JPH04113270A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分、特に生物学的流体試
料中の特定微量成分を測定する方法に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に極微量含有される物質を検出する
方法として、各種分析法の開発がなされてきた。その分
析法は、主として免疫反応をその原理とするものである
。上記原理を用いる免疫測定方法は、種々のものが開発
されており、精度の高いものとして知られている。

免疫測定方法は、１９５８年、ベルソン（Ｂｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標識
した、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インシ
ュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定方法が広く用いられ
てきた。

これ以来、標識化合物として、放射性同位元素以外のも
のが種々開発されてきた。他の標識化合物としては、例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バタテ
リオファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍光性分子等
が挙げられる。

免疫測定方法は、均一系免疫測定法と、非均一系免疫測
定法の２つに大別される。すなわち、抗原抗体反応生成
物（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ体）の分離（
以後Ｂ／Ｆ分離という）が必要な非均一系免疫測定法と
Ｂ／Ｆ分離の必要がない均一系免疫測定法とにわかれて
いる。このうち、測定対称物質が高分子である場合には
、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均一系免疫測定法が利用されて
いる。

〔発明が解決しようとする課題〕

非均一系免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つ
として、Ｂ／Ｆ分離があり、操作を煩雑なものとしてき
た。また、Ｂ／Ｆ分離以外にも、試薬の調整、標識物質
、基質、反応停止液等の添加等が非均一系免疫測定法の
操作を煩雑なものとしている。

非均一系免疫測定法の別の問題点としては免疫反応に長
時間を要するという点が挙げられる。

例えば、非均−系免疫測定の１つであるサンドイツチ法
は通常、１次免疫反応に２時間、２次免疫反応に１時間
を要するのが普通である。

特開平２−８３４４８号では上記問題点のうち、操作性
の改良について言及しているが、これは従来からある免
疫測定方法と従来からある乾式測定法の技術を組合せた
もので、免疫反応段階の操作は改良されておらず、免疫
反応時間についても全く改良されていない。

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は、非均一系免疫測定法にお
ける煩雑な操作を不要とすると共に、従来、長時間を要
した免疫測定時間を大幅に短縮させるものである、流体
試料中の微量成分、特に生物学的流体試料中の特定微量
成分を定量するための免疫測定方法を提供するものであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は免疫測定方法に関する発
明であって、非均一系免疫測定法を用いて試料中の特定
成分を分析する方法において、免疫反応若しくは免疫反
応に準する生物活性を示す物質の特異反応の結果生成す
る、不溶化担体に結合した標識体と、不溶化担体に結合
しないで遊離の状態で存在する標識体とを含有する混合
液の一定量を、乾式分析素子に滴下し、該遊離の状態で
存在する標識体量を測定することにより、試料中の特定
成分を分析することを特徴とする。

本発明をより詳しく説明すれば、非均一系免疫測定法に
おいて、標識された抗体（若しくは抗原）と、一定量の
抗体（若しくは抗原）が不溶化担体に化学的及び／又は
物理的に結合された不溶化抗体（若しくは不溶化抗原）
、及び、試料中の抗原（又は抗体）とを接触させ、免疫
反応させた後、液相と固相の混合液の一定量を直接、試
薬を含有させた乾式分析素子に滴下し、乾式分析素子に
Ｂ／Ｆ分離を行わせ、液相の標識体（Ｆｒｅｅ体）の活
性を測定することにより、生物学的流体試料中の特定微
量成分を簡便な操作で、かつ迅速に分析するものである
。

例えば抗体（又は抗原）を粒径２ｍｍ以下のポリアクリ
ルアミドのような適当な担体に化学的及び／又は物理的
に結合させ、不溶化抗体（若しくは不溶化抗原）を得、
これを用いて免疫反応させた後、液相と固相を含む混合
液の一定量を乾式分析素子に滴下する。不溶化担体の選
択及び処理、乾式分析素子の作成において創意工夫する
ことで、滴下された混合液のうち、不溶化担体を乾式分
析素子上に第１図（断面図）及び第２図（平面図）で示
すような状態で存在させることに成功した。第１図及び
第２図は本発明の免疫測定方法の測定原理を説明するた
めの模式図であり、符号１は乾式分析素子、２は不溶化
担体、３はＢ体の乾式分析素子上の広がり、４はＦ体の
乾式分析素子中での広がりを意味する。すなわちＢ体（
不溶化担体に結合した標識体）は乾式分析素子上の積層
する形で残るが、Ｆ体（不溶化担体に結合しないで遊離
の状態で存在する標識体）は、素子中に幅広く存在する
ことになる。また、第２図かられかるようにＢ体がつく
る円面積に比べ、Ｆ体のつくる面積が大きい。つまり第
２図においてドツトで示した部分にはＦ体のみが存在す
ることになり、Ｂ／Ｆ分離が行われる。Ｂ体がＦ体と同
等に広がってしまう場合には、広がらないよう、乾式分
析素子上に抑制物、例えばリングのようなものをおいた
り、素子表面に凹凸をつけるなどをしてもよい。Ｆ体の
標識物のみが存在する部分（第２図中ドツトで示した部
分）の標識物の活性を直接、又は乾式分析素子に内蔵し
た試薬とＦ体の標識物の反応により生成される物質を測
定することにより、流体試料中の微量成分が測定できる
。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液等が使用しつるが、好ましくは生物由
来の流体試料例えば、血液、血しょう、血清、脳せき髄
液、だ液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しつる流体試料中での特定成分とは、
その特定成分に特異的に結合する物質が存在する物質又
は物質群である。すなわち、ポリペプチド、タンパク質
、複合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホ
ルモン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げ
られる。具体的には特開昭６２−９０５３９号、同６３
−１３１０６２号各公報等に記載の物質、又は物質群を
挙げることができるが、これらに限定されるものではな
い。

