JPH04124199A - Method of manufacturing blood coagulation 8 factor/von bilbrandt factor complex concentrate from total plasma - Google Patents
Method of manufacturing blood coagulation 8 factor/von bilbrandt factor complex concentrate from total plasmaInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は全血液血漿から高い特異性を有する■因子−７
オン・ビルプラント（Ｖａｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）
因子の濃縮物の製造方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides highly specific factor-7 from whole blood plasma.
Van Willebrand
The present invention relates to a method for producing a factor concentrate.
本発明を要約すれば、本発明は全（非−寒冷沈澱）血漿
から高い特異性を有する■因子−７オン・ビルプラント
因子複合体の濃縮物を製造する方法に関し、本方法は塩
化バリウムを用い、及び水酸化アルミニウムを用いる二
重処理によって予備精製することを含んで成り、次いで
本方法はＤＥＡＥ−７ラクトゲル型の陰イオン交換樹脂
によるクロマトグラフィーにより精製することを含んで
成り、本方法は溶剤−界面活性剤を用いる処理によるウ
ィルス不活性化段階を含んでおり、本方法は同じ血漿か
らフィブリノーゲン、アルブミン、免疫クロプリン、抗
トロンビン■、フィブロネクチン及びプロトロンビン複
合体を回収することを可能とするものであることであっ
て、本発明による方法を用いて得られる濃縮物は特に治
療用を対象としていることである。To summarize the present invention, the present invention relates to a method for producing a highly specific concentrate of Factor-7 on Virupando factor complex from whole (non-cryoprecipitated) plasma, the method comprising barium chloride. and prepurifying by dual treatment with aluminum hydroxide; Including a virus inactivation step by treatment with a solvent-detergent, the method makes it possible to recover fibrinogen, albumin, immunocloprin, antithrombin, fibronectin and prothrombin complex from the same plasma. The concentrate obtained using the method according to the invention is particularly intended for therapeutic use.
■因子の注射による血友病Ａの治療は普通に実施されて
おり、高純度の製剤の使用を必要としているが、一方で
はウィルスの感染の危険を減少させ、且つ他方では、注
射は度々繰り返されなければならないので、残留する汚
染物質があれば患者に望ましくない免疫応答の危険を誘
発する危険があり、これをを避けることが必要である。■Treatment of hemophilia A by injection of factors is commonly practiced and requires the use of highly pure preparations, which on the one hand reduces the risk of viral infection and, on the other hand, injections are often repeated. Any residual contaminants may pose a risk of an unwanted immune response in the patient, which must be avoided.
■因子を精製するためにヒトの血漿の処理を行うだめの
数種の方法が既に工業センターで使用されている。かよ
うな方法は各種の化学剤を用いる汚染蛋白質の沈澱、ゲ
ル透過クロマトグラフィー免疫アフィニティクロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び種々の
方法の各種の組み合わせを含んでいる。■ Several methods for processing human plasma to purify factors are already in use in industrial centers. Such methods include precipitation of contaminating proteins using various chemical agents, gel permeation chromatography, immunoaffinity chromatography, ion exchange chromatography, and various combinations of various methods.
血漿中には少量の■因子が存在するだけであるから、精
製方法の収量は解決さるべき主要な問題である。更に■
因子は不安定な蛋白質であり、他の血液因子（こより活
性化できる蛋白質である；しかし活性化条件においては
それは治療的価値を失う；従って精製方法及び最終的投
薬量もこの問題に取り組むように適応させなければなら
ない。Since only a small amount of factor 2 is present in plasma, the yield of the purification method is a major problem to be solved. Furthermore■
The factor is an unstable protein and can be activated by other blood factors; however, in activation conditions it loses its therapeutic value; therefore purification methods and final dosages should also address this issue. have to adapt.
本発明者はフランス特許出願第８８ ０７５３０号に記
載されており、高純度の■因子を得ることができる、イ
オン交換クロマトグラフィーを用いる精製方法を開発し
た。The present inventors have developed a purification method using ion exchange chromatography, which is described in French patent application No. 88 07530 and is capable of obtaining factor 1 in high purity.
しかし、この方法においては、他の方法により使用され
るものと同じく、使用される出発物質は血漿の寒冷沈降
画分である。この寒冷沈降段階は上澄液に留まる、■因
子の３０ないし４０％の損失を招く。However, in this method, as used by other methods, the starting material used is a cryoprecipitated fraction of plasma. This cryoprecipitation step results in a loss of 30 to 40% of the factor ■, which remains in the supernatant.
従って■因子の損失を抑制するためＪこ寒冷沈降されな
かった全血漿からの製造方法を開発することは有益であ
ろう。更に、かような方法は寒冷沈降法を実施すること
が困難である、設備の不備な製造センターに極めて有利
な簡易化をもたらすであろう。Therefore, it would be beneficial to develop a method for producing J from whole plasma that has not been cryoprecipitated in order to suppress the loss of factor. Furthermore, such a process would provide a highly advantageous simplification for poorly equipped manufacturing centers where cryoprecipitation methods are difficult to implement.
以上は本発明者が全血漿から■因子を精製する高純度で
、安定な濃縮物を得ることを可能とし、しかも極めて良
好な収率を与える、簡易な方法を開発した理由である。The above is the reason why the present inventor has developed a simple method that makes it possible to obtain a highly pure and stable concentrate for purifying factor (1) from whole plasma and provides an extremely good yield.
