JPH0361488A - 発現用ビークルから成る組成物とそれにより形質転換された宿主とそれにより生産される蛋白質及び蛋白質から成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワクチン - Google Patents
発現用ビークルから成る組成物とそれにより形質転換された宿主とそれにより生産される蛋白質及び蛋白質から成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワクチンInfo
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- JPH0361488A JPH0361488A JP1162823A JP16282389A JPH0361488A JP H0361488 A JPH0361488 A JP H0361488A JP 1162823 A JP1162823 A JP 1162823A JP 16282389 A JP16282389 A JP 16282389A JP H0361488 A JPH0361488 A JP H0361488A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はトレポネマ・ヒオジセンテリエ−(Trep
onema hyodysente−riae (T
、hyo、))に関し、より詳しく組換えトレポネマ・
ヒオジセンテリエー抗原に関する。更にこの発明はブタ
赤痢用ワクチンに関する。
onema hyodysente−riae (T
、hyo、))に関し、より詳しく組換えトレポネマ・
ヒオジセンテリエー抗原に関する。更にこの発明はブタ
赤痢用ワクチンに関する。
ブタ赤痢はすべての主要なブタ飼育地方に見られる重大
な感染性疾病である。ブタ赤痢の兆候は重大な粘液出血
性下痢、脱水及び体重減少である。
な感染性疾病である。ブタ赤痢の兆候は重大な粘液出血
性下痢、脱水及び体重減少である。
ブタ赤痢は嫌気性のB−溶血性スピロヘータであるトレ
ポネマ・ヒオジセンテリエーによって引き起こされるこ
とが発見された。
ポネマ・ヒオジセンテリエーによって引き起こされるこ
とが発見された。
この疾病は一般に、急性感染又は無症候性保菌ブタから
のトレポネマ・ヒオジセンテリエーを含む糞便の摂取も
しくは農場設備又は取扱い者により散布される糞便によ
り起こる。
のトレポネマ・ヒオジセンテリエーを含む糞便の摂取も
しくは農場設備又は取扱い者により散布される糞便によ
り起こる。
トレポネマ・ヒオジセンテリエーに対するワクチンを作
る多くの試みがなされたが、それらは−般に童画の使用
を含むものであった。
る多くの試みがなされたが、それらは−般に童画の使用
を含むものであった。
この発明は組換えT、hyo、の抗原の調製及びそのワ
クチンとしての使用に関する。
クチンとしての使用に関する。
この発明の19の態様により、少なくとも19のT、h
yo、抗原のエピトーブを認識する少なくとも19の抗
体を引き出すことのできる少なくとも19の蛋白質をコ
ード化するDNA配列を含む組換えDNA分子もしくは
発現用又はクローニング用ビークル(ベクター又はプラ
スミド)が提供される。
yo、抗原のエピトーブを認識する少なくとも19の抗
体を引き出すことのできる少なくとも19の蛋白質をコ
ード化するDNA配列を含む組換えDNA分子もしくは
発現用又はクローニング用ビークル(ベクター又はプラ
スミド)が提供される。
この発明の他の態様により、少なくとも19のそのよう
な蛋白質を発現することのできるような発現用ビークル
で形質転換された宿主が提供される。
な蛋白質を発現することのできるような発現用ビークル
で形質転換された宿主が提供される。
この発明の更に別の態様により、そのような宿主によっ
て発現された少なくとも19のそのような蛋白質を含む
ワクチンが提供される。
て発現された少なくとも19のそのような蛋白質を含む
ワクチンが提供される。
より詳しくは、そのような発現用プラスミド又はヘクタ
ーに含まれるDNA配列は約19kDaないし約90k
Daの範囲の分子量を持つ少なくとも19のT、hyo
、抗原のエピトーブ(19又は複数)を認識する抗体を
引き出すことのできる少なくとも19の蛋白質をコード
化し、そのような抗原は最も一般的には少なくとも25
kDaで65kDaより大きくない分子量を持つ。
ーに含まれるDNA配列は約19kDaないし約90k
Daの範囲の分子量を持つ少なくとも19のT、hyo
、抗原のエピトーブ(19又は複数)を認識する抗体を
引き出すことのできる少なくとも19の蛋白質をコード
化し、そのような抗原は最も一般的には少なくとも25
kDaで65kDaより大きくない分子量を持つ。
更により詳しくは、DNA配列は次のT、hyO5抗原
、すなわち、19kDa、29kDa。
、すなわち、19kDa、29kDa。
30kDa、31kDa、34kDa、36kDa、3
8kDa、39kDa、42kDa、44kDa及び6
0kDaのT、hyo、抗原の少なくとも19の又は複
数のエピトーブ(19又は複数)を認識する抗体を引き
出すことのできる少なくとも19の蛋白質をコード化す
る。特に好ましい具体化においては、DNA配列は38
kDa。
8kDa、39kDa、42kDa、44kDa及び6
0kDaのT、hyo、抗原の少なくとも19の又は複
数のエピトーブ(19又は複数)を認識する抗体を引き
出すことのできる少なくとも19の蛋白質をコード化す
る。特に好ましい具体化においては、DNA配列は38
kDa。
39kDa及び60kDaのT、hyo、抗原の少なく
とも19のエピトーブ(19または複数)を認識する抗
体を生産することのできる蛋白質をコード化する。
とも19のエピトーブ(19または複数)を認識する抗
体を生産することのできる蛋白質をコード化する。
DNA配列は、そのようなりNA配列から生産される蛋
白質は免疫後T、hyo、抗原のエピトーブを認識する
抗体を引き出すことを条件として全抗原、又は抗原の断
片又は誘導体、もしくは抗原又は断片と他の蛋白質との
融合生成物をコート化することができる。
白質は免疫後T、hyo、抗原のエピトーブを認識する
抗体を引き出すことを条件として全抗原、又は抗原の断
片又は誘導体、もしくは抗原又は断片と他の蛋白質との
融合生成物をコート化することができる。
従って、例えばDNA配列は60kDaの抗原の断片(
10kDaの分子量を持ち、60kDaの抗原ペプチド
n列の一部を含む蛋白質)であるかそれを含む蛋白質を
、そのような断片が60kDaのエピトーブを認識する
抗体を生産することを条件としてコード化することがで
きる。
10kDaの分子量を持ち、60kDaの抗原ペプチド
n列の一部を含む蛋白質)であるかそれを含む蛋白質を
、そのような断片が60kDaのエピトーブを認識する
抗体を生産することを条件としてコード化することがで
きる。
同様に、DNA配列は抗原の誘導体例えばペプチド頻に
おける19又は複数のアミノ酸の変異である蛋白質を、
そのような誘導体が上述のT、hyo、抗原のエピトー
ブ(19又は複−a)を認識する抗体を引き出す限りコ
ード化することかできる。
おける19又は複数のアミノ酸の変異である蛋白質を、
そのような誘導体が上述のT、hyo、抗原のエピトー
ブ(19又は複−a)を認識する抗体を引き出す限りコ
ード化することかできる。
DNA配列は上述のT、hyo、抗原のエピトーブ(1
9又は複数)を認識する抗体を生産する蛋白質と他の蛋
白質(例えばキモシン)との融合生成物である蛋白質を
コード化することができる。
9又は複数)を認識する抗体を生産する蛋白質と他の蛋
白質(例えばキモシン)との融合生成物である蛋白質を
コード化することができる。
結果として、用語「上述のT、hyo、抗原のエピトー
ブ(19又は複数)に認識する抗体を生産する蛋白質を
コード化するDNA配列」は適当な抗原、抗原の断片、
抗原の誘導体又はそのような抗原、抗原の断片又は抗原
の誘導体と他の蛋白質との融合生成物であることができ
る蛋白質をコード化するか及び/又は適当な形質転換さ
れた細胞中で発現するDNA配列を包含する。
ブ(19又は複数)に認識する抗体を生産する蛋白質を