本発明に適用しうる標識物質としては、例えば、酵素、
酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質
（酵素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を活
性化する物質など）酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質な
どが挙げられる。

具体的な物質としては特開昭６２−９０５３９号公報等
に記載のものが挙げられるが、好ましくは酵素、又は蛍
光物質であり、更に好ましくはβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、
アミラーゼの少なくとも１つから選択された酵素である
。

上記酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は
、公知のものが使用できる。具体的には、特開昭６１−
２９２０６０号、同６２−９０５３９号、同６３−１３
１０６２号、同６３−４５５６２号各公報、特願昭６３
−２１９８９３号明細書等に記載の物質、又は物質群が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。

これら標識物質の抗体又は抗原への結合は、当業者間で
知られている公知の試薬と公知の方法で行うことができ
、更にくわしく言えば石ノ栄治、河合　忠、宮井　漸縮
「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１９７８年
刊）や日本臨床病理学全編「臨床病理」臨時増刊特集第
５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用
−」　（臨床病理刊行会、１９８３年刊）などに記載さ
れた方法を参考にすることができる。

本発明で使用する抗体は、その由来を特に限定されるも
のではなく、は乳動物等に抗原を投与、免疫して得られ
る抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知の方
法である（右田俊介編「免疫化学」中山書店第７４〜８
８頁参照）硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈
殿法、セファデックスゲルによるゲルろ適法、イオン交
換セルロースクロマトグラフィー法、電気泳動法等で精
製して用いることができる。

あるいは抗原で感作したは乳動物等（例えばマウス）ひ
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっても
良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　
ＩｇＤ。

ＩｇＢ各分画を用いることができ、あるいはこれらの抗
体を酵素処理してＦａｂ、　Ｆａｂ’又はＦ　（ａｂ’
　）　２といった活性抗体フラグメントにして使用して
もよい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の
抗体を組合せて使用してもかまわない。

本発明の免疫測定方法による反応型式としては、競合法
、２抗体法、サンドイツチ法等が挙げられるが、特に限
定はされない。また、他の生物活性物質（例えば、ビオ
チン、アビジン）を利用した免疫測定方法も適用するこ
とができる。

本発明においては、流体試料中の特定成分を測定するの
に反応型式として免疫反応を挙げているが、免疫反応に
準する生物活性を示す物質の特異反応を本発明に利用す
ることも可能である。その特異的に結合する物質の組合
せとしては下記のものが挙げられる。

酵素と基質（生成物） 〃　と阻害剤 〃　と補欠分子族 〃　と補酵素 〃　とアロステリックエフェクター 抗体と抗原 〃　とプロティンＡ レクチンと多糖類 〃　　と糖タンパク質 核酸と相補性の塩基配列 〃　とヒストン 〃　と核酸 〃　とポリメラーゼ ホルモンと受容体 ビオチンとアビジン（ストレプトアビジン）ビオチシン
　　　とアビジン（） デスチオビオチンと　　〃（） オキシビオチン　と　　〃（） 本発明で使用する抗原は特異抗体と反応するものであり
、ハプテン及びその誘導体を含有する。

抗体（又は抗原）を結合させる不溶化担体としては、当
業者で公知のものが使用できるが、免疫反応時間を従来
に比べ大幅に短縮させ、かつ乾式分析素子上に滴下でき
るものでなくてはいけないことから、その大きさが２ｍ
ｍ以下の粒状体（又は粉砕物）、あるいは、６０メツシ
ユ以下の繊維が好ましい。更に好ましいのは０．１μｍ
〜１００μｍのサイズの粒状体（又は粉砕物）である。

不溶化担体の材料としては、アガロース、セルロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、セルロース、
微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋ポリアクリル
アミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン
、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、各種合成
樹脂（ポリスチレンなど）などのほか、後述する多孔質
層の素材が利用できる。

好ましくは、アガロース、架橋アガロース、架橋デキス
トラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド
、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セルロース、微
結晶セルロースであり、更に好ましくは、ポリアクリル
アミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチレン、微結
晶セルロースである。

上記不溶化担体は数種を混合して用いることもできる。

抗体又は抗原は、これら不溶化担体に、当業者で公知の
方法で化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的
に結合させることができる。

結合法については１９７６年、講談社発行、千畑一部ば
か２名編「実験と応用　了フィニティクロマトグラフィ
ー」　（第１刷）　　１９７５年、講談社発行、出端　
誠ほか２名編「アフィニティクロマトグラフィー」　（
第１版）を参考にすることができる。