従って本発明は全血漿から■因子濃縮物を製造する方法
に関する。この方法はプロトロンビン複合体（■、■、
■、Ｘ因子）の構成分を除去するための予備精製、及び
ゲル及び溶離緩衝液の選択により■因子−７オンービル
プラント因子複合体を高純度で得ることを可能とする陰
イオン交換クロマトグラフィーによる精製を含んでいる
。Therefore, the present invention relates to a method for producing factor (1) concentrate from whole plasma. This method uses the prothrombin complex (■, ■,
(1) Prepurification to remove components of factor Includes graphical purification.
この方法は追加的精製段階の後に、フィブリノーゲン、
フィブロネクチン、アルブミン、免疫グロブリン及び抗
トロンビンｍのような他の血漿蛋白質の精製溶液を得る
ために使用することかできる。This method, after an additional purification step, produces fibrinogen,
It can also be used to obtain purified solutions of other plasma proteins such as fibronectin, albumin, immunoglobulins and antithrombin m.
本方法はヒトの血漿を用いて開発されたが、動物起源の
血漿にも等しく利用可能である。Although the method was developed using human plasma, it is equally applicable to plasma of animal origin.
かように本発明による方法は出発物質として全血漿、即
ち新鮮であっても又は保存するｌ；めに凍結してあって
もよいが、寒冷沈降されていない血漿を使用することを
可能とする。この血漿は抗凝固剤又は安定化溶液の存在
下で採取されることが有利である。通常は、クエン酸塩
−デキストロース−燐酸塩混合物が使用される；それに
■因子の任意の特異的安定剤を追加又は代用することも
有利である。The method according to the invention thus makes it possible to use whole plasma as starting material, i.e. plasma which may be fresh or stored; frozen, but which has not been cryoprecipitated. . Advantageously, this plasma is collected in the presence of an anticoagulant or stabilizing solution. Usually a citrate-dextrose-phosphate mixture is used; it is also advantageous to add or substitute thereto any specific stabilizer of factor II.
０．２ないし２Ｕ／１１２のヘパリン、ｌないし５ｍＭ
のＥＤＴＡ及び１ないし１０ｍＭのＣａＣＩ！の混合物
に、５ないし６０ｇ／１２の濃度にグルコースをできる
だけ添加して、血漿出発物質の安定剤溶液として都合良
く使用できる。0.2 to 2U/112 heparin, l to 5mM
of EDTA and 1-10mM CaCI! Glucose, preferably added to a concentration of 5 to 60 g/12, can be conveniently used as a stabilizer solution for the plasma starting material.
本発明による方法は、塩化バリウムでの沈澱及び水酸化
アルミニウムゲル上への吸着を組み合わせた最初の予備
精製段階を含んでいる。The process according to the invention comprises a first prepurification step combining precipitation with barium chloride and adsorption onto an aluminum hydroxide gel.
塩化バリウム処理はｐＨが６．５に調節された血漿を用
いて、ＩＭの塩化バリウム溶液を最終的に０．０８Ｍの
濃度が得られるまで、撹拌しながら添加することによっ
て行われることが有利であり、沈澱した蛋白質を除去す
るために５°ないし】０℃で遠心し、次いで上澄液を集
める処理が続いて行われる。沈澱した蛋白質はプロトロ
ンビン複合体又はその構成分を製造するために都合良く
採取することができる。Advantageously, barium chloride treatment is carried out with plasma adjusted to pH 6.5 by adding IM barium chloride solution with stirring until a final concentration of 0.08M is obtained. This is followed by centrifugation at 5° to 0°C to remove precipitated proteins, followed by collection of the supernatant. Precipitated proteins can be conveniently harvested for producing prothrombin complexes or components thereof.
次いで上澄液を３％の水酸化アルミニウムゲルとｐＨ６
，５で接触させると、それは残りの汚染蛋白質を吸収す
る；この処理に続いて低温槽内で５″ないし８°Ｃに冷
却し、上澄液を集め、それを５ａないし８℃で保存する
ことが行われる。The supernatant was then mixed with 3% aluminum hydroxide gel, pH 6.
, 5, it absorbs any remaining contaminating proteins; this treatment is followed by cooling in a cryostat to 5" to 8°C, collecting the supernatant and storing it at 5" to 8°C. things are done.
この上澄液を脱塩しなければならないが、それは次ぎの
クロマトグラフィー段階のための、０゜５ないし２Ｕ／
Ｉａ（ｌのヘパリンを添力ａした装入緩衝液の存在にお
ける限外濾過によって、又は同じ緩衝液の存在における
セファデックスＧ２５を用いるタロマドグラフィーによ
るかのいずれかによって行うことかできる。This supernatant has to be desalted, but it is free from 0°5 to 2 U/L for the next chromatography step.
It can be carried out either by ultrafiltration in the presence of a loading buffer supplemented with Ia(1) of heparin, or by talomadography using Sephadex G25 in the presence of the same buffer.
本発明による方法は次いで陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによる分離を含んでいる。本発明者は既にフランス
特許出願第８８ ０７５３０号に、低いイオン交換能及
び寸法の大きい細孔を有する形式の樹脂について、これ
が極めて寸法の大きい分子を保持することを可能とする
点を解明した利点を記載した。この長期の保持が樹脂と
の僅かに疎水性の結合の形成を可能とし、及び緩衝液の
イオン強度の選択によって固定された分子の選択的な脱
着が可能となる。The method according to the invention then comprises separation by anion exchange chromatography. The inventor has already disclosed in French Patent Application No. 88 07530 the advantages of a type of resin with low ion exchange capacity and large pores, which makes it possible to retain very large molecules. is listed. This long retention allows the formation of slightly hydrophobic bonds with the resin, and the selection of the ionic strength of the buffer allows selective desorption of the immobilized molecules.
