JPH04144685A - ORSV遺伝子の↓cDNA - Google Patents
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- JPH04144685A JPH04144685A JP1306626A JP30662689A JPH04144685A JP H04144685 A JPH04144685 A JP H04144685A JP 1306626 A JP1306626 A JP 1306626A JP 30662689 A JP30662689 A JP 30662689A JP H04144685 A JPH04144685 A JP H04144685A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、オドントグロッ丈ム リンクスポット ウィ
ルス(Odoncogtos口+1% ri?&gap
ot virus;0R5V)の遺伝子に対応するD
NA及びその断片、並びにそれらの相補鎖に関する。
ルス(Odoncogtos口+1% ri?&gap
ot virus;0R5V)の遺伝子に対応するD
NA及びその断片、並びにそれらの相補鎖に関する。
本発明t;、特にオドントグロッサム リングスポット
ウィルスの遺伝子に対応する単離され又はクローン化さ
れた環状ヱたは4I状の1)NA及びその断片、並びに
そnらの相補鎖に関する。
ウィルスの遺伝子に対応する単離され又はクローン化さ
れた環状ヱたは4I状の1)NA及びその断片、並びに
そnらの相補鎖に関する。
本発明のオドントグロッサム リングスポット ウィル
スの遺伝子に対応するDNA及びその断片、並びにそれ
らの相補鎖ニ、植物に使用して有用なベクターを構築す
る際の素材として有用であり、更VCマたラン科檀物の
ウィルス抵抗性株の炸裂に使用されて有用である。
スの遺伝子に対応するDNA及びその断片、並びにそれ
らの相補鎖ニ、植物に使用して有用なベクターを構築す
る際の素材として有用であり、更VCマたラン科檀物の
ウィルス抵抗性株の炸裂に使用されて有用である。
また本発明のオドントグロッサム リングスポット ウ
ィルスの遺伝子に対応するDNA及びその断片、並びに
それらの相補#ItX、ウィルスの遺伝子なスクリーニ
ングする際のプローブとして有用である。
ィルスの遺伝子に対応するDNA及びその断片、並びに
それらの相補#ItX、ウィルスの遺伝子なスクリーニ
ングする際のプローブとして有用である。
更にヱだ、本発明のオドントグロッサム リングスポッ
ト ウィルスの遺伝子に対応するDNA及びその断片並
びにそれらの相補@は、それを過当な発現ベクターに組
込んで宿主細胞で発現することにより、ウィルス関連タ
ンパク實及びペプチドを製造するに使用でき、更にその
フィルス関連タンパク質及びペプチドに、ウィルス及び
ウィルスの遺伝子をスクリーニングするための試薬とし
であるいはそのウィルス及びウィルスの遺伝子をスクリ
ーニングするだめの試薬作製のたのの試薬として有用で
ある。
ト ウィルスの遺伝子に対応するDNA及びその断片並
びにそれらの相補@は、それを過当な発現ベクターに組
込んで宿主細胞で発現することにより、ウィルス関連タ
ンパク實及びペプチドを製造するに使用でき、更にその
フィルス関連タンパク質及びペプチドに、ウィルス及び
ウィルスの遺伝子をスクリーニングするための試薬とし
であるいはそのウィルス及びウィルスの遺伝子をスクリ
ーニングするだめの試薬作製のたのの試薬として有用で
ある。
オドントグロッサム リングスポット ウィルス(Od
o%togtosハm ringspot *1r
ss;0R5V)It@。
o%togtosハm ringspot *1r
ss;0R5V)It@。
カドレア、シンビジウム、デンドコビウム、オドントグ
ロツサムなどのラン科値物に王に感染する棒状のRNA
ウィルスであり、ウィルス粒子自体にすてに単離されて
いる。
ロツサムなどのラン科値物に王に感染する棒状のRNA
ウィルスであり、ウィルス粒子自体にすてに単離されて
いる。
(農学研究、Vow、 60 、 Nov、 2 、5
3−67.1983)しかしながら、その遺伝子そのも
のは単離されて2らず、その遺伝子の塩基配列をはじめ
遺伝子の構造に関する情報は全く知られていない。従っ
て、その遺伝子を利用することは全く不可能であつ1≧ 一般に、ウィルスからのDNA遺伝子は遺伝子組換え技
@yc′j6いて、動物分野を中心に広くベクターとし
て開発利用されている。しかし、植物の場合その植物ウ
ィルスの大半はその遺伝子としてRNAをもつものであ
り、すぐさまその植物ウィルスの遺伝子RNAを遺伝子
組換えに用いることは技術上困難である。そこで七のR
NAを調型にしてcDNAに置き換える必要がある。
3−67.1983)しかしながら、その遺伝子そのも
のは単離されて2らず、その遺伝子の塩基配列をはじめ
遺伝子の構造に関する情報は全く知られていない。従っ
て、その遺伝子を利用することは全く不可能であつ1≧ 一般に、ウィルスからのDNA遺伝子は遺伝子組換え技
@yc′j6いて、動物分野を中心に広くベクターとし
て開発利用されている。しかし、植物の場合その植物ウ
ィルスの大半はその遺伝子としてRNAをもつものであ
り、すぐさまその植物ウィルスの遺伝子RNAを遺伝子
組換えに用いることは技術上困難である。そこで七のR
NAを調型にしてcDNAに置き換える必要がある。
現在fでK[物遺伝子組換え用ベクターとしての利用の
可能性のあるものとして知られ℃いるのは1例えばトマ
トやタバコなどの双子葉類植物に膿瘍を作るアグロバク
テリウム−ツメファシェンスCAgrobαcc−デi
s%tstnafα−cians )が有している核外
遺伝子のrs プラスミド、キャベツや白菜などに病
気を起こすカリフラワーモサイクウイルスからのDNA
遺伝子などである。
可能性のあるものとして知られ℃いるのは1例えばトマ
トやタバコなどの双子葉類植物に膿瘍を作るアグロバク
テリウム−ツメファシェンスCAgrobαcc−デi
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遺伝子のrs プラスミド、キャベツや白菜などに病
気を起こすカリフラワーモサイクウイルスからのDNA
遺伝子などである。
(物ウィルスは殆どすべてがRNAウィルスであり、し
かもその壇殖罷シ極めて扁く℃、タバコ モサイク ウ
ィルスILどではダラム率僅のウィルスを得ることも容
易である。このことD)ら植物細胞がRtV 、4の複
製に適し1こ何らかの生理的条件を1肩えていることが
考えられるっしたがって、R4’iAウィルスを用いた
/?−VAベクター系は植物でを工極め℃有用であると
思われる。しPL、促米櫃物に対するベクターといえば
Tiプラスミドと同義と思わするぐらい、それ以外に有
用なベタターが存在していなり)つたが、rsプラスミ
ドt;植物細胞の染色体に組み込1れる2わ、その発現
tト極ので低いという間dがある。−万RN Aウィル
スにより構築されたRNAベクターを工、染色体とY工
独!し℃自己増殖するベクターであり、それρ)らの発
現量はTiプラスミドを用いた場合よりも遥ρ・icA
いことが期待される。
かもその壇殖罷シ極めて扁く℃、タバコ モサイク ウ
ィルスILどではダラム率僅のウィルスを得ることも容
易である。このことD)ら植物細胞がRtV 、4の複
製に適し1こ何らかの生理的条件を1肩えていることが
考えられるっしたがって、R4’iAウィルスを用いた
/?−VAベクター系は植物でを工極め℃有用であると
思われる。しPL、促米櫃物に対するベクターといえば
Tiプラスミドと同義と思わするぐらい、それ以外に有
用なベタターが存在していなり)つたが、rsプラスミ
ドt;植物細胞の染色体に組み込1れる2わ、その発現
tト極ので低いという間dがある。−万RN Aウィル
スにより構築されたRNAベクターを工、染色体とY工
独!し℃自己増殖するベクターであり、それρ)らの発
現量はTiプラスミドを用いた場合よりも遥ρ・icA
いことが期待される。
rsプラスミドによる外米遺伝子の導入は、以上のよっ
たことからもっばら植物lf橿という視点からのみ1じ
らn、貞桑耐性遺伝子の導入などがその話題の中心とな
ってさた。
たことからもっばら植物lf橿という視点からのみ1じ
らn、貞桑耐性遺伝子の導入などがその話題の中心とな
ってさた。
しかし、自己複製能をもった植物の新しいベクターとし
てのRNAベクターの導入は、動物ホルモンなどの有用
タンパク質を生#:する場としての種物a胞fたは植物
体?見直すことになる。
てのRNAベクターの導入は、動物ホルモンなどの有用
タンパク質を生#:する場としての種物a胞fたは植物
体?見直すことになる。
また、大腸菌を用いた有用タンパク質の生産を工実用友
階に人って多くの困難(直面している。その一つは、外
米タンパク質の発現量が大きいと封入体としてその発現
タンパク質が閉じ込のられてしまうことがあることであ
る。大腸−は一個の細胞で生命を維持し又いるので、大
量の異物タンパク質が生Mされると、そのことは大腸菌
にとって好fしくtいD)うである。従って、できるだ
けその影41を除くたのにその発現タンパク質を封入体
に閉じ込のてし1つことは大腸−にとっては非常に合目
的であるのである。このため大gk菌を宿主とした物質
生産を考える場合、これは避けて通れないデメリットで
ある。
階に人って多くの困難(直面している。その一つは、外
米タンパク質の発現量が大きいと封入体としてその発現
タンパク質が閉じ込のられてしまうことがあることであ
る。大腸−は一個の細胞で生命を維持し又いるので、大
量の異物タンパク質が生Mされると、そのことは大腸菌
にとって好fしくtいD)うである。従って、できるだ
けその影41を除くたのにその発現タンパク質を封入体
に閉じ込のてし1つことは大腸−にとっては非常に合目
的であるのである。このため大gk菌を宿主とした物質
生産を考える場合、これは避けて通れないデメリットで
ある。
これに反し、植物体は大さな寛容性をもっている。例え
ば、一つの葉が枯れてし1ったとしても植物体全体への
影響に七nはど太き(ない。このような1物の性質を考
えると異極タンパク質が多量に生産されても、変成不溶
化さセるよ5tg力な排除機構は働かない。
ば、一つの葉が枯れてし1ったとしても植物体全体への
影響に七nはど太き(ない。このような1物の性質を考
えると異極タンパク質が多量に生産されても、変成不溶
化さセるよ5tg力な排除機構は働かない。
七nゆえに、オドントグロッサム リングスポット ウ
ィルスの遺伝子に対応するcDNAをRNAベクターと
することは、それ自体極め℃意味のあることである。ヱ
た、この、DNAの中にはウィルスの外被タンパク質遺
伝子が含まれており、こtをTsプラスミドに連結し植
物細胞の染色体に組み込むことによりウィルス抵仇性品
樵の作出が期侍しつる。
ィルスの遺伝子に対応するcDNAをRNAベクターと
することは、それ自体極め℃意味のあることである。ヱ
た、この、DNAの中にはウィルスの外被タンパク質遺
伝子が含まれており、こtをTsプラスミドに連結し植
物細胞の染色体に組み込むことによりウィルス抵仇性品
樵の作出が期侍しつる。
オドントグロツサム リングスポット ウィルスの心1
遺伝子を単離することに成功すると共に、七の単離さn
たRNA遺伝子を鋳型として七nに相補的なり N A
(cDN、4 )を作表し、さらにそれをクローニン
グし、久にそのクローニングさtたCDNAを使用して
オドントグロツサム リングスポット ウィルスの遺伝
子を発現することに成功した。さらにその(Hl)NJ
K−は過当な制限酵素切断部[があることも見出した。
遺伝子を単離することに成功すると共に、七の単離さn
たRNA遺伝子を鋳型として七nに相補的なり N A
(cDN、4 )を作表し、さらにそれをクローニン
グし、久にそのクローニングさtたCDNAを使用して
オドントグロツサム リングスポット ウィルスの遺伝
子を発現することに成功した。さらにその(Hl)NJ
K−は過当な制限酵素切断部[があることも見出した。
そし℃、そのクローニングさnたにDNAをもとにオド
ントグロツサム リングスポット ウィルスの遺伝子に
対応する。L)NAの1基部列を決定し、その塩基配列
ρ・ら得られる矧見を利用するとともに、遺伝子iI!