本発明の乾式分析素子は素子上で、Ｂ／Ｆ分離を行うた
め、滴下したＦ体の標識物質は速かに乾式分析素子中に
入り、Ｂ体の標識物質の大部分は乾式分析素子上に残る
ものでなくてはならない。

その条件を満たすために、乾式分析素子は、少なくとも
１層以上の多孔質層をもっことが好ましい。

多孔質層の素材は特に限定されないが、好ましい例とし
てはサイズ１〜３５０μｍの粒状体あるいは４０〜４０
０メツシユの繊維から１つ以上選ばれた素材により構成
される構造体が挙げられる。該粒状体の材料としては、
ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸
化鉛、微結晶セルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル
、架橋デキストリン、架橋ポリアクリルアミド、アガロ
ース、架橋アガロース、各種合成樹脂（ポリスチレンな
ど）などのほか、次のような反応性基を持つ化合物から
成る自己結合型粒子が挙げられる。

例示化合物 （１）ポリ　（スチレン−コーグリシジルメタクリレ−
）　）　　［９０／１（Ｄ　。

（２）ポリ　（スチレンーコーメチルアクリレートコー
グリシジルメタクリレート） ［８０／１５１５］　。

（３）ポリ　（スチレン−ツーｎ−ブチルメタクリレー
ト−コーグリシジルメタクリレー ト’）　　［７５／１５／１０１　。

（４）ポリ　（スチレンーコービニルベンジルクロライ
ドーコーグリシジルメタクリレー ）　）　　Ｉ：　８０／１０／１０）。

（５）ポリ　（スチレンーコージビニルベンゼンコーグ
リシジルメタクリレート） ［９０／２／８］。

（６）ポＩＪ（ｐ−ビニルトルエン−コーグリシジルメ
タクリレート）　　Ｃ９０／１（Ｄ。

（７）ポリ　（メチルメタクリレート−コーグリシジル
メタクリレート）　　［８０／２０：］。

（８）ポリ　（スチレンーツーＮ。Ｎ−ジメチルアミノ
エチルメタクリレート）　　［９５１５Ｆ。

（９）ポリ　（スチレンーコーアジリジニルエチルメタ
クリレー））　　［９５１５］。

（１０）ポリ　（スチレンーコーメチルアクリレートコ
ーアクロレイン）　　［９０１５１５：］。

（１１）ポリ　（スチレンーコーアクリルアミド）［９
５１５）。

（１２）ポリ（スチレンーコービニルチオール）［９５
１５）］。

（１３）ポリ　（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリ
ルアミド）　　［９５１５１。

（１４）ポリ　（スチレン−ツーｔ−ブチルアクリレー
ト−コーグリシジルメタクリレート）［９０１５１５）
。

（１５）ポリ　（スチレンーコービニルイソシアネー）
）　　［９５１５］　。

（１６）ポリ　（メチルアクリレートーコースチレンー
コーＮ−メチロールアクリルアミド）Ｃ５０／３５／１
５］。

（１７）ポリ　（スチレンーコーグリシジルメタクリレ
ートーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノ エチルメタクリレート）　　［９０１５１５）。

（１Ｂ）ポリ　（スチレンーコーメタクリル酸−コアク
リルアミド）　　［９５／２／３コ。

（１９）ポリ　（スチレンーコーＮ−メチロールアクリ
ルアミドーコーメトキシエチルアク リ　レー　ト）　　　［９０１５１５］　　。

（２０）ポリ　（ｐ−ビニルトルエンーコーＮ−メチロ
ールアリルアミドーコーアクリル酸）［９０／８／２］
。

（２１）ポリ　（メチルメタクリレートーコーグリシジ
ルメタクリレートーコーｔ−ブチル アクリレート）　　［８０／１０／１（Ｄ。

（２２）ポリ　（スチレンーコーｐ−ビニルベンジルク
ロライドーコーアクリル酸−コーラ レイドエチルアクリレート） Ｃ７５／１０１５／１０）。

（２３）ポリ　（スチレンーコーメタクロレインーコα
−ヒドロキシエチルメタクリレー ト）　　［９０１５１５）。

（２４）ポリ　（スチレンーコーアクロレインーコアセ
トアセトキシエチルメタクリレー ト）　　［８５１５／１０）。

（２５）ポリ　（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミ
ノエチルアクリレートーコービニル スルホニルエチルメタクリレート） ［９０１５１５］。

（２６）ポＩＪ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミノスチ
レンーコービニルスルホニルエチル メタクリレート）　　［８５／１０１５］。