コード化するDNA配列」は適当な抗原、抗原の断片、
抗原の誘導体又はそのような抗原、抗原の断片又は抗原
の誘導体と他の蛋白質との融合生成物であることができ
る蛋白質をコード化するか及び/又は適当な形質転換さ
れた細胞中で発現するDNA配列を包含する。
又、細胞中に導入されるベクター中に存在するDNA配
列はそのようなりNA配列によってコード化される蛋白
質の一部のみを発現するのであり、発現される蛋白質部
分は上述のT、hyo。
列はそのようなりNA配列によってコード化される蛋白
質の一部のみを発現するのであり、発現される蛋白質部
分は上述のT、hyo。
抗原の19又は複数のエピトーブ(19又は複数)を認
識する抗体を生産することを条件としてそのようなりN
A配列は上述の定義の範囲内にあると理解すべきである
。例えはDNA配列は全抗原をコード化することができ
るが、発現される蛋白質は抗原の断片である。
識する抗体を生産することを条件としてそのようなりN
A配列は上述の定義の範囲内にあると理解すべきである
。例えはDNA配列は全抗原をコード化することができ
るが、発現される蛋白質は抗原の断片である。
個別の分子量を持つ発現された蛋白質は種々な形で存在
することもでき、すなわち、特別な分子量を持つ蛋白質
のアミノ酸配列は全配列にわたって同一でない場合もあ
る。従って、例えば39kDaの分子量を持つT、hy
o、抗原は種々な形で存在することができ、すなわち、
39kDaの分子量を持ち、共に80%近くのアミノ酸
配列の同一性を持つにも拘らず相互に異なるアミノ酸配
列を持つ少なくとも2つの異なるT、)1310゜抗原
がある。従って、本発明はクローニング・ビークルとそ
のようなりローニング・ビークルを使用して発現される
蛋白質を含み、前記発現される蛋白質(19又は複数)
は分子量は同一であるが、アミノ酸配列は変動するT、
hyo、抗原。
することもでき、すなわち、特別な分子量を持つ蛋白質
のアミノ酸配列は全配列にわたって同一でない場合もあ
る。従って、例えば39kDaの分子量を持つT、hy
o、抗原は種々な形で存在することができ、すなわち、
39kDaの分子量を持ち、共に80%近くのアミノ酸
配列の同一性を持つにも拘らず相互に異なるアミノ酸配
列を持つ少なくとも2つの異なるT、)1310゜抗原
がある。従って、本発明はクローニング・ビークルとそ
のようなりローニング・ビークルを使用して発現される
蛋白質を含み、前記発現される蛋白質(19又は複数)
は分子量は同一であるが、アミノ酸配列は変動するT、
hyo、抗原。
断片又は誘導体であることができる。同様に、そのよう
な場合、発現される蛋白質は同一の分子量を持つがアミ
ノ酸配列に若干の相違がある19又は複数のT、hyo
、抗原のエピトーブ(19又は複数)を認識する抗体を
引き出すことができる。
な場合、発現される蛋白質は同一の分子量を持つがアミ
ノ酸配列に若干の相違がある19又は複数のT、hyo
、抗原のエピトーブ(19又は複数)を認識する抗体を
引き出すことができる。
適当なりNA配列が任意の広範囲の種類のベクター又は
プラスミドに含まれることができる。そのようなベクタ
ーは染色体、非染色体及び合成りNA配列、例えばSV
40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、酵母
プラスミド、プラスミドとファージDNA、又は種痘ウ
ィルス、アデノウィルス、感染性上皮腫ウィルス及び偽
狂犬病ウィルスのようなウィルスDNAとの組合せによ
り得られるベクターを含む。
プラスミドに含まれることができる。そのようなベクタ
ーは染色体、非染色体及び合成りNA配列、例えばSV
40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、酵母
プラスミド、プラスミドとファージDNA、又は種痘ウ
ィルス、アデノウィルス、感染性上皮腫ウィルス及び偽
狂犬病ウィルスのようなウィルスDNAとの組合せによ
り得られるベクターを含む。
適当なりNA配列は種々な方法によりベクター中に挿入
することができる。一般に、DNA配列は当該技術分野
で公知の方法により適当な制限エンドメクレアーゼ部位
(19又は複数)に挿入することができる。これらの方
法は当業者が容易に到達できる範囲内にある打考えられ
る。
することができる。一般に、DNA配列は当該技術分野
で公知の方法により適当な制限エンドメクレアーゼ部位
(19又は複数)に挿入することができる。これらの方
法は当業者が容易に到達できる範囲内にある打考えられ
る。
発現用ベクター中のDNA配列はmRNA合成に向かう
適当な発現制御配列(19又は複数)くプロモーター)
に有効に連結される。そのようなプロモーターの代表例
としてL T R又は5V40プロモーター、イー・コ
リ(E、coli)のlacまたはtrp、ファージ・
ラムダPLプロモーター及び他の原核又は真核細胞又は
それらのウィルスにおいて遺伝子の発現を制御すること
が知られているプロモーターを挙げる事ができる。発現
用ベクターは翻訳開始及び転写終了遺伝子のリポソーム
結合部位も含む。ベクターは又適当な発現を増幅するた
めの配列も含む事ができる。
適当な発現制御配列(19又は複数)くプロモーター)
に有効に連結される。そのようなプロモーターの代表例
としてL T R又は5V40プロモーター、イー・コ
リ(E、coli)のlacまたはtrp、ファージ・
ラムダPLプロモーター及び他の原核又は真核細胞又は
それらのウィルスにおいて遺伝子の発現を制御すること
が知られているプロモーターを挙げる事ができる。発現
用ベクターは翻訳開始及び転写終了遺伝子のリポソーム
結合部位も含む。ベクターは又適当な発現を増幅するた
めの配列も含む事ができる。
更に、発現用ベクターは真核細胞培養のためのジヒドロ
葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、もしくはE、co
liにおけるテトライタリン又はアンピシリン耐性のよ
うな形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性
を具える遺伝子を含むのか好ましい。
葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、もしくはE、co
liにおけるテトライタリン又はアンピシリン耐性のよ
うな形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性
を具える遺伝子を含むのか好ましい。
上述の適当なりNA配列、並びに適当なプロモーター又
は制御配列を含むベクターは適当な宿主を蛋白質を発現
し得るように形質転換させるために使用することかでき
る。適当な宿主の代表例として、E、coli、サルモ
ネラーティフィムリューム(Salmonella
typhi −mu r i um)のような細菌m胞
、酵母のようなカビ細胞、CHO又はボウニス(Bow
es)メラノーマのような動物細胞、植物細胞などが挙
げられる。適当な宿主の選択はここに示したことにより
当業者が容易に到達し得る範囲内にあると考えられる。
は制御配列を含むベクターは適当な宿主を蛋白質を発現
し得るように形質転換させるために使用することかでき
る。適当な宿主の代表例として、E、coli、サルモ
ネラーティフィムリューム(Salmonella
typhi −mu r i um)のような細菌m胞
、酵母のようなカビ細胞、CHO又はボウニス(Bow
es)メラノーマのような動物細胞、植物細胞などが挙
げられる。適当な宿主の選択はここに示したことにより
当業者が容易に到達し得る範囲内にあると考えられる。
上に述べたように、選択された部位に挿入される適当な
りNA配列を含む発現用ビークルは上述のT、hyo、
抗原(19又は複数)のエピトーブ(19又は複数)を
認識する抗体を生産することができる蛋白質をコード化
する遺伝子の部分ではないDNA又は遺伝子配列を含む
事ができる。
りNA配列を含む発現用ビークルは上述のT、hyo、
抗原(19又は複数)のエピトーブ(19又は複数)を
認識する抗体を生産することができる蛋白質をコード化
する遺伝子の部分ではないDNA又は遺伝子配列を含む
事ができる。
