JPH0366297B2 - - Google Patents
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Description
本発明は式
を有するカルボン酸、その薬理上許容しうる塩、
そのエステルまたはその閉環ラクトン体からなる
3″−ヒドロキシ−ML−236B誘導体およびその製
造法に関する。
従来、前記一般式（）において、3″位のヒド
ロキシ基が水素原子で置換されたML−236B誘導
体は例えば特開昭50−155690号、同53−56314号、
同53−84954号に記載されており、また、6′位の
水素原子がメチル基で置換されたMB−530B誘
導体は米国特許第4376863号に記載されており、
いずれもコレステロール合成阻害作用を示すこと
が知られている。
本発明者らは、前記一般式（）を有するカル
ボン酸、その薬理上許容しうる塩、そのエステル
またはその閉環ラクトン体がいずれもコレステロ
ール合成阻害作用を示すことを見出し、本発明を
完成した。
本発明の前記一般式（）を有する化合物の薬
理上許容しうる塩としては例えば金属塩、アミノ
酸塩またはアミン塩である。金属塩としては例え
ばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、
カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金
属塩、およびアルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅
塩、ニツケル塩およびコバルト塩などがあげられ
るが、この中、アルカリ金属塩、アルカリ土類金
属塩およびアルミニウム塩が好適であり、さらに
ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩および
アルミニウム塩が最も好適である。アミノ酸塩と
しては例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、
α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチンなどの塩基性
アミノ酸が好適である。アミノ塩としては例えば
ｔ−オクチルアミン、ジベンジルアミン、ジシク
ロヘキシルアミン、モルホリン、Ｄ−フエニルグ
リシンアルキルエステル、Ｄ−グルコサミンなど
が好適である。
前記一般式（）を有する化合物のエステルと
しては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルなどの
アルキルエステルをあげることができる。好適に
はメチルである。
前記一般式（）を有する化合物の閉環ラクト
ン体とは、式（）が次の閉環構造式で示される
化合物をいう。
本発明によつて得られる前記一般式（）を有
するカルボン酸、その薬理上許容しうる塩、その
エステルまたはその閉環ラクトン体としては、例
えば以下に記載する化合物をあげることができ
る。
１ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸
２ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸ナト
リウム塩
３ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸カリ
ウム塩
４ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸カル
シウム塩
５ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸アル
ミニウム塩
６ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸アル
ギニン塩
７ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸リジ
ン塩
８ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸ｔ−
オクチルアミン塩
９ 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸Ｄ−
フエニルグリシンエチルエステル塩
10 3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸メチ
ルエステル
11 3″−ヒドロキシ−ML−236ラクトン体
本発明の前記一般式（）においては、置換分
の配置により種々の幾何異性体が存在する。
また、不斉炭素原子の存在により種々の光学異
性体も存在する。前記一般式（）においては、
これらの異性体およびこれらの異性体の混合物が
すべて単一の式で示されている。従つて、本発明
においては、前記一般式（）を有するカルボン
酸、その薬理上許容しうる塩、そのエステルまた
はその閉環ラクトン体には、これらの異性体のみ
ならず、これらの異性体の混合物をも全て包むも
のである。
本発明の目的化合物は、コレステロールの合成
を阻害することにより血中の脂質を低下させる作
用を有し、例えば高脂血症治療剤、動脈硬化予防
薬として医薬に使用することができる。
これらの化合物は経口的または非経口的に例え
ばカプセル剤、錠剤、注射剤等の形で投与するこ
とができる。投与量は年令、症状、体重等によつ
て異なるが、通常は成人に対し１日約0.2〜200mg
を３〜４回に分けて投与される。しかし必要に応
じてそれ以上の量を使用することもできる。
本発明の原料物質である例えばML−236Bラク
トン体およびML−236Bカルボン酸は前述の如く
既知物質であり、青カビの一種ペニシリウム・チ
トリヌムの代謝産物より分離、精製される。その
化学構造式は次式
および
で示される通りであり、実験動物から分離した酵
素系や培養細胞系においてコレステロールの生合
成をその律速酵素の３−ヒドロキシ−３−メチル
グルタリル・コエンザイムＡリダクターゼと競合
することにより阻害し、動物の個体レベルにおい
ても強力な血清コレステロールの低下作用を示す
ことが知られている（特開昭50−155690号、アテ
ロスクレローシス（Atherosclerosis），32，307
〜313，1979年）。
本発明の目的化合物は式
を有するカルボン酸、その薬理上許容しうる塩、
そのエステルまたはその閉環ラクトン体からなる
ML−236B誘導体を、3″−ヒドロキシ化変換菌ま
たはその無細胞抽出液と接触させて酵素的に水酸
化し、次いで得られた変換反応物を所望により加
水分解反応、塩形成反応、エステル化反応または
ラクトン化反応に付し、反応液から採取すること
によつて得られる。
前記原料化合物を前記一般式（）を有するカ
ルボン酸、その薬理上許容しうる塩、そのエステ
ルまたはその閉環ラクトン体に変換せしめ得る微
生物としてはストレプトミセス属があげられる。
ストレプトミセス属に属する微生物の中、特に
ストレプトミセス・エスピー
（Streptomycessp.）SANK62285（微工研条寄
第1142号）
ストレプトミセス・エスピー
（Streptomycessp.）SANK62385（微工研条寄
第1143号）
ストレプトミセス・エスピー
（Streptomycessp.）SANK62485（微工研条寄
第1144号）
が90％以上の変換率でML−236B誘導体を3″−ヒ
ドロキシ−ML−236B誘導体に変換する能力を有
する。
これらの菌株の菌学的性状は次の通りである。
１ 形態学的特徴
形態はISP〔インターナシヨナル・ストレプト
マイセス・プロジエクト（International
Streptomyces Project）〕規定の培地上、28℃、
14日間培養後、光学および電子顕微鏡下で観察し
た。SANK62285、SANK62385および
SANK62485株とも基生菌糸は分枝して良く伸長
し、気菌糸は単純分枝である。
SANK62285株の胞子鎖の形態は直状を示し、
胞子は球形〜卵形でその表面構造は平滑を示す。
SANK62385株およびSANK62485株の胞子鎖の
形態は螺旋状を示し、胞子は球形〜楕円形で、そ
の表面構造は平滑である。SANK62285、
SANK62385およびSANK62485株にはいずれも
気菌糸の車軸分枝、菌核、胞子のうなどの特殊器
官は観察されなかつた。
２ 各種培養基上の諸性質
各種培養基上で28℃、14日間培養後の性状は第
１〜３表に示す通りである。色調の表示は日本色
彩研究所版、“標準色票”のカラーチツプ・ナン
バーを表わす。
The present invention is based on the formula a pharmacologically acceptable salt thereof,
Consists of its ester or its ring-closed lactone
This invention relates to a 3"-hydroxy-ML-236B derivative and a method for producing the same. Conventionally, ML-236B derivatives in which the hydroxy group at the 3" position in the above general formula () is substituted with a hydrogen atom have been disclosed, for example, in JP-A-50-155690. , No. 53-56314,
53-84954, and the MB-530B derivative in which the hydrogen atom at the 6' position is substituted with a methyl group is described in U.S. Patent No. 4,376,863.