この種の樹脂はフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅ＋）の
−般名で商業的に入手し得る。ＤＥＡＥ−フラクトゲル
６５０■及びＴ−又はＤ−ＭＡＥ−フラクトゲル（メル
ク［Ｍｅｒｃｋ］ ）が使用できる。これらの同じ樹脂
は現在“触毛（ｔｅｎｔａｃｕｌａｒ）型樹脂″として
供給者により記載された形状で入手できる。これらのマ
トリックスの構造はゲルの能力の増大に資する、正電荷
の固定表面を増大するように改頁されている。Resins of this type are commercially available under the generic name of Fractogel+. DEAE-Fructogel 650 and T- or D-MAE-Fructogel (Merck) can be used. These same resins are currently available in a form described by the supplier as "tentacular resins." The structure of these matrices is modified to increase the positively charged surface, which contributes to increased gel performance.
クロマトグラフィーカラムの装入緩衝液はｐＨ７に調節
されたクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを基剤と
した緩衝液であり、塩化力ルノウムを０．５ないし６ｍ
Ｍの間の濃度に、リジンを２ないし４９／Ｑの程度の濃
度に、及びグリシンを８ないし１１ｇ／（ｌの濃度に含
むことが有利である。工程の実施はこの塩化ナトリウム
濃度の予定された増大を含んで成る。The charging buffer for the chromatography column is a sodium citrate and sodium chloride based buffer adjusted to pH 7, with a concentration of 0.5 to 6 m
It is advantageous to include lysine in a concentration of the order of 2 to 49/Q and glycine in a concentration of 8 to 11 g/(l). It consists of an increase in
本発明による精製工程の実施はクロマトグラフィーカラ
ム上に上記の予備精製調製物を注入することを含む。規
定された条件（０，１１Ｍ ＮａＣＩ）下で、カラムは
７オン・ビルプラント因子−■因子複合体のような極め
て寸法の大きい分子を固定することができ、そしてフィ
ブリノーゲン、アルブミン、免疫グルプリン、抗トロン
ビン■及びフィブロネクチンを濾液として流出させる。Carrying out the purification process according to the invention involves injecting the above-described prepurification preparation onto a chromatography column. Under defined conditions (0,11 M NaCI), the column is able to immobilize very large molecules such as the 7-on-Viruplant factor-■ factor complex, as well as fibrinogen, albumin, immunoglobulins, anti- Thrombin ■ and fibronectin are allowed to flow out as a filtrate.
最適な■因子回収効率を達成することを目的とする本発
明の好適な形態の具体化によれば、クロマトグラフィー
カラムの溶離のだめの緩衝液のイオン強度は、−回だけ
塩化ナトリウム０．２７Ｍまで増大される。本発明の具
体化の他の形態によれば、この溶離工程はフィブロネク
チンを除去するため塩化ナトリウム０．１３Ｍまでイオ
ン強度を上げることによって先行される。According to a preferred embodiment of the invention aimed at achieving optimal factor recovery efficiency, the ionic strength of the elution reservoir buffer of the chromatography column is - times up to 0.27 M sodium chloride. Increased. According to another embodiment of the invention, this elution step is preceded by increasing the ionic strength to 0.13M sodium chloride to remove fibronectin.
これらの条件下で脱着され溶離された■因子−フォン・
ビルブラント因子複合体は、少なくとも５ないしＩＯＵ
／ｍｇに等しい特異的活性を有している。この方法の全
体的な収率は始めの血漿１１２当たり少なくとも３５０
Ｕであり、上記のように安定他剤混合物が初期血漿に添
加された場合は少なくとも５００ Ｕ／Ｑであることが
できる。■Factor desorbed and eluted under these conditions - von
The Willebrand factor complex contains at least 5 to IOU
It has a specific activity equal to /mg. The overall yield of this method is at least 350
U/Q, which can be at least 500 U/Q when a stable drug mixture is added to the initial plasma as described above.
次ぎの用途により、■因子−７オン・ビルプラント因子
複合体は更に精製段階を追加することができ、特に他の
クロマトグラフィーにより濃縮することができる。前記
のように、これはＤＥＡＥ−４はＴ／Ｄ−ＭＡＥ−フラ
クトゲルにより行うことができ：硫酸デキストラン、固
定化されたアミノーヘキ／ル、固定化されたヘパリン、
及びスルホプロピル樹脂及びアフィニティ又は免疫アフ
ィニティ樹脂のような他の支持体も使用できる。Depending on the next use, the factor 7-on-Viruplant factor complex can be subjected to further purification steps, in particular it can be concentrated by other chromatography. As mentioned above, this can be done by DEAE-4 T/D-MAE-Fructogel: dextran sulfate, immobilized aminohexyl, immobilized heparin,
Other supports such as sulfopropyl resins and affinity or immunoaffinity resins can also be used.
この追加的クロマトグラフィー段階は上記と同じ基礎的
緩衝液中で行われる。できるだけ濃縮された■因子を得
ることを目的とする、本発明の具体化の好適な形態によ
れば、この追加的クロマトグラフィーは最初のものと同
じ条件下で行われる、即ち、緩衝液のイオン強度を０．
２７ＭＮａＣ１に増大することによる単一的脱着条件を
用いて行われる。本発明の他の形態の具体化によれば、
残存する汚染蛋白質を除去するために緩衝液のイオン強
度を最初０．１３Ｍに増大させることが行われ、少なく
とも１０ないし２０ＬＪ／＋＊ｇの特異的活性を有する
高純度の■因子−７オン・ビルプラント因子複合体をを
得るために０．２７Ｍへの第二の増大が行われる。This additional chromatography step is performed in the same basic buffer as above. According to a preferred embodiment of the invention, which aims to obtain as concentrated a factor as possible, this additional chromatography is carried out under the same conditions as the first one, i.e. Set the strength to 0.