（２７）ポリ　（スチレンーツーＮ。Ｎ−ジメチルアミ
ノエチルメタクリレート）　　［９０／１０］。

（２８）ポリ　（スチレンーコーアクリル酸）　　［９
７／３）。

（２９）ポリ　（スチレンーコーアクリルアミド）［９
７／３］。

（３０）ポリ　（ｐ−ビニルトルエン−ツーｔ−ブチル
アクリレ−））　　［９５１５］。

（３１）ポリ　（メチルアクリレートーコーメタクリル
アミド）　　［９５１５］。

（３２）ポリ（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリル
アミド）　　［９５１５１］　。

（３３）ホＩＪ（ｐ−ビニルベンジルクロライドーコＮ
−メチロールアクリルアミド） ［９６／４］。

（３４）ポリ　（スチレンーコーイタコン酸）　　［９
ｇ／２）（３５）ポリ　（スチレン−ツーｔ−ブチルア
クリレート）　　［９２／８］。

（３６）ポリ　（メチルアクリレートーコースチレンコ
ーアクロレイン）　　［３０／６５１５］。

（３７）ポリ　（メチルメタクリレートーコースチレン
ーコ−２−ヒドロキシエチルメタク リレート）　　［２５／７０１５］　。

（３８）ポリ　（スチレンーコービニルスルホニルエチ
ルアクリレート’）　　［８０／２０］。

（３９）ポリ　（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミ
ノエチルアクリレート）　　［９０／１０〕。

（４０）ポリ　（スチレンーコーメチルアクリレ〜トコ
−アセトアセトキシエチルアクリ レート）〔９０１５１５〕　。

（４１）ポリ　（スチレン−コーメタクリル酸）［９５
１５］。

各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、多孔質層に用いる繊維としては、パルプ、粉末ろ
紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、セルロース
エステル、ビスコースレーヨン、銅アンモニアレーヨン
、ポリアミド（６ナイロン、６，６−ナイロン、６．Ｉ
Ｏ−ナイロンなど）　ポリエステル（ポリエチレンテレ
フタレートなど）　ポリオレフィン（ポリプロピレン、
ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿などの植物性・動物
性・鉱物性・合成・半合成・再生繊維を用いることがで
き、あるいはこれらを混合して用いても良い。あるいは
別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、ろ紙、プラッシ
ュポリマー　あるいはガラス繊維、鉱物性繊維（石綿な
ど）、植物性繊維（木綿、麻、バルブなど）動物性繊維
（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロン
、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレンなど）
、再生繊維（レーヨン、セルロースエステルナト）ナト
ヲ単独するいは混合して製造した織物、不織布、合成紙
などを該多孔質層に用いることもできる。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は！ｉ！膜することにより、自由に接
触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が存在する
多孔質層を形成する。

自己結合性を有しない粒子は適当な接着剤を用いて粒子
同志が点接着する形で製膜することができ、例えば特開
昭４１−５３８８８号、同５５９０８５９号、同５７−
６７８６０号各公報に記載の方法を適用することができ
る。自己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭５７
−１０１７６０号、同５′？−１０１７６１号、同５８
−７０１６３号各公報に記載の方法により同様に製膜で
きる。繊維又は繊維及び粒子の混合物については特開昭
５７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号公報に
記載された繊維分散液を塗布することにより多孔質層を
形成できる。また特開昭６０−１７３４７１号公報で行
われている方法のようにゼラチンやポリビニルピロリド
ンのような水溶性バインダーを使用した繊維分散液を塗
布することも可能である。

また、このときのバインダーは水溶性に限らず、疎水性
のバインダーの使用も可能である。このような分散液を
製造するためには、多くの方法を単独又は組合せて用い
ることが可能である。

例えば有用な方法の一つとして界面活性剤を液体キャリ
ヤーへ添加し粒状体及び／又は、繊維の分散液中におけ
る分布及び安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ−１００（ロームアンドハース社製；オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール）、サーファクタント
ＬＯＧ■（オリーン社製；ノニルフェノキシポリグリシ
ドール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、粒状体及び／又は繊維の重量に対して０．
００５〜１０重量％好ましくは０．０５〜６重量％用い
ることができる。更に別の方法として該粒子単位と液体
キャリヤーの音波処理、物理的混合、及び物理的かくは
ん処理、ｐｉ（調整がある。これらは前記の方法と組合
せることにより、更に有用である。

標識抗体又は抗原の非特異的反応を排除する目的で、測
定すべき特異的反応に関与しないタンパク質を担持する
ことが可能である。それらの代表的な例としては、は乳
動物の正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク
、乳酸発酵物、コラーゲン、ゼラチン及びそれらの分解
物等が挙げられる。

このような固定化操作は、前述の粒状体あるいは繊維に
あらかじめ行っておいた後、多孔質層を形成しても良く
、あるいは多孔質層を形成した後に該固定化操作を行う
ことも可能である。

乾式分析素子の形態は分析を行いうるものであればよく
、特に制限されるものではないが、製造上及び操作測定
上、フィルム状あるいはシート状であることが好ましい
。

乾式分析素子は１層から成っていても、多層から成って
いてもよい。

本発明の免疫測定方法において実用可能な乾式分析素子
の構成の１例を示すが、これに制限されるものではない
。

第３図から第５図は本発明に用いることができる乾式分
析素子の層構成の態様例を示す断面図であり、符号５は
多孔質層、６は吸水層、７は多孔質層を意味する。なお
、多孔質層７は多孔質層５より多孔度が大きいことが好
ましい。