All are known to exhibit cholesterol synthesis inhibitory effects. The present inventors have completed the present invention by discovering that a carboxylic acid having the general formula (), its pharmacologically acceptable salt, its ester, or its ring-closed lactone form all exhibit a cholesterol synthesis inhibitory effect. Pharmaceutically acceptable salts of the compound having the general formula () of the present invention include, for example, metal salts, amino acid salts, and amine salts. Examples of metal salts include alkali metal salts such as sodium and potassium;
Examples include alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium, and aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, and cobalt salts, among which alkali metal salts, alkaline earth metal salts, and aluminum salts are preferred, and the sodium, potassium, calcium and aluminum salts are most preferred. Examples of amino acid salts include arginine, lysine, histidine,
Basic amino acids such as α,γ-diaminobutyric acid and ornithine are preferred. Suitable amino salts include t-octylamine, dibenzylamine, dicyclohexylamine, morpholine, D-phenylglycine alkyl ester, and D-glucosamine. Examples of the ester of the compound having the general formula () include alkyl esters such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, and pentyl. Methyl is preferred. The ring-closed lactone of the compound having the general formula () above refers to a compound in which the formula () is represented by the following ring-closed structural formula. Examples of the carboxylic acid having the general formula (), its pharmacologically acceptable salt, its ester, or its ring-closed lactone derivative obtained by the present invention include the compounds described below. 1 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid 2 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid sodium salt 3 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid potassium salt 4 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid calcium salt 5 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid aluminum salt 6 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid arginine salt 7 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid lysine salt 8 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid t-
Octylamine salt 9 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid D-
Phenylglycine ethyl ester salt 10 3″-Hydroxy-ML-236B carboxylic acid methyl ester 11 3″-Hydroxy-ML-236 lactone The general formula () of the present invention has various geometric isomerisms depending on the arrangement of the substituents. A body exists. Furthermore, various optical isomers also exist due to the presence of asymmetric carbon atoms. In the general formula (),
All of these isomers and mixtures of these isomers are shown in a single formula. Therefore, in the present invention, the carboxylic acid having the general formula (), its pharmacologically acceptable salt, its ester, or its ring-closed lactone includes not only these isomers but also mixtures of these isomers. It also encompasses everything. The object compound of the present invention has an effect of lowering blood lipids by inhibiting cholesterol synthesis, and can be used in medicine, for example, as a therapeutic agent for hyperlipidemia or an agent for preventing arteriosclerosis. These compounds can be administered orally or parenterally, for example, in the form of capsules, tablets, injections, and the like. The dosage varies depending on age, symptoms, body weight, etc., but it is usually about 0.2 to 200 mg per day for adults.
is administered in 3 to 4 divided doses. However, larger amounts can be used if desired. The raw materials of the present invention, such as ML-236B lactone and ML-236B carboxylic acid, are known substances as described above, and are separated and purified from metabolites of Penicillium titrinum, a type of blue mold. Its chemical structure is as follows and As shown by It is known that it exhibits a strong serum cholesterol-lowering effect even at the individual level (Japanese Patent Application Laid-open No. 155690/1983, Atherosclerosis, 32 , 307).
~313, 1979). The object compound of the present invention has the formula a pharmacologically acceptable salt thereof,
Consists of its ester or its ring-closed lactone
The ML-236B derivative is enzymatically hydroxylated by contacting it with a 3″-hydroxylated conversion bacterium or its cell-free extract, and then the resulting conversion reaction product is subjected to hydrolysis reaction, salt formation reaction, and esterification as desired. It is obtained by subjecting the raw material compound to a carboxylic acid having the general formula (), a pharmacologically acceptable salt thereof, an ester thereof, or a closed ring lactone thereof. Among the microorganisms belonging to the genus Streptomyces, Streptomyces sp. ) SANK62385 (Feikoken Article No. 1143) Streptomyces sp. SANK62485 (Feikoken Article No. 1144) converts ML-236B derivatives into 3″-hydroxy-ML with a conversion rate of over 90%. It has the ability to convert into -236B derivatives. The mycological properties of these strains are as follows. 1 Morphological characteristics The morphology is ISP (International Streptomyces progeny).
Streptomyces Project)] on specified medium, 28℃,
After culturing for 14 days, it was observed under light and electron microscopes. SANK62285, SANK62385 and
In both SANK62485 strains, the basal hyphae are branched and elongate well, and the aerial hyphae are simply branched. The shape of the spore chain of SANK62285 strain is straight;
The spores are spherical to oval in shape and have a smooth surface structure.
The spore chains of the SANK62385 and SANK62485 strains have a spiral shape, the spores are spherical to oval, and the surface structure is smooth. SANK62285,
Special organs such as axle branches of aerial hyphae, sclerotia, and sporangia were not observed in either SANK62385 or SANK62485 strains. 2. Properties on various culture media The properties after culturing on various culture media at 28°C for 14 days are as shown in Tables 1 to 3. The color tone display represents the color chip number of the "Standard Color Chart" published by the Japan Color Research Institute.
