回につき
０．００１−１０ ｍｇ、好ましくは０．０１−１ｍｇ
のカルパインニーキャリアを、初回はアジュバント（例
えば、フロイントの完全アジュバント）とよく混合して
、皮下、腹腔内等に投与し、２週間以上経過後、再びア
ジュバント（例えば、フロイントの不完全アジュバント
）をよく混合して、皮下、腹腔内等に投与する。さらに
、２週間以上経過後、カルパインニーキャリアのみを静
脈内、皮下、腹腔内等に投与して、十分免疫する。この
ようにして免疫された動物を、好ましくは最終免疫から
２〜４日後に殺し、リンパ球を採取する。リンパ球調製
には、肺臓、リンパ節、末梢血等が用いられる。このリ
ンパ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく。Immunization methods such as the amount of antigen to be used, the site of administration, and the use of adjuvants may be in accordance with conventional methods for obtaining antiserum. For example, when using mice, 0.001-10 mg per mouse, preferably 0.01-1 mg per dose.
For the first time, the calpain knee carrier is thoroughly mixed with an adjuvant (e.g., Freund's complete adjuvant) and administered subcutaneously, intraperitoneally, etc. After 2 weeks or more, the adjuvant (e.g., Freund's incomplete adjuvant) is administered again. Mix well and administer subcutaneously, intraperitoneally, etc. Furthermore, after two weeks or more have elapsed, the calpain knee carrier alone is administered intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, etc. to sufficiently immunize the animal. Animals thus immunized are sacrificed, preferably 2 to 4 days after the final immunization, and lymphocytes are harvested. For lymphocyte preparation, lungs, lymph nodes, peripheral blood, etc. are used. The lymphocytes are suspended in a culture medium.
一方、ミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のものを
使用することが好ましい。さらに、そのミエローマは薬
剤抵抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミエ
ローマかハイブリドーマ選択培地で生育しないものが好
ましい。最も一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞ラ
インか用いられる。これは、ヒポキサンチンーグアニン
ーホスホリボシルトランスフエラーセ（Ｈｙｐｏｘａｎ
ｔ ｉｎｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓ
ｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が欠損しており、選択
培地の一種ヒポキサンチンーアミノプテリンーチミジン
（ＨＡＴ）培地に生育できない。また、使用するミエロ
ーマ自身が抗体を分泌しないものが望ましい。以上の点
から、例えば、市販のマウスミエローマＰ３・Ｘ６３・
Ａｇ８・６・５・３（Ｘ６３・６・５・３）；Ｐ３・Ｘ
６３・Ａｇ８・Ｕｌ （Ｐ３Ｕ１） 、ラットミエロ
ーマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３等を用いるのが
好ましい。On the other hand, it is preferable to use myeloma derived from the same species as the immunized animal. Furthermore, the myeloma is preferably a drug-resistant mutant strain, and is preferably an unfused myeloma or one that does not grow on a hybridoma selection medium. Most commonly, 8-azaguanine resistant cell lines are used. This is hypoxanthin-guanine-phosphoribosyltransferase (Hypoxanthin-guanine-phosphoribosyltransferase).
t inguanine phosphoribos
yl transferase) and cannot grow on hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium, a type of selective medium. In addition, it is desirable that the myeloma used itself does not secrete antibodies. From the above points, for example, commercially available mouse myeloma P3, X63,
Ag8.6.5.3 (X63.6.5.3); P3.X
It is preferable to use 63.Ag8.Ul (P3U1), rat myeloma 210.RCY3.Agl.2.3, and the like.
このミニ−ローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含有
するイーグル最少培地（Ｍ Ｅ Ｍ）、ＲＰＭ１１６４
０培地（ＲＰＭ Ｉ １６４０）等の培地中で培養する
。The mini-Roma was cultured in Eagle's minimal medium (MEM) containing serum, preferably fetal bovine serum, RPM1164.
0 medium (RPM I 1640) or the like.