第３図は最も単純な態様の断面図の１例である。この場
合は多孔質層５のみで乾式分析素子が構成されており、
必要に応じて、標識物質が酵素である場合には基質を内
蔵する。

第４図は吸水層６の上に多孔質層５が積層されている断
面図の１例である。必要に応じて標識物質が酵素である
場合には、基質を吸水層、多孔質層のいずれか一方、若
しくは相方に内蔵する。

第５図は吸水層６の上に多孔質層５．７が２層重なって
いる断面図の１例である。必要に応じて標識物質が酵素
である場合には、３層あるうちのいずれか１層、３層の
うち任意の２層、あるいは３層すべてに基質を内蔵させ
ることができる。

ここでいう吸水層の素材としては、ゼラチン、フタル化
ゼラチン等のゼラチン誘導体、ボリヒ゛ニルアルコール
、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、ポ
リアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウム等の合成
高分子、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム塩等のセルロース誘導体の多糖
類等が挙げられる。そして好ましくはゼラチン、フタル
化ゼラチン等のゼラチン誘導体が挙げられる。

標識体に基づく信号の測定方法は標識の種類により異な
る。例えば標識物質が蛍光物質であれば、乾式分析素子
に励起光を当て、蛍光強度を測定すれば良い。標識物質
が酵素であれば適当な基質、必要ならば酵素や発色系を
含む溶液を添加し一定時間インキユベートした後に、該
発色系に適合した波長の光の反射濃度（基質の種類によ
っては蛍光強度、発光強度）を測定することにより信号
強度を測定できる。このような目的で用いられる基質・
発色系は標識酵素の種類に従って公知の方法から適当な
ものを選択できる。

標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光
法、又は発光法で検出することができ、測定法としては
信号の経時的変化を測定するレート測定法、又は一定時
間後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定する
ことができる。吸光度法（比色法）では、紫外光、可視
光、近赤外光を利用することができ、例えば流体試料と
して血清を用いる場合には、血清による吸光の影響を小
さくするた約に緑色光、赤色光、又は近赤外光を利用す
るのが好ましい。

乾式分析素子は前述の多孔質層が必要構成要素であるが
、発明の効果をより一層発揮するために種々の補助層を
設けることができる。第６図〜第８図に乾式分析素子の
実施の態様を表す断面概略図を示す。各図において符号
８は光透過性支持体、９は光反射性支持体、１０は光反
射層を意味する。

第６図に示した乾式分析素子は光透過性支持体８の上に
多孔質層５が積層されており、支持体の存在により素子
の取扱い性が向上している。

このような目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セル
ロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な高分子化合物、あるいはガラスのような透明無機化合
物が挙げられる。該多孔質層はこのような支持体の上で
直接塗布及び／又は製膜するか、あるいは−旦多孔質層
を別に形成した後に前述の支持体に貼りっけても良い。

第６図に示した態様の場合、流体試料は多孔質層側から
滴下する必要があるが、信号の測定は両側から行うこと
が可能である。

第７図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
９の上に多孔質層５−が設けられている。この態様では
、試料等の滴下、信号測定とも多孔質層側から行い、信
号を反射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれを容
易にしている（信号を蛍光強度で測定する際は黒色の吸
光性支持体を同じように用いることで同様な効果を得る
ことができる） このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミックス、金属、あるいは
樹脂被覆等で防水処理を施した紙等が挙げられ、これら
の材質に必要ならばＴｌＯ２、Ｂａ５Ｄ＜　、マイカな
どの白色顔料等を塗布するか含有させることにより目的
を果たすことができる。

第８図の態様も同様な目的によるもので、光透過性支持
体８の上に多孔質層５、光反射層１０が順に積層されて
いる。この態様では試料等は光反射層側から滴下され、
信号測定は光透過性支持体側から行われる。光反射層は
公知の分析素子及びその類似品に用いられていたものを
いずれも使用できるが、好ましくは多孔質層に用いられ
るのと同様な粒子及び繊維に前述の白色顔料等を含有さ
せたものを塗布又は製膜するか貼りつけることができる
。

乾式分析素子は滴下されだ液相を展開するための展開層
を有することが好ましい。展開層は供給された試料液の
体積に比例し、液相を展開することが好ましい。素材と
しては多孔質層と同様のものを塗布、製膜貼付しても良
く、あるいは吸水性の洋紙、和紙、ろ紙、プラッシュポ
リマー　あるいはガラス繊維、鉱物性繊維（石綿など）
、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど）動物性繊維（羊
毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロン、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリプロピレンなど）、再
生繊維（レーヨン、セルロースエステルなど）すどヲ単
独あるいは混合して製造した織物、不織布、合成紙など
で作成した結合物含有層を貼付しても良い。

結合物含有層の位置は、必要に応じて種々選択でき本態
様のように結合物含有層が最上層以外の部分にある場合
、結合物含有層に用いる素材としては前述のもののほか
にゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロースなど
）　カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロースなどの親水性高分子物質、あるいはビニルピロ
リドン、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、ビニ
ルアルコール、スルホニルスチレンなどをモノマーとし
たホモポリマーあるいはコポリマーといった連続バイン
ダーを塗布して用いる方法がある。