It is performed using single desorption conditions by increasing to 27M NaCl. According to another embodiment of the invention,
The ionic strength of the buffer was initially increased to 0.13M to remove any remaining contaminating proteins, and a highly purified Factor-7on. A second increase to 0.27M is performed to obtain the Virupand factor complex.
免疫グロブリン、アルブミン、抗トロンビン■、フィブ
リノーゲン及びフィブロネクチンのようなカラムの最初
の濾液の他の蛋白質も慣用のクロマトゲラフイー法によ
り精製及び濃縮することかできる。Other proteins in the initial filtrate of the column, such as immunoglobulin, albumin, antithrombin, fibrinogen and fibronectin, can also be purified and concentrated by conventional chromatography techniques.
本発明による方法は又既知の技術によるウィルス不活性
化旭理を含む。例えば溶剤−界面活性剤を用いる処理の
ように化学薬品が使用される場合は、クロマトグラフィ
ーが不活性化剤を確実に除去するように、いずれか一つ
のクロマトグラフィー段階に先立って行うことが推奨さ
れる。The method according to the invention also includes virus inactivation according to known techniques. If chemicals are used, e.g. solvent-surfactant treatments, it is recommended to precede any one chromatography step to ensure that the chromatography removes the inactivating agent. be done.
■因子−７オン・ビルプラント因子複合体の濃縮物及び
上記の方法を用いて得られる他の血漿蛋白質の濃縮物は
又本発明の目的である。Concentrates of factor-7 on viruplant factor complex and of other plasma proteins obtained using the above method are also objects of the present invention.
該濃縮物は薬局法の標準法に従って製剤化され、治療目
的に使用することができる。The concentrate can be formulated according to standard methods of pharmacy law and used for therapeutic purposes.
下記の実施例は本発明の具体化の二つの形態を説明する
ものであるが、しかし本発明の範囲を限定するものでは
ない。The following examples illustrate two forms of implementation of the invention, but are not intended to limit the scope of the invention.
実施例 Ｉ
抗凝固剤／安定化剤（例えばクエン酸塩−デキストロー
ス−燐酸塩）の存在において採血された、新鮮な血漿、
又は２２−２５℃で解凍されｔ；凍結血＊２５０ｍｆｆ
を用い、酢酸でｐＨを６．５に調節する。Example I Fresh plasma drawn in the presence of anticoagulants/stabilizers (e.g. citrate-dextrose-phosphate),
or thawed at 22-25°C; frozen blood*250 mff
and adjust the pH to 6.5 with acetic acid.
ａ）予ｆ７１！！精製
ｐ Ｈ６，５で２０ｍＱの１Ｍ塩化バリウムを蝿動式ポ
ンプを用いて０．０８Ｍの最終濃度が得られるまで添加
する。塩化バリウムは４ないし８ｍＣ毎分の速度で添加
され、混合物を室温で１５分間撹拌する。a) Pref71! ! 20 mQ of 1M barium chloride at purified pH 6.5 is added using a rotary pump until a final concentration of 0.08M is obtained. Barium chloride is added at a rate of 4 to 8 mC per minute and the mixture is stirred at room temperature for 15 minutes.
次いで混合物を８℃で２０分間７００ｒｐｍで遠心し、
次いで上澄液を回収する。The mixture was then centrifuged at 700 rpm for 20 min at 8°C.
The supernatant is then collected.
次いで血漿ＩＱ当たり２．３ｇの割合で水酸化アルミニ
ウムゲル（３％のＡｌ（ＯＨ）３を有するアルヒドロゲ
ル・ユーロビオ［Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｅｕｒ。Aluminum hydroxide gel (Alhydrogel Eur with 3% Al(OH)3) was then applied at a rate of 2.3 g per plasma IQ.
−ｂｉｏ］）上に吸着させる。ｐＨを６．５に調節し、
温度を低温槽中で５℃に下げる。混合物を５℃で２７０
０ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄液を回収し、５℃で保
存する。-bio]). Adjust the pH to 6.5,
The temperature is lowered to 5°C in a cryostat. The mixture was heated to 270°C at 5°C.
Centrifuge at 0 rpm for 20 minutes, collect the supernatant, and store at 5°C.
この処理によってプロトロンビン複合体（■、■、■、
Ｘ因子）の各成分を除去することができ、それらは採取
され、既知の方法で精製することができる。Through this treatment, the prothrombin complex (■, ■, ■,
Each component of Factor X) can be removed, and they can be collected and purified by known methods.
アルヒドロゲル処理単独法ではプロトロンビン及び他の
ＰＰ５Ｂの成分を完全に除去することかできず、及び塩
化バリウム処理のみでは成程度Ｘ因子、プロトロンビン
及びとりわけ■因子が残るから、これらの二つの処理を
組み合わせることにより、特に満足すべき結果を得るこ
とができる。Alhydrogel treatment alone cannot completely remove prothrombin and other PP5B components, and barium chloride treatment alone leaves only a small amount of factor X, prothrombin, and especially factor Particularly satisfactory results can thus be obtained.
こうして集められた上澄液は、ＩＵ／＋＊Ｒのヘパリン
を加えた次ぎのクロマトグラフィー段Ｎ（下記参照）の
緩衝液の存在における限外濾過か、又は同じ緩衝液中で
のセファデックスＧ２５によるクロマトグラフィーのい
ずれかによって脱塩される。The supernatant thus collected is subjected to ultrafiltration in the presence of buffer for the next chromatography step N (see below) with the addition of IU/+*R heparin or Sephadex G25 in the same buffer. Desalted either by chromatography.