次に、ＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４０等の培地に上記で得た
リンパ球およびミエローマを各々懸濁し、混合する。こ
のときの混合比は任意に選択できるが、好ましくはリン
パ球：ミエローマが細・胞数で１：１〜２０：１、好ま
しくは５：４−ｔｏ：１の比率を用いればよい。混合し
た細胞は、融合促進剤を用いて融合を行う。融合方法と
しては、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｖｏｌ、ＩＩ、 ２８５． １９８１゜Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに従って行えばよい。融合
促進剤としては、種々の高分子物質やウィルス等を用い
ることができるが、好ましくはポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）、センダイウィルスを用いればよい。ＰＥＧ
は、平均分子量４００〜２０．０００のものが使用でき
るが、好ましくは１．０００〜７．５００のものを用い
ればよい。その使用濃度は、４０〜６０Ｖｏ１．％が好
ましい。Next, the lymphocytes and myeloma obtained above are each suspended in a medium such as MEM or RPM11640 and mixed. Although the mixing ratio at this time can be arbitrarily selected, it is preferable to use a ratio of lymphocytes to myeloma of 1:1 to 20:1 in terms of cell/cell number, preferably 5:4-to:1. The mixed cells are fused using a fusion promoter. As a fusion method, for example, Immunological Met
hods Vol, II, 285. 1981゜A
This can be done according to Academic Press. As the fusion promoter, various polymeric substances, viruses, etc. can be used, but polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus are preferably used. PEG
may have an average molecular weight of 400 to 20.000, preferably 1.000 to 7.500. The concentration used is 40 to 60 Vol. % is preferred.
融合させた細胞は、洗浄で融合促進剤を除去し、５〜１
５Ｖｏ１．％の血清を含むＭＥＭまたはＲＰ Ｍ Ｉ
１６４０培地に懸濁し、９６穴培養皿等に０．５〜５Ｘ
−１０’／穴の割合で分注する。さらに、各式に選択培
地（例えば、ＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交換
すれば、１０〜１４日後には未融合のミエローマは死滅
し、ハイブリドーマのみ生育する。囚に、リンパ球は長
時間生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では育成できず、やは
り１０〜１４日後には死滅する。The fused cells are washed to remove the fusion promoter, and then washed for 5 to 1
5Vo1. MEM or RP MI containing % serum
Suspend in 1640 medium and 0.5-5X in a 96-well culture dish etc.
Dispense at a rate of -10'/well. Furthermore, if a selective medium (eg, HAT medium) is added to each formula and the selective medium is replaced as appropriate, unfused myelomas will die after 10 to 14 days, and only hybridomas will grow. Unfortunately, lymphocytes cannot be grown in vitro for a long time and die after 10 to 14 days.
次に、カルパインＴに対する抗体を産生ずるハイブリド
ーマを検索、選別する。そのための方法としてはＥＬ
Ｉ ＳＡ法を用いることができる。ただし、その場合に
上記ハイブリドーマは、カルパインニーキャリアを抗原
とするため、カルバ４２■合成ペプチドに対する抗体を
産生ずるもののほか、担体タンパク質に対する抗体を産
生ずるものも存在するので、カルパインＩに対する抗体
を産生ずるハイブリドーマのみを選択する必要がある。Next, hybridomas that produce antibodies against calpain T are searched and selected. For that purpose, EL
The ISA method can be used. However, in that case, the above hybridomas use the calpain knee carrier as an antigen, so in addition to those that produce antibodies against the carba 42■ synthetic peptide, there are also those that produce antibodies against the carrier protein, so they do not produce antibodies against calpain I. Only the hybridomas that arise need to be selected.
そのためには、たとえば担体タンパク質以外のタンパク
質にカルバインＩ合成ペプチドを共有結合させた複合体
（以下、カルパインニーキャリア２と記載する）を作成
し、これをＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、これにハイ
ブリドーマ上清を加え、洗浄後、市販の免疫動物免疫グ
ロブリンに対する標識抗体（例えば、ホースラディシュ
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体あるいは１２５
Ｉ標識抗体）を添加する。その結果、ハイブリドーマ上
清中にカルパインエ合成ペプチドに対する抗体が存在す
る場合には、それが固相のカルパインニーキャリア２に
結合し、さらに免疫グロブリンに対する標識抗体がこれ
に結合して、標識によるシグナルが得られる。一方、上
清中にカルパインＩに対する抗体が存在しない場合には
、固相のカルパインニーキャリア２には何も結合せず、
従ってシグナルも得られない。このように、標識による
シグナルの有無を手がかりとしてハイブリドーマの選択
を行うことができる。To do this, for example, a complex (hereinafter referred to as calpain knee carrier 2) in which a calbain I synthetic peptide is covalently bonded to a protein other than the carrier protein is created, this is adsorbed onto an ELISA plate, and the hybridoma supernatant is adsorbed onto this complex. After washing, add a commercially available labeled antibody against immunoglobulin for immunized animals (for example, horseradish peroxidase (HRP) labeled antibody or 125
Add I-labeled antibody). As a result, if an antibody against Calpaine synthetic peptide is present in the hybridoma supernatant, it binds to the solid-phase Calpaine knee carrier 2, and furthermore, a labeled antibody against immunoglobulin binds to this, and the signal from the label is emitted. can get. On the other hand, when there is no antibody against calpain I in the supernatant, nothing binds to the solid phase calpain knee carrier 2,
Therefore, no signal can be obtained. In this way, hybridomas can be selected using the presence or absence of a signal from a label as a clue.