例えば、所望のDNA配列は同じ読み取り機構の中に発
現に寄与するか又は精製を改ぷするか又は適当な蛋白質
の発現を許容するDNA配列を融合させることができる
。例えば本発明の代表的具体化に示すように、適当なり
NA配列として小生キモシンをコート化する遺伝子をベ
クターの同じ読み取り機構の中に挿入し、所望の蛋白質
は子牛キモシンとの融合ペプチドとして発現される。
現に寄与するか又は精製を改ぷするか又は適当な蛋白質
の発現を許容するDNA配列を融合させることができる
。例えば本発明の代表的具体化に示すように、適当なり
NA配列として小生キモシンをコート化する遺伝子をベ
クターの同じ読み取り機構の中に挿入し、所望の蛋白質
は子牛キモシンとの融合ペプチドとして発現される。
ワクチンを開発することが望まれる場合、中和又は保護
抗体は自然抗原の不連続構造依存性エピトーブを標的と
することができる。従って組換え発現系から得られる蛋
白質は本来の蛋白質分子の自然環境下におけるそれと実
質的に異なる三次元構造を持つことができるか否かを考
慮しなければならない。従って分離される蛋白質の免疫
原的性質により、適当な分子構造を復活するため本来の
性質に戻すことが必要になる場合がある。多くの蛋白質
を復元する方法が科学文献に記載されており、それらは
(1)アルカリ、カオトロープ(chaotrope)
、有機溶剤及びイオン性界面活性剤のような薬品の使用
と引き続く希釈、透析又はp++調整により変性剤を除
去することにより達成される復元段階による不適当に折
り重なった蛋白質の変性(広げ)と、(2)免疫原性蛋
白質のための膜様環境を再生するための蛋白質の脂質二
層又はリボゾーム中への再構築を含む。
抗体は自然抗原の不連続構造依存性エピトーブを標的と
することができる。従って組換え発現系から得られる蛋
白質は本来の蛋白質分子の自然環境下におけるそれと実
質的に異なる三次元構造を持つことができるか否かを考
慮しなければならない。従って分離される蛋白質の免疫
原的性質により、適当な分子構造を復活するため本来の
性質に戻すことが必要になる場合がある。多くの蛋白質
を復元する方法が科学文献に記載されており、それらは
(1)アルカリ、カオトロープ(chaotrope)
、有機溶剤及びイオン性界面活性剤のような薬品の使用
と引き続く希釈、透析又はp++調整により変性剤を除
去することにより達成される復元段階による不適当に折
り重なった蛋白質の変性(広げ)と、(2)免疫原性蛋
白質のための膜様環境を再生するための蛋白質の脂質二
層又はリボゾーム中への再構築を含む。
本発明の他の態様により、上述の種類のクローニング・
ビークルで形質転換した宿主から生産される蛋白質は、
ブタ赤痢特にT、hyo、によって誘導されるブタ赤痢
に対して保護するため生理的に受容可能な賦形剤と共に
使用することができる。上で述べたように、そのような
蛋白質は上述のT、hyo、の19又は複数のエピトー
ブ(19又は複数)を認識する抗体を引き出すことがで
きる。そのような発現された蛋白質は、今後時には「組
換えT、hyo、抗原」と称するが、しかしながら上述
のようにそのような蛋白質は断片、誘導体又は融合生成
物も含むことがある点でT、hyo、抗原に相当しない
場合がある。用語「組換えT、hyo、抗原」はそのよ
うな断片。
ビークルで形質転換した宿主から生産される蛋白質は、
ブタ赤痢特にT、hyo、によって誘導されるブタ赤痢
に対して保護するため生理的に受容可能な賦形剤と共に
使用することができる。上で述べたように、そのような
蛋白質は上述のT、hyo、の19又は複数のエピトー
ブ(19又は複数)を認識する抗体を引き出すことがで
きる。そのような発現された蛋白質は、今後時には「組
換えT、hyo、抗原」と称するが、しかしながら上述
のようにそのような蛋白質は断片、誘導体又は融合生成
物も含むことがある点でT、hyo、抗原に相当しない
場合がある。用語「組換えT、hyo、抗原」はそのよ
うな断片。
誘導体及び融合生成物も含むものである。
組換えT、hyo、抗原はブタ赤痢から保護するための
有効量をワクチンに使用する。
有効量をワクチンに使用する。
一般に、ワクチンの各投与はそのような組換えT、hy
o、抗原の少なくとも5マイクログラム及び好ましくは
少なくとも100マイクログラムを含む。大部分の場合
、ワクチンはそのような組換えT、hyo、抗原を20
ミリグラムより多い量を含むことはない。
o、抗原の少なくとも5マイクログラム及び好ましくは
少なくとも100マイクログラムを含む。大部分の場合
、ワクチンはそのような組換えT、hyo、抗原を20
ミリグラムより多い量を含むことはない。
用語「保護」又は「保護する」はここに記述するブタ赤
痢用ワクチンに関連して使用する場合、ワクチンがブタ
赤痢を予防し及び/又はブタ赤痢の重篤度を軽減するこ
とを意味する。
痢用ワクチンに関連して使用する場合、ワクチンがブタ
赤痢を予防し及び/又はブタ赤痢の重篤度を軽減するこ
とを意味する。
一般に多投与を行う場合は、それらは6週間に3回投与
を超えない。
を超えない。
組換えT、hyo、抗原と共に使用する賦形剤は広範囲
の種類の賦形剤の任意の19を使用することができる。
の種類の賦形剤の任意の19を使用することができる。
適当な賦形剤の代表例として、鉱物油、ミョウバン、合
成ポリマーなどが挙げられる。ワクチン用賦形剤は当該
技術分野で公知であり、適当な賦形剤の選択はここに示
したことにより当業者が容易に到達し得る範囲内にある
と考えられる。適当な賦形剤の選択はワクチンが投与さ
れる方法にも依存する。ワクチンは注射可能な投与形態
とすることができ、筋肉内、静脈内又は皮下投与により
投与することができる。又、ワタチンを錠剤形態などを
作り、飼料又は水と活性成分を混合して経口的に投与す
ることもできる。
成ポリマーなどが挙げられる。ワクチン用賦形剤は当該
技術分野で公知であり、適当な賦形剤の選択はここに示
したことにより当業者が容易に到達し得る範囲内にある
と考えられる。適当な賦形剤の選択はワクチンが投与さ
れる方法にも依存する。ワクチンは注射可能な投与形態
とすることができ、筋肉内、静脈内又は皮下投与により
投与することができる。又、ワタチンを錠剤形態などを
作り、飼料又は水と活性成分を混合して経口的に投与す
ることもできる。
他のワクチンの投与方法はここに示したことにより当業
者に明白であり、従ってこの発明の範囲は個別の供給形
態に限定されるものではない。
者に明白であり、従ってこの発明の範囲は個別の供給形
態に限定されるものではない。
又、ワクチンには上述の組換えT、hyo、抗原または
その断片の外に活性成分又はアジュバントを含むことも
できると理解すべきである。
その断片の外に活性成分又はアジュバントを含むことも
できると理解すべきである。
この発明は、更に次の実施例との関連で説明するが、こ
の発明の範囲はそれによって限定されるものではない。
の発明の範囲はそれによって限定されるものではない。
実施例においては、別記せぬ限りM製、消化及び連結は
コールド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−(Co
ld SpringHarbor Laborat
ory)、マ:アティス(Maniatis)外著「モ
レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ
アル(Molecular Cloning、a
1abortatory m a n u a
l ) 」に記述された方法により行った。次
の実施例において、別記せぬ限り形質転換はコーエン(
Cohen)外、ブロシーデインダス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス(PNAS)(19
73年)、69巻、21.10ページに記述の方法によ
り行った。
コールド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−(Co
ld SpringHarbor Laborat
ory)、マ:アティス(Maniatis)外著「モ
レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ
アル(Molecular Cloning、a