i換え技術等を利用して新しいベクター及び形質転換体
の作出、あるいはウィルスなどの慎知がtしうることを
兇出し總(発明の開示) 本発明&Lラン科に属するカドレア、ンンビジワム、デ
ンドロビウム、オドントグロツサム等から、特に単離さ
れるオドントグロツサム リングスポット ウィルスの
遺伝子に対応するDNA及びその断片、並びにそれらの
相補鎖D iV A vC関する。
ントグロツサム リングスポット ウィルスの遺伝子に
対応する。L)NAの1基部列を決定し、その塩基配列
ρ・ら得られる矧見を利用するとともに、遺伝子iI!
i換え技術等を利用して新しいベクター及び形質転換体
の作出、あるいはウィルスなどの慎知がtしうることを
兇出し總(発明の開示) 本発明&Lラン科に属するカドレア、ンンビジワム、デ
ンドロビウム、オドントグロツサム等から、特に単離さ
れるオドントグロツサム リングスポット ウィルスの
遺伝子に対応するDNA及びその断片、並びにそれらの
相補鎖D iV A vC関する。
本発明で意図するオドントグロッサム リングスポット
ウィルスを工必ずしもラン科櫃物のみD・ら率IIMさ
れるものに限らず、以下に詳述するような理由からその
ウィルスとし℃の特性を有するものであれば、そのすべ
てを含みうろことができる。
ウィルスを工必ずしもラン科櫃物のみD・ら率IIMさ
れるものに限らず、以下に詳述するような理由からその
ウィルスとし℃の特性を有するものであれば、そのすべ
てを含みうろことができる。
本発明に係わるオドントグロツサム リングスポットウ
ィルスは、その感染ff:に重大な影響を受けないで天
然に変異することがOT能であり、ヱた人工的にも適当
なニトロンウレア等のfA剤の処理あるいを工紫外巌又
は放射−の処理により、f異させ0ことかできる。
ィルスは、その感染ff:に重大な影響を受けないで天
然に変異することがOT能であり、ヱた人工的にも適当
なニトロンウレア等のfA剤の処理あるいを工紫外巌又
は放射−の処理により、f異させ0ことかできる。
更に、本発明によって開示されていΦ七の塩基配タリに
ついての情報を利用し℃、そのウィルスの遺伝子の一部
を置換しfこつ、削除したり、あるいVXR加したり、
あるいは、池のウィルス、ia陶、動植物の遺伝子を加
えたりすることがでさ、そのようなもののうちには、依
然としてオドントグロツサム リングスポット ウィル
ス様の性質を保持することができるものがあり得るので
ある。
ついての情報を利用し℃、そのウィルスの遺伝子の一部
を置換しfこつ、削除したり、あるいVXR加したり、
あるいは、池のウィルス、ia陶、動植物の遺伝子を加
えたりすることがでさ、そのようなもののうちには、依
然としてオドントグロツサム リングスポット ウィル
ス様の性質を保持することができるものがあり得るので
ある。
本発明のオドントグロップム リングスポット ウィル
スの遺伝子に対応するDNAI工、代表的にi工区1に
示される塩基配タリを有する二本鎖L)NAのうちの任
意の一部あるいに全部を有するものである。図1に示さ
れた配列のうち、上段vc記載の配列がオドントグロッ
サム リグンスポットウイルスのゲノムの十頼RNAに
対応する。1)NA浦であヱた。このよ5なり N A
のうちには、丁ドントグロッサム リングスポット ウ
ィルス遺伝子のうちの33Aタンパク質あるいヤニ外被
(コードンタンパク質の遺伝子のいずnp’ある(褐工
両万を富むものが挙げられる。更に本発明は上記二本鎖
DNAのうちの単にウィルスRNAに相補的なりNA鎖
のみでな(、もう一方のDNA@をも色合するものであ
る。
スの遺伝子に対応するDNAI工、代表的にi工区1に
示される塩基配タリを有する二本鎖L)NAのうちの任
意の一部あるいに全部を有するものである。図1に示さ
れた配列のうち、上段vc記載の配列がオドントグロッ
サム リグンスポットウイルスのゲノムの十頼RNAに
対応する。1)NA浦であヱた。このよ5なり N A
のうちには、丁ドントグロッサム リングスポット ウ
ィルス遺伝子のうちの33Aタンパク質あるいヤニ外被
(コードンタンパク質の遺伝子のいずnp’ある(褐工
両万を富むものが挙げられる。更に本発明は上記二本鎖
DNAのうちの単にウィルスRNAに相補的なりNA鎖
のみでな(、もう一方のDNA@をも色合するものであ
る。
更にまた1本発明は、図1で示さnるDNAの塩基配列
のうちの任意の一部からなるDNAwfr片をも色合す
る。こるいを工そのaa個を組み合わせて用いることに
より第1図で示される塩基配列を有するDNAから綽導
されるものである。
のうちの任意の一部からなるDNAwfr片をも色合す
る。こるいを工そのaa個を組み合わせて用いることに
より第1図で示される塩基配列を有するDNAから綽導
されるものである。
ここで使用できる制限#素とし′″Cは1例えば蛋白質
・核酸−apJE Vol、30413.p、1429
1445(1985)K−示されているようなものな
どを挙げることができる。さらに、例えばこのよったD
NA断片とじては、図1で示される塩基配列を有するD
NAを、制限酵素C1α■で処理し、2ケ所を開裂させ
、そうして得られる約3,87KbpのI)fit肩析
片、約L58KhpのDNA断片及び約0.56Xbp
のDNA断片であってよい。また別の例としては、図2
に示したようにして各種制限酵素を作用させて得られる
ものがあげられる。
・核酸−apJE Vol、30413.p、1429
1445(1985)K−示されているようなものな
どを挙げることができる。さらに、例えばこのよったD
NA断片とじては、図1で示される塩基配列を有するD
NAを、制限酵素C1α■で処理し、2ケ所を開裂させ
、そうして得られる約3,87KbpのI)fit肩析
片、約L58KhpのDNA断片及び約0.56Xbp
のDNA断片であってよい。また別の例としては、図2
に示したようにして各種制限酵素を作用させて得られる
ものがあげられる。
このように図1で示される4基部列を有するDNAに適
当な制限酵素を作用させて得られるDNA断片を二その
制限酵素が有する認lls位の特異性と1図1で示され
る塩基配列とρ)らいかなる配列を有するものであるか
は明らかである。さらに本発明を工、このよ5にして得
られたD rV A断片に、化学的な方法で塩基を付加
したつ、除去したりしたもの及び化学的な方法で合成さ
れたDNA断片をtTmしたものをも包含している。す
なわち、上記したようにして得られたD N A #片
をエキソヌクレアーゼにより短縮化したつ、あるいは撞
々のDNA断片にオリゴヌクVオチド又はポリヌクVオ
チドを付加することにより延長したりしたものをも包含
している。
当な制限酵素を作用させて得られるDNA断片を二その
制限酵素が有する認lls位の特異性と1図1で示され
る塩基配列とρ)らいかなる配列を有するものであるか
は明らかである。さらに本発明を工、このよ5にして得
られたD rV A断片に、化学的な方法で塩基を付加
したつ、除去したりしたもの及び化学的な方法で合成さ
れたDNA断片をtTmしたものをも包含している。す
なわち、上記したようにして得られたD N A #片
をエキソヌクレアーゼにより短縮化したつ、あるいは撞
々のDNA断片にオリゴヌクVオチド又はポリヌクVオ
チドを付加することにより延長したりしたものをも包含
している。
本発明はさらに図1に示された塩基配列の任意の一部あ
るいは全部のDNAgのいずrLD’をプローブとして
用い℃、それに対してノ・イブリダイズする遺伝子をも
包含するものである。
るいは全部のDNAgのいずrLD’をプローブとして
用い℃、それに対してノ・イブリダイズする遺伝子をも
包含するものである。
このよ5な遺伝子としては、実質的にオドントグロツサ
ム リングスポット ウィルス遺伝子中の全あるいは各
遺伝子と同一あるいに類似の機能を有するものがあげら
れ、さらにその遺伝子に対応するc D N A又はそ
の断片、あるいはそれらの相補鎖1) iV Aであっ
てよいものである。
ム リングスポット ウィルス遺伝子中の全あるいは各
遺伝子と同一あるいに類似の機能を有するものがあげら
れ、さらにその遺伝子に対応するc D N A又はそ
の断片、あるいはそれらの相補鎖1) iV Aであっ
てよいものである。
本発明のオド/トグロツサム リングスポット ウィル
スの遺伝子に対応するD N A h速本ウィルスの感
染を受けた損物体ρ・らそのウィルス粒子を率離し、矢
にそのウィルス粒子からウィルスRNAを分離し、次に
そのウィルスRNJを鋳型にし℃逆転写#素を作用させ
ることにより得ることができる。久にこのようにして得
られたDNATtZ、適当なりローユングベクターに組
み込まれて適当な宿主中に導入されて増すことができる
。このようにして得られたクローニングDNAは、それ
を適当な制限#累を使用して断片化した後、マキサムギ
ルバート法とかあるいにチエインターミネーション法等
の方法でその塩基配夕1jを解析することができる。
スの遺伝子に対応するD N A h速本ウィルスの感
染を受けた損物体ρ・らそのウィルス粒子を率離し、矢
にそのウィルス粒子からウィルスRNAを分離し、次に
そのウィルスRNJを鋳型にし℃逆転写#素を作用させ
ることにより得ることができる。久にこのようにして得
られたDNATtZ、適当なりローユングベクターに組
み込まれて適当な宿主中に導入されて増すことができる
。このようにして得られたクローニングDNAは、それ
を適当な制限#累を使用して断片化した後、マキサムギ
ルバート法とかあるいにチエインターミネーション法等
の方法でその塩基配夕1jを解析することができる。
このようにして−旦解明されたそのDNAの塩基配列は
。
。
その細見を利用してその任意の一部又は全部の塩基配列
を待つDNAを調製しそれをプローブとして用いて、天
然に存在する遺伝子から得られる遺伝子ライブラリーあ
る(・は/ヨツトガン遺伝子ライブラリーを検索し℃、
trたな表頁的にオドントグロツサム リングスポット
ウィルスの機能を有するR iV Aあるいを工それ