次いで、このようにして得たカルパイン■に対するモノ
クローナル抗体を特異的に産生ずるハイブリドーマを選
択的に培養することにより、ハイブリドーマ細胞株を創
製することがきる。Next, a hybridoma cell line can be created by selectively culturing the thus obtained hybridoma that specifically produces the monoclonal antibody against calpain ①.
なお、この方法に従って予めカルパインニーキャリアで
免疫したマウスの肺臓リンパ球とマウスのミエローマ細
胞を融合して創製したハイブリドーマ細胞株の１種を、
ハイブリドーマＣＡＬＩ４Ｇ１１と命名した。この株を
、平成２年８月２７日に通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託の手続を行い、微工研菌寄第１１６
９７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１６９７）として受は入れら
れた。このＣＡＬＩ４Ｇ１１は、−１２０℃以下でほぼ
永久的に凍結保存が可能であって、たえず頒布可能な状
態に置かれている。In addition, according to this method, one type of hybridoma cell line was created by fusing mouse myeloma cells with mouse lung lymphocytes that had been immunized with a calpine knee carrier in advance.
The hybridoma was named CALI4G11. On August 27, 1990, procedures were carried out to deposit this strain with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry.
It was accepted as No. 97 (FERM P-11697). This CALI4G11 can be frozen and stored almost permanently at -120°C or lower, and is always available for distribution.
このハイブリドーマＣＡＬＩ４Ｇ１１は、通常用いられ
る培地で増殖可能である。例えば、牛胎児血清を５〜２
０％含有するＲ Ｐ Ｍ Ｉ １６４０又はＭＥＭを培
地として用い、３７℃、炭酸ガス濃度５Ｖｏ１．％含有
空気下でよく増殖する。また、ミエローマの造腫瘍性を
も有しているので、生体内（例えば、同系の動物、ヌー
ドマウスなど）で増殖し、カルパインＩに対するモノク
ローナル抗体を産生ずることができる。This hybridoma CALI4G11 can be grown in a commonly used medium. For example, add 5 to 2
Using RPM I 1640 or MEM containing 0% as a medium, the temperature was 37°C and the carbon dioxide concentration was 5Vo1. It grows well in air containing %. Furthermore, since it has myeloma tumorigenic properties, it can proliferate in vivo (for example, in syngeneic animals, nude mice, etc.) and produce monoclonal antibodies against calpain I.
（２） カルパイン■のモノクローナル抗体の多量採取
：
上記の通り作成したハイブリドーマ細胞株を培養するこ
とにより、カルパインＩに対するモノクローナル抗体を
大量に採取することができる。このモノクローナル抗体
の採取方法には、大きく分けて２通りの方法がある。１
つは、培地を用い、フラスコ等の培養容器で培養し、そ
の上澄液から抗体を採取する方法である。例えば、５〜
１０ Ｖｏｌ、％の血清を含むＭＥＭまたはＲＰＭＩ１
６４０培地に０．５〜５×ｌＯｓ個のハイブリドーマ細
胞株を植えると、２〜４日で１０〜２０倍に生育し、そ
の培養後の上澄液から抗体を採取する方法である。もう
１つの方法は、このようにして培養容器で培養したハイ
ブリドーマ細胞株を、同系の動物に接種する方法である
。すなわち、ハイブリドーマ細胞株１０５〜１０７個を
同系の動物の皮下または腹腔内等に投与し、７〜２０日
後ハイブリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍が大きくなった
ときに、血清および腹水を採取する方法である。腹腔内
に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２． ６．
１０． １４−テトラメチルペンタデカン等の鉱物油
を投与すると、より多量の腹水か得られる。(2) Collection of large quantities of monoclonal antibodies against calpain I: By culturing the hybridoma cell line prepared as described above, monoclonal antibodies against calpain I can be collected in large quantities. There are two main methods for collecting monoclonal antibodies. 1
The first method is to culture in a culture container such as a flask using a medium, and collect the antibody from the supernatant. For example, 5~
10 Vol, MEM or RPMI1 containing % serum
When 0.5 to 5 x 10s of hybridoma cell lines are planted in 640 medium, they grow 10 to 20 times in 2 to 4 days, and antibodies are collected from the supernatant after the culture. Another method is to inoculate the hybridoma cell line thus cultured in a culture vessel into a syngeneic animal. That is, 10 to 10 hybridoma cell lines are administered subcutaneously or intraperitoneally to a syngeneic animal, and after 7 to 20 days, when the hybridoma cell lines proliferate and the tumor becomes large, serum and ascites are collected. be. When administering intraperitoneally, 2. In advance (3 to 7 days). 6.