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】
３ 生理学的性質
SANK62285、SANK62385およびSANK62485
株の生理学的性質は第４〜６表に示す通りであ
る。[Table] 3 Physiological properties SANK62285, SANK62385 and SANK62485
The physiological properties of the strains are shown in Tables 4-6.
【表】【table】
【表】【table】
【表】
ゼラチンの液化 陽性
[Table] Liquefaction of gelatin positive
【表】
また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地を使用
して、14日間培養後炭素源の資化性を調べた。
SANK62285、SANK62385およびSANK62485株
は炭素源無添加の対照培地でも若干の生育がみら
れるため、正確な資化性を記述することは困難で
ある。尚、参考のため第７表に対照を−とした時
の相対的な資化性を示した。[Table] In addition, using Pridham-Gotlieb agar medium, the assimilation of carbon sources was investigated after 14 days of culture.
SANK62285, SANK62385, and SANK62485 strains show some growth even in a control medium without carbon source addition, so it is difficult to describe their accurate assimilation ability. For reference, Table 7 shows the relative assimilation ability when the control is -.
【表】
４ 菌体成分について
SANK62285、SANK62385およびSANK62485
株の細胞壁はビー・ベツカーらの方法〔B.
Beckeret al.，アプライド・マイクロバイオロジ
ー（Applied Microbiology），12巻，421〜423
頁，1964年〕に従い検討した結果、Ｌ，Ｌ−ジア
ミノピメリン酸およびグリシンが検出されたこと
から、細胞壁タイプであることが確認された。
また、SANK62285、SANK62385および
SANK62485株の全細胞中の糖成分をエム・ピ
ー・レシエバリエの方法〔M.P.Lechevalier，ジ
ヤーナル・オブ・ラボラトリイ・アンド・クリニ
カル・メデイシン（Journal of Laboratory and
Clinical Madicine），71巻，934頁，1968年〕に
従い検討した結果、特徴的なパターンは認められ
なかつた。
以上のことから、本菌株３株は放線菌の中でも
ストレプトマイセス属に属することが判明したの
で、ストレプトマイセス・エスピー
（Streptomyces sp.）SANK62285、SANK62385
およびSANK62485と命名された。
なお、SANK62285、SANK62385および
SANK62485株の同定はISP〔ジ・インターナシヨ
ナル・ストレプトマイセス・プロジエクト（The
International Streptomyces Project）〕基準、
バージーズ・マニユアル（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）第８版、ジ・ア
クチノミセイテス（The Actinomycetes）第２
巻および放線菌に関する最近の文献によつて行つ
た。
以上、SANK62285、SANK62385および
SANK62485株について説明したが、枚線菌の諸
性質は一定したものではなく、自然的、人工的に
容易に変化することは周知のとおりであり、本発
明で使用しうる菌株はストレプトマイセス属に属
し、ML−236B誘導体を3″−ヒドロキシ−ML−
236B誘導体に変換し得る菌株すべてを包含する
ものである。
本発明の方法を実施するに際して、酵素的に水
酸化する方法としては、変換菌をその生育に適し
た培養条件下で培養し、ａ○原料化合物を培地中に
添加して接触させる方法ｂ○変換菌を培養・集菌
し、得られた変換菌菌体を原料化合物と接触させ
る方法、およびｃ○変換菌菌体から調製した無細胞
抽出液を原料化合物と接触させる方法などが採用
される。
変換菌の培養方法としては、通常微生物が利用
しうる栄養物を含有する培地で培養することがで
きる。栄養源としては一般微生物培養に利用され
る公知のものが使用できる。例えば炭素源として
グルコース、シユークロース、澱粉、グリセリ
ン、水飴、糖密、大豆油等を使用しうる。また窒
素源としては大豆粉、水麦胚芽、肉エキス、ペプ
トン、コーンスチープリカー、乾燥酵母、硫酸ア
ンモニウム等を使用しうる。その他必要に応じて
食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、隣酸塩等の無
機塩のほか、菌の発育を助け、前記水酸化能を有
する酵素の生産促進に必要な添加物を適宜組合せ
使用することができる。培養方法としては微生物
一般に用いられる培養法例えば液体培養法が可能
であり、工業的には深部培養法が適している。
培養は好気的条件下で行なわれ、培養温度は20
〜37℃、好適には26〜28℃である。
ａ○法は、原料化合物を添加し培養することによ
つて行なわれる。添加時期は、使用する変換菌の
至適培養条件、特に培養装置、培地組成、培地温
度等により異なるが、変換菌の水酸化能が高まり
はじめる時期がよく、通常は変換菌の培養開始後
２〜３日経過した時点が好ましい。原料化合物の
添加量は培地に対し0.01〜5.0％の範囲から選ば
れるが、0.05〜0.5％の範囲が好適である。原料
化合物添加後の培養は好気的条件で上記培養温度
で行なわれる。培養期間は原料化合物の添加後３
〜５日である。