1abortatory m a n u a
l ) 」に記述された方法により行った。次
の実施例において、別記せぬ限り形質転換はコーエン(
Cohen)外、ブロシーデインダス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス(PNAS)(19
73年)、69巻、21.10ページに記述の方法によ
り行った。
実施例1
発狂
発病性T、hyo、B204株を2℃発酵漕巾で嫌気的
(N290%、Co、10%から成る大気)に培養し、
その際p)16.8、温度37℃に、保った。培地はプ
レイン・ハート・インフユージBン(Brain−He
art 1nfus−ion)、5%ウシ胎児血清、
デキストロース及びスベクチノマイシン・二塩酸から成
っていた。
(N290%、Co、10%から成る大気)に培養し、
その際p)16.8、温度37℃に、保った。培地はプ
レイン・ハート・インフユージBン(Brain−He
art 1nfus−ion)、5%ウシ胎児血清、
デキストロース及びスベクチノマイシン・二塩酸から成
っていた。
細胞濃度約5×108/mQのときi*!!物を収穫し
た。細胞を遠心分離てし集め、150mMKClをを含
むpH4,75の10mM酢a!2緩衝液で洗浄1八遠
心分離した。洗浄操作を2回以上繰返し、最終の細胞ベ
レットを一20℃で保存した。
た。細胞を遠心分離てし集め、150mMKClをを含
むpH4,75の10mM酢a!2緩衝液で洗浄1八遠
心分離した。洗浄操作を2回以上繰返し、最終の細胞ベ
レットを一20℃で保存した。
近n3しと症l
凍結細胞を融解し、次いで典型的には元の培養液量の1
/20である光学密度25〜3゜(600mml、’:
おける)が達成されるまで(溶液希釈液につき測定)p
H4,75の10mM酢酸カリウムに再懸濁した。次い
でツイーン(Tween)−20(非イオン性界面活性
剤)を細胞懸濁液に添加し、最終濃度を0.2%とした
。10分間穏やかに攪拌した後細胞を遠心分離した(1
0.OOOxg、10分)。この上澄液画分を棄却し、
細胞を酢酸M衝液に再懸濁し、次いで2.0%Twee
n−20で抽出した。遠心分Ill後2%Tweenの
上澄液(界面活性剤で可溶化した抗原のプール)を貯蔵
し、m胞ベレットを再懸濁し、7 w e e n −
20の濃度を約2%から約10%まで増加しながら順次
更に3回繰返して再抽出を行った。界面活性剤可溶化上
澄液画分をプールした。この抽出操作は細菌を溶菌又は
破壊することな(T、hyo、の表面蛋白質を選択的に
(定損的ではないが)可溶化する。
/20である光学密度25〜3゜(600mml、’:
おける)が達成されるまで(溶液希釈液につき測定)p
H4,75の10mM酢酸カリウムに再懸濁した。次い
でツイーン(Tween)−20(非イオン性界面活性
剤)を細胞懸濁液に添加し、最終濃度を0.2%とした
。10分間穏やかに攪拌した後細胞を遠心分離した(1
0.OOOxg、10分)。この上澄液画分を棄却し、
細胞を酢酸M衝液に再懸濁し、次いで2.0%Twee
n−20で抽出した。遠心分Ill後2%Tweenの
上澄液(界面活性剤で可溶化した抗原のプール)を貯蔵
し、m胞ベレットを再懸濁し、7 w e e n −
20の濃度を約2%から約10%まで増加しながら順次
更に3回繰返して再抽出を行った。界面活性剤可溶化上
澄液画分をプールした。この抽出操作は細菌を溶菌又は
破壊することな(T、hyo、の表面蛋白質を選択的に
(定損的ではないが)可溶化する。
10 、 OOOg X g テ高速遠心分Ma、Tw
een−20可溶化蛋白質からのベレットを元の培養液
量の17500の液量の25mMトリス(Tr i s
) −C1(pH6、8)に超音波処理により再懸濁し
た(全蛋白質濃度20mg/mj2)。次いでこの懸濁
液を6Mの尿素を含む元の培養液量の3/100の同一
緩衝液に室温で穏やかに攪拌しながら混合した。この段
階で元のベレット中の蛋白質の約80%が可溶化される
。尿素不溶性蛋白質(UPI)をfooKXgの超遠心
分離を4℃で90分間行って捕集し、元の培養NiHの
l1500の25mMTr i 5−Cl1(pH6,
8)に再懸濁し、6Mの尿素を含む元の培養液はの3/
100の同一緩衝液で穏やかに攪拌しなから室温で1時
間2回目の抽出を行った。
een−20可溶化蛋白質からのベレットを元の培養液
量の17500の液量の25mMトリス(Tr i s
) −C1(pH6、8)に超音波処理により再懸濁し
た(全蛋白質濃度20mg/mj2)。次いでこの懸濁
液を6Mの尿素を含む元の培養液量の3/100の同一
緩衝液に室温で穏やかに攪拌しながら混合した。この段
階で元のベレット中の蛋白質の約80%が可溶化される
。尿素不溶性蛋白質(UPI)をfooKXgの超遠心
分離を4℃で90分間行って捕集し、元の培養NiHの
l1500の25mMTr i 5−Cl1(pH6,
8)に再懸濁し、6Mの尿素を含む元の培養液はの3/
100の同一緩衝液で穏やかに攪拌しなから室温で1時
間2回目の抽出を行った。
この2回口の尿素抽出は、38kDaの蛋白質とUP2
の小量成分である29kDaを選択的に可溶化する。2
時間の尿素抽出で可溶化されない他の蛋白質は100K
Xgで4℃、90分の超遠心分離により除去した。2時
間尿素可溶化の上澄液(US2)は10 m M N
H4HCO3に透析して尿素を除き5次いで凍結乾燥し
た。次いでこの物質を25mMTr i 5−C11(
pH6,8)に可溶化し、−20℃で貯蔵した。湿fR
重蛍10 g mのT、hyo、細胞ペースト(培養液
1.5L)から出発して、U32画分中に4mgの38
kDa蛋白質と0.4mgの29kDa蛋白質が得られ
る。
の小量成分である29kDaを選択的に可溶化する。2
時間の尿素抽出で可溶化されない他の蛋白質は100K
Xgで4℃、90分の超遠心分離により除去した。2時
間尿素可溶化の上澄液(US2)は10 m M N
H4HCO3に透析して尿素を除き5次いで凍結乾燥し
た。次いでこの物質を25mMTr i 5−C11(
pH6,8)に可溶化し、−20℃で貯蔵した。湿fR
重蛍10 g mのT、hyo、細胞ペースト(培養液
1.5L)から出発して、U32画分中に4mgの38
kDa蛋白質と0.4mgの29kDa蛋白質が得られ
る。
38kDa の ミノ
38kDa蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列を自動化
されたアプライド・バイオシステムス(Applied
Biosystems)気相蛋白質配列測定装置で
連続的エドマン(Edman)分解法を用いて測定する
。38kDai白買から遊離したアミノ酸はインチオシ
アン酸フェニル(PITC)で誘導体化し、HPLCで
分離し分析した。このようにして決定した蛋白11の最
初の30個のアミノ酸の実態は下図の通りである。
されたアプライド・バイオシステムス(Applied
Biosystems)気相蛋白質配列測定装置で
連続的エドマン(Edman)分解法を用いて測定する
。38kDai白買から遊離したアミノ酸はインチオシ
アン酸フェニル(PITC)で誘導体化し、HPLCで
分離し分析した。このようにして決定した蛋白11の最
初の30個のアミノ酸の実態は下図の通りである。
2
10?−Val−+1e−Asn−^5n−Asn−T
le−5er−Ala−11e−Asn−0 Ala−Gln−八rg−Thr−Leu−Lys−P
he−Gln−Val−^5p−Leu−0 Lys−?−Asp−?−Ala−Met−11e−3
8kDa蛋白質からの別のアミノ酸配列が、380μg
のUS2 (1ナノモル)を113μmの50mMT
r i 5−CIL (pH6,8)中で8μgのエン
ドプロテイナーゼLysCで37℃、4時間消化するこ
とにより得られた。この消化物から得られるペプチド断
片を0.1%トリフルオロ酢酸中0〜100%アセトニ
トリル:イソプロパノール(2:1)のグラジェントを
使用するC4カラム上のHPLCにより分離した。
10?−Val−+1e−Asn−^5n−Asn−T
le−5er−Ala−11e−Asn−0 Ala−Gln−八rg−Thr−Leu−Lys−P