10. When mineral oils such as 14-tetramethylpentadecane are administered, larger amounts of ascites are obtained.
このようにして得られた抗体は、必要に応じ精製して使
用することができる。たとえば硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、プロティンＡを固定したアフィニテ
ィークロマトグラフィー等、通常タンパク質に適用され
うる手段を用いて精製することができる。The antibody thus obtained can be purified and used if necessary. For example, purification can be carried out using means commonly applicable to proteins, such as ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography with immobilized protein A.
このようにして、カルパインエに対するモノクローナル
抗体を容易に、かつ多量に得ることができる。In this way, monoclonal antibodies against Calpainae can be easily obtained in large amounts.
（３） モノクロナール抗体を用いるカルノ（インＩの
免疫学的測定：
まず、カルパインニーキャリアを面相に固定化する。固
相としては、プラスチ・ツク試験管、マイクロタイター
プレート、ガラスピーズ、プラスチックビーズ、メンブ
レン等を用いることができる。(3) Immunoassay of Calpain I using a monoclonal antibody: First, immobilize Calpine knee carrier on a surface phase.Solid phase can be a plastic test tube, microtiter plate, glass beads, or plastic beads. , membrane, etc. can be used.
カルパインニーキャリアを固定化するには、一般的な物
理的吸着法を用いることができるが、官能基をもつ固相
に固定化する場合には共有結合法を用いることもできる
。このとき、カルパインニーキャリアの濃度は、０．０
０１■／−以上、好ましくは０．０５〜０．２■／−と
し、これを固相と接触させればよい。A general physical adsorption method can be used to immobilize the calpain knee carrier, but a covalent bonding method can also be used when immobilizing it on a solid phase having a functional group. At this time, the concentration of calpain knee carrier is 0.0
01 .mu./- or more, preferably 0.05 to 0.2 .mu./-, and may be brought into contact with the solid phase.
次に、このようにカルパインニーキャリアを固定した固
相に、数種のカルパイン■濃度既知の液体またはカルパ
インＩ濃度未知の検体を加える。Next, to the solid phase on which the calpain knee carrier is immobilized in this manner, several kinds of liquids with known concentrations of calpain I or samples with unknown concentrations of calpain I are added.
さらに、これに酵素、ＲＩ、蛍光物質等を標識したカル
パインＩに対する抗体を加えるか、またはカルパインＩ
に対する抗体を加えた後、酵素、ＲＩ、蛍光物質等を標
識した二次抗体を加える。Furthermore, an antibody against calpain I labeled with enzyme, RI, fluorescent substance, etc. is added to this, or an antibody against calpain I labeled with enzyme, RI, fluorescent substance, etc.
After adding an antibody against the antibody, a secondary antibody labeled with an enzyme, RI, fluorescent substance, etc. is added.
なお、酵素としては、ＨＲＰ、ウシ小腸アルカリホスフ
ァターゼ等を用いることができる。また、ＲＩとして１
２５■を、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオ
シアネート、テトラメチルローダミンイソシアネート等
を用いることができる。Note that, as the enzyme, HRP, bovine small intestine alkaline phosphatase, etc. can be used. Also, as RI 1
As the fluorescent substance, fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isocyanate, etc. can be used for 25.
次いで、数種のカルパイン■濃度既知の液体の標識抗体
に対するシグナルを各々測定して検量線を作成し、カル
パインＩ濃度未知の検体から得られるシグナルをこの検
量線に当てはめ、その検体のカルパイン■濃度を定量す
る。Next, a calibration curve is created by measuring the signals of several types of labeled antibodies in liquids with known calpain I concentrations, and the signal obtained from a sample with an unknown calpain I concentration is applied to this calibration curve to determine the calpain concentration of the sample. Quantify.