ｂ○法は、上記の方法により変換菌を少量の基質
の存在下で培養し、変換菌の水酸化能が最大とな
るまで培養する。即ち、水酸化能は培地の種類、
温度等によつて異なるが、通常は培養開始後４〜
５日で最大となるので、この時点で培養を終了す
る。集菌は培養物を遠心分離、過等の方法に付
すことによつて行なわれる。集菌された変換菌菌
体は通常生理食塩水、緩衝液等で洗浄して使用す
るのが好ましい。
このようにして得られた変換菌菌体を原料化合
物と接触させるには、通常は水性媒体中、例えば
PH５〜９の隣酸塩緩衝液中で行なわれる。反応温
度は20〜45℃、好適には25〜30℃である。原料化
合物の濃度は通常0.01〜5.0％の範囲から選ばれ
る。反応時間は原料化合物の濃度、反応温度等に
よるが、通常１〜５日位である。
ｃ○方法での無細胞抽出液は、上記の方法で得ら
れた変換菌菌体に物理的または化学的手段を適用
し、例えば磨砕、超音波処理等によつて菌体破壊
物として、また界面活性剤、酵素処理等によつて
菌体溶解液として得られる。
このようにして得られた無細胞抽出液を原料化
合物と接触させる方法は、上記の変換菌菌体を原
料化合物と接触させる方法と同様に行なわれる。
変換反応終了後、目的化合物は生成物から既知
の方法で直接採取、分離、精製することができ
る。例えば生成物を過し、得られた液を酢酸
エチルのような水と混和しにくい有機溶媒で抽出
し、抽出液から溶媒を留去させたのち、得られた
粗目的化合物をシリカゲル、アルミナ等を用いた
カラムクロマトグラフに付し、適切な溶離剤で溶
出することによつて分離、精製することができ
る。
さらに、得られた生成物は所望により、化学的
常法に従つて加水分解反応、塩形成反応、エステ
ル化反応またはラクトン化反応に付すことによつ
て日的化合物に変え、容易に採取することができ
る。
これらの方法はいずれも常法であり、例えば次
のような方法である。
式（）を有するカルボン酸は、変換反応の生
成物がカルボン酸塩である場合、得られた液を
PH４以下、好ましくはPH３〜４に調整することに
よつて得られる。使用される酸としては目的化合
物に影響を与えるものでなければ有機酸または鉱
酸等に限定はなく、例えばトリフルオロ酢酸、塩
酸、硫酸などが好適に使用される。
このようにして得られたカルボン酸は、抽出、
洗浄、脱水等の処理をした後、以下の反応に使用
することができる。
式（）を有するカルボン酸の金属塩は、該金
属の水酸化物、炭酸塩等を水性溶媒中で上記カル
ボン酸と接触させることによつて得られる。使用
される水性溶媒としては例えば水；メタノール、
エタノールのようなアルコール類、アセトン、ｎ
−ヘキサン、酢酸エチルなどの有機溶媒と水との
混合溶媒が好適である。特に親水性有機溶媒と水
との混合溶媒が好適である。反応は通常室温付近
で好適に行なわれるが、必要に応じて加熱下で行
つてもよい。
式（）を有するカルボン酸のアミン塩は、ア
ミンを水性溶媒中で上記カルボン酸と接触させる
ことによつて得られる。使用される水性溶媒とし
ては例えば水；メタノール、エタノールなどのア
ルコール類、テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリルなどのニトリル類と水との混
合溶媒等をあげることができるが、好ましくは含
水アセトンである。反応は通常PH７〜8.5で室温
以下、特に５〜10℃で好適に行なわれる。反応は
瞬時に完了する。あるいは例えば上記で得られた
カルボン酸金属塩を水性溶媒に溶解し、次いで目
的のアミンの鉱酸塩（例えば塩酸塩など）を上記
条件下で添加し、塩交換反応により得ることもで
きる。
式（）を有するカルボン酸のアミノ塩は、ア
ミノ酸を水性溶媒中で上記カルボン酸と接触させ
ることによつて得られる。使用される水性溶媒と
しては例えば水；メタノール、エタノールなどの
アルコール類、テトラヒドロフランなどのエーテ
ル類と水との混合溶媒等をあげることができる。
反応は通常加熱下、好ましくは50〜60℃付近で行
なわれる。
式（）を有するカルボン酸のアルキルエステ
ルは、上記で得られたカルボン酸をアルコールと
接触させることによつて得られる。この際、触媒
としては塩酸、硫酸などの鉱酸あるいはフツ化ホ
ウ素、酸性イオン変換樹脂などが用いられ、溶媒
としては同一のアルコールまたはベンゼン、クロ
ロホルム、エーテル等反応に関与しないものが使
用される。あるいは、上記で得られたカルボン酸
をジアゾアルカンと接触させることによつて得ら
れる。反応は通常ジアゾアルカンのエーテル溶液
と接触させることによつて行なわれる。あるい
は、上記で得られたカルボン酸の金属塩にハロゲ
ン化アルキルを接触させることによつて得られ
る。使用される溶媒としては例えばジメチルホル
ムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホ
キシド、アセトンなどが好適である。
反応はいずれも室温付近で好適に行なわれる
が、反応系の種類によつては必要に応じて加熱下
で行なつてもよい。
式（）を有するカルボン酸のラクトン体は、
上記で得られたカルボン酸を触媒量の酸と接触さ
せることによつて得られる。使用される酸として
は、例えばトリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸などの
有機酸または鉱酸が好適である。反応は通常室温
付近で好適に行なわれる。
さらに、このようにして得られた目的化合物を
原料として、上記の化学的常法に従つて、他の目
的化合物に変えることもできる。
このようにして得られた目的化合物は種々の方
法を適宜組合わせることによつて採取、分離、精
製することができる。例えば活性炭、シリカゲル
等の各種担体を用いる吸着またはイオン交換クロ
マト、あるいはセフアデツクスカラムによるゲル
過、エーテル、酢酸エチル、クロロホルムなど
の有機溶媒を用いての抽出などにより行なわれ
る。
特に異性体の分離は、変換反応終了後、または
所望工程の終了後の適切な時期に上記の分離精製
手段により行うことができる。
次に実施例を示すが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
実施例 １