に対応するcl)NAなどを容易に椴得できる。
を待つDNAを調製しそれをプローブとして用いて、天
然に存在する遺伝子から得られる遺伝子ライブラリーあ
る(・は/ヨツトガン遺伝子ライブラリーを検索し℃、
trたな表頁的にオドントグロツサム リングスポット
ウィルスの機能を有するR iV Aあるいを工それ
に対応するcl)NAなどを容易に椴得できる。
したがって、本発明に、オドントグロツサム リングス
ポット ウィルス遺伝子、又はその対応6DNA、さら
にはそれらの核酸断片を検知するための分析法をも提供
する。
ポット ウィルス遺伝子、又はその対応6DNA、さら
にはそれらの核酸断片を検知するための分析法をも提供
する。
ヱた、不発明は、このようにして検知さnたオドントグ
ロツサム リングスポット ウィルス遺伝子に対応する
DNA又はその断片あるいはそれらの相補鎖DNAをク
ローニングする方法及び、そうして得らnたDNA又は
その断片あるいはそれらの相補鎖DNAvcも関する。
ロツサム リングスポット ウィルス遺伝子に対応する
DNA又はその断片あるいはそれらの相補鎖DNAをク
ローニングする方法及び、そうして得らnたDNA又は
その断片あるいはそれらの相補鎖DNAvcも関する。
本発明ハ、またオドントグロツサム リングスポットウ
ィルスの遺伝子に対応するDNA又(工その断片、ある
いはそれらの相補鎖な組み込んでなる遺伝子iji換え
ベクターにも関する。
ィルスの遺伝子に対応するDNA又(工その断片、ある
いはそれらの相補鎖な組み込んでなる遺伝子iji換え
ベクターにも関する。
本発明に、さらに図1で示さnる塩基配列を有する二本
−7)NAのうちの任意の一部あるい(工全部を含有す
るDNA及びその断片、並びくそnらの相補鎖を組み込
んでなる遺伝子組換えベクターに関する。
−7)NAのうちの任意の一部あるい(工全部を含有す
るDNA及びその断片、並びくそnらの相補鎖を組み込
んでなる遺伝子組換えベクターに関する。
本発明の遺伝子組換えベクターは前記不発明の万ドント
グロツサム リングスポット ウィルスの遺伝子に対応
するD NJ又にその断片あるいはそれらの相補鎖を、
当業者に広(知られていたり、当業界において広く使用
せられていに9、あるいは市販されており、容易に人手
することのでさる池の生物の基本的なベクターの単独あ
るいt工それらかも過当に調製されたベクターに組み換
えて得られる〕・イブリッドDNAであることができる
。
グロツサム リングスポット ウィルスの遺伝子に対応
するD NJ又にその断片あるいはそれらの相補鎖を、
当業者に広(知られていたり、当業界において広く使用
せられていに9、あるいは市販されており、容易に人手
することのでさる池の生物の基本的なベクターの単独あ
るいt工それらかも過当に調製されたベクターに組み換
えて得られる〕・イブリッドDNAであることができる
。
このような池の生物の基本的なベクターとして1工、例
えば犬&噛プラスミドベクター、コスミドベクター、フ
ァージベクター、枯草画用プラスミドベクター、スタフ
ィロコッカス白米のプラスミドベクター、?J#母用ベ
クメー、複数の宿主細胞にSいて目律壇殖できるンマト
ルベクターなどをめげることができる。これらベクター
は適当なプロモーター、制限酵素切断部位1選別用のマ
ーカーケ待つが、適宜それに必要な機能をさらに加えた
ものであってもよい。
えば犬&噛プラスミドベクター、コスミドベクター、フ
ァージベクター、枯草画用プラスミドベクター、スタフ
ィロコッカス白米のプラスミドベクター、?J#母用ベ
クメー、複数の宿主細胞にSいて目律壇殖できるンマト
ルベクターなどをめげることができる。これらベクター
は適当なプロモーター、制限酵素切断部位1選別用のマ
ーカーケ待つが、適宜それに必要な機能をさらに加えた
ものであってもよい。
ここでこの人腸函プラスミドベクターとして1工、例え
ば1、BR322、pBR325、pBR32B、pU
c19、pUCl 18、pUC119、pMB9、p
xc7などをあげることができ、さらにこのコスミドベ
クターとし℃ヲ鼠例えばpAY2662、plic79
、pJc720などかあげられる。
ば1、BR322、pBR325、pBR32B、pU
c19、pUCl 18、pUC119、pMB9、p
xc7などをあげることができ、さらにこのコスミドベ
クターとし℃ヲ鼠例えばpAY2662、plic79
、pJc720などかあげられる。
上記ファージベクターとしては、例えばλgtll、λ
gg・λC1λgt”λBζ λ1059、EMBL3
.4、λrEs−λB’、 シgo=y4A、 シャo
ン28、λL47−1,7−?ロン8.7ヤロ/17.
7τロ/20、ジャロン3.イ、ンτロン16A、シイ
Cl713A、’/ヤo /14−4.7ギロンL5A
などがあり5らnる。
gg・λC1λgt”λBζ λ1059、EMBL3
.4、λrEs−λB’、 シgo=y4A、 シャo
ン28、λL47−1,7−?ロン8.7ヤロ/17.
7τロ/20、ジャロン3.イ、ンτロン16A、シイ
Cl713A、’/ヤo /14−4.7ギロンL5A
などがあり5らnる。
ヱたこのi車重用プラスミドベクターとしC)工、劉え
V工、pUBllo、pUB112、pHY300PL
t(pT、41060、pTA1015、pTAIO2
0、pT−41050、pTP4、prp5などがあげ
らnる。
V工、pUBllo、pUB112、pHY300PL
t(pT、41060、pTA1015、pTAIO2
0、pT−41050、pTP4、prp5などがあげ
らnる。
さらに、スタフィロコッカス由来のプラスミドベクター
としては、例えば、psAO501,pc194、pc
221、pC223、pUBllo、ptjBllz、
などρ)あげられる。
としては、例えば、psAO501,pc194、pc
221、pC223、pUBllo、ptjBllz、
などρ)あげられる。
上記8母用ベクターとしてを工、例えば、YRp7、Y
lp32、YEp13、pY(、11pyc2、Ylp
l、pJ DB248、pJDB219、pJDB24
8、pDB248、pGK−1,2、pLC544、p
FY、’に1’;l、 p F Y M 225などの
Ylp蟹ベクター、YE−p塁ベクター、YRpベクタ
ーYCp@プラスミドベクターYRMp型ベクターなど
がうえらぶことかできる。
lp32、YEp13、pY(、11pyc2、Ylp
l、pJ DB248、pJDB219、pJDB24
8、pDB248、pGK−1,2、pLC544、p
FY、’に1’;l、 p F Y M 225などの
Ylp蟹ベクター、YE−p塁ベクター、YRpベクタ
ーYCp@プラスミドベクターYRMp型ベクターなど
がうえらぶことかできる。
さらにヱたこのシャトルベクターとしては、例えば、p
FYM225、YRp7、Y I p 5 白米75
スミト、pTA1302、あるいに上記ベクターのうち
1.Waf)宿主域を有するもの、さらには新しく制限
#索などを用いて適当なプロモーター、その他の制御配
列などを組み込んだり、あるいに互いのベクターを組み
合わせたものなどがあげられる。
FYM225、YRp7、Y I p 5 白米75
スミト、pTA1302、あるいに上記ベクターのうち
1.Waf)宿主域を有するもの、さらには新しく制限
#索などを用いて適当なプロモーター、その他の制御配
列などを組み込んだり、あるいに互いのベクターを組み
合わせたものなどがあげられる。
これら本発明のハイブリッドDNAは、本発明の第1図
で示される塩基配列な頁する二本@DNAを、好1しく
に過当な1ケ所あるいは複数ケ所で切断し5る制限#累
で処理した後、これを同一の制限#素で開裂させた上記
慣の生物の基本的なベクターに組み込むことにより製造
できる。
で示される塩基配列な頁する二本@DNAを、好1しく
に過当な1ケ所あるいは複数ケ所で切断し5る制限#累
で処理した後、これを同一の制限#素で開裂させた上記
慣の生物の基本的なベクターに組み込むことにより製造
できる。
fだ1本発明のハイブリッドDNAは、例えば精製した
フィルスより抽出したRNAを調型にして得られたcD
NAを、DNA結合酵素、例えばT4 DNA+)ガ
ーゼにより処理してその両端にE6oRKアダプターを
敗り付け、久ニこれを上記他の生物の基本的なベクター
、例えばpUC118をEcOR1分解後アルカリホス
ファターゼ処理したものと混合し、次にDNA結合酵素
、例えばT+DNAリガーゼにより結合1化させること
により得ることができる。
フィルスより抽出したRNAを調型にして得られたcD
NAを、DNA結合酵素、例えばT4 DNA+)ガ
ーゼにより処理してその両端にE6oRKアダプターを
敗り付け、久ニこれを上記他の生物の基本的なベクター
、例えばpUC118をEcOR1分解後アルカリホス
ファターゼ処理したものと混合し、次にDNA結合酵素
、例えばT+DNAリガーゼにより結合1化させること
により得ることができる。
上記アルカリホスファターゼ処理は、池の脱リン酸化酵
累処環で代用することも可能であり、その処理はD J
V Aの5′−禾漏の脱リン酸化をすることにより自己
環化を防止することができて、好ヱしいものである。
累処環で代用することも可能であり、その処理はD J
V Aの5′−禾漏の脱リン酸化をすることにより自己
環化を防止することができて、好ヱしいものである。
なお、この方法で使用できる制限#素としては、例えば
ECt)Rl、 A6e1. Pstl、HindII
[、Mis、 Xba l、EcaRV及びApa(な
どがあげられるが、また蛋白質核酸#ふメot、30.
/&i13.p−14251445(1985)K記載
されたものあるいを工その池の公知のものが使用し5こ
のようにして得られた本発明のバイブリドDNA61、
それぞれ適当な宿主細胞に導入することができる。
ECt)Rl、 A6e1. Pstl、HindII
[、Mis、 Xba l、EcaRV及びApa(な
どがあげられるが、また蛋白質核酸#ふメot、30.