以下、実施例を示し、この発明について具体的に説明す
る。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples.
実施例１
（免疫原およびハイブリドーマ細胞株のスクリーニング
）
担体タンパク質として、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｙｍｐｅｔ
Ｈｏｍｏｃｙａｎｉｎ （Ｋ Ｌ Ｈ）およびウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を用い、免疫原およびハイブリド
ーマ細胞株のスクリーニングを行った。Example 1 (Immunogen and hybridoma cell line screening) As a carrier protein, Keyhole Lympet
Homocyanin (K L H) and bovine serum albumin (BSA) were used to screen immunogens and hybridoma cell lines.
ｌＯ■ＫＬＨまたは２０■ＢＳＡを０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７゜０） ２．５１ｎｌに溶解し、
これに２５０μＩ Ｎ、 Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒ
ｍａｍｉｄｅに溶解した２、５ ｍｇＮ−Ｈｙｄｒｏｘ
ｙｓｕｃｃｉｍｉｄｏ ｅｓｔｅｒ ｏｆＮ −（４−
ｃａｒｂｏｘｙ ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌ）
Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを添加して、３０℃の温度で３０分
間反応させＫＬＨまたはＢＳＡにマレイミド基を導入し
た。次いで、これらのマレイミド−ＫＩ、Ｈまたはマレ
イミド−ＢＳＡ溶液と、カルバ４２■合成ペプチド４■
を１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐ）１６．０） ３−に溶解したものを混合し、４
°Ｃで反応させてカルパインＩ−ＫＬＨまたはカルパイ
ンＩ−ＢＳＡを作成した。Dissolve 10 KLH or 20 BSA in 2.51 nl of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7°0),
Add 250 μI N, N-dimethylfor to this.
2.5 mg N-Hydrox dissolved in mamide
ysuccimido ester ofN -(4-
carboxy cyclohexyl methyl)
Maleimide was added and reacted at a temperature of 30° C. for 30 minutes to introduce a maleimide group into KLH or BSA. Next, these maleimide-KI, H or maleimide-BSA solutions and Carba 42 ■ Synthetic peptide 4 ■
was dissolved in 0.1M sodium phosphate buffer (p) 16.0) containing 1mM EDTA and mixed.
Calpain I-KLH or calpain I-BSA was prepared by reacting at °C.
さらに、ＫＬＨまたはＢＳＡに導入されたマレイミド基
を測定しく石川榮治、酵素免疫測定法医学書院 ｐ７５
）、これらのマレイミド基と合成ペプチドのチオール基
が全て結合したと考えられることから、ＫＨＬ １分子
あたりに結合したカルパインＩ合成ペプチドは約２０分
子、またＢ５Ａｌ分子あたりに結合したカルバ４２■合
成ペプチドは約７分子と求められた。Furthermore, the maleimide group introduced into KLH or BSA will be measured by Eiji Ishikawa, Enzyme Immunoassay Method Igaku Shoin, p75.
), it is thought that all of these maleimide groups and the thiol groups of the synthetic peptide are bonded, so there are approximately 20 molecules of calpain I synthetic peptide bonded to each KHL molecule, and approximately 20 molecules of calpain I synthetic peptide bonded to each B5Al molecule. was determined to be approximately 7 molecules.
実施例２
（ハイブリトーマの作成）
８週令のマウスＢａ１ｂ／ｃ（オリエンタルバイオサー
ビスより入手）に、実施例１で作成したカルパインＩ合
成ペプチド−ＫＬＨを完全フロインドアジュバント（半
井化学より入手）と１：１に混合乳化し、腹腔内に投与
し、２週間後に５０μｇのカルパインＩ合成ペプチド−
ＫＬＨを静注して追加免疫し、３日後に肺臓を取り出し
、ＭＥＭ培地（半井化学より入手）にほぐして懸濁洗浄
した。一方、マウスのミエローマＸ６３・６・５・３（
京都大学より入手）を２日前から培養し、対数増殖期に
ある細胞を遠心分離で集めた。Example 2 (Creation of hybridoma) Calpain I synthetic peptide-KLH prepared in Example 1 was added to 8-week-old mouse Ba1b/c (obtained from Oriental Bioservices) with complete Freund's adjuvant (obtained from Hanui Chemical). : 1 and administered intraperitoneally, and 2 weeks later, 50 μg of calpain I synthetic peptide.