he−Gln−Val−^5p−Leu−0 Lys−?−Asp−?−Ala−Met−11e−3
8kDa蛋白質からの別のアミノ酸配列が、380μg
のUS2 (1ナノモル)を113μmの50mMT
r i 5−CIL (pH6,8)中で8μgのエン
ドプロテイナーゼLysCで37℃、4時間消化するこ
とにより得られた。この消化物から得られるペプチド断
片を0.1%トリフルオロ酢酸中0〜100%アセトニ
トリル:イソプロパノール(2:1)のグラジェントを
使用するC4カラム上のHPLCにより分離した。
吸収を214nmと280nmで監視した。主要なピー
クを含む画分を凍結乾燥し、0.1%SDSに再懸濁し
、上のように配列を測定した。38kDa蛋白質の2つ
の内部蛋白分解断片からアミノ酸配列が得られ、これを
下に示す。
クを含む画分を凍結乾燥し、0.1%SDSに再懸濁し
、上のように配列を測定した。38kDa蛋白質の2つ
の内部蛋白分解断片からアミノ酸配列が得られ、これを
下に示す。
(ペプチド1)
Met−Arg−Thr
?−11e−八rg−Gly−Leu−0
Arg−Met−^1a−Glu−Arg−Asn−T
hr−?−0 Asp−Gly−11e−? Phe−11e−?−Thr− 0 Glu−?−Gly−Tyr−Leu−Glu−Glu
−Thr−(ペプチド2) Leu−^sn−Met−Leu−?−Gly−Arg
−Phe−0 ^1a−^rg−5er−Thr−Gly−Glu−^
sn−0 Thr−Pro−Thr−AIa−5er−?−Trp
−Leu−0 H4s−11e−Gly−Ala−^sn−Met−A
sp−Glu−Arg−Lys− T、)1 o、DNAの・。
hr−?−0 Asp−Gly−11e−? Phe−11e−?−Thr− 0 Glu−?−Gly−Tyr−Leu−Glu−Glu
−Thr−(ペプチド2) Leu−^sn−Met−Leu−?−Gly−Arg
−Phe−0 ^1a−^rg−5er−Thr−Gly−Glu−^
sn−0 Thr−Pro−Thr−AIa−5er−?−Trp
−Leu−0 H4s−11e−Gly−Ala−^sn−Met−A
sp−Glu−Arg−Lys− T、)1 o、DNAの・。
T、hyo、8204株の1リツトルの培養液を遠心分
離し、細菌細胞を6mfLのリン酸N!衝液化食塩水に
再懸濁した(全波fi9.5mILとなる)。次いでこ
れを10mILのA溶液(CsCIll 13.6g、
TEA!衝液(10mMTris/1mMEDTA (
p)18.0) ) 87.6mj2)と7昆合し、細
胞を溶解するため6.88m角の界面活性剤、20%サ
ルコシル(Sarkosy 1 )を添加した。次いで
3.5muのTE緩衝液と6.12m1の10mg/m
uEtBrを添加し、溶液をソーパル(Sorval
1)TV850ローター中で43.OOOrpmで一晩
回転した。ゲノムDNAのバンドを18ゲージの注射器
で抜き取り、50%(w/w)CsC文と混合し、5o
rvallTV865t17−ター中で55.000r
pmで7時間回転した。ゲノムDNAを再び抜き取り、
C5CJZ中、TV8650−ター中で一晩回転した。
離し、細菌細胞を6mfLのリン酸N!衝液化食塩水に
再懸濁した(全波fi9.5mILとなる)。次いでこ
れを10mILのA溶液(CsCIll 13.6g、
TEA!衝液(10mMTris/1mMEDTA (
p)18.0) ) 87.6mj2)と7昆合し、細
胞を溶解するため6.88m角の界面活性剤、20%サ
ルコシル(Sarkosy 1 )を添加した。次いで
3.5muのTE緩衝液と6.12m1の10mg/m
uEtBrを添加し、溶液をソーパル(Sorval
1)TV850ローター中で43.OOOrpmで一晩
回転した。ゲノムDNAのバンドを18ゲージの注射器
で抜き取り、50%(w/w)CsC文と混合し、5o
rvallTV865t17−ター中で55.000r
pmで7時間回転した。ゲノムDNAを再び抜き取り、
C5CJZ中、TV8650−ター中で一晩回転した。
ゲノムDNAを抜き取った後、臭化エチジウムをイソプ
ロパツールで抽出して除いた。次いでDNAをTE緩衝
液に対して十分透析し、−20℃で保存した。
ロパツールで抽出して除いた。次いでDNAをTE緩衝
液に対して十分透析し、−20℃で保存した。
オリゴメクレオ ド・プローブ
T、hyo、38kDa抗原にライての部分的アミノ酸
配列については上で記述した。蛋白質のN末端の最初の
6つのアミノ酸領域をコード化できるすべての可能性の
あるDNA配列を決定し、混合したプローブを生成させ
た。この混合したプローブは下に示すような標的領域の
アミノ酸配列をコード化できるヌクレオチドの可能性の
ある組合せのすべてを含む配列のプールである。そのよ
うな混合したプローブをデジェネレート(degene
rate)と称する。各プローブは17ヌクレオチドの
長さである。従って、このプローブC0D450は96
層のデジェネレートである。C0D450はDNA合成
装置で作った。
配列については上で記述した。蛋白質のN末端の最初の
6つのアミノ酸領域をコード化できるすべての可能性の
あるDNA配列を決定し、混合したプローブを生成させ
た。この混合したプローブは下に示すような標的領域の
アミノ酸配列をコード化できるヌクレオチドの可能性の
ある組合せのすべてを含む配列のプールである。そのよ
うな混合したプローブをデジェネレート(degene
rate)と称する。各プローブは17ヌクレオチドの
長さである。従って、このプローブC0D450は96
層のデジェネレートである。C0D450はDNA合成
装置で作った。
0D450
Val−11e−Asn−Asn−Asn−11eC
GA(:C(:
GTT ATT ATT ATT ATT AT
T、h o、DNAの T、hyo、8204株のDNAをHind■で消化し
、1%アガロース(Agarose)ゲル上を泳動させ
た。次いでゲルをサウザン(Southern)7去(
JMB、98二503)によりプロットし、C0D45
0をプローブとして調べた。ハイブリダイゼーションの
条件は下記の通りである。
T、h o、DNAの T、hyo、8204株のDNAをHind■で消化し
、1%アガロース(Agarose)ゲル上を泳動させ
た。次いでゲルをサウザン(Southern)7去(
JMB、98二503)によりプロットし、C0D45
0をプローブとして調べた。ハイブリダイゼーションの
条件は下記の通りである。
乾燥したフィルターを0.9MNaC息、90mMTr
i 5−HCfl (pH7,5)、6mMEDTAか
ら成る溶液中で再度ぬらした。次いでフィルターをバッ
グに入れ、2.5mJ2のプレハイブダイゼーション溶
液をフィルターに添加した。
i 5−HCfl (pH7,5)、6mMEDTAか
ら成る溶液中で再度ぬらした。次いでフィルターをバッ
グに入れ、2.5mJ2のプレハイブダイゼーション溶
液をフィルターに添加した。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ン溶液は 6xNET。
ン溶液は 6xNET。
5XDenhardts、
0.1mM rATP、
1、OmM NaPP1゜
10.0mM リン酸ナトリウム(+1+(7,5)
。
。
0.2% SDS、
0.1mg/mu M音波処理したサケ***DNA、
250μH/mu E、eoliのtRNA、を含む
。
。
ブレハイブリダイゼーションは37℃で2・1/2時間
行った。
行った。
次いでプレハイブリダイゼーション溶液をバッグから排
出し、各バッグに3mj2の第2のプレハイブリダイゼ
ーション溶液を添加した。第2のプレハイブリダイゼー
ション溶液は50mf1当り1mff1の100mg/
muラムダgtllDNAと5mff1の362μg/
miE、cofiDNAを添加する以外第1と同様であ
った。両方のDNAは使用直前500bp以下まで超音
波処理し、10分間煮沸し、速やかに冷却した。フィル
ターはこの溶液中で37℃で2・1/2時間プレハイブ
リダイズした。
出し、各バッグに3mj2の第2のプレハイブリダイゼ
ーション溶液を添加した。第2のプレハイブリダイゼー
ション溶液は50mf1当り1mff1の100mg/