/&i13.p−14251445(1985)K記載
されたものあるいを工その池の公知のものが使用し5こ
のようにして得られた本発明のバイブリドDNA61、
それぞれ適当な宿主細胞に導入することができる。
例えば、大腸菌プラスミドベクターとのハイブリッドD
NAの場合は、大腸菌に、枯草菌用プラスミドベクター
とのハイブリッドDNAcI)場合VCは、枯草菌に、
スメフィロコツカス由来のプラスミドベクターとのハイ
ブリッドDNAの場合にはスタフィロコッカス園に、酵
母用ベクターとのハイブリッドD lvA f)場合に
を工酵母函に、そして更に複数の宿主域を有する7ヤト
ルベクターとのハイブリッドDNA17)場合には適宜
適当な宿主に、公知の方法に従って導入することができ
る。
NAの場合は、大腸菌に、枯草菌用プラスミドベクター
とのハイブリッドDNAcI)場合VCは、枯草菌に、
スメフィロコツカス由来のプラスミドベクターとのハイ
ブリッドDNAの場合にはスタフィロコッカス園に、酵
母用ベクターとのハイブリッドD lvA f)場合に
を工酵母函に、そして更に複数の宿主域を有する7ヤト
ルベクターとのハイブリッドDNA17)場合には適宜
適当な宿主に、公知の方法に従って導入することができ
る。
このよ5なハイブリッドDNAの宿主への導入法として
は、例えば大腸1や枯草陶の場合は、公知の方法を通用
して例えば、CaC%処理により宿主細胞をコンピテン
ト細胞とした後に形質転換する。
は、例えば大腸1や枯草陶の場合は、公知の方法を通用
して例えば、CaC%処理により宿主細胞をコンピテン
ト細胞とした後に形質転換する。
また、酵母の場合には細胞壁溶解酵素、例えばグルスラ
ーゼ、ヘリカーゼ、ザイモリアーゼ等で処理してプロト
プラスト化した後、例えば、PEG及びCa 存在下
に形質等、又は還元剤、例えば2−メルカプトエタノー
ル等で処理して形質転換させる方法があげられる。
ーゼ、ヘリカーゼ、ザイモリアーゼ等で処理してプロト
プラスト化した後、例えば、PEG及びCa 存在下
に形質等、又は還元剤、例えば2−メルカプトエタノー
ル等で処理して形質転換させる方法があげられる。
このようにして得られた形質転換体は適当な桑畑耐性あ
るいは栄養要求性を利用して選び出されたり、あるいは
コロニーハイブリダイゼーション法を用いて選び出すこ
とができる。
るいは栄養要求性を利用して選び出されたり、あるいは
コロニーハイブリダイゼーション法を用いて選び出すこ
とができる。
さらにまた本発明のハイブリッドDNAは、七のうちに
更<mtの外米逼伝子ゲ組み込んでなるものであっても
よい。
更<mtの外米逼伝子ゲ組み込んでなるものであっても
よい。
このような外米遺伝子の成算とし℃/よりイルス、催物
、動物、#I困、1類などの生切体あるいは、化学合成
したものであって工い。
、動物、#I困、1類などの生切体あるいは、化学合成
したものであって工い。
本発明において使用することのできる外米遺伝子として
は、また種物を形質転換させるのに使用しつるものが好
ましく、そのようなものとしてC工、害虫又は寄生虫に
対する耐性付与遺伝子、病ぷ体に対する耐性何与遺伝子
、除草鋼抵抗性あるいは耐性に関4する遺伝子、その成
長性に影響を与える遺伝子、産業上有用なタンパク質又
はペプチド。
は、また種物を形質転換させるのに使用しつるものが好
ましく、そのようなものとしてC工、害虫又は寄生虫に
対する耐性付与遺伝子、病ぷ体に対する耐性何与遺伝子
、除草鋼抵抗性あるいは耐性に関4する遺伝子、その成
長性に影響を与える遺伝子、産業上有用なタンパク質又
はペプチド。
あるいはその他の物質をその体内で産生さぜるための遺
伝子、などがあげられる。
伝子、などがあげられる。
ここで、害虫又は寄生虫に対する耐性付与遺伝子として
は、昆虫又は線虫に対する殺虫性毒素産生遺伝子、ブロ
ティナーゼインヒビター誘導遺伝子、リボゾーム不活性
化りンパク質屋生遺伝子などかあげられる。
は、昆虫又は線虫に対する殺虫性毒素産生遺伝子、ブロ
ティナーゼインヒビター誘導遺伝子、リボゾーム不活性
化りンパク質屋生遺伝子などかあげられる。
除草剤抵抗性あるいは耐性に関4する遺伝子とじ℃)耘
バラコート耐性遺伝子、スルフロン耐性遺伝子、スルホ
ナミド耐性遺伝子、グリホセート耐性遺伝子、などがあ
げられる。
バラコート耐性遺伝子、スルフロン耐性遺伝子、スルホ
ナミド耐性遺伝子、グリホセート耐性遺伝子、などがあ
げられる。
また病原体に対する耐性付与遺伝子としてはウィルス耐
性付与遺伝子、各種?Ia菌産生毒素に対する耐性付与
遺伝子。
性付与遺伝子、各種?Ia菌産生毒素に対する耐性付与
遺伝子。
カナマイシン耐性などに関与する遺伝子などD・あげら
れる。
れる。
また、その成長性に影41?与える遺伝子としては、例
えば高温、低温、水不足あるいは肥料又は栄養素に対す
る改良された耐性を付与するような遺伝子があげられる
。
えば高温、低温、水不足あるいは肥料又は栄養素に対す
る改良された耐性を付与するような遺伝子があげられる
。
さらにまた催物で通常見出さnる酵素、貯蔵タンパク質
などを制御している遺伝子があげられる。また、その他
植物に導入されて有用あるとさする遺伝子をあげること
ができる。
などを制御している遺伝子があげられる。また、その他
植物に導入されて有用あるとさする遺伝子をあげること
ができる。
本発明のハイブリッドDNAを用いての形質転換方法に
つい℃、さも九−つの具体すjをあげて詳しく説明する
。
つい℃、さも九−つの具体すjをあげて詳しく説明する
。
例えは本発明のハイブリッドIJ l’VΔか、第1図
のDNAの両端KEcoRIアタ′ブタ−をT4DNA
リガーゼにより結合したものと、大fIk菌プラスミ
ドのpUC118のEcoR1j+解物とを、T4DN
Aリガーゼで結合したハイブリッドDNAである場合、
このハイブリッドDNAでもって公知の方法により、大
腸1i/J![109株を形質転換し、久にアンピシリ
ン50μ)/vを含有する寒天培地(2xTYの表面に
100 twhM IPTG及び2% $−g!Lf
含む)の5えに生じたコロニーに対し、ブルーホワイト
セレクション法(1αC−Z遺伝子の発現の有無による
選抜法)を施こして白色のコロニーのみを選別する。
のDNAの両端KEcoRIアタ′ブタ−をT4DNA
リガーゼにより結合したものと、大fIk菌プラスミ
ドのpUC118のEcoR1j+解物とを、T4DN
Aリガーゼで結合したハイブリッドDNAである場合、
このハイブリッドDNAでもって公知の方法により、大
腸1i/J![109株を形質転換し、久にアンピシリ
ン50μ)/vを含有する寒天培地(2xTYの表面に
100 twhM IPTG及び2% $−g!Lf
含む)の5えに生じたコロニーに対し、ブルーホワイト
セレクション法(1αC−Z遺伝子の発現の有無による
選抜法)を施こして白色のコロニーのみを選別する。
このようにして得られたコロニーは、プラスミドpUC
118のEcOR1部位に第1図で示されるよ5な塩基
配列を有するり、’i、4が挿入3nたハイブリッドI
) tV Aで形質転換4fi、た大′w5菌ノリ10
9株である。こ・ノ)形質転換体n・ら公兄の方法、・
てよりハイブリッドυ1V−4を分離することり・でき
る。
118のEcOR1部位に第1図で示されるよ5な塩基
配列を有するり、’i、4が挿入3nたハイブリッドI
) tV Aで形質転換4fi、た大′w5菌ノリ10
9株である。こ・ノ)形質転換体n・ら公兄の方法、・
てよりハイブリッドυ1V−4を分離することり・でき
る。
なお、以上のような手法を繰り返すことlこより、オド
ントグロッサム リングスポット ウィルス遺伝子の全
長に対応するcDNAの塩基配列を順次決定することも
oT籠である。
ントグロッサム リングスポット ウィルス遺伝子の全
長に対応するcDNAの塩基配列を順次決定することも
oT籠である。
このハイブリッドDNAは、それをそのままあるいは適
当な断片として下記に示すような植物細胞形質転換用の
ベクターに組み込んでもよいし、あるいはそれをそのま
まあるいは過当な処理を加えた後新たにハイブリッドD
NAを作成して宿主細胞を再度形質転換したり、あるい
はその−イブリッドDNAを保有する形質転換体を増殖
させて増やすこともできる。
当な断片として下記に示すような植物細胞形質転換用の
ベクターに組み込んでもよいし、あるいはそれをそのま
まあるいは過当な処理を加えた後新たにハイブリッドD
NAを作成して宿主細胞を再度形質転換したり、あるい
はその−イブリッドDNAを保有する形質転換体を増殖
させて増やすこともできる。
例えば、目的とするーイブリツドDNAを大量に調製す
るだのに一工、ハイブリッドL)NAケ含有する形質転
換体、−1えは大腸菌J、イ109株を増殖さぜ、さら
には必要に応じてハイブリッドDNAのみを増幅さぜる
ような処理ゲ1え、矢にその菌体を溶菌させ、得らnた
ハイブリッドDNA?含有する水溶液から超遠心法、電
気原動法などの手段を施こしてそのハイブリッドDNA
を分離しうる。
るだのに一工、ハイブリッドL)NAケ含有する形質転
換体、−1えは大腸菌J、イ109株を増殖さぜ、さら
には必要に応じてハイブリッドDNAのみを増幅さぜる
ような処理ゲ1え、矢にその菌体を溶菌させ、得らnた
ハイブリッドDNA?含有する水溶液から超遠心法、電
気原動法などの手段を施こしてそのハイブリッドDNA
を分離しうる。
例えば、ハイブリッドDNAが大、i!醜用のプラスミ
ドpUC118とのハイブリッドDNAである場合には
、該ハイブリッドD N Aを含む大腸菌の形質転換体
を公知の方法に従ってハイブリッドDNA増幅処理した
後公知の方法で溶場し、こうして得られたD 7■、4
含有溶液を、セシワムクロライド平衡密度勾配遠心法を
用いてコバレントIJ−クローズドサーキュラ−型のハ
イブリッドDNAのみを分離ことにより行なうことがで
きる。
ドpUC118とのハイブリッドDNAである場合には
、該ハイブリッドD N Aを含む大腸菌の形質転換体
を公知の方法に従ってハイブリッドDNA増幅処理した
後公知の方法で溶場し、こうして得られたD 7■、4
含有溶液を、セシワムクロライド平衡密度勾配遠心法を
用いてコバレントIJ−クローズドサーキュラ−型のハ
イブリッドDNAのみを分離ことにより行なうことがで
きる。
さらにまた、このようにして分lI!された・・イブリ
ッドυJVAは、クローニングの際に使用したと同じ制
限#素で処理することにより、オドントグロツサム リ
ングスポット ウィルスの遺伝子に対応するONA又は
その断片、特に寵lK示された塩基配列の任意の一部又
は全部を有するDNA断片と、ベクターDNAとに分け
ることができる。
ッドυJVAは、クローニングの際に使用したと同じ制
限#素で処理することにより、オドントグロツサム リ
ングスポット ウィルスの遺伝子に対応するONA又は
その断片、特に寵lK示された塩基配列の任意の一部又
は全部を有するDNA断片と、ベクターDNAとに分け
ることができる。
さら(またこうして得られたD iV A断片は、アガ
ロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲルなどを用い
たゲル電気永動によって互いに分離し1例えば当該DN
A断片を宮むバンド部分のゲルを切り取り、公知の方法
に従ってゲルよりDNA断片を抽出するなどして分離し
精製することにより、精製されたものを得ることができ
る。
ロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲルなどを用い
たゲル電気永動によって互いに分離し1例えば当該DN
A断片を宮むバンド部分のゲルを切り取り、公知の方法
に従ってゲルよりDNA断片を抽出するなどして分離し
精製することにより、精製されたものを得ることができ
る。
このようにして得られたDNAは、さらにまた発現用ハ
イブリッドD NAに組み換えて適当な宿主細胞に導入
させて発現させることができる。
イブリッドD NAに組み換えて適当な宿主細胞に導入
させて発現させることができる。