次いで溶剤−界面活性剤を用いる慣用のウィルス不活性
化剋理が２４℃で６時間行われる。（この処理方法は欧
州特許出願環０．１３１．７４０号に記載されている。A conventional virus inactivation process using a solvent-detergent is then carried out at 24° C. for 6 hours. (This treatment method is described in European Patent Application Circular 0.131.740.
）
ｂ）クロマトグラフィーによる精製
予備精製され、透析された上澄液はクロマトグラフィー
濾過段階に付される。２．６ｃｍの直径及び３０ｃ＋ｍ
の有効高さを有し、その中１０ｃ＋ｍはＤＥＡＥ−７ラ
クトゲルーＴＳＫ６５０＠樹脂（メルク）カ充填されて
いるに２６／３カラム（ファルマシア［Ｐｈａｒｍａｃ
１ａｌ−ウプサラ、スエーデン）が使用される。b) Chromatographic purification The prepurified and dialyzed supernatant is subjected to a chromatographic filtration step. 2.6cm diameter and 30c+m
It has an effective height of 26/3 column (Pharmacia
1al-Uppsala, Sweden) is used.
カラム装入及び試料溶解用緩衝液の組成は下記の通りで
ある：クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ；塩化カルシウム
、ＩｍＭ；グリシン、９９／１２；リジン、３ｇ／β。The composition of the column loading and sample dissolution buffer is as follows: sodium citrate, 10mM; calcium chloride, ImM; glycine, 99/12; lysine, 3g/β.
この緩衝液に塩化ナトリウムを添加し、最終濃度０．１
１Ｍ及びｐＨ７に調節する。Add sodium chloride to this buffer to a final concentration of 0.1
Adjust to 1M and pH 7.
試料をカラムに１００ ｍＱ／時間の速度で注入する。Inject the sample onto the column at a rate of 100 mQ/hour.
フィブリノーゲン、アルブミン、免疫グロブリン、抗ト
ロンビン■及びフィブロネクチンを含む、非吸着蛋白質
、並びにウィルス不活性化剤を除去するために装入緩衝
液でカラムを洗浄する。The column is washed with loading buffer to remove unadsorbed proteins, including fibrinogen, albumin, immunoglobulins, antithrombin and fibronectin, as well as virus inactivators.
次いで緩衝液のイオン強度を塩化ナトリウム０゜２７Ｍ
に増やして、■因子−フォン・ビルブラント因子を脱着
する。Next, the ionic strength of the buffer solution was adjusted to 0°27M sodium chloride.
, and remove the ■ factor - von Willebrand factor.
この方法を用いて得られる■因子溶液は５ないし１Ｑｒ
Ｕ／＋ｍｙの特異的活性を有し、カラムに注入した血漿
に関する精製効率は６０ないし８０％の間である。二つ
の因子、■因子及びリストセチン補助因子単位で表現さ
れたフォン・ヒルプラント因子の濃度について、１．Ｕ
／ＩＬＩに近い比率が常時観察される。■The factor solution obtained using this method is 5 to 1 Qr.
It has a specific activity of U/+my and the purification efficiency for plasma injected onto the column is between 60 and 80%. For the concentration of two factors, factor ① and von Hilplant factor expressed in units of ristocetin cofactor, 1. U
A ratio close to /ILI is always observed.
この■因子の溶液の純度は生成物を濃縮できる追加的ク
ロマトグラフィー分離工程により更に僅かに向上させる
ことができる。例えば上記と同じ装入条件下でＤＥＡＥ
−フラクトゲルの第二のカラムが使用され、残留する汚
染蛋白質を除去する０、１３ＭのＮａＣｌを用いる予備
洗浄が実施される。次いで緩衝液のイオン強度を塩化ナ
トリウム０．２７Ｍまで増大させ、高度に精製され且つ
濃縮された■因子−７オン・ビルプラント因子複合体を
脱着させて溶離する。The purity of this factor 1 solution can be further improved slightly by an additional chromatographic separation step which allows the product to be concentrated. For example, DEAE under the same charging conditions as above.
- A second column of fructogel is used and a pre-wash with 0.13M NaCl is carried out to remove residual contaminating proteins. The ionic strength of the buffer is then increased to 0.27M sodium chloride to desorb and elute the highly purified and concentrated factor 7-Viruplant factor complex.
第二のクロマトグラフィー濃縮段階は限外濾過によって
代替することができる。The second chromatographic concentration step can be replaced by ultrafiltration.
本発明の具体化の通常の形態によれば、クロマトグラフ
ィーによる第一の精製段階はＤＥＡＥフラクトゲル樹脂
を用いて行われる。しかし又ＤＥＡＥ−７ラク［・ゲル
の性質と等しい性質を有する、ＴＭＡＥ−フラクトゲル
（ＴＭＡＥ−ｈリメチルアミノエチル）又はＤＭＡＥ−
フラクトゲル（ＤＭＡＥ−ジーＭＡＥ）のような、メル
クにより市販されている新しい樹脂を用いても極めて良
好な結果が得られた。又メルク社により開発され、Ｗ、
ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）により１９８９年６月ストッ
クホルムの“液体クロマトグラフィー会議ＣＣｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ）″で発表された“触毛Ｑｅｎｔａｃｕｌａ
ｒ）ｌ”の新型樹脂を使用することもできる。According to a common form of implementation of the invention, the first chromatographic purification step is carried out using a DEAE fructogel resin. However, TMAE-fractogel (TMAE-hlimethylaminoethyl) or DMAE-
Very good results were also obtained using new resins marketed by Merck, such as Fractogel (DMAE-MAE). Also developed by Merck & Co., W.