本発明においては、展開層内に基質等を内蔵させ、反応
層としての役目をもたせてもよい。

乾式分析素子には他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、
界面活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加することがで
きる。緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応
等に適したｐＨにするために含有される。用いることが
できる緩衝剤としては、日本化学全編「化学便覧基礎編
」〔東京、丸蓋■（１９６６）：］第１３１２〜１３２
０頁、Ｎ、Ｅ、　　グツド（Ｇｏｏｄ）等、ノ〈イオケ
　ミ　ス　ト　リ　−（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）！
　　５　　巻、　第　４６７頁（１９６６）　、合材、
高原、「化学の領域」第３０巻、（２）、第７９頁（１
９７６）、Ｗ。

Ｊ、ファーギュソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）等、アナリテ
イカル　バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｎ、）第１０４巻、第３００頁（１９８０）等の文
献に記載されているものを挙げることができる。

具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リスバルビッール、クリシン、グツド緩衝剤等が挙げら
れる。これらの緩衝剤は必要に応じて単独で層を形成さ
せてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のだ杓に含有され
、酸化防止剤などがある。また、酵素発色の安定化等の
ために、ゼラチン、ゼラチン分解物、アルブミン、ＢＳ
Ａ、シクロデキストリン類、非還元糖類（スクロース、
トレノ＼ロース）　ポリエチレングリコール、アミノ酸
、各種イオン、アジ化ソーダ等を添加してもよい。

界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。その他
の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブロッカ
−試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応じて適
当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定のための検出物
質を、測光部側に集中的に集めたり、検出物質が色素の
場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフトさせる物質
であり検出物質と強い相互作用を示す。

カチオン性ポリマー　アニオン性ポリマー及びこれらの
ポリマーのラテックスが用いられる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明方法を具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。

実施例１ １−（１）　　Ｂ−Ｄ−１”５クトシタ−セ［識ｃＲＰ
抗体の作成 ＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社製
）２０ｍｇを０．１　Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ６，５
）２．０−に溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプ
ロイルオキシ）スクシンイミド（同位化学研究所製）の
２．５　ｍｇ／　ｍｅジメチルホルムアミド溶液７７μ
ｌを加えて３０℃、２０分間反応後、５　ｍＭ　　Ｅ　
Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐｔ１６．０
）で平衡化したセファデックス０２５カラムで精製し、
マレイミド化したＣＲＰ抗体を得た。次にβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ（東洋紡社製）の１０．５　ｍｇ／ｍｆ　
　０．１　Ｍ　　リン酸緩衝液１．８　ｍｌに、前記マ
レイミド化したＣＲＰ抗体　１３．６　ｍｇを含む溶液
３．２　ｉｆを加えて、４℃で４５時間反応後、０，１
Ｍ２−メルカプトエチルアミン１７５μｌを加えて３０
℃２０分反応させ、０．１５Ｍ　　塩化ナトリウム含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したスー
パーローズ６ブレツプグレード（）アル１フ２フ社製）
カラムで分離・精製し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識
ＣＲＰ抗体を得た。

１−（２）　　ＣＲＰ抗体固定化オイバーギッ）Ｃの合
成 オイパーギットＣ（ロームファーマ＞、［）３ｇを０．
１５Ｍ　　塩化ナトリウム含有の０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０＞　４０ｉ中に分散し、これにＣＲＰ抗体
（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社製）１３６ｍ
ｇを入れ、４℃で２０時間かくはんし反応させる。反応
後、ろ取し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）と０．
１Ｍ　炭酸緩衝液（ｐｔ１８．０）を交互に用い、充分
洗浄した。次いで、水洗した後、径口３８μｍのメツシ
ュでふるいをかけた。オイパーギットＣの非特異的結合
部位をブロックするため、上記のふるいをかけたオイパ
ーギットＣを３％スキムミルク添加の０．１５Ｍ　　塩
化ナトリウム含有０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）中で４℃、２０時間かくはんした。次いで水洗し、Ｃ
ＲＰ抗体固定化オイｉｉ　−ギットＣを得た。

１−（３）　　乾式分析素子の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に、下記の組成の塗布液〔１）を塗
布し、乾燥させ、ゼラチン層を作成させた。

塗布液−（１） 次に塗布液−（２）を前記ゼラチン層の上に塗布し、乾
燥した。

塗布液−（２） 次に塗布液−（３）を前記アビセル層の上に塗布し、乾
燥した。

塗布液−（３） これを１．５ｘｌ、５ｃｍ２の大きさに裁断し、乾式分
析素子１とした。

１−（４）　　乾式分析素子１を用いてのＣＲＰ測定１
　ｍＭ　　塩化マグネシウム及び３重量％のウシ血清ア
ルブミンを含有する０、　３　Ｍ　　ビストリスＭ衝液
１９０μｍに、ＣＲＰ抗体固定化オイパーギットＣ１５
ｍｇ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体（１０
Ｍｇ／ｍ７り　２５μ１１ＣＲＰ溶液（０，３，１０，
３０，１００，３００Ｍｇ／ｍｆ）　７μｍを添加混合
し、室温で１２分間免疫反応させる。反応後の混合液を
よくかくはんした後、混合液の１５μｌを１−（３）で
作成した乾式分析素子１に滴下した。３７℃で２０分間
インキュベートしながら、乾式分析素子上に積層したオ
イパーギットｃの真下を避け、その周辺部分を支持体側
から５４６Ｍｍの反射濃度を測定した。１〜２０分の反
射濃度差（ΔＤｒ）を用いて検量線を作成した結果を第
９図に示す。