本発明においては、オドントグロッサム リングスポッ
ト ウィルス粒子を構成する33にタンパク質&ひ’/
l;ノパク質を宿主細胞中で発現させて取得することが
できる。
ト ウィルス粒子を構成する33にタンパク質&ひ’/
l;ノパク質を宿主細胞中で発現させて取得することが
できる。
不発明に従えば遺伝子組換えの手法?用いてそれらのタ
ンパク質入)一部のアミノ酸配列D・らなるペプチドを
取得することも、あるいはその構成アミノ酸の一部を置
換させたり、付加したり、欠失させることも容易に行な
うことができることは当業者であれば容易に理解でさよ
う。
ンパク質入)一部のアミノ酸配列D・らなるペプチドを
取得することも、あるいはその構成アミノ酸の一部を置
換させたり、付加したり、欠失させることも容易に行な
うことができることは当業者であれば容易に理解でさよ
う。
したがって、本発明のオドントグロッサム リングスポ
ット ウィルスの33にタンパク質及び外被タンパク質
。
ット ウィルスの33にタンパク質及び外被タンパク質
。
更ニはそれらの断片ペプチド化合物は、それらすべてを
包含するものである。
包含するものである。
なお、上記オドントグロッサム リングスポット ウィ
ルスの33fタンパク質ハ、タバコモザイク ウィルス
(r、w〆)の30にタンパク質と同様の機能を有する
ものである。
ルスの33fタンパク質ハ、タバコモザイク ウィルス
(r、w〆)の30にタンパク質と同様の機能を有する
ものである。
本発明の遺伝子組換えベクターは、前記本発明の丁ドン
トグロッサム リングスポット ウィルスの遺伝子((
対応するDNA又はその断片あるいは七nらの相補Sを
、当業者に広(却られたり、当業界において広(使用さ
れてぃた9、市販されており容易に入手することのでき
る植物細胞あるいは植物組織を形質転換し5るベクター
【組み換えて得られるハイブリッドDNAであることか
でさる。
トグロッサム リングスポット ウィルスの遺伝子((
対応するDNA又はその断片あるいは七nらの相補Sを
、当業者に広(却られたり、当業界において広(使用さ
れてぃた9、市販されており容易に入手することのでき
る植物細胞あるいは植物組織を形質転換し5るベクター
【組み換えて得られるハイブリッドDNAであることか
でさる。
このよ5な種物細胞あるいは櫃物組鐵を形質転換しうる
ベクターとしては1例えばダラム怠性菌のりゾビウム科
rhizogmnas) に保持され、植物にクラウンゴール病及び根毛病を引き
起こす原因プラスミドとして見出された1゛i プラス
ミド又はそnから誘導3nたプラスミド、及びd4 7
−ラスミド又はそrt711・ら誘導さlしたフ゛ラス
ミド、カリフラワーモザイクウィルス由来ベタメー、ゾ
エミニウイルス由来ベクター、酵母用ベクターとし℃知
られたンヤトルベクターなどかあげらn、植物細胞内で
自律複↓できたつ。
ベクターとしては1例えばダラム怠性菌のりゾビウム科
rhizogmnas) に保持され、植物にクラウンゴール病及び根毛病を引き
起こす原因プラスミドとして見出された1゛i プラス
ミド又はそnから誘導3nたプラスミド、及びd4 7
−ラスミド又はそrt711・ら誘導さlしたフ゛ラス
ミド、カリフラワーモザイクウィルス由来ベタメー、ゾ
エミニウイルス由来ベクター、酵母用ベクターとし℃知
られたンヤトルベクターなどかあげらn、植物細胞内で
自律複↓できたつ。
種物細胞の形質転換ができるものなどから選ばれて用い
ることができる。
ることができる。
ここで%疋Tiプラスミド又はそnから誘導されたプラ
スミドとしてイエ、そのオパインと総称される、−jえ
ばオクトビン、ツバリン、アグロピンによって分類さn
る各プラスミドがあげられ、またT−L)NA領領域含
むグラスミド、あるいはその地のオビ7分解、発癌性、
アゲロジン感受性などに関与する遺伝子の他、そのa衾
などに関与する遺伝子ケ組み合わく″′C江成さnたも
のがあげもねる。
スミドとしてイエ、そのオパインと総称される、−jえ
ばオクトビン、ツバリン、アグロピンによって分類さn
る各プラスミドがあげられ、またT−L)NA領領域含
むグラスミド、あるいはその地のオビ7分解、発癌性、
アゲロジン感受性などに関与する遺伝子の他、そのa衾
などに関与する遺伝子ケ組み合わく″′C江成さnたも
のがあげもねる。
このようなプラスミドとしては、p 、W (J IV
糸ベクタpGV 3850で代表41bるようなdLS
arm型のTiプラスミド、バイナリ−型ベクターなど
があげられる。
糸ベクタpGV 3850で代表41bるようなdLS
arm型のTiプラスミド、バイナリ−型ベクターなど
があげられる。
このようなプラスミドの代表的なものとしては例えVま
S。
S。
G、Rogmrs at ah、Kacotnbi
nα、I DNA nsa thado−1Ogy
、Ray its at aL、tA、
p 二i8 7−417−410(1989)ACa
tt Pra88 ic示さnているp 、M Cj
N 200、p、LfON5 U5、pMUN237な
どをあげることかでさる。
nα、I DNA nsa thado−1Ogy
、Ray its at aL、tA、
p 二i8 7−417−410(1989)ACa
tt Pra88 ic示さnているp 、M Cj
N 200、p、LfON5 U5、pMUN237な
どをあげることかでさる。
本発明の植物用のハイブリッド1)lVAは、′Aえは
、Tiプラスミド又はそれに由来するプラスミドベクタ
ーを使用した場合には、アグロバクテリウム・ツメファ
シェンスに、三親又雑法、二親交雑による自律可動性ベ
クターの直接転移により、あるいは直接的な取り込み法
、七のハイブリッドDNAを含有する他の細胞とのスフ
ェロプラスト融合により、リボゾーム法、あるいはウィ
ルスにバッグージとし℃の感染によるなどにより、導入
し、ついで、このアグロバクテリウム、ツメファシェン
スを植物細胞に感染させることによって植物細胞?形質
転換さゼ5る。
、Tiプラスミド又はそれに由来するプラスミドベクタ
ーを使用した場合には、アグロバクテリウム・ツメファ
シェンスに、三親又雑法、二親交雑による自律可動性ベ
クターの直接転移により、あるいは直接的な取り込み法
、七のハイブリッドDNAを含有する他の細胞とのスフ
ェロプラスト融合により、リボゾーム法、あるいはウィ
ルスにバッグージとし℃の感染によるなどにより、導入
し、ついで、このアグロバクテリウム、ツメファシェン
スを植物細胞に感染させることによって植物細胞?形質
転換さゼ5る。
さらにまたRsプラスミド又はそれに由来するプラスミ
ドベクターを用いた場合にはアグロバクテリウム・リゾ
ゲネスカ、上記アグロバクテリウムのツメファシェンス
ト同様!こして使用される。
ドベクターを用いた場合にはアグロバクテリウム・リゾ
ゲネスカ、上記アグロバクテリウムのツメファシェンス
ト同様!こして使用される。
これら、アグロバクテリウム細−を植物細胞に感染させ
るには、当業者に広く用いられている方法が利用できる
。
るには、当業者に広く用いられている方法が利用できる
。
このような方法とし”(fl、例えば、培養中の植物細
胞またに植物組織中に七のアグロバクテリウム細菌を加
え℃更に培養を続けるD・、栽培中の植物に直接感染さ
せるか、植物プロトプラストにその細菌を直接感染させ
るρ・、植物プロトプラストとその細菌のスフェロプラ
ストとを融合させるなどの方法をとることができる。
胞またに植物組織中に七のアグロバクテリウム細菌を加
え℃更に培養を続けるD・、栽培中の植物に直接感染さ
せるか、植物プロトプラストにその細菌を直接感染させ
るρ・、植物プロトプラストとその細菌のスフェロプラ
ストとを融合させるなどの方法をとることができる。
また1本発明の−・イブリッドL)NAは、直接に[*
細胞または櫂1I11!I組藏に導入さ6℃、そnを形
質転換させることかでさる。
細胞または櫂1I11!I組藏に導入さ6℃、そnを形
質転換させることかでさる。
このような方法とし′Chi、様々の公知方法D・便用
でさ、例えば411物のプロトプラストをポリエチレン
グリコール等の存在下キャリアーDNAと共に細胞に取
り込ませる方法。
でさ、例えば411物のプロトプラストをポリエチレン
グリコール等の存在下キャリアーDNAと共に細胞に取
り込ませる方法。
ホスファチジルセリンとコレステロールからなるリボゾ
ームの中にハイブリッドDNAを入れ、そnでもって植
物プロトプラストをポリエチレングリコール等の存在下
Jp7/−島力リシウムす液で処理する方法、マイクロ
インジエクシ7法、電気パルス法等があげろしる。
ームの中にハイブリッドDNAを入れ、そnでもって植
物プロトプラストをポリエチレングリコール等の存在下
Jp7/−島力リシウムす液で処理する方法、マイクロ
インジエクシ7法、電気パルス法等があげろしる。
こ5して形質転換さnた植物細胞又は植物組il&は、
当業者によ(知られた方法で再生さイて他物体とするこ
とかできる。このような他物体は、野外においてもある
いは温室内に′j6いても栽培することができる。
当業者によ(知られた方法で再生さイて他物体とするこ
とかできる。このような他物体は、野外においてもある
いは温室内に′j6いても栽培することができる。
以上!5i、8At、たことからも解るように、本発明
はオドントグロツサム リングスポット ウィルスの遺
伝子に対応するL)NA又は七の断片、あるいはそれら
の相補鎖を含有する遺伝子組羨えベクターで形質転換さ
れた形質転換体及びその作成法にも関するものであるこ
とは明らかである。
はオドントグロツサム リングスポット ウィルスの遺
伝子に対応するL)NA又は七の断片、あるいはそれら
の相補鎖を含有する遺伝子組羨えベクターで形質転換さ
れた形質転換体及びその作成法にも関するものであるこ
とは明らかである。
本発明に、さらにオドントグロツサム リングスポット
ウィルスのRNA遺伝子に対応するDNA及びその断片
、並びにそれらの相補鎖LISAのいずれかを用いたハ
イブリダイゼーション法にも@する。本発明を1、また
lf!fに第1図で示される塩基配伺の任意の一部ある
いは全部のDNA鎖のいずれかを用いたーイブリダイゼ
ー7ヨ7法にも関する。
ウィルスのRNA遺伝子に対応するDNA及びその断片
、並びにそれらの相補鎖LISAのいずれかを用いたハ
イブリダイゼーション法にも@する。本発明を1、また
lf!fに第1図で示される塩基配伺の任意の一部ある
いは全部のDNA鎖のいずれかを用いたーイブリダイゼ
ー7ヨ7法にも関する。
このハイブリダイゼーションは、種々の公知の手法で行
なうことができるこのハイブリダイゼーションは、f4
えば久のよ5な条件下に行なうことができる。
なうことができるこのハイブリダイゼーションは、f4
えば久のよ5な条件下に行なうことができる。
すなわち、被験ウィルスDNA¥ニトロセルロースフィ
ルターに1足した麦、11(1液、例えば、25惰、イ
tpo。
ルターに1足した麦、11(1液、例えば、25惰、イ
tpo。
(pH7,4)5XSさC,5xυashαrate液
(このDa 5hard t @gfX O,2%フィ
コール(か予電40.000)、0.2%ポリビニルピ
ロリドン(分子量30.000〜40.000 )及び
υ2囁ウシ皿渭アルブミン(画分V)からなる。)、5
0μ、/Uサケ***D NA 、及び50%ホルムアミ
ド液からなる緩衝液中で、37°C〜42℃にて3時間
から一夜の間プレーイブリタイゼーションを行なう。
(このDa 5hard t @gfX O,2%フィ
コール(か予電40.000)、0.2%ポリビニルピ
ロリドン(分子量30.000〜40.000 )及び
υ2囁ウシ皿渭アルブミン(画分V)からなる。)、5
0μ、/Uサケ***D NA 、及び50%ホルムアミ
ド液からなる緩衝液中で、37°C〜42℃にて3時間
から一夜の間プレーイブリタイゼーションを行なう。
次に以上のように処理されたニトロセルロースフィルタ
ーを本発明により得らnたウィルス遺伝子に対応する1
)NAの一部の配列からなるL)NAプローブを含有す
る緩衝液、fli&! 25 muシI KPO,(