3″−ヒドロキシ−ML−236ラクトン体
グルコース20、ペプトン10、酵母エキス1.0
（ｇ／）PH7.0からなる培地100mlを含有する500
ml容の三角フラスコ４本にストレプトミセス・エ
スピーSANK62285株を接種し、28℃で48時間振
盪培養（220r.p.m）した。得られた種培養液150
mlを上記と同じ組成の培地15を含む30容ジヤ
ーフアーメンター２基にそれぞれ移し、消泡剤と
してCB−442を0.01％加えて通気量15／分、内
圧1.0Kg／cm2、撹拌速度100〜200r.p.m培養温度28
℃の条件下で45時間培養した。これにML−236
カルボン酸ナトリウム塩を最終濃度で0.1％にな
るように添加して更に50時間培養を続けた。培養
終了後、培養液を過し、液を得た。
15ジヤー２基分の液26をHP−20樹脂２
にSV4〜５で吸着させたのち水洗（８）し、
30％アセトン−水３、50％アセトン−水８の
溶媒で溶出した。50％アセトン−水溶出分画８
を減圧濃縮しアセトンを除去した。濃縮液4.6
を6N−塩酸でPH2.8〜3.0としたのち等量の酢酸エ
チル（４×２）で抽出した。この酢酸エチル抽
出液を飽和食塩水（４×２）で水洗後、無水硫
酸ナトリウムで乾燥して濃縮し油状の濃縮物20ｇ
を得た。得られた油状濃縮物20ｇを乾燥した酢酸
エチル100mlに溶解し、これにトリフルオロ酢酸
0.5mlを加え50℃、３時間放置しラクトン化を行
つた。反応液を酢酸エチル400mlで希釈し、１％
重炭酸ナトリウム液で処理したのち飽和食塩水で
水洗、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。この酢酸
エチル液を濃縮（100ml）し、析出した3″−ヒド
ロキシ−ML−236Bラクトン体の粗結晶12.8ｇを
別した。この粗結晶の一部をシリカゲルカラム
クロマト精製（Si−60，ｎ−ヘキサン−アセトン
０〜50v／ｖ％）して得られる純品3″−ヒドロキ
シ−ML−236Bラクトン体は以下の物理定数を示
す。
１ 分子式：C23H34O6
２ 分子量：406（SIMS質量分析スペクトラム：
QM＋Ｈ，407）
３ 赤外線吸収スペクトル：νnaxcm-1
KBr中で測定した赤外線吸収スペクトルは第
１図に示す通りである。
４ 炭素−13−核磁気共鳴スペクトル：δ：ppm
重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシ
ランを使用して測定した炭素−13−核磁気共鳴ス
ペクトル（22.5MHz）は、以下のケミカケルシフ
ト（ppm）および多重度を示す。
ケミカケルシフト 多重度
１ 10.9 Ｑ
２ 13.8 Ｑ
３ 20.0 Ｑ
４ 20.9 Ｔ
５ 23.6 Ｔ
６ 26.2 Ｔ
７ 30.9 Ｄ
８ 32.7 Ｔ
９ 36.9 Ｄ
10 36.0 Ｔ
11 37.6 Ｄ
12 38.6 Ｔ
13 45.9 Ｄ
14 62.5 Ｄ
15 68.1 Ｄ
16 68.4 Ｄ
17 76.2 Ｄ
18 123.6 Ｄ
19 128.1 Ｄ
20 132.8 Ｄ
21 133.7 Ｓ
22 170.8 Ｓ
23 175.7 Ｓ
実施例 ２
3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸ナトリ
ウム塩
実施例１で得られた3″−ヒドロキシ−ML−
236Bラクトン体2.0ｇをメタノール200mlに溶解
し、これに蒸留水50mlを加えた。この溶液にほぼ
等モル量の水酸化ナトリウム液（0.25ｇ／40ml
H2O）を40〜50℃で滴加した。この間ナトリウ
ム塩の生成は液体クロマト法で確認した。滴加後
約２時間で反応液をＮ−塩酸でPH8.5に調整した
のち減圧濃縮（50ml）しメタノールを除去し、水
層を凍結乾燥することにより3″−ヒドロキシ−
ML−236Bカルボン酸ナトリウム塩2.6ｇを得た。
3″−ヒドロキシ−ML−236Bカルボン酸ナトリウ
ム塩は以下の物理定数を示す。
１ 分子式：C23H35O7Na
２ 赤外線吸収スペクトル：νnaxcm-1
KBr中で測定した赤外線吸収スペクトルは第
２図に示す通りである。
３ プロトン−核磁気共鳴スペクトル：δ：ppm
重水中、内部基準にテトラメチルシランを使用
して測定したプロトン−核磁気共鳴スペクトル
（270PH）は第３図に示す通りである。
４ 炭素−13−核磁気共鳴スペクトル：δ：ppm
重水中、内部基準にテトラメチルシランを使用
して測定した炭素−13−核磁気共鳴スペクトル
（22.5MHz）は、以下のケミカケルシフト（ppm）
および多重度を示す。
ケミカケルシフト 多重度
１ 13.8 Ｑ
２ 14.7 Ｑ
３ 21.7 Ｑ
４ 21.9 Ｄ
５ 25.2 Ｔ
６ 27.0 Ｄ
７ 31.8 Ｄ
８ 35.5 Ｔ
９ 38.2 Ｔ
10 38.3 Ｔ
11 44.6 Ｔ
12 45.6 Ｔ
13 48.6 Ｄ
14 68.8 Ｄ
15 69.4 Ｄ
16 70.0 Ｄ
17 71.1 Ｄ
18 124.0 Ｄ
19 129.0 Ｄ
20 134.5 Ｄ
21 135.0 Ｓ
22 177.7 Ｓ
23 180.9 Ｓ
実施例 ３
ストレプトミセス・エスピーSANK62285株の
代りにそれぞれストレプトミセス・エスピー
SANK62385株および同SANK62485株を用いて、
実施例１および２と同様に実施して、3″−ヒドロ
キシ−ML−236Bラクトン体および3″−ヒドロキ
シ−ML−236Bカルボン酸ナトリウム塩が得られ
た。
物理定数は実施例１および２で得られたものと
同じであつた。
試験例 コレステロール合成阻害作用
前記一般式（）を有するカルボン酸、その薬
理上許容しうる塩、そのエステルまたはその閉環
ラクトン体からなる3″−ヒドロキシ−ML−236B
誘導体はコレステロール合成経路上の律速酵素と
して知られる３−ヒドロキシ−３−メチルグルタ
リル・コエンザイムＡリダクーゼ（３−hydroxy
−３−methyl−glutaryl−Co Ａ reductase）
を特異的に阻害することが分つた。これら化合物
のコレステロール合成阻害作用〔ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.