A booster immunization was given by intravenously injecting KLH, and 3 days later, the lungs were taken out, suspended and washed in MEM medium (obtained from Hanui Chemical). On the other hand, mouse myeloma X63, 6, 5, 3 (
(obtained from Kyoto University) was cultured for two days prior, and cells in the logarithmic growth phase were collected by centrifugation.
牌細胞１０”個をミエローマＸ６３・６・５・３ＸＩＯ
’と混合し、遠心によりペレットしたのち、３７℃の水
浴中で５０％のＰ Ｅ Ｇ ４０００−ＲＰＭ１１６４
０（ギブコ社より入手）１−を徐々に１分間で加え、さ
らに１分間緩やかに撹拌後、９−のＲＰＭＩＩ６４０培
地を徐々に加えて、ＰＥＧ４０００を希釈した。遠心分
離によりＰＥＧ溶液を除去し、ペレットに１０％牛脂児
血清を含むＨＡＴ培地２０−を加えて、２皿の９６穴培
養皿（コーニング社製）の各式に０．１−ずつ分注した
。４゜８．１１日口の計３回にわたり半分量の培養基を
捨て、新しいＨＡＴ培地を加えた。Myeloma X63, 6, 5, 3XIO with 10” tile cells
' and pelleted by centrifugation, then 50% PEG 4000-RPM1164 in a 37°C water bath.
0 (obtained from Gibco) 1- was gradually added over 1 minute, and after gentle stirring for another 1 minute, RPM II 640 medium 9- was gradually added to dilute PEG4000. The PEG solution was removed by centrifugation, and HAT medium 20 - containing 10% tallow serum was added to the pellet, and 0.1 - was dispensed into each of two 96-well culture dishes (manufactured by Corning). . Half of the culture medium was discarded three times on days 4, 8, and 11, and fresh HAT medium was added.
その結果、１０日後には３８４穴中２６８穴でハイブリ
ドーマの生育が観察された。As a result, hybridoma growth was observed in 268 out of 384 wells after 10 days.
実施例３
（ハイブリドーマ細胞株の作成）
実施例２で得たハイブリドーマのうちカルパインＩ合成
ペプチドに対する抗体を産生ずる株を、ＥＬ Ｉ ＳＡ
法を用い検索した。Example 3 (Creation of hybridoma cell line) Among the hybridomas obtained in Example 2, strains producing antibodies against calpain I synthetic peptide were subjected to ELISA.
The search was conducted using the method.
まず、ＥＬＩＳＡプレート（コーニング社製）に５０ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６に溶解したカルパ
インエ合成ペプチド−ＢＳＡを各式につき５０μβずつ
分注し、２５℃の温度で２時間放置した。この液を除去
した後、各式に１．０％ＢＳＡ、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１７
．２）を充満させ、２５℃の温度で１時間放置した。さ
らにこの液を除去し、０．２％トウィーン２０．０．２
％ＢＳＡ、０、１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）からなる洗浄液で
各ウェルをよく洗浄し、カルパインＩ合成ペプチドーＢ
ＳＡ固定化プレートを作成した。First, 50 m on an ELISA plate (manufactured by Corning)
Calpaine synthetic peptide-BSA dissolved in M sodium carbonate buffer, pH 9.6, was dispensed in an amount of 50 μβ for each formula and left at a temperature of 25° C. for 2 hours. After removing this solution, each formula contains 20mM sodium phosphate buffer (p) containing 1.0% BSA, 0.15M sodium chloride.
．． 2) and left at a temperature of 25° C. for 1 hour. Further remove this liquid and add 0.2% Tween 20.0.2.
Each well was thoroughly washed with a washing solution consisting of 20mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) containing % BSA, 0.15M sodium chloride, and calpain I synthetic peptide-B.
An SA immobilization plate was prepared.