muラムダgtllDNAと5mff1の362μg/
miE、cofiDNAを添加する以外第1と同様であ
った。両方のDNAは使用直前500bp以下まで超音
波処理し、10分間煮沸し、速やかに冷却した。フィル
ターはこの溶液中で37℃で2・1/2時間プレハイブ
リダイズした。
プローブは6.24μ角のC0D450(1,570D
/m2)を80μ文反応液中377111の”P−AT
P (7000Ci/mMo1e)を使用して20ユニ
ツトのBMBキナーゼと混合してキナーゼ処理した。
/m2)を80μ文反応液中377111の”P−AT
P (7000Ci/mMo1e)を使用して20ユニ
ツトのBMBキナーゼと混合してキナーゼ処理した。
キナーゼ処理したプローブ、C0D450を30m2の
プレハイブリダイゼーション溶液に添加した。バッグか
らプレハイブリダイゼーション溶液を排出し、ハイブリ
ダイゼーション溶液を含むプローブを添加した。これを
37℃で一晩(16時間)インキュベートした。
プレハイブリダイゼーション溶液に添加した。バッグか
らプレハイブリダイゼーション溶液を排出し、ハイブリ
ダイゼーション溶液を含むプローブを添加した。これを
37℃で一晩(16時間)インキュベートした。
次いで、フィルターを1リツトルの6XSSC中、室温
で4×5分洗浄し、次いで3M塩化テトラメチルアンモ
ニウム、50mMTris−H(12(pH8,0)、
2mMEDTA、1 mg/musDsを含む溶液(T
MAC)(DNA、82.1585〜f 588)10
0mJ2中、室温で4×5分洗浄した。次いでフィルタ
ーを400mflのTMAC中、55℃で5分間洗浄し
た。次いでフィルターをプラスチック製ラップで包み(
最初の乾燥をしないで)、−8o℃で2倍増強スクリー
ンと共にコダック(Kodak)XAR5フィルムに1
〜1/2時間露出した。
で4×5分洗浄し、次いで3M塩化テトラメチルアンモ
ニウム、50mMTris−H(12(pH8,0)、
2mMEDTA、1 mg/musDsを含む溶液(T
MAC)(DNA、82.1585〜f 588)10
0mJ2中、室温で4×5分洗浄した。次いでフィルタ
ーを400mflのTMAC中、55℃で5分間洗浄し
た。次いでフィルターをプラスチック製ラップで包み(
最初の乾燥をしないで)、−8o℃で2倍増強スクリー
ンと共にコダック(Kodak)XAR5フィルムに1
〜1/2時間露出した。
オートラジオグラフの分析により、2つのDNA断片が
C0D450にハイブリダイズし、それらの大きさは3
200及び2300bpであることが示された。
C0D450にハイブリダイズし、それらの大きさは3
200及び2300bpであることが示された。
5outhe rn プロットをプラスチック製ラッ
プから除き、400muのTMAC中で1回、60℃で
5分間洗浄した。次いでこれを上述のようにXAR5フ
ィルムに再露出し、オートラジオグラフはC0D450
は3200及び2300bpのDNA断片のいずれも溶
出したことを示した。
プから除き、400muのTMAC中で1回、60℃で
5分間洗浄した。次いでこれを上述のようにXAR5フ
ィルムに再露出し、オートラジオグラフはC0D450
は3200及び2300bpのDNA断片のいずれも溶
出したことを示した。
攬虹旦上通畳11
145.6μgのT、hyo、B204株のゲノムDN
AをHi ndIII (BMB)で消化した。このD
NAの80μgを3%アクリルアミドゲルで電気泳動を
行った。HindI]Iで消化したラムダDNAをサイ
ズマーカーとして使用し、2Kbと3.5Kbの間にあ
るA装用T、hyo、消化物中のすべてをゲルから0.
5clI+スライスとして切り出した。この結果、各
々が異なる大きさ等級のHindm断片を含む全部で7
つのゲルスライスが得られた。各々のサイズ画分を電気
溶離し、フェノール抽出し、エタノール沈澱し、50μ
文の水に再懸濁した。
AをHi ndIII (BMB)で消化した。このD
NAの80μgを3%アクリルアミドゲルで電気泳動を
行った。HindI]Iで消化したラムダDNAをサイ
ズマーカーとして使用し、2Kbと3.5Kbの間にあ
るA装用T、hyo、消化物中のすべてをゲルから0.
5clI+スライスとして切り出した。この結果、各
々が異なる大きさ等級のHindm断片を含む全部で7
つのゲルスライスが得られた。各々のサイズ画分を電気
溶離し、フェノール抽出し、エタノール沈澱し、50μ
文の水に再懸濁した。
各両分の5μkを200μ角の10mMTri 5−H
Cl2 (pH7,4)と20μmの3MNaOHに混
合し、65℃で30分間インキュベートした。次いで試
料を15分間かけて室温まで冷却し、200μにの2
M N H40A cを添加した。次いでこれらの試料
をシエライヒヤー(Schleicher)とシュエル
(Sch−uell)が定めた装置とプロトコルを使用
し、ニトロセルロース上にスロットプロット(slot
blot)した。次いでスロットプロットしたフィ
ルターを6xNET中で再びぬらし、プラスチック製バ
ッグに入れた。
Cl2 (pH7,4)と20μmの3MNaOHに混
合し、65℃で30分間インキュベートした。次いで試
料を15分間かけて室温まで冷却し、200μにの2
M N H40A cを添加した。次いでこれらの試料
をシエライヒヤー(Schleicher)とシュエル
(Sch−uell)が定めた装置とプロトコルを使用
し、ニトロセルロース上にスロットプロット(slot
blot)した。次いでスロットプロットしたフィ
ルターを6xNET中で再びぬらし、プラスチック製バ
ッグに入れた。
E、coliのtRNAを除く以外前回と同様に調製し
た5mILのブレハイブリダイゼーション溶液を添加し
た。フィルターを37°で5時間インキュベートした。
た5mILのブレハイブリダイゼーション溶液を添加し
た。フィルターを37°で5時間インキュベートした。
更にC0D450を上述のようにキナーゼ処理した。ス
ロットプロットしたフィルターを5outhern
プロットについて上で述べたのと同じ方法でハイブリダ
イズし、洗浄し、フィルムに露出した。
ロットプロットしたフィルターを5outhern
プロットについて上で述べたのと同じ方法でハイブリダ
イズし、洗浄し、フィルムに露出した。
オートラジオグラフの試験は、画分5が最も強いハイブ
リダイゼーションのシグナルを与えることを示した。画
分5DNAの試料はアガロースゲル上で約2300〜2
700bpにサイズ分類された。画分5をクローニング
する両分として選んだ。
リダイゼーションのシグナルを与えることを示した。画
分5DNAの試料はアガロースゲル上で約2300〜2
700bpにサイズ分類された。画分5をクローニング
する両分として選んだ。
0.035μgの画分5DNAを0.017μgの)I
indm消化pUC9と連結し、DH5取込み細胞(B
RL)に形質転換した。形質転換試料を50μg /
m ItのX−gaj2を含む平板上に平板培養した0
発生する206個の白色コロニーをすべて培養し、ミニ
選別を行った。
indm消化pUC9と連結し、DH5取込み細胞(B
RL)に形質転換した。形質転換試料を50μg /
m ItのX−gaj2を含む平板上に平板培養した0
発生する206個の白色コロニーをすべて培養し、ミニ
選別を行った。
すべての206個のミニ選別の試料をHindmで消化
し、上述のスロットプロット分析によりC0D450と
ハイブリダイズした。2つの陽性のクローンが確認され
、pTrep2及びpTrep3と命名した。
し、上述のスロットプロット分析によりC0D450と
ハイブリダイズした。2つの陽性のクローンが確認され
、pTrep2及びpTrep3と命名した。
ρTrep2からのプラスミドDNAを30の異なる制
限酵素で消化して制限マツプを作成した。消化物はC0
D450に対する5outh−ern ブロッティン
グにより分析した。得られた制限マツプを第1図に示す
。
限酵素で消化して制限マツプを作成した。消化物はC0
D450に対する5outh−ern ブロッティン
グにより分析した。得られた制限マツプを第1図に示す
。
E、coliにお 38kDa の38kDa抗
原はベクターpWHA93を使用してプロキモシンとの