Chem.）234巻2835頁（1959年）記載の方法で測
定〕を第８表に示す。[Table] 4 Regarding bacterial components SANK62285, SANK62385 and SANK62485
The cell wall of the strain was determined using the method of B. Betzker et al. [B.
Beckeret al., Applied Microbiology, vol. 12, 421-423.
Page, 1964], L,L-diaminopimelic acid and glycine were detected, so it was confirmed that it was a cell wall type.
Also SANK62285, SANK62385 and
Sugar components in whole cells of SANK62485 strain were determined using the MP Lechevalier method [MPLechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine].
Clinical Medicine, Vol. 71, p. 934, 1968], no characteristic pattern was observed. From the above, it was found that these three strains belong to the genus Streptomyces among actinomycetes, and therefore Streptomyces sp. SANK62285, SANK62385
and was named SANK62485. In addition, SANK62285, SANK62385 and
Identification of SANK62485 strain was carried out by ISP [The International Streptomyces Project].
International Streptomyces Project) Standards,
Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology 8th edition, The Actinomycetes 2nd edition
volume and recent literature on actinomycetes. Above, SANK62285, SANK62385 and
Although the SANK62485 strain has been explained, it is well known that the properties of Streptomyces spp. are not constant and can easily change naturally or artificially. ML-236B derivative belongs to 3″-hydroxy-ML-
This includes all strains that can be converted into 236B derivatives. When carrying out the method of the present invention, methods for enzymatic hydroxylation include a method in which the converting bacteria are cultured under culture conditions suitable for their growth, and a○ a raw material compound is added to the medium and brought into contact b○ A method of cultivating and collecting the converting bacteria and contacting the obtained converted bacteria cells with a raw material compound, and a method of contacting a cell-free extract prepared from c○ converting bacteria cells with the raw material compound, etc. are adopted. . The converting bacteria can be cultured in a medium containing nutrients that can be used by microorganisms. As the nutrient source, any known nutrient source used for general microbial culture can be used. For example, glucose, sucrose, starch, glycerin, starch syrup, molasses, soybean oil, etc. can be used as the carbon source. Further, as the nitrogen source, soybean flour, barley germ, meat extract, peptone, corn steep liquor, dried yeast, ammonium sulfate, etc. can be used. In addition to other inorganic salts such as salt, potassium chloride, calcium carbonate, and phosphate salts, additives necessary to support the growth of bacteria and promote the production of the enzymes having the above-mentioned hydroxylation ability may be used in combination as appropriate. I can do it. As a culture method, a culture method generally used for microorganisms, such as a liquid culture method, can be used, and a deep culture method is suitable for industrial use. Cultivation was carried out under aerobic conditions, with a culture temperature of 20
~37°C, preferably 26-28°C. The a○ method is carried out by adding and culturing a raw material compound. The timing of addition varies depending on the optimal culture conditions of the converting bacteria used, especially the culture equipment, medium composition, medium temperature, etc., but it is best to add it when the hydroxylation ability of the converting bacteria begins to increase, usually 2 days after the start of culturing of the converting bacteria. Preferably, after ~3 days have elapsed. The amount of the raw material compound to be added to the medium is selected from the range of 0.01 to 5.0%, preferably from 0.05 to 0.5%. Cultivation after addition of the raw material compound is carried out under aerobic conditions at the above-mentioned culture temperature. The culture period is 3 after the addition of the raw material compound.
~5 days. In the b○ method, converted bacteria are cultured in the presence of a small amount of substrate by the method described above, and cultured until the hydroxylation ability of the converted bacteria reaches its maximum. In other words, the hydroxylation ability depends on the type of medium,
Although it varies depending on the temperature etc., it usually takes 4 to 4 hours after the start of culture.
Since it reaches its maximum level in 5 days, the culture is terminated at this point. Bacterial collection is performed by subjecting the culture to centrifugation, straining, etc. It is preferable that the collected converted bacterial cells be washed with normal saline, buffer solution, etc. before use. In order to bring the thus obtained converted bacterial cells into contact with the starting compound, it is usually carried out in an aqueous medium, e.g.
It is carried out in a phosphate buffer with a pH of 5-9. The reaction temperature is 20-45°C, preferably 25-30°C. The concentration of the raw material compound is usually selected from the range of 0.01 to 5.0%. The reaction time depends on the concentration of the raw material compound, the reaction temperature, etc., but is usually about 1 to 5 days. The cell-free extract obtained by the c○ method is obtained by applying physical or chemical means to the converted bacterial cells obtained by the above method, for example, by grinding, ultrasonication, etc., to obtain a cell-free extract. It can also be obtained as a bacterial cell lysate by treatment with a surfactant or an enzyme. The method of contacting the cell-free extract thus obtained with the raw material compound is carried out in the same manner as the method of contacting the converted bacterial cells with the raw material compound described above. After the conversion reaction is completed, the target compound can be directly collected, separated, and purified from the product by known methods. For example, the product is filtered, the resulting liquid is extracted with an organic solvent that is not easily miscible with water such as ethyl acetate, the solvent is distilled off from the extracted liquid, and the resulting crude target compound is extracted with silica gel, alumina, etc. It can be separated and purified by subjecting it to column chromatography and eluting with an appropriate eluent. Furthermore, the obtained product can be converted into a common compound by subjecting it to a hydrolysis reaction, salt formation reaction, esterification reaction, or lactonization reaction according to conventional chemical methods, and can be easily collected. I can do it. All of these methods are conventional methods, such as the following method. Carboxylic acids with formula () are used when the product of the conversion reaction is a carboxylate salt, and the resulting liquid
It can be obtained by adjusting the pH to 4 or less, preferably 3 to 4. The acid used is not limited to organic acids or mineral acids as long as it does not affect the target compound; for example, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, etc. are preferably used. The carboxylic acid thus obtained is extracted,
After processing such as washing and dehydration, it can be used in the following reaction. A metal salt of a carboxylic acid having the formula () can be obtained by contacting a hydroxide, carbonate, etc. of the metal with the above carboxylic acid in an aqueous solvent. Examples of aqueous solvents used include water; methanol;
Alcohols such as ethanol, acetone, n
- A mixed solvent of water and an organic solvent such as hexane or ethyl acetate is suitable. Particularly suitable is a mixed solvent of a hydrophilic organic solvent and water. The reaction is usually suitably carried out at around room temperature, but may be carried out under heating if necessary. Amine salts of carboxylic acids having formula () are obtained by contacting amines with the above carboxylic acids in an aqueous solvent. Examples of the aqueous solvent used include water; alcohols such as methanol and ethanol; ethers such as tetrahydrofuran; and mixed solvents of water and nitriles such as acetonitrile; preferred is aqueous acetone. The reaction is usually suitably carried out at a pH of 7 to 8.5 and below room temperature, particularly at 5 to 10°C. The reaction is completed instantly. Alternatively, the carboxylic acid metal salt obtained above can be dissolved in an aqueous solvent, and then a mineral acid salt (eg, hydrochloride) of the desired amine can be added under the above conditions to obtain the salt exchange reaction. The amino salt of a carboxylic acid having the formula () can be obtained by contacting an amino acid with the above carboxylic acid in an aqueous solvent. Examples of the aqueous solvent used include water; a mixed solvent of water and alcohols such as methanol and ethanol; and ethers such as tetrahydrofuran.