ptl 7.4 ) 、 5xSSC,5XLl
ask(Lrdt溶液、5Q11y/112サケs子D
NA、50%*ルムアミド液、及び10%デキストラン
ff1R塩液からなる緩衝液中で、37℃〜42℃eこ
3いて6時(−1ρ)ら−便ハイブリタ゛イゼーンヨン
反応を行ない、矢にノ・イフリタイズしたウィルスI)
N A f(′茗云に便って恢出する。
ーを本発明により得らnたウィルス遺伝子に対応する1
)NAの一部の配列からなるL)NAプローブを含有す
る緩衝液、fli&! 25 muシI KPO,(
ptl 7.4 ) 、 5xSSC,5XLl
ask(Lrdt溶液、5Q11y/112サケs子D
NA、50%*ルムアミド液、及び10%デキストラン
ff1R塩液からなる緩衝液中で、37℃〜42℃eこ
3いて6時(−1ρ)ら−便ハイブリタ゛イゼーンヨン
反応を行ない、矢にノ・イフリタイズしたウィルスI)
N A f(′茗云に便って恢出する。
な、世1本発明において用いられ、そして遺伝子Ith
i1換技術にP6V−)−る一般的な方法及び当業者ん
とって常法であるような1去の詳しい説明(工1例えは
、T0MαルniαtL8 agαt rMoLac
sLar Con1ルg−A Laboratory
rdanhbaLjCold 、)pring tia
rbor Laboratory(1982) ; R
JFu、 ati、 「、イgchod iルEnz
ymoLogyJ468(1979)、100(198
3)、及び101(1983)Academic Pr
ess等・?参照丁Φことrz9容易に理解しつる。
i1換技術にP6V−)−る一般的な方法及び当業者ん
とって常法であるような1去の詳しい説明(工1例えは
、T0MαルniαtL8 agαt rMoLac
sLar Con1ルg−A Laboratory
rdanhbaLjCold 、)pring tia
rbor Laboratory(1982) ; R
JFu、 ati、 「、イgchod iルEnz
ymoLogyJ468(1979)、100(198
3)、及び101(1983)Academic Pr
ess等・?参照丁Φことrz9容易に理解しつる。
以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はこnら芙遁例シこ限定されるものではない。
本発明はこnら芙遁例シこ限定されるものではない。
液KfflJで?l1Mしたシンビジウムグ〕オドノト
グロツサムリングスポット ウィルス感染の晒葉乍よく
粉砕し、久にIJ、1%ナオグリコールを百〇pH7,
Qのリン酸堪言有峻責液を加えて懸濁し、久にカーゼケ
通して濾過する。久に濾液を四項化炭素で処理した後、
6チのポリエチレングリコ−A/6000、U、1 、
kl NaC1,1%rritonX−100となるよ
うに各試薬を加え、水上にて2時間静置した。
グロツサムリングスポット ウィルス感染の晒葉乍よく
粉砕し、久にIJ、1%ナオグリコールを百〇pH7,
Qのリン酸堪言有峻責液を加えて懸濁し、久にカーゼケ
通して濾過する。久に濾液を四項化炭素で処理した後、
6チのポリエチレングリコ−A/6000、U、1 、
kl NaC1,1%rritonX−100となるよ
うに各試薬を加え、水上にて2時間静置した。
矢にこの溶液を低速遠71L?(3000rpm、 1
5W間、4℃、TuMY−R520MB)しC、ウィル
スU子を含む成分を回収する。久にリン咳塩言有緩衝液
を加えて懸濁し、高速遠心処理(30,OU Orpw
h、 1時間、4℃、BECILMAN L8−
70.kf 、70 、 ITi rotor
)して、ウィルス粒子を沈殿として回収した。次に得
らnたウィルス粒子をさらに10〜40%のショll密
度石配遠心(25,70Orpm、24間、4℃、B
E CK Jf 、4 N5lF’40Ti)にかけ、
遠心チェーブの底部より分−分取する操作?施こしウ
ィルスを細化した。このよ5にし′″CM化したウィル
ス粒子より常法に従って51)さ−フェノール法により
ウィルス、’< lV Aを抽出した。
5W間、4℃、TuMY−R520MB)しC、ウィル
スU子を含む成分を回収する。久にリン咳塩言有緩衝液
を加えて懸濁し、高速遠心処理(30,OU Orpw
h、 1時間、4℃、BECILMAN L8−
70.kf 、70 、 ITi rotor
)して、ウィルス粒子を沈殿として回収した。次に得
らnたウィルス粒子をさらに10〜40%のショll密
度石配遠心(25,70Orpm、24間、4℃、B
E CK Jf 、4 N5lF’40Ti)にかけ、
遠心チェーブの底部より分−分取する操作?施こしウ
ィルスを細化した。このよ5にし′″CM化したウィル
ス粒子より常法に従って51)さ−フェノール法により
ウィルス、’< lV Aを抽出した。
実 施 例 2. ウィルスRJV Aからのcl)
NAの合成実N例1のようにして得られたlflウィル
スRNAの3′禾;4VC,PoLy(A)ポリメラー
ゼを用いてPo1y(A)%l−付加した。
NAの合成実N例1のようにして得られたlflウィル
スRNAの3′禾;4VC,PoLy(A)ポリメラー
ゼを用いてPo1y(A)%l−付加した。
次にオリゴd(T)をプライマーに用いAMV逆転写醇
素を用いて通常の方法に従って処理し、ウィルス/?
lV Aに相補的な第−鎖目のL)NAを合成した。
素を用いて通常の方法に従って処理し、ウィルス/?
lV Aに相補的な第−鎖目のL)NAを合成した。
上記オリゴd (T)ブライマーの代わりに、オドント
グロツサム リングスポット ウィルスの塩基配列から
合成プライマー?作成して用いることもできる。
グロツサム リングスポット ウィルスの塩基配列から
合成プライマー?作成して用いることもできる。
次にこのようにして得られたウィルスRlV A −1
) # Aからなるーイブリツド核1!l K RIV
aga&を作用させ、そり)RノVA@にニックを人n
、久にこのK rV−4をフ゛ライマーとして L)
N AポリラーゼIを用い第−嘘のDrVAに相補的な
第二鎖目のDNAの合成を行なった。仄にクレノウフラ
グメ/ト乞作用さイ℃オーツく一ノヘングを除去し℃、
cL)NAの画鴻を平滑床端とした。
) # Aからなるーイブリツド核1!l K RIV
aga&を作用させ、そり)RノVA@にニックを人n
、久にこのK rV−4をフ゛ライマーとして L)
N AポリラーゼIを用い第−嘘のDrVAに相補的な
第二鎖目のDNAの合成を行なった。仄にクレノウフラ
グメ/ト乞作用さイ℃オーツく一ノヘングを除去し℃、
cL)NAの画鴻を平滑床端とした。
上記処理を行なうにあたつ℃は、アマジャム−シャツ;
ン。
ン。
ファルマシア、コスモ・バイオ、生化学工業、第一化学
薬品、宝酒遺、相九純桑などから市販され℃いる谷櫨千
ット及びそれらの試薬を利用して行なうことができる。
薬品、宝酒遺、相九純桑などから市販され℃いる谷櫨千
ット及びそれらの試薬を利用して行なうことができる。
実 施 例 3. ウィルスcDNAのクローニング
実施例2で調製されたL)NA馨常法に促ってT4DN
Aリガーゼで処理し℃、その内床端部にECoR(アダ
プターを*’、1つけた。
実施例2で調製されたL)NA馨常法に促ってT4DN
Aリガーゼで処理し℃、その内床端部にECoR(アダ
プターを*’、1つけた。
このυtVAは常法に従って循々のベクターに組み込ん
でクローニングすることがCさるか、ここで&裔大腸@
7’ラスミド、、 j7 C118を用いてクローニ
ングする場合ケヅ1にとって説明する。
でクローニングすることがCさるか、ここで&裔大腸@
7’ラスミド、、 j7 C118を用いてクローニ
ングする場合ケヅ1にとって説明する。
上記しfこようにし℃実施例2で調製されたυlV、4
0両末端にE(、oR1アダプター?付加されたD i
V Aは、矢にポリヌクレオチドキナーゼを用いて常法
に従ってそのP:coRIアタ′ブタ一部のす/ハ化を
行なった。別に、プラスミドpUC118を制限#素E
coR1で37℃、2時間処理して開裂した。この−抹
化したpUcL18’tフェノール処理して、そこに含
1rLる制限酵素?不活性化した後、常法Vこ促ってア
ルカリフォスファターゼで処理し℃脱リン酸化した。
0両末端にE(、oR1アダプター?付加されたD i
V Aは、矢にポリヌクレオチドキナーゼを用いて常法
に従ってそのP:coRIアタ′ブタ一部のす/ハ化を
行なった。別に、プラスミドpUC118を制限#素E
coR1で37℃、2時間処理して開裂した。この−抹
化したpUcL18’tフェノール処理して、そこに含
1rLる制限酵素?不活性化した後、常法Vこ促ってア
ルカリフォスファターゼで処理し℃脱リン酸化した。
上記2櫨類のDNAviエタノール沈wiヲ施して回収
された恢、七n’en7 イケーショ7@衝漱C−66
s、M Tris−MCI CpH7,6)、6.6
、w MgC2,,105M DTT。
された恢、七n’en7 イケーショ7@衝漱C−66
s、M Tris−MCI CpH7,6)、6.6
、w MgC2,,105M DTT。
01朧イフイTI’〕に溶解ぎnた。仄にこnらの溶液
を混合し、史7fこ七σ)混8溶欣甲にf4 D +
V 、4 リ、勺−ゼケ塀−tて、16’cで2時間反
応ぎへ常法に便ってライT−ンヨン反応を行なった。久
lここの反応液乞用い、常1去、・ζ便って塩化力ルシ
ウム法によつ1コンピテントな’f、91cさnでいる
大腸菌je109の形質転換を行なった。矢に形質転換
さnた大腸菌J1%4109は、培地中でアノピシリン
耐性で且つLac−Z遺伝子の発現しないことを指標に
選択されて、最終的にpUC118のEcoRl切断部
位にオドントグロツサム リングスポット ウィルスの
遺伝子に対応するDNAまたはその断片の挿入さnたプ
ラスミドを保持する大腸菌コロニーケ得た。このように
して得らnた大腸菌コロニーから四つのコロニーを選び
、七rLそれオドントグロツサムリングスポット ウィ
ルスの遺伝子に対応する1iNAまたにその断片の挿入
されているプラスミドを得た。こnらのプラスミドレエ
、それぞれpORE5−25、pORt!:6−45、
pORE1033及びp(JR524と苗名された。
を混合し、史7fこ七σ)混8溶欣甲にf4 D +
V 、4 リ、勺−ゼケ塀−tて、16’cで2時間反
応ぎへ常法に便ってライT−ンヨン反応を行なった。久
lここの反応液乞用い、常1去、・ζ便って塩化力ルシ
ウム法によつ1コンピテントな’f、91cさnでいる
大腸菌je109の形質転換を行なった。矢に形質転換
さnた大腸菌J1%4109は、培地中でアノピシリン
耐性で且つLac−Z遺伝子の発現しないことを指標に
選択されて、最終的にpUC118のEcoRl切断部
位にオドントグロツサム リングスポット ウィルスの
遺伝子に対応するDNAまたはその断片の挿入さnたプ
ラスミドを保持する大腸菌コロニーケ得た。このように
して得らnた大腸菌コロニーから四つのコロニーを選び
、七rLそれオドントグロツサムリングスポット ウィ
ルスの遺伝子に対応する1iNAまたにその断片の挿入
されているプラスミドを得た。こnらのプラスミドレエ
、それぞれpORE5−25、pORt!:6−45、
pORE1033及びp(JR524と苗名された。
谷プラスミドのコード電域は凶2に漢式的に示しである
。
。
なお上記処理7行なうには、実施例2で記載したように
市販さnている各撞キット及び試薬?用いて行なうこと
かでさる。
市販さnている各撞キット及び試薬?用いて行なうこと
かでさる。
実 施 例 4. ウィルス6DNAの塩基配幻の決
定実施例3で得られたプラスミドを用いて、図2のシー
ケンスストラテジーに示した戦略で、L)NAf)@基
部列を決定した。
定実施例3で得られたプラスミドを用いて、図2のシー
ケンスストラテジーに示した戦略で、L)NAf)@基
部列を決定した。
過当な制限#素で断片化し1次に塩基配列γ決定しよう
とするL) tvA #r片を、ノAessing s
t aE 、が開発したM137アージベクターあ