融合体として発現させることにした。
原はベクターpWHA93を使用してプロキモシンとの
融合体として発現させることにした。
最初にpTrep2のHindnl挿入部位を利用可能
な制限部位として最良に使用できるように変換する必要
があった。pTrep2をHindmで消化し、連結し
、E、co I i JM83株中で形質転換し、又ク
ローンpTrep7はHi ndII[断片上にpTr
ep2から逆方向で38Kd遺伝子を持つことが確認さ
れた。
な制限部位として最良に使用できるように変換する必要
があった。pTrep2をHindmで消化し、連結し
、E、co I i JM83株中で形質転換し、又ク
ローンpTrep7はHi ndII[断片上にpTr
ep2から逆方向で38Kd遺伝子を持つことが確認さ
れた。
1 sμgのpTrep7をNde Iで消化し、2塩
基のNde Iオーバーハングを埋めるためT4DNA
ポリメラーゼ(BRL)で処理した。
基のNde Iオーバーハングを埋めるためT4DNA
ポリメラーゼ(BRL)で処理した。
DNAはHi ndI[Iで消化するためフェノール抽
出し、エタノール沈澱し、適当な&ll液液再懸濁した
。Hincl[[で消化後、DNAを5%アクリルアミ
ドゲルで電気泳動を行った。1900bρのHi nc
lII−Nde I断片をゲルから切り出し、電気溶離
した。
出し、エタノール沈澱し、適当な&ll液液再懸濁した
。Hincl[[で消化後、DNAを5%アクリルアミ
ドゲルで電気泳動を行った。1900bρのHi nc
lII−Nde I断片をゲルから切り出し、電気溶離
した。
発現用ベクターpWHA93をHindmとHincI
Iて消化し、これをゲル上を移動させて3870bp断
片を電気溶離した。クッシュナー・j−ス・アール(K
ushner、S、R,)著、「ジェネティック・エン
ジニアリング(Genetic Engineeri
ng)」(1978年、エルゼビア/ノース・ホーラン
ド・バイオメディカル・プレス(Elsevier/N
orth Ho1land BioMedical
Press)刊)、17〜23ベージの記述により
、T、hyo、断片とpWHA93ヘクターを連結し、
JM83株中で形質転換した。
Iて消化し、これをゲル上を移動させて3870bp断
片を電気溶離した。クッシュナー・j−ス・アール(K
ushner、S、R,)著、「ジェネティック・エン
ジニアリング(Genetic Engineeri
ng)」(1978年、エルゼビア/ノース・ホーラン
ド・バイオメディカル・プレス(Elsevier/N
orth Ho1land BioMedical
Press)刊)、17〜23ベージの記述により
、T、hyo、断片とpWHA93ヘクターを連結し、
JM83株中で形質転換した。
この形質転換からpTrep9がミニ選別分析により確
認された。このプラスミドの配列を測定し、38kDa
開口読取り機構が同一相でプロキモシンの開口読取り機
構の下流に置かれる正しい融合を持つことが認められた
。
認された。このプラスミドの配列を測定し、38kDa
開口読取り機構が同一相でプロキモシンの開口読取り機
構の下流に置かれる正しい融合を持つことが認められた
。
pTrep9の生産の順序は第2図に図式的に示されて
いる。
いる。
蛋白質の発現と回収は、後述のように39kDa抗原に
ついて実行した〈実施例2)。
ついて実行した〈実施例2)。
E、coliにおいて、pTrep9は73kDaのプ
ロキモシン融合ポリペプチドの合成を指導することがw
4察されたが、このポリペプチドにおいて32kDaは
プロキモシンより大きい。
ロキモシン融合ポリペプチドの合成を指導することがw
4察されたが、このポリペプチドにおいて32kDaは
プロキモシンより大きい。
配列分析によると、38kd抗原遺伝子の開口読取り機
構は32kDaのポリペプチドをコード化しているよう
に見える。
構は32kDaのポリペプチドをコード化しているよう
に見える。
この融合蛋白質は、ウェスタンプロット(Wester
n b 1 o t)でブタ赤痢から回収したブタ血
清又はN製した38kDaT、hyo、蛋白質で超免疫
したマウス血清と反応させた場合、標準のT、hyo、
38kDa蛋白質と同等の免疫反応性を示した。
n b 1 o t)でブタ赤痢から回収したブタ血
清又はN製した38kDaT、hyo、蛋白質で超免疫
したマウス血清と反応させた場合、標準のT、hyo、
38kDa蛋白質と同等の免疫反応性を示した。
WHA93のふ−
pWHA93を一連の方法で組み立てた。プロキそシン
の全コード化配列を含むプラスミドpWHA31 B
(ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー(J、Bio
tech、)(1986年)、2巻、177〜190ペ
ージ)を制限エンドヌクレアーゼBe1lで消化した。
の全コード化配列を含むプラスミドpWHA31 B
(ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー(J、Bio
tech、)(1986年)、2巻、177〜190ペ
ージ)を制限エンドヌクレアーゼBe1lで消化した。
プロキモシン遺伝子停止コドンであるTGAはBan制
限エンドヌクレアーゼ部位のメクレオチド配列、TGA
TCAの中に含まれる。次いでムング・ビーン・ヌクレ
アーゼ(mung beannuclease)にュ
ー・イングランド・バイオラプス(New Engl
and Biolabs))を使用してBcIIによ
って作られた末端を平滑にした。この段階の次にEco
RIで消化した。
限エンドヌクレアーゼ部位のメクレオチド配列、TGA
TCAの中に含まれる。次いでムング・ビーン・ヌクレ
アーゼ(mung beannuclease)にュ
ー・イングランド・バイオラプス(New Engl
and Biolabs))を使用してBcIIによ
って作られた末端を平滑にした。この段階の次にEco
RIで消化した。
次いでカルボキシ末端の205のアミノ酸をコード化す
る配列を含む618の塩基対(bp)のDNA断片を単
離した。
る配列を含む618の塩基対(bp)のDNA断片を単
離した。
pUc18(New England Bi。
l abs)を制限エンドヌクレアーゼKpnIで消化
し、ムング・ビーン・ヌクレアーゼで処理し、EcoR
Iで消化し、2674bpのDNA断片を単離した。こ
の断片はベータラクタマーゼ選択可能マーカー(Amp
’遺伝子)、aI製起点、ラクトースオペロン(1ac
)プロモーター、制限エンドヌクレアーゼBamHI、
XbaI、5alI、Pstl、5phI、及びHi
ndI[Iのポリリンカー含有部位、及びベータガラク
トシダーゼのアミン末端の82のアミノ酸をコート化す
る配列を含む。
し、ムング・ビーン・ヌクレアーゼで処理し、EcoR
Iで消化し、2674bpのDNA断片を単離した。こ
の断片はベータラクタマーゼ選択可能マーカー(Amp
’遺伝子)、aI製起点、ラクトースオペロン(1ac
)プロモーター、制限エンドヌクレアーゼBamHI、
XbaI、5alI、Pstl、5phI、及びHi
ndI[Iのポリリンカー含有部位、及びベータガラク
トシダーゼのアミン末端の82のアミノ酸をコート化す
る配列を含む。
2674bpのDNA断片を618bpのDNA断片に
連結してpMH22を形成した。プラスミドはポリリン
カーの一端に融合したプロキモシンのカルボキシ末端の
コード化配列を含み、一方位端はベータガラクトシダー
ゼのアミノ末端のコード化配列と融合している。プロキ
モシン停止コドン、TGAはムング・ビーン・ヌクレア
ーゼによって破壊され、2つのコード化配列は同じ翻訳
読み取り機構の中にある。
連結してpMH22を形成した。プラスミドはポリリン
カーの一端に融合したプロキモシンのカルボキシ末端の
コード化配列を含み、一方位端はベータガラクトシダー
ゼのアミノ末端のコード化配列と融合している。プロキ
モシン停止コドン、TGAはムング・ビーン・ヌクレア
ーゼによって破壊され、2つのコード化配列は同じ翻訳
読み取り機構の中にある。
pWHA43 (J、Bi otech、)(198
6年)、2@、177〜190ページ)もpWHA93