次いで、このプレートに実施例２で得たハイブリドーマ
の上清５０μｌを添加し、２５℃の温度で２時間放置し
た後、洗浄液で充分に洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ（フナコシよす購入）ｌμｇ／１ＩＴｌを各式に
５０μｌ加え２５°Ｃの温度で２時間放置した。さらに
、洗浄後、パーオキシダーゼ測定試薬（バイオラッド社
製）５０μｌを加え、２５℃の温度で２０分間反応させ
、ｌＯ％ＳＤＳ ５０μｌの添加によりバーオキシンダ
ーゼ活性を停止させ、４１５ｎｍにおける吸光度（Ａ４
１５）を測定した。また対照にはハイブリドーマ上清の
かわりにＨＡＴ培地のみを反応させたものを用いた。Next, 50 μl of the hybridoma supernatant obtained in Example 2 was added to this plate, and after leaving it at a temperature of 25°C for 2 hours, it was thoroughly washed with a washing solution, and HRP-labeled goat anti-mouse IgG (purchased by Funakoshi Yosu) was added. 50 μl of 1 μg/1 ITl was added to each formula and left at a temperature of 25° C. for 2 hours. Furthermore, after washing, 50 μl of peroxidase measurement reagent (manufactured by Bio-Rad) was added, the reaction was carried out at 25°C for 20 minutes, the peroxidase activity was stopped by adding 50 μl of 10% SDS, and the absorbance at 415 nm (A4
15) was measured. In addition, as a control, a reaction using only HAT medium instead of the hybridoma supernatant was used.
その結果、対照として用いた上清無添加時のシグナルに
比べ、高いシグナルを示した上清か得られた。これらの
高いシグナルを示した上溝について、同様にヒト力ルパ
インエ固定化プレートを作成し、同様の操作により吸光
度を測定したところ、やはり高いシグナルを示した上清
が得られた。この上清の穴の株を選択し、限界希釈法に
てクローニングを行い、モノクローンのハイブリドーマ
細胞株ＣＡＬＩ４Ｇ１１を得た。As a result, a supernatant was obtained that showed a higher signal than the signal when no supernatant was added, which was used as a control. Regarding these supernatants that showed high signals, human lupine immobilization plates were similarly prepared and the absorbance was measured using the same procedure, and a supernatant that also showed high signals was obtained. A strain in this supernatant well was selected and cloned by limiting dilution method to obtain monoclonal hybridoma cell line CALI4G11.
実施例４
（カルパイン■に対するモノクローナル抗体の採取）
実施例３で得たハイブリドーマ細胞株
ＣＡＬＩ４Ｇ１１を培養し、カルパイン■に対するモノ
クローナル抗体の採取を行った。Example 4 (Collection of monoclonal antibody against calpain ■) The hybridoma cell line CALI4G11 obtained in Example 3 was cultured, and a monoclonal antibody against calpain ■ was collected.
まず、ＣＡＬＩ４Ｇ１１をｌＯ％牛脂児血清含をＲＰ
Ｍ Ｉ １６４０培地で培養し、細胞濃度が２×１０６
細胞／−に達した培養物３００−を遠心分離し、その上
清を５０％飽和硫安分画により粗抗体画分を分離し、透
析した後、プロティンＡ−セファロース（ｐＨ９，０）
に吸着させ、クエン酸緩衝液（ｐＨ３，０）で溶出して
カルパイン■に対する抗体（以下、ＣＡＬＩＡ４Ｇ１１
と記載する）を得た。First, CALI4G11 was added to RP with 10% beef fat serum.
Cultured in M I 1640 medium with a cell concentration of 2 x 106
The culture that reached 300 cells/- was centrifuged, and the supernatant was subjected to 50% saturated ammonium sulfate fractionation to separate the crude antibody fraction, which was dialyzed and then treated with protein A-Sepharose (pH 9,0).
The antibody against calpain ■ (hereinafter referred to as CALIA4G11
) was obtained.
次に、このＣＡＬＩＡ４Ｇ１１のヒトカルパインＩに対
する特異性を検討した。Next, the specificity of CALIA4G11 to human calpain I was examined.
まず、ヒトカルパイン■とヒトカルパイン■溶液（０，
Ｄ２８０ ＃ ０．０５）をＥＬ Ｉ ＳＡプレートに
５０μβずつ注入し、各々を固定したＥＬＩＳＡプレー
トの各式に２．０μｇ７／−濃度のＣＡＬ ｌＡ４Ｇ１
１５０μｌを添加した。このプレートを２５°Ｃの温度
で２時間インキュベートした後、０．２％ヒトィーン２
０．０．２％ＢＳＡ、０．１５塩化ナトナトリウム含有
２０リン酸ナトリウム緩衝液で充分に洗浄し、ＨＲＰ標
識ヤキ抗マウスＩｇＧ抗体を各式に添加した。次いでこ
れを洗浄し、パーオキシダーゼ測定試薬（バイオラッド
社製）５０μｌを加え、２５℃の温度で２０分間反応さ
せた後、１０％５ＤＳ５０μｌを添加して反応を停止さ
せ、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。First, human calpain ■ and human calpain ■ solution (0,
D280 #0.05) was injected in 50 μβ portions into the ELISA plate, and 2.0 μg7/- concentration of CAL 1A4G1 was added to each formula of the fixed ELISA plate.