るいはpUC118/119プラスミドベクターでもっ
てクローニングし、久にF、S61%g−デ5tat、
が開発したいわゆるジデオ千シ法(蛋白質核酸酵素Vo
L、29..I64.p294〜306(1984))
を適用してその塩基配列を決定した。
とするL) tvA #r片を、ノAessing s
t aE 、が開発したM137アージベクターあ
るいはpUC118/119プラスミドベクターでもっ
てクローニングし、久にF、S61%g−デ5tat、
が開発したいわゆるジデオ千シ法(蛋白質核酸酵素Vo
L、29..I64.p294〜306(1984))
を適用してその塩基配列を決定した。
図2に示さnているよ5にE:coRl、 Acc(、
Pstl、11ixd Ill、 M&s t、 Xb
a I、 Mco RV及ヒApαIノソれぞれの部位
から塩基配列が解析でさるようにpUC118及びpL
Ic 119のそれぞれのクローニング部位に各DNA
断片を挿入することがなされるが、過当な大きさに断片
化できない場合にはt!、zonscLaasa 匿(
エキンヌクレアーゼ厘)によるプリージョン処理を施こ
し、過当な各種の長さの断片とじ℃から、その塩基配列
を決定した。
Pstl、11ixd Ill、 M&s t、 Xb
a I、 Mco RV及ヒApαIノソれぞれの部位
から塩基配列が解析でさるようにpUC118及びpL
Ic 119のそれぞれのクローニング部位に各DNA
断片を挿入することがなされるが、過当な大きさに断片
化できない場合にはt!、zonscLaasa 匿(
エキンヌクレアーゼ厘)によるプリージョン処理を施こ
し、過当な各種の長さの断片とじ℃から、その塩基配列
を決定した。
上記の1云により決定さnたオドントグロツサム リン
グスポット ウィルス遺伝子に対応するD N A (
1)塩基配列2図1に示す。
グスポット ウィルス遺伝子に対応するD N A (
1)塩基配列2図1に示す。
図1に示されたL):VA@基配列配列ドントグC17
9ムリ/ゲスポット ウィルス遺伝子の全鎖長に相当す
るものではないが、その5ちに4式つィルス’) 33
K p ンパク貰に相当する領域及び外板(コート)
タンパク質に由由する領域が含まれている。
9ムリ/ゲスポット ウィルス遺伝子の全鎖長に相当す
るものではないが、その5ちに4式つィルス’) 33
K p ンパク貰に相当する領域及び外板(コート)
タンパク質に由由する領域が含まれている。
図IK示さrた配夕1jのうち、上段の配列に該ウィル
スケツムの十sfR:vA疋対応するcD、VAである
。図1に示さr、た塩基配列のうち、第5107塩目′
7)塩基ρ・ら第5583番目までの塩基ツク領域を発
現さくると、ウィルスの外被タンパク質活性を有する発
現物が得られる。なお崗1甲二不鎖の上段は5′−末端
から3′−床端方向への配列で示ざrて5つ、下段には
上段に対して相補的な配列D)左側3′−禾瑞より5′
−末端方向疋示さしている。
スケツムの十sfR:vA疋対応するcD、VAである
。図1に示さr、た塩基配列のうち、第5107塩目′
7)塩基ρ・ら第5583番目までの塩基ツク領域を発
現さくると、ウィルスの外被タンパク質活性を有する発
現物が得られる。なお崗1甲二不鎖の上段は5′−末端
から3′−床端方向への配列で示ざrて5つ、下段には
上段に対して相補的な配列D)左側3′−禾瑞より5′
−末端方向疋示さしている。
芙 施 fII5. ウィルスタンパク質の発現以
下の実施例では図1で示さnる塩基配列より、ウィルス
タンパク質をコードする遺伝子部分を分尊し、矢、てそ
の遺伝子から発現用ベクターを構築し、ついでこうして
得らnたベクターをもつ℃形質転換した宿主細胞により
産生さr5たタンパク質が、ウィルスタンパク質である
ことを確認した。
下の実施例では図1で示さnる塩基配列より、ウィルス
タンパク質をコードする遺伝子部分を分尊し、矢、てそ
の遺伝子から発現用ベクターを構築し、ついでこうして
得らnたベクターをもつ℃形質転換した宿主細胞により
産生さr5たタンパク質が、ウィルスタンパク質である
ことを確認した。
11J ウィルス外板タンパク質遺伝子の単離図17
)塩基配列よりオーブ/リーディングフV−ム(転写翻
訳砕:0RF)の探累な行なった。
)塩基配列よりオーブ/リーディングフV−ム(転写翻
訳砕:0RF)の探累な行なった。
次に探索さnたORFの内で、タバコモザイクウィルス
(T、ばV)CI)遺伝子構造と比較検討し℃、TMV
O外被タンパク質遺伝子の装置と同等の位置関係ケ示す
と共にほぼ同等量の分子量?コードすることかでさるO
RF、即ち図1で示ざnる塩基配列の第5107塩基目
から第5583塩基目までを、オドントグロツサム リ
ングスポット ウィルスの外被タフバク質をコードする
遺伝子部但と推定した。
(T、ばV)CI)遺伝子構造と比較検討し℃、TMV
O外被タンパク質遺伝子の装置と同等の位置関係ケ示す
と共にほぼ同等量の分子量?コードすることかでさるO
RF、即ち図1で示ざnる塩基配列の第5107塩基目
から第5583塩基目までを、オドントグロツサム リ
ングスポット ウィルスの外被タフバク質をコードする
遺伝子部但と推定した。
次に該υ−V 、4 #片を制限#素で切り出した。先
ず外被タフバク質をコードすることが推定される遺伝子
部分を言むDNA断片1例えはp (J RE 5 2
5 、 p ORI!、1す33又はpORE6−45
を制限#素xbα[(4950塩基d)及びNsz l
(3639H番目)を用いて実施例3に記載したよう
な通常の方法ンこ従って処理し一〇、χbα1−N5i
1断片を取得した。このxbα1−N5iI断片?使用
し1図3に示すようにして発現用ベクターを構築した。
ず外被タフバク質をコードすることが推定される遺伝子
部分を言むDNA断片1例えはp (J RE 5 2
5 、 p ORI!、1す33又はpORE6−45
を制限#素xbα[(4950塩基d)及びNsz l
(3639H番目)を用いて実施例3に記載したよう
な通常の方法ンこ従って処理し一〇、χbα1−N5i
1断片を取得した。このxbα1−N5iI断片?使用
し1図3に示すようにして発現用ベクターを構築した。
このxbα■−N3i(断片を実施例3に記載したよう
な通常の方法に従つ℃、プラスミドベクターpU(−1
19のXb(11及びPst1部位に結合した。こうし
て得ろnだハイブリッドDNAを実施例3′/c記載し
たような通常の方法に従つ℃大腸菌]、d109に導入
してプブクローニングし℃、そして形質転換8nだ大m
IIコロニーを選択した。
な通常の方法に従つ℃、プラスミドベクターpU(−1
19のXb(11及びPst1部位に結合した。こうし
て得ろnだハイブリッドDNAを実施例3′/c記載し
たような通常の方法に従つ℃大腸菌]、d109に導入
してプブクローニングし℃、そして形質転換8nだ大m
IIコロニーを選択した。
こうして得られた形質転換された大腸菌ココニーからサ
ブクローン化した目的ハイブリッドD IV Aプラス
ミドを回収した。次にこのプラスミドを′i!施例3に
記載されているように常法に従って制限酵素Kpnl及
びSmαIで処理して、1状のものとし、次にエキソヌ
クレアーゼIで通常の方法に従ってプリージョンを行な
った。ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子のO
RFの翻訳開始部位ATGコドンの4塩基手前まで、こ
のプリー7ヨ/を行なう。次てこの5′側平滑末ys4
に通常の方法を用いてEcoRI リンカ−を取りつけ
た。次に制限酵素Hind f[でもって通常の方法で
処理して、ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子
のORFを含有するE、oRl−HindII断片を取
得した。
ブクローン化した目的ハイブリッドD IV Aプラス
ミドを回収した。次にこのプラスミドを′i!施例3に
記載されているように常法に従って制限酵素Kpnl及
びSmαIで処理して、1状のものとし、次にエキソヌ
クレアーゼIで通常の方法に従ってプリージョンを行な
った。ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子のO
RFの翻訳開始部位ATGコドンの4塩基手前まで、こ
のプリー7ヨ/を行なう。次てこの5′側平滑末ys4
に通常の方法を用いてEcoRI リンカ−を取りつけ
た。次に制限酵素Hind f[でもって通常の方法で
処理して、ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子
のORFを含有するE、oRl−HindII断片を取
得した。
t2J ウィルス外被タンパク質遺伝子の発現上記工
程illで得らnたウィルス外被タンパク質遺伝子をコ
ードするDNAを含むDNA断片を、大WIJ菌用発現
ベクターpKK223−3のttc、R1及びHind
M部位に、実施例3に記載されているような通常の方法
に従って結合した。次にこのハイブリッドDNAを用い
、実施例3に記載されているような通常の方法(τ従っ
てコンピテントな大腸菌J、背101−形質転換し、大
yIJ菌での発現で行なった。
程illで得らnたウィルス外被タンパク質遺伝子をコ
ードするDNAを含むDNA断片を、大WIJ菌用発現
ベクターpKK223−3のttc、R1及びHind
M部位に、実施例3に記載されているような通常の方法
に従って結合した。次にこのハイブリッドDNAを用い
、実施例3に記載されているような通常の方法(τ従っ
てコンピテントな大腸菌J、背101−形質転換し、大
yIJ菌での発現で行なった。
このようにして形質転換さnた大腸菌は、先ずアンビシ
リ150μyを含む2XTYN地(5紅)で−夜培養を
行ない1次にその培養液から50μeを分取し、新鮮培
地[2XTY培地(5紅)〕で培養(37℃、2.5時
間)した。次にその培地シで100 rn−’yf I
/’ TG 5μg 添加(終濃度0.1mM)L
で後、さらに培養を40℃で1.5時間行なった。
リ150μyを含む2XTYN地(5紅)で−夜培養を
行ない1次にその培養液から50μeを分取し、新鮮培
地[2XTY培地(5紅)〕で培養(37℃、2.5時
間)した。次にその培地シで100 rn−’yf I
/’ TG 5μg 添加(終濃度0.1mM)L
で後、さらに培養を40℃で1.5時間行なった。
こうして得られた培養液を5分間水冷した後、その21
Ltの培養液より大腸菌を常法に従って集め、次いでT
E緩衝液で洗浄後、100μlのNcdrP O,(p
H7,0)液に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕(1
分間印加、30秒間停止の処理を6回繰り返す)にかけ
、大i菌よりタンパク質の抽出を行なった。
Ltの培養液より大腸菌を常法に従って集め、次いでT
E緩衝液で洗浄後、100μlのNcdrP O,(p
H7,0)液に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕(1
分間印加、30秒間停止の処理を6回繰り返す)にかけ
、大i菌よりタンパク質の抽出を行なった。
こうして得られた抽出液を154svsポリアクリルア
ミド電気泳動にかけた俊、ゲル上のタンパク質をニトロ
セルロースフィルターにエレクトロプロットする。オド
ントグロツサム リングスポット ウィルスに対する仇
血清を用いて、公知の方法に従ってイミュンブロットア
ッセイ(ウェスタンプロット法)にカケ、ニトロセルロ
ースフィルター上にそのオドントグロッサム リングス
ポット ウィルスに対する仇血清と反応するタンパク質
があるか否かを検ぺた。図3に示すように、上記のよ5
にして形質転換された大腸@JId109(pORcP
−D83と命名した。)から抽出されたタンパク質は、
オドントグロッサム リングスポット ウィルスに対す
る抗皿清と反応した。この抽出されたタンパク質はオド
ントグロッサム リングスポット ウィルスの外被タン
パク質であることが確認された。