Müller at the "Liquid Chromatography Conference CConfe" in June 1989 in Stockholm.
Rence on Liquid Chromatog
"Qentacula" announced at "Raphy)"
It is also possible to use a new type of resin.
実施例 ２
本発明の具体化の他の形態は、やや低い収率及び僅かに
向上した特異性を持った■因子−７オン・ビルプラント
因子濃縮物を同時に与えると共に、フィブリノーゲン及
びフィブロネクチンの濃縮物の製造を可能とするもので
ある。Example 2 Another form of embodiment of the invention provides simultaneously a factor-7 concentrate with a slightly lower yield and slightly improved specificity, and a concentrate of fibrinogen and fibronectin. This makes it possible to manufacture
本方法はＤＥＡＥ−７ラクトゲルの第一のカラムから■
因子−フォン・ビルブラント因子複合体の溶離までは実
施例１と同一である。This method starts from the first column of DEAE-7 lactogel.
The steps up to the elution of the factor-von Willebrand factor complex were the same as in Example 1.
フィブリノーゲン、抗トロンビン■、アルブミン及び免
疫グロブリンはカラムによって保持されず、濾液中に回
収できる。Fibrinogen, antithrombin ■, albumin and immunoglobulins are not retained by the column and can be recovered in the filtrate.
■因子−７オン・ビルプラント因子は残留する汚染蛋白
質を固体しないように、０．１７Ｍの塩化ナトリウムの
イオン強度における緩衝液の装入により、ＤＥＡＥ−７
ラクトゲルによる第二のクロマトグラフィー分離段階に
よって精製及び濃縮できる：塩化ナナトリウムイオン強
度を０．２７Ｍに増大させることにより、■因子−７オ
ン・ビルプラント因子複合体を脱着し、溶離することに
より１０ないし２０１Ｕ／１１９の特異的活性がこうし
て得られる。■Factor-7 On Billeprand's factor was prepared by charging DEAE-7 with a buffer solution at an ionic strength of 0.17M sodium chloride to prevent residual contaminating proteins from solidifying.
It can be purified and concentrated by a second chromatographic separation step on a lactogel: by increasing the sodium chloride ionic strength to 0.27M, the factor-7 on Billeplant factor complex is desorbed and eluted by 10 A specific activity of 201 U/119 is thus obtained.
フィブリノーゲン及びフィブロネクチンは次いで既知の
クロマトグラフィー法を用いて精製及び濃縮でき、フラ
ンス特許出顯第８８ ０７５３０号に記載されたように
、治療用として適当な性質を有する溶液を与える。Fibrinogen and fibronectin can then be purified and concentrated using known chromatographic methods to give a solution with suitable therapeutic properties, as described in French Patent No. 88 07530.
血漿の他の蛋白質は慣用の分別方法を使用して精製及び
濃縮することができる。Other proteins in plasma can be purified and concentrated using conventional fractionation methods.
実施例 ３
精製効率は始めの血漿に、その解凍から２５℃まで上げ
る際に下記の混合物：
ヘパリン：ｌＵ／＋Ｑ
ＥＤＴＡ ： ２ｍＭ又は０．７４ｇ／Ｑ塩化カルシウ
ム：６ｍＭ又は０．６７９／（１を添加することにより
なお更に向上することができる。Example 3 Purification efficiency was determined by adding the following mixtures to the initial plasma from its thawing to 25°C: Heparin: 1U/+Q EDTA: 2mM or 0.74g/Q Calcium chloride: 6mM or 0.679/(1 Further improvement can be achieved by adding it.
更に５ないし６０９／（ｌの間のグルコースヲ更にこの
溶液に添加することができる。In addition, between 5 and 609/l of glucose can also be added to this solution.
次いで酢酸を添加することによりｐＨを６．５に下げる
。The pH is then lowered to 6.5 by adding acetic acid.
精製段階は実施例１又は２のようにして行われる。The purification step is carried out as in Example 1 or 2.
これらの条件下で精製工程の全体の収率は、初期血漿Ｉ
Ｑ当たり少なくとも５００Ｕの■因子凝固活性蛋白質（
■：Ｃ）に等しい。Under these conditions the overall yield of the purification step is lower than the initial plasma I
At least 500 U of factor coagulation active protein (
■: Equal to C).
これは蛋白質１１１Ｉｇ当たり１０ないし３０単位の■
因子凝固活性蛋白質（■・Ｃ）の特異的活性に対し、■
因子活性の５５ないし６５％の全体的回収率に対応する
。This is 10 to 30 units per 111 Ig of protein.
For the specific activity of factor coagulation active protein (■・C), ■
This corresponds to an overall recovery of 55-65% of factor activity.
本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。The main features and aspects of the invention are as follows.
１、全血漿を塩化バリウムを用い、及び水酸化アルミニ
ウムを用いる二重処理による予備精製、及び極めて大き
い寸法の分子の保持を可能とする陰イオン交換樹脂によ
る精製に付することを特徴とする、高い特異的活性を有
する■因子−７オン・ビルプラント因子複合体の安定な
濃縮物を製造する方法。1. characterized by subjecting the whole plasma to a double treatment with barium chloride and with aluminum hydroxide, and to purification with an anion exchange resin, which allows the retention of molecules of very large size; 2. A method for producing a stable concentrate of factor-7 on viruplant factor complex having high specific activity.