The reaction is usually carried out under heating, preferably around 50 to 60°C. The alkyl ester of a carboxylic acid having the formula () can be obtained by contacting the carboxylic acid obtained above with an alcohol. In this case, as a catalyst, a mineral acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, or boron fluoride, or an acidic ion conversion resin is used, and as a solvent, a solvent that does not participate in the reaction, such as the same alcohol or benzene, chloroform, or ether, is used. Alternatively, it can be obtained by contacting the carboxylic acid obtained above with a diazoalkane. The reaction is usually carried out by contacting with an ethereal solution of the diazoalkane. Alternatively, it can be obtained by contacting the metal salt of carboxylic acid obtained above with an alkyl halide. Suitable solvents to be used include, for example, dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxide, and acetone. All reactions are preferably carried out at around room temperature, but depending on the type of reaction system, they may be carried out under heating if necessary. The lactone form of carboxylic acid having the formula () is
It is obtained by contacting the carboxylic acid obtained above with a catalytic amount of acid. The acid used is preferably an organic or mineral acid such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, or sulfuric acid. The reaction is usually suitably carried out at around room temperature. Furthermore, the target compound thus obtained can be used as a raw material and converted into other target compounds according to the above-mentioned conventional chemical methods. The target compound thus obtained can be collected, separated, and purified by appropriately combining various methods. For example, this may be carried out by adsorption using various carriers such as activated carbon or silica gel, ion exchange chromatography, gel filtration using a Sephadex column, or extraction using an organic solvent such as ether, ethyl acetate, or chloroform. In particular, separation of isomers can be carried out by the above separation and purification means at an appropriate time after the completion of the conversion reaction or after the completion of the desired step. Examples will be shown next, but the present invention is not limited thereto. Example 1 3″-hydroxy-ML-236 lactone Glucose 20, Peptone 10, Yeast Extract 1.0
(g/) 500 containing 100ml of medium consisting of PH7.0
Four ml Erlenmeyer flasks were inoculated with Streptomyces sp. SANK62285 strain, and cultured with shaking (220 rpm) at 28°C for 48 hours. Obtained seed culture solution 150
ml was transferred to two 30-volume jar fermenters containing medium 15 with the same composition as above, and 0.01% of CB-442 was added as an antifoaming agent at an aeration rate of 15/min, an internal pressure of 1.0 Kg/cm 2 , and a stirring speed. 100~200r.pm culture temperature 28
The cells were cultured for 45 hours at ℃. ML−236 for this
Carboxylic acid sodium salt was added to the final concentration of 0.1%, and the culture was continued for an additional 50 hours. After the culture was completed, the culture solution was filtered to obtain a solution. Add liquid 26 for 2 15 jars to 2 HP-20 resin.
After adsorbing with SV4~5, wash with water (8),
Elution was carried out with a solvent of 30% acetone-water (33%) and 50% acetone-water (88%). 50% acetone-water elution fraction 8
was concentrated under reduced pressure to remove acetone. Concentrate 4.6
After adjusting the pH to 2.8-3.0 with 6N hydrochloric acid, the mixture was extracted with an equal amount of ethyl acetate (4x2). This ethyl acetate extract was washed with saturated brine (4x2), dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated to give 20g of oily concentrate.
I got it. 20 g of the obtained oily concentrate was dissolved in 100 ml of dry ethyl acetate, and trifluoroacetic acid was added to this.
0.5 ml was added and left to stand at 50°C for 3 hours to perform lactonization. Dilute the reaction solution with 400ml of ethyl acetate to 1%
After treatment with sodium bicarbonate solution, the mixture was washed with saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate. This ethyl acetate solution was concentrated (100 ml) and 12.8 g of precipitated crude crystals of 3″-hydroxy-ML-236B lactone were separated. A part of this crude crystal was purified by silica gel column chromatography (Si-60, n- The pure 3''-hydroxy-ML-236B lactone obtained by combining hexane-acetone (0 to 50 v/v%) exhibits the following physical constants. 1 Molecular formula: C 23 H 34 O 6 2 Molecular weight: 406 (SIMS mass spectrometry spectrum:
QM+H, 407) 3 Infrared absorption spectrum: ν nax cm -1 The infrared absorption spectrum measured in KBr is shown in FIG. 4 Carbon-13-nuclear magnetic resonance spectrum: δ: ppm The carbon-13-nuclear magnetic resonance spectrum (22.5 MHz) measured in deuterated chloroform using tetramethylsilane as an internal standard has the following chemical Kel shift (ppm ) and multiplicity. Chemikakel shift Multiplicity 1 10.9 Q 2 13.8 Q 3 20.0 Q 4 20.9 T 5 23.6 T 6 26.2 T 7 30.9 D 8 32.7 T 9 36.9 D 10 36.0 T 11 37.6 D 12 38.6 T 13 4 5.9 D 14 62.5 D 15 68.1 D 16 68.4 D 17 76.2 D 18 123.6 D 19 128.1 D 20 132.8 D 21 133.7 S 22 170.8 S 23 175.7 S Example 2 3″-hydroxy-ML-236B carboxylic acid sodium salt 3″-Hydroxy-ML- obtained in Example 1
2.0 g of 236B lactone was dissolved in 200 ml of methanol, and 50 ml of distilled water was added thereto. Add approximately equimolar amount of sodium hydroxide solution (0.25g/40ml) to this solution.