ミド電気泳動にかけた俊、ゲル上のタンパク質をニトロ
セルロースフィルターにエレクトロプロットする。オド
ントグロツサム リングスポット ウィルスに対する仇
血清を用いて、公知の方法に従ってイミュンブロットア
ッセイ(ウェスタンプロット法)にカケ、ニトロセルロ
ースフィルター上にそのオドントグロッサム リングス
ポット ウィルスに対する仇血清と反応するタンパク質
があるか否かを検ぺた。図3に示すように、上記のよ5
にして形質転換された大腸@JId109(pORcP
−D83と命名した。)から抽出されたタンパク質は、
オドントグロッサム リングスポット ウィルスに対す
る抗皿清と反応した。この抽出されたタンパク質はオド
ントグロッサム リングスポット ウィルスの外被タン
パク質であることが確認された。
ここで得られた上記形質転換大&liJ&xo9株(p
tJRcP−D83と命名)は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄詫され℃いる(倣工研条寄第11134号
1:FEBM P−11134))。
tJRcP−D83と命名)は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄詫され℃いる(倣工研条寄第11134号
1:FEBM P−11134))。
+3) 淋]様な手法を繰り返すことにより、ウィル
スの33にタンパク質を取得することもできる。
スの33にタンパク質を取得することもできる。
図1は、オドントグロツサム リングスポット ウィル
ス遺伝子に対応するDNAの塩基配列?示す。上段の塩
基の配列がウィルスゲノムの中鎖RNAvc対応するc
L)NAの塩基配列を示すものである。 因2は、図1に示されたDNAの塩基配列を決定するだ
のの戦略と、それに使用さnた王な制限酵素の切断部位
を示す。各DNA断片は矢印の方向にその塩基配列が決
定された。 図3は、オドントグロツサム リングスポット ウィル
スの外被タンパク貰遺伝子発現用ベクターの構築法を模
式図4は、遺伝子組換えで得られたオドントグロツサム
リングスポット ウィルスの外被タン・くり質を同定す
るのに用いらnたイミュンブロットアツセイ試験の結果
を示すものである。 レーンAはオドントグロツサム リングスポット ウィ
ルス包子、レーンBは大助mJId109から抽出さn
たタンパク質、レーンCは実施f45で得られた形質転
換大l1li!J菌JM109CpORCP−D83と
命名)から抽出されたタンパク質をそれぞれ示す。 I+ −ノ −!+−I′+ へ し −ノ
r−〜 しノ リ じ −ノ、←
←< CJC:l uo ←く く← しつ 0
0図3 97.4に −66,2に −42,7に −310に =144に 区し今
ス遺伝子に対応するDNAの塩基配列?示す。上段の塩
基の配列がウィルスゲノムの中鎖RNAvc対応するc
L)NAの塩基配列を示すものである。 因2は、図1に示されたDNAの塩基配列を決定するだ
のの戦略と、それに使用さnた王な制限酵素の切断部位
を示す。各DNA断片は矢印の方向にその塩基配列が決
定された。 図3は、オドントグロツサム リングスポット ウィル
スの外被タンパク貰遺伝子発現用ベクターの構築法を模
式図4は、遺伝子組換えで得られたオドントグロツサム
リングスポット ウィルスの外被タン・くり質を同定す
るのに用いらnたイミュンブロットアツセイ試験の結果
を示すものである。 レーンAはオドントグロツサム リングスポット ウィ
ルス包子、レーンBは大助mJId109から抽出さn
たタンパク質、レーンCは実施f45で得られた形質転
換大l1li!J菌JM109CpORCP−D83と
命名)から抽出されたタンパク質をそれぞれ示す。 I+ −ノ −!+−I′+ へ し −ノ
r−〜 しノ リ じ −ノ、←
←< CJC:l uo ←く く← しつ 0
0図3 97.4に −66,2に −42,7に −310に =144に 区し今
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、オドントグロツサムリングスポットウィルス(Od
ontoglossum ringspot viru
s;ORSV)の遺伝子に対応するDNA及びその断片
、並びにそれらの相補鎖DNA。 2、次の塩基配列: 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表される二本鎖DNAのうちの任意の一部あるいは全
部を含有するものである請求項1に記載のDNA及びそ
の断片、並びにそれらの相補鎖DNA。 3、請求項2に記載のDNA鎖のいずれかとハイブリダ
イズすることができ、その塩基配列とは部分的に異なる
塩基配列を有しかつオドントグロッサムリングスポット
ウィルスの遺伝子としての性質を持つものである請求項
1に記載のDNA及びその断片、並びにそれらの相補鎖
DNA。 4、請求項1に記載の二本鎖DNAから、制限酵素E_
c_oR_ I 、A_c_e_ I 、P_s_t_ I 、
H_i_n_d_III、M_i_n_ I 、X_b_a_
I 、E_c_eRV及びA_p_a_ I のうちの一種
あるいは二種以上の制限酵素による開裂により生ずる請
求項2に記載のDNA及びその断片、並びにそれらの相
補鎖DNA。 5、オドントグロッサムリングスポットウィルスのRN
A遺伝子を単離する工程、その単離されたRNAよりそ
のRNAに相補的なcDNAを製造する工程よりなるこ
とを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のDNA
及び断片、並びにそれらの相補鎖DNAを製造する方法
。 6、得られたcDNAをさらにクローニングすることか
らなる請求項5に記載の方法。 7、オドントグロッサムリングスポットウィルスの遺伝
子に対応するDNA又はその断片、あるいはそれらの相
補鎖DNAを組み込んでなる遺伝子組換えベクター。 8、請求項2〜4のいずれかに記載のDNA又はその断
片、あるいはそれらの相補鎖DNAを組み込んでなる請
求項7に記載の遺伝子組換えベクター。 9、オドントグロッサムリングスポットウィルスの遺伝
子に対応するDNA又はその断片、あるいはそれらの相
補鎖DNAを含有する遺伝子組換えベクターで、形質転
換された形質転換体。 10、請求項8に記載の遺伝子組換えベクターで、形質
転換されたものである請求項9に記載の形質転換体。 11、宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母アグロバクテリ
ウム属菌、植物細胞である請求項9または10に記載の
形質転換体。 12、オドントグロツサムリングスポットウィルスの遺
伝子に対応するDNA又はその断片、あるいはそれらの
相補鎖DNAを組み込んでなる遺伝子組換えベクターで
もつて宿主細胞を形質転換させることよりなる形質転換
体の製造法。 13、請求項8に記載の遺伝子組換えベクターを用いる
ことからなる請求項12に記載の方法。 14、オドントグロツサムリングスポットウィルスのR
NA遺伝子、あるいはそのRNA遺伝子を逆転写して得
られたcDNA、あるいはさらにはそのcDNAをクロ
ーニングして得られた核酸を、請求項1〜4のいずれか
に記載のDNA及びその断片、並びにそれらの相補績か
ら選ばれたものからなるプローブとのハィブリダイゼー
シヨンによつて検知することを特徴とするオドントグロ
ツサムリングスポットウィルス関連遺伝子の分析法。 15、遺伝子組換え技術により製造されたオドントグロ
ツサムリングスポットウィルスの33Kタンパク質又は
その外被タンパク質あるいはそれらのペプチド断片化合
物。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1306626A JPH04144685A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | ORSV遺伝子の↓cDNA |
DE69014100T DE69014100T2 (de) | 1989-11-28 | 1990-11-28 | Cdns des orsv-virus gens. |
PCT/JP1990/001546 WO1991008296A1 (en) | 1989-11-28 | 1990-11-28 | Cdna of orsv gene |
EP90917547A EP0460217B1 (en) | 1989-11-28 | 1990-11-28 | cDNA OF ORSV GENE |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1306626A JPH04144685A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | ORSV遺伝子の↓cDNA |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04144685A true JPH04144685A (ja) | 1992-05-19 |
Family
ID=17959353
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1306626A Pending JPH04144685A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | ORSV遺伝子の↓cDNA |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0460217B1 (ja) |
JP (1) | JPH04144685A (ja) |
DE (1) | DE69014100T2 (ja) |
WO (1) | WO1991008296A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4317039A1 (de) * | 1993-05-21 | 1994-11-24 | Fischer Artur Werke Gmbh | Spreizdübel |
CN102043056A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-05-04 | 福建省亚热带植物研究所 | 同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6608241B1 (en) * | 1985-10-29 | 2003-08-19 | Monsanto Technology Llc | Protection of plants against viral infection |
-
1989
- 1989-11-28 JP JP1306626A patent/JPH04144685A/ja active Pending
-
1990
- 1990-11-28 WO PCT/JP1990/001546 patent/WO1991008296A1/ja active IP Right Grant
- 1990-11-28 DE DE69014100T patent/DE69014100T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-28 EP EP90917547A patent/EP0460217B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0460217B1 (en) | 1994-11-09 |
EP0460217A4 (en) | 1993-02-17 |
DE69014100T2 (de) | 1995-06-14 |
WO1991008296A1 (en) | 1991-06-13 |
DE69014100D1 (de) | 1994-12-15 |
EP0460217A1 (en) | 1991-12-11 |
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