すなわち、第９図は本発明の免疫測定方法により作成さ
れたＣＲＰの検量線を示すグラフであり、横軸はＣＲＰ
量（μｇ／ｍｆ）を、縦軸は反射濃度差（ΔＤｒ）を示
す。この結果から本発明方法により操作も簡便であり、
測定時間は３２分と従来に比べ短時間でＣＲＰが測定可
能であることがわかる。

実施例２ ２−（１）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰの
作成 ＣＲＰ　　（カナデイアンバイオ社製）２０ｍｇを用い
、１−（１）と同様な手段でβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
標識ＣＲＰを作成した。

２−（２）　ＣＲＰの測定 １ｍＭ　　塩化マグネシウム及び３重量％ウシ血清アル
ブミンを含有する０、３Ｍ　ビストリス緩衝液１９０μ
ｌに、１−（２）で合成したＣＲＰ抗体固定化オイパー
ギッ）Ｃ１５ｍｇ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲ
Ｐ　（１０Ｍｇ／ｍ１２）　２５ｔ−ｔｌ！、ＣＲＰ溶
液（０，３，１０，３０，１００゜３００Ｍｇ／ｍｅ）
　７μｍを添加混合し、室温で１２分間免疫反応させる
。反応後の混合液をよくかくはんした後、混合液の１５
μｌを１−（３）で作成した乾式分析素子１に滴下した
。３７℃で２０分間インキュベートしながら、乾式分析
素子上に積層したオイパーギッ）Ｃの真下を避け、その
周辺部分を支持体側から５４６Ｍｍの反射濃度を測定し
た。１〜２０分の反射濃度差（ΔＤｒ）を用いて検量線
を作成した結果を第１０図に示す。すなわち、第１Ｏ図
は本発明の免疫測定方法により作成されたＣＲＰの検量
線を示すグラフであり、横軸はＣＲＰ量（μｇ　／　ｍ
ｌ　）を、縦軸は反射濃度差（ΔＤｒ）を示す。この結
果から本発明により、操作も簡便であり測定時間は３２
分と従来に比べて短時間で競合法によりＣＲＰの測定が
可能であることがわかる。

実施例３ ３−　（１）　　ＣＲＰ固定化オイバーギットＣの合成
ＣＲＰ１０ｍｇを用い、１−（２）と同様な手段で、Ｃ
ＲＰ固定化オイパーギッ）Ｃを作成した。

：３−（２）　　ＣＲＰの測定 １　ｍＭ　　塩化マグネシウム及び３重量％ウシ血清ア
ルブミンを含有する０、３Ｍ　ビス）　ＩＪス緩衝液１
９０μｌにＣＲＰ固定化オイパーギットＣｌ５ｍｇ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体（１０Ｍｇ／艷
）２５μＡ、ＣＲＰ溶液（０，３，１０，３０，１００
，３００μｇ／艶）７μβを添加混合し、室温で１２分
間免疫反応させる。反応後の混合液をよくかくはんした
後、混合液の１５μ！を１−（３）で作成した乾式分析
素子１に滴下した。３７℃で２０分間インキュベートし
ながら、乾式分析素子上に積層したオイパーギッ）Ｃの
真下を避け、その周辺部分を支持体側から５４６ｎｍの
反射濃度を測定した。１〜２０分の反射濃度差（△Ｄｒ
）を用いて検量線を作成した結果を第１１図に示す。す
なわち、第１１図は本発明の免疫測定方法により作成さ
れたＣＲＰの検量線を示すグラフであり、横軸はＣＲＰ
量（μｇ／ｒｎｌ）を、縦軸は反射濃度差（△Ｄｒ）を
示す。この結果から本発明により操作も簡便であり、測
定時間は３２分と、従来に比べて短時間でＣＲＰの測定
が可能であることがわかる。

実施例４ ４−（１）　　ＨＢｓ抗原固定化ラテックスの合成粒径
１０μｍのラテックス（市販品）１００ｍｇを０．１５
Ｍ　　塩化ナトリウム含有の０．１　Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）　１０−中に分散し、これにＨＢ’　ｓ抗
原（５００Ｊｔｇ／ｍｌ＞　　１０ｍｌを入れ、３７℃
で１時間マグネットスタラーによりかくはんする。０．
１５Ｍ　　塩化ナトリウム含有の０．１Ｍ　リン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）で洗浄後、２％ＢＳＡ添加の０．１５
Ｍ　　塩化す）ＩＪウム含有０．１Ｍ　リン酸緩衝液（
ｐＨ７，４＞で、室温、２時間表面処理をし、ＨＢｓ抗
原固定化ラテックスを得た。