２、全血漿が新鮮であるか又は凍結した血漿である、上
記１に記載の方法。2. The method according to 1 above, wherein the whole plasma is fresh or frozen plasma.
３．０．２ないし２Ｕ／ｍＱのヘパリン、ｌないし５ｍ
ＭのＥＴＤＡ及びｌないし１０ｍＭのＣａＣ１□から成
る安定剤混合物が血漿に添加される、上記ｌ又は２に記
載の方法。3.0.2 to 2 U/mQ heparin, l to 5 m
3. The method according to item 1 or 2 above, wherein a stabilizer mixture consisting of M ETDA and 1 to 10 mM CaCl□ is added to the plasma.
４、安定剤混合物が更に５ないし６０ｙ／Ｑの濃度のグ
ルコースを含む、上記３に記載の方法。4. The method according to 3 above, wherein the stabilizer mixture further comprises glucose at a concentration of 5 to 60y/Q.
５、予備精製が
ａ）塩化バリウムによる沈澱に続いて遠心及び上澄液の
採取、
ｂ）水酸化アルミニウムゲルによる吸着に統いて冷間遠
心及び上澄液の採取、
Ｃ）脱塩処理
を含んで成る、上記１ないし４のいずれか一つに記載の
方法。5. Prepurification includes a) precipitation with barium chloride followed by centrifugation and collection of supernatant, b) adsorption with aluminum hydroxide gel followed by cold centrifugation and collection of supernatant, and C) desalting treatment. The method according to any one of 1 to 4 above, comprising:
６、塩化バリウムによる沈澱がｐＨ６，５においてＩＭ
の塩化バリウムの溶液を撹拌しながら添加し、次いで５
ないし１０℃で遠心し、及び上澄液を採取することによ
り行われる、上記５に記載の方法。6. Precipitation with barium chloride is IM at pH 6.5.
of barium chloride is added with stirring, then 5
5. The method according to 5 above, which is carried out by centrifuging at 10 to 10°C and collecting the supernatant.
７、水１ｍ化アルミニウムゲルによる吸着がｐＨ６，５
で３％ゲルで行われ、次いで迅速に５℃に冷却され、５
℃で遠心され、及び上澄液が採取される、上記５又は６
に記載の方法。7. Adsorption by water 1m aluminum gel at pH 6.5
run on a 3% gel at 5°C and then rapidly cooled to 5°C.
5 or 6 above, centrifuging at °C and collecting the supernatant.
The method described in.
８、脱塩が継続して行われるクロマトグラフィー段階用
の、ヘパリンが添加されている、装入緩衝液の存在にお
ける限外濾過により行われる、上記５ないし７のいずれ
か一つに記載の方法。8. The method according to any one of 5 to 7 above, carried out by ultrafiltration in the presence of a loading buffer, to which heparin has been added, for a chromatography step in which desalting is carried out continuously. .
９、脱塩が継続して行われるクロマトグラフィー段階用
の、ヘパリンが添加されている、装入緩衝液の存在にお
けるセファデックスＧ２５のカラムによるクロマトグラ
フィーにより行われる、上記５ないし７のいずれか一つ
に記載の方法。9. Any one of the above 5 to 7, carried out by chromatography on a column of Sephadex G25 in the presence of a loading buffer, to which heparin has been added, for a chromatographic step in which desalting is carried out continuously. The method described in.
１０、予備精製を受けた血漿の上澄液が極めて大きい寸
法の分子を排除しない陰イオン交換ゲルヲ含むクロマト
グラフィーカラム上に注入され、フィブリノーゲン、ア
ルブミン、免疫グロブリン、杭トロンビン■及びフィブ
ロネクチンを濾液中に流出させる、上記ｌないし９のい
ずれか一つに記載の方法。10. The prepurified plasma supernatant is injected onto a chromatography column containing an anion exchange gel that does not exclude molecules of extremely large size, and fibrinogen, albumin, immunoglobulins, thrombin, and fibronectin are collected in the filtrate. 10. The method according to any one of 1 to 9 above, wherein the method is caused to flow out.
１１、クロマトグラフィーゲルがＤＥＡＥ又はＴ−又は
Ｄ−ＭＡＥ型の基が固定されている種類のビニル重合体
のゲルである、上記１ないし１０のいずれか一つに記載
の方法。11. The method according to any one of 1 to 10 above, wherein the chromatography gel is a gel of a vinyl polymer of the type on which DEAE or T- or D-MAE type groups are fixed.
１２、重合体ゲルが７ラクトゲルである、上記１１に記
載の方法。12. The method according to 11 above, wherein the polymer gel is 7-lactogel.
１３、クロマトグラフィーカラム装入緩衝液がグリシン
及びリジンを含み、０．１．１Ｍの塩化ナトリウムが添
加され、及びｐＨ７に調節された、クエン酸ナトリウム
及び塩化力ルンウム基剤の緩衝液である、上記１０ない
し１２のいずれか一つに記載の方法。13. The chromatography column loading buffer is a sodium citrate and chloride based buffer containing glycine and lysine, added with 0.1.1 M sodium chloride, and adjusted to pH 7. The method according to any one of 10 to 12 above.
１４、緩衝液が８ないしｆ１ｇ／１２のグリシン及び２
ないし４ｇ／Ｑのリジンを含む、上記１３に記載の方法
。14, buffer solution is 8 to f1g/12 glycine and 2
14. The method according to 13 above, comprising 4 to 4 g/Q of lysine.
１５、緩衝液のイオン強度が塩化ナトリウムの０．２７
Ｍまで増大されて、クロマトグラフィーカラムから■因
子−７オン・ビルプラント因子複合体を脱着する、上記
１０ないし１４のいずれか一つに記載の方法。15. The ionic strength of the buffer is 0.27 of sodium chloride.