150 μl was added. After incubating the plate for 2 hours at a temperature of 25°C,
After thorough washing with 20 sodium phosphate buffer containing 0.0.2% BSA and 0.15 sodium chloride, HRP-labeled Yaki anti-mouse IgG antibody was added to each formula. Next, this was washed, 50 μl of peroxidase measurement reagent (manufactured by Bio-Rad) was added, and the mixture was allowed to react at a temperature of 25° C. for 20 minutes. After that, 50 μl of 10% 5DS was added to stop the reaction, and the absorbance at 415 nm was measured. .
その結果、モノクローナル抗体
ＣＡＬＩＡ４Ｇ１１は、ヒトカルパインＩを認識し、ま
たヒトカルパイン■をわずかに認識はするが、それもヒ
トカルパインエに対する認識力の１００分の１程度であ
ることが判明した。As a result, it was found that monoclonal antibody CALIA4G11 recognizes human calpain I and slightly recognizes human calpain ■, but its recognition ability is about 1/100 of that for human calpain E.
以上のことから、この発明のモノクローナル抗体ＣＡＬ
ＩＡ４Ｇ１１は、ヒトカルパイン■に対する特異的なモ
ノクローナル抗体であると考えられる。From the above, the monoclonal antibody CAL of this invention
IA4G11 is believed to be a specific monoclonal antibody against human calpain ■.
（発明の効果）
以上詳しく説明した通り、この発明によりモノクローナ
ル抗体を用いたヒトカルパイン■の免疫学的測定が可能
となり、生体液中のカルパインＩを簡易にかつ迅速に、
しかも高精度に定量化することができる。(Effects of the Invention) As explained in detail above, this invention makes it possible to immunologically measure human calpain I using a monoclonal antibody, and to easily and quickly measure calpain I in biological fluids.
Moreover, it can be quantified with high precision.
しかも、このヒトカルパインＩに対するモノクローナル
抗体を特異的に産生ずるハイブリドーマ細胞株の樹立に
より、診断および測定に有用なヒトカルパイン■のモノ
クローナル抗体を多量に、かつ容易に得ることが可能と
なる。Furthermore, by establishing a hybridoma cell line that specifically produces monoclonal antibodies against human calpain I, it becomes possible to easily obtain a large amount of human calpain II monoclonal antibodies useful for diagnosis and measurement.
Claims (4)
酸配列部位を合成したペプチドを免疫した哺乳動物より
調製したリンパ球と、ミエローマ細胞株とを融合したハ
イブリドーマから産生されてなることを特徴とするヒト
カルパイン I 特異認識モノクローナル抗体。(1) A human body characterized by being produced from a hybridoma obtained by fusion of a myeloma cell line and lymphocytes prepared from a mammal immunized with a peptide synthesized with an amino acid sequence site specific to human calpain I as an antigen. Calpain I-specific monoclonal antibody.
を合成したペプチドのアミノ酸配列が、Ａｓｐ−Ｇｌｕ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである請求項（１）記載のヒト
カルパイン I 特異認識モノクローナル抗体。(2) The amino acid sequence of the peptide synthesized with the amino acid sequence site specific to human calpain I is
-Thr-Asp-Asp-Pro-Asp-Asp-
The human calpain I-specific monoclonal antibody according to claim (1), which is Tyr-Gly-Cys.
I 特異認識モノクローナル抗体産生能を有するハイブ
リドーマ細胞株。(3) Human calpain according to claims (1) and (2)
I A hybridoma cell line capable of producing specific recognition monoclonal antibodies.
I 特異認識モノクローナル抗体を用いるヒトカルパイ
ン I の免疫学的測定法。(4) Human calpain according to claims (1) and (2)
Immunological assay for human calpain I using I-specific monoclonal antibodies.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2308097A JPH04179497A (en) | 1990-11-13 | 1990-11-13 | Monoclonal antibody specifically recognizing human carpine and hybridoma cell strain producing the same, and immunologically measuring method using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2308097A JPH04179497A (en) | 1990-11-13 | 1990-11-13 | Monoclonal antibody specifically recognizing human carpine and hybridoma cell strain producing the same, and immunologically measuring method using the same |
Publications (1)
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|---|---|
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04179497A (en) |
-
1990
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