４−（２）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗
体の作成 常法に従いウサギを免疫することにより得たＨＢｓ抗体
を用い、１−（１）と同様な手段で、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識ＨＢｓ抗体を得た。

４−（３）ＨＢｓ抗体の測定 １ｍＭ　　塩化マグネシウム及び３重量％ウシ血清アル
ブミンを含有する０、３Ｍ　ビストリス緩衝液１９０μ
βに、ＨＢｓ抗原固定化ラテックス１０ｍｇ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ標識ＨＢＳ抗体（１０μｇ／ｍｆ）　
２５　ｔｔｌｌ、ＨＢｓポジティブ試料を上記緩衝液で
３００倍、１０００倍、３０００倍、１００００倍、３
００００倍と希釈した溶液２５μｌを添加混合し、室温
で１２分間免疫反応させる。反応後の混合液をよくかく
はんした後、混合液の１５μｌを１−（３）で作成した
乾式分析素子１に滴下した。３７℃で２０分間インキュ
ベートしながら、乾式分析素子上に積層したラテックス
の真下を避け、その周辺部分を支持体側から５４６　ｎ
ｍの反射濃度を測定した。１〜２０分の反射濃度差（△
Ｄｒ）を用いて検量線を作成した結果を第１２図に示す
。すなわち、第１２図は本発明の免疫測定方法により作
成されたＨＢｓ抗体の検量線を示すグラフであり、横軸
は試料濃度を、縦軸は反射濃度差（△Ｏｒ）を示す。こ
の結果から本発明方法により、操作も簡便であり、測定
時間は３２分と従来に比べて短時間で、ＨＢｓ抗体の測
定が可能であることがわかる。

実施例５ ５−（１）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗−ＨＢ
ｓ抗体抗体 常法に従い、マウスを免疫することにより得た抗−ＨＢ
ｓ抗体抗体を用い、１−（１）と同様な手段で、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ標織抗−ＨＢｓ抗体抗体を得た。

５−（２）　　ＨＢｓ抗体の測定 １ｍＭ　　塩化マグネシウム、及び３重量％ウシ血清ア
ルブミンを含有する０、３Ｍ　ビストリス緩衝液２００
μｌに４−（１）で合成したＨＢｓ抗原固定化ラテック
ス１０ｍｇ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＨＢ　ｓ
抗体抗体（１０μｇ／ｍ１）２５μｍ、ＨＢｓ抗体ポジ
ティブ試料を上記緩衝液で３００倍、１０００倍、３０
００倍、１００００倍、３００００倍と希釈した溶液２
５μ矛を添加混合し、室温で１２分間免疫反応させる。

反応後の混合液をよくかくはんした後、混合液の１５μ
βを１−（３）で作成した乾式分析素子１に滴下した。

３７℃で２０分間インキュベートしながら、乾式分析素
子上に積層したラテックスの真下を避け、その周辺部分
を支持体側から５４６ｎｍの反射濃度を測定した。１〜
２０分の反射濃度差（ΔＤｒ）を用いて検量線を作成し
た結果を第１３図に示す。すなわち、第１３図は本発明
の免疫測定方法により作成されたＨＢｓ抗体の検量線を
示すグラフであり、横軸は試料濃度を、縦軸は反射濃度
差（△Ｄｒ）を示す。この結果から、本発明方法により
、操作も簡便であり、測定時間は３２分と、従来に比べ
て短時間で、ＨＢｓ抗体の測定が可能であることがわか
る。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の免疫測定方法によ
れば、流体試料中の特定成分を、短時間で簡便に定量す
ることができるという顕著な効果を奏することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の免疫測定方法の測定原理を
説明するための模式図、第３図〜第８図は本発明に用い
ることができる乾式分析素子の層構成の態様例を示す断
面図、第９図〜第１１図は本発明の免疫測定方法により
作成されたＣＲＰの検量線を示すグラフ、第１２図及び
第１３図は本発明の免疫測定方法により作成されたＨＢ
ｓ抗体の検量線を示すグラフである。 １：乾式分析素子、２：不溶化担体、３：８体の乾式分
析素子上での広がり、４：Ｆ体の乾式分析素子中での広
がり、５及び７：多孔質層、６：吸水層、８：光透過性
支持体、９：光反射性支持体、１０：光反射層 第　／　図 売　３　図 第４図 第２図 第　５　図 坏 図 亮 図 第 図 栴 ／／ 図 亮 ／２ 図 戴′ｆ＋−漂度 第 図 第 図 ＣＲＰ量（ｐｇ／ｒｎｌ　） 第 図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、非均一系免疫測定法を用いて試料中の特定成分を分
   析する方法において、免疫反応若しくは免疫反応に準す
   る生物活性を示す物質の特異反応の結果生成する、不溶
   化担体に結合した標識体と、不溶化担体に結合しないで
   遊離の状態で存在する標識体とを含有する混合液の一定
   量を、乾式分析素子に滴下し、該遊離の状態で存在する
   標識体量を測定することにより、試料中の特定成分を分
   析することを特徴とする免疫測定方法。