15. The method according to any one of 10 to 14 above, wherein the factor-7-on-Viruplant factor complex is desorbed from a chromatography column.
１６、緩衝液のイオン強度がフィブロネクチンを除去す
る、塩化ナトリウムの０．１３Ｍまで増大サレ、次いで
クロマトグラフィーカラムから■因子−フォン・ビルブ
ラント因子複合体を脱着する、塩化ナトリウムの０−２
７Ｍまで増大される、上記１０ないし１４のいずれか一
つに記載の方法。16. The ionic strength of the buffer is increased to 0.13 M of sodium chloride, which removes fibronectin, and then 0-2 of sodium chloride, which desorbs the factor-von Willebrand factor complex from the chromatography column.
15. The method according to any one of 10 to 14 above, wherein the method is increased to 7M.
１７、クロマトグラフィーカラムから脱着された■因子
−７オン・ヒルプラント因子複合体か追加的精製段階及
びクロマトグラフィーによる濃縮に付される、上記ｌな
いし１６のいずれか一つに記載の方法。17. The method according to any one of 1 to 16 above, wherein the factor-7 on Hilplant factor complex desorbed from the chromatography column is subjected to an additional purification step and chromatographic concentration.
１８、追加的クロマトグラフィーが下記：ＤＥＡＥ−又
はＴ／Ｄ−ＭＡＥ−７ラクトゲル、固定化アミノーヘキ
ンル、固定化ヘパリン、硫酸デキストラン、スルホプロ
ピル、又はアフィニティ又は免疫アフィニティ樹脂：か
ら選択されたイオン交換樹脂を用いて行われる、上記ｌ
ないし１７のいずれか一つに記載の方法。18. Additional chromatography using an ion exchange resin selected from: DEAE- or T/D-MAE-7 lactogel, immobilized aminohequinyl, immobilized heparin, dextran sulfate, sulfopropyl, or affinity or immunoaffinity resin. The above l
18. The method described in any one of 17 to 17.
１９、追加的クロマトグラフィーが塩化ナトリウム０．
１７Ｍに調節された緩衝液を用いて行われ、イオン強度
を二段階に分けて０．１３Ｍに、次いで０．２７Ｍの増
大させることを含む、上記１７又は１８に記載の方法。19.Additional chromatography with sodium chloride 0.
19. The method according to 17 or 18 above, which is carried out using a buffer adjusted to 17M and comprising increasing the ionic strength in two steps to 0.13M and then to 0.27M.
２０、追加的クロマトグラフィーが塩化ナトリウムを０
．１７Ｍに調節された緩衝液を用いて行われ、イオン強
度を０．２７Ｍに一回増大させることを含んで成る、上
記１７又は１８に記載の方法。20.Additional chromatography eliminates sodium chloride
．． 19. The method according to claim 17 or 18, carried out with a buffer adjusted to 17M and comprising increasing the ionic strength once to 0.27M.
２１、上記１０に記載のクロマトグラフィー濾液中に存
在する蛋白質が追加的精製及び濃縮段階に付される、上
記１ないし１４のいずれか一つに記載の方法。21. The method according to any one of 1 to 14 above, wherein the protein present in the chromatography filtrate according to 10 above is subjected to an additional purification and concentration step.
２２、慣用のウィルス不活性化処理が任意のクロマトグ
ラフィー段階に先立って溶剤−界面活性剤を用いて行わ
れる、上記１ないし２１のいずれか一つに記載の方法。22. A method according to any one of 1 to 21 above, wherein a conventional virus inactivation treatment is carried out using a solvent-detergent prior to any chromatography step.
２３、上記１ないし２２のいずれか一つに記載の方法に
より得られる、■因子−フォン・ビルブラント因子複合
体濃縮物。23. A factor (2)-von Willebrand factor complex concentrate obtained by the method described in any one of 1 to 22 above.
２４、上記ｌないし１４のいずれか一つ及び２１又は２
２に記載の方法により得られる、血漿から誘導された蛋
白質濃縮物。24, any one of the above l to 14 and 21 or 2
2. A protein concentrate derived from plasma, obtained by the method described in 2.
２５、治療用として製剤化されている、上記２３又は２
４に記載の濃縮物。25. 23 or 2 above, which is formulated for therapeutic use.
Concentrate according to 4.
Claims (1)
ウムを用いる二重処理による予備精製、及び極めて大き
い寸法の分子の保持を可能とする陰イオン交換樹脂によ
る精製に付することを特徴とする、高い特異的活性を有
するVIII因子−フォン・ビルブラント因子複合体の安定
な濃縮物を製造する方法。1. characterized by subjecting the whole plasma to a double treatment with barium chloride and with aluminum hydroxide, and to purification with an anion exchange resin, which allows the retention of molecules of very large size; A method for producing a stable concentrate of factor VIII-von Willebrand factor complex with high specific activity.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2240177A JP2931655B2 (en) | 1990-09-12 | 1990-09-12 | Method for producing blood concentrate VIII-Fon-Vilbrand factor complex concentrate from whole plasma |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04124199A true JPH04124199A (en) | 1992-04-24 |
| JP2931655B2 JP2931655B2 (en) | 1999-08-09 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7498146B2 (en) | 1996-03-15 | 2009-03-03 | Baxter Innovations Gmbh | Stable factor VIII/von willebrand factor complex |
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1990
- 1990-09-12 JP JP2240177A patent/JP2931655B2/en not_active Expired - Fee Related
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| JP2931655B2 (en) | 1999-08-09 |
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