H2O ) was added dropwise at 40-50<0>C. During this time, the formation of sodium salt was confirmed by liquid chromatography. Approximately 2 hours after the dropwise addition, the reaction solution was adjusted to pH 8.5 with N-hydrochloric acid, concentrated under reduced pressure (50 ml) to remove methanol, and the aqueous layer was freeze-dried to give 3"-hydroxy-
2.6 g of ML-236B carboxylic acid sodium salt was obtained.
3″-Hydroxy-ML-236B carboxylic acid sodium salt exhibits the following physical constants: 1 Molecular formula: C 23 H 35 O 7 Na 2 Infrared absorption spectrum: ν nax cm -1 The infrared absorption spectrum measured in KBr is As shown in Figure 2. 3 Proton-nuclear magnetic resonance spectrum: δ: ppm The proton-nuclear magnetic resonance spectrum (270PH) measured in heavy water using tetramethylsilane as an internal standard is as shown in Figure 3. 4 Carbon-13-nuclear magnetic resonance spectrum: δ: ppm The carbon-13-nuclear magnetic resonance spectrum (22.5MHz) measured in heavy water using tetramethylsilane as an internal standard has the following chemical Kel shift. (ppm)
and multiplicity. Chemikakel shift Multiplicity 1 13.8 Q 2 14.7 Q 3 21.7 Q 4 21.9 D 5 25.2 T 6 27.0 D 7 31.8 D 8 35.5 T 9 38.2 T 10 38.3 T 11 44.6 T 12 45.6 T 13 4 8.6 D 14 68.8 D 15 69.4 D 16 70.0 D 17 71.1 D 18 124.0 D 19 129.0 D 20 134.5 D 21 135.0 S 22 177.7 S 23 180.9 S Example 3 Streptomyces sp.
Using SANK62385 strain and SANK62485 strain,
In the same manner as in Examples 1 and 2, 3''-hydroxy-ML-236B lactone and 3''-hydroxy-ML-236B carboxylic acid sodium salt were obtained. The physical constants were the same as those obtained in Examples 1 and 2. Test example Cholesterol synthesis inhibitory effect 3″-hydroxy-ML-236B consisting of a carboxylic acid having the above general formula (), a pharmacologically acceptable salt thereof, an ester thereof, or a closed ring lactone thereof
The derivative is 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase), which is known as the rate-limiting enzyme in the cholesterol synthesis pathway.
-3-methyl-glutaryl-Co A reductase)
was found to specifically inhibit Cholesterol synthesis inhibitory effect of these compounds [Journal of Biological Chemistry (J.Biol.
Chem.) Vol. 234, p. 2835 (1959)] are shown in Table 8.
【表】
トリウム塩
ML−236Bラクトン体(対照) 0.010
[Table] Thorium salt
ML-236B lactone (control) 0.010
Claims (1)
そのエステルまたはその閉環ラクトン体からなる
3″−ヒドロキシ−ML−236B誘導体。 ２ 式 を有するカルボン酸、その薬理上許容しうる塩、
そのエステルまたはその閉環ラクトン体からなる
ML−236B誘導体を、式 を有するカルボン酸、その薬理上許容しうる塩、
そのエステルまたはその閉環ラクトン体からなる
3″−ヒドロキシ−ML−236B誘導体に変換しうる
ストレプトミセス属に属する微生物を、ML−
236B誘導体を含有する培地で培養するか、ある
いはこの微生物の酵素抽出液とML−236B誘導体
とを接触せしめてML−236B誘導体を3″−ヒドロ
キシ−ML−236B誘導体に変換せしめ、変換反応
物を含む系より3″−ヒドロキシ−ML−236B誘導
体を採取することを特徴とする3″−ヒドロキシ−
ML−236B誘導体の製造法。[Claims] 1 formula a pharmacologically acceptable salt thereof,
Consists of its ester or its ring-closed lactone
3″-Hydroxy-ML-236B derivative. 2 Formula a pharmacologically acceptable salt thereof,
Consists of its ester or its ring-closed lactone
The ML-236B derivative has the formula a pharmacologically acceptable salt thereof,
Consists of its ester or its ring-closed lactone
A microorganism belonging to the genus Streptomyces that can be converted into a 3″-hydroxy-ML-236B derivative was
The ML-236B derivative is converted into a 3″-hydroxy-ML-236B derivative by culturing in a medium containing the 236B derivative, or by contacting the enzyme extract of this microorganism with the ML-236B derivative, and the conversion reaction product is converted into a 3″-hydroxy-ML-236B derivative. A 3″-hydroxy-ML-236B derivative is collected from a system containing the 3″-hydroxy-ML-236B derivative.
Method for producing ML-236B derivative.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP20261485 | 1985-09-13 | ||
| JP60-202614 | 1985-09-13 |
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|---|---|
| JPS62174040A JPS62174040A (en) | 1987-07-30 |
| JPH0366297B2 true JPH0366297B2 (en) | 1991-10-16 |
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ID=16460312
Family Applications (1)
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Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JPS62174040A (en) |
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1986
- 1986-09-04 JP JP20862086A patent/JPS62174040A/en active Granted
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