を組み立てるのに使用した。このプラスミドをEcoR
Iで消化し、ムング・ビーン・ヌクレアーゼで処理し、
制限エンドヌクレアーゼHi ndI[Iで消化した。
6年)、2@、177〜190ページ)もpWHA93
を組み立てるのに使用した。このプラスミドをEcoR
Iで消化し、ムング・ビーン・ヌクレアーゼで処理し、
制限エンドヌクレアーゼHi ndI[Iで消化した。
プロキモシン、Amp’遺伝子、複製起点、及びIac
プロモーターのコード化配列のすべてを含む3654b
pのDNA断片を単離した。
プロモーターのコード化配列のすべてを含む3654b
pのDNA断片を単離した。
ρDR540(ビー・エル・バイオケミカルス(P−L
Biochemicals))を制限エンドヌクレ
アーゼBamHIで消化し、ムング・ビーン・ヌクレア
ーゼでIA理し、Hi ndIIIで消化した。Tac
プロモーターを含む92bPのDNA断片を単離し、3
654bPのDNA断片と連結してpWHA49を組み
立てた。このプラスミドは2つのLacとTacプロモ
ーターで制御されるプロキそシンの全コード化配列を持
っていた。
Biochemicals))を制限エンドヌクレ
アーゼBamHIで消化し、ムング・ビーン・ヌクレア
ーゼでIA理し、Hi ndIIIで消化した。Tac
プロモーターを含む92bPのDNA断片を単離し、3
654bPのDNA断片と連結してpWHA49を組み
立てた。このプラスミドは2つのLacとTacプロモ
ーターで制御されるプロキそシンの全コード化配列を持
っていた。
ρWHA49を制限エンドメクレアーゼNarIとEc
oRIで消化した。プロキモシンのアミン末端の160
のアミノ酸、Lac及びTacプロモーター、Amp’
遺伝子、及び複製起点のコード化配列を含む3049b
pのD’NA断片を単離した。
oRIで消化した。プロキモシンのアミン末端の160
のアミノ酸、Lac及びTacプロモーター、Amp’
遺伝子、及び複製起点のコード化配列を含む3049b
pのD’NA断片を単離した。
pMH22をNarIと):coRIで消化し、プロキ
モシンのカルボキシ末端の205のアミノ酸のコード化
配列、ポリリンカー及びベータガラクトシダーゼのアミ
ノ末端の52のアミノ酸のコード化配列を含む200b
ρのDNA断片を単離した。この200bpのDNA断
片を3049bpのDNA断片と連結して、pWHA9
3を組み立て、このものはIacとtacプロモーター
に制御され、同時に融合した全プロキモシンコード化配
列、ポリリンカー、及びアミノ末端の82のアミノ酸の
コード化配列を含んでいた。tacプロモーターは部位
特異的M換えの際pWHA93から除かれ、完全なla
cプロモーターが残ることが後に発見された。
モシンのカルボキシ末端の205のアミノ酸のコード化
配列、ポリリンカー及びベータガラクトシダーゼのアミ
ノ末端の52のアミノ酸のコード化配列を含む200b
ρのDNA断片を単離した。この200bpのDNA断
片を3049bpのDNA断片と連結して、pWHA9
3を組み立て、このものはIacとtacプロモーター
に制御され、同時に融合した全プロキモシンコード化配
列、ポリリンカー、及びアミノ末端の82のアミノ酸の
コード化配列を含んでいた。tacプロモーターは部位
特異的M換えの際pWHA93から除かれ、完全なla
cプロモーターが残ることが後に発見された。
実施例2 工生i且!曵五羞
発酵と蛋白質精製は実施例1のように達成した。
第二次尿素抽出液の遠心分離により得られる不溶性物質
は39kDaの単一の主要蛋白質成分を含む。この不溶
性蛋白質を3%SDS、1mMEDTA、及び70mM
2−メルカプトエタノールを含む25mMTris−H
Cl2 (pi(6,8)中で煮沸することにより可溶
化した。この溶液をセファ0−ス(Sapharose
)6B(バイオラド(Bio Rad)(リッチモン
ド(Richmond)、カリフォルニア)から入手)
の30cmのカラム上のゲル濾過クロマトグラフにかけ
た。39kDaのピークをカラム溶離液画分のゲル電気
泳動により確認し、適当な画分をプールし、蛋白質をア
セトンで沈澱させて濃縮し、遠心分離により集めた。ベ
レットを1、t%SDSに溶解し、次いで残留SDSを
除くためクロロホルム/メタノールで処理した。
は39kDaの単一の主要蛋白質成分を含む。この不溶
性蛋白質を3%SDS、1mMEDTA、及び70mM
2−メルカプトエタノールを含む25mMTris−H
Cl2 (pi(6,8)中で煮沸することにより可溶
化した。この溶液をセファ0−ス(Sapharose
)6B(バイオラド(Bio Rad)(リッチモン
ド(Richmond)、カリフォルニア)から入手)
の30cmのカラム上のゲル濾過クロマトグラフにかけ
た。39kDaのピークをカラム溶離液画分のゲル電気
泳動により確認し、適当な画分をプールし、蛋白質をア
セトンで沈澱させて濃縮し、遠心分離により集めた。ベ
レットを1、t%SDSに溶解し、次いで残留SDSを
除くためクロロホルム/メタノールで処理した。
上で調製した39kDa蛋白質のアミノ末端のアミノ酸
配列を自動化されたアプライド・バイオシステムス気相
配列測定装置中で連続的エドマン分解法を用いて求めた
。このようにして求めた蛋白質の最初の41のアミノ酸
の実態を下に示す。
配列を自動化されたアプライド・バイオシステムス気相
配列測定装置中で連続的エドマン分解法を用いて求めた
。このようにして求めた蛋白質の最初の41のアミノ酸
の実態を下に示す。
1
10MeL−Tyr−GIy−Asp
−Arg−Asp−5er−Trp−Ile−Asp−
Phe−0 Leu−Thr−H4s−Gly−Asn−Gin−P
he−^rg−Ala−^rg−Met−Asp−Gl
n−Leu−Gly−Phe−Val−Leu−Gly
−^sn−^5p−Thr−1 11e−Lys−Gly−Thr−Phe−?−?−八
rgへオリゴヌクレオ ド・プローブの 一組のDNAプローブを上に示したアミノ酸配列データ
を用いて合成した。それらの各々は下に示すような標的
領域のアミノ酸配列をコード化できるヌクレチドのすへ
ての可能な組合せを含むデジェネレート配列のプールか
ら成る。各プローブは長さが17ヌクレオチドである。
10MeL−Tyr−GIy−Asp
−Arg−Asp−5er−Trp−Ile−Asp−
Phe−0 Leu−Thr−H4s−Gly−Asn−Gin−P
he−^rg−Ala−^rg−Met−Asp−Gl
n−Leu−Gly−Phe−Val−Leu−Gly
−^sn−^5p−Thr−1 11e−Lys−Gly−Thr−Phe−?−?−八
rgへオリゴヌクレオ ド・プローブの 一組のDNAプローブを上に示したアミノ酸配列データ
を用いて合成した。それらの各々は下に示すような標的
領域のアミノ酸配列をコード化できるヌクレチドのすへ
ての可能な組合せを含むデジェネレート配列のプールか
ら成る。各プローブは長さが17ヌクレオチドである。
Met−Tyr−Gly−^sp−Arg−^5pAT
G−T八T−GGT−GAT−^GT−G^ccc ^ ^ G プローブ名−COD 55 デジエネラシー 2128層 (128の 組合せの混合) 0 Trp−+1e−^5p−Phe−Leu−Thr
プローブ名−[:OD 553TGG−ATT−GAT
−TTT−TTT−ACccc A ^ G デジエネラシー Ill =96層11is−Gl
y−Asn−Gin−Phe−Arg プローブ名−
COD 556CAT−GGT−AAT−CA^−TT
T−八GCG CG にCデジエネラシー A =128層 T、ho、DNAのゲノム−イブ−1−の 立て 48μgのT、hyo、b204株のゲノムDNAを6
単位のA]uIで消化した。酵素を添加する前、溶液を
37℃で10分間インキュヘートした。反応条件はBR
Lによって規定されているそれであり、全量は480μ
℃であった。酵素添加後反応物を37℃にインキュベー
トした。酵素添加後15秒、2分11秒、4分8秒、6
分4秒、8分にそれぞれ96μ角の試料を除いた。各試
料を直ちに96μ角のフェノール−CHCIt。
G−T八T−GGT−GAT−^GT−G^ccc ^ ^ G プローブ名−COD 55 デジエネラシー 2128層 (128の 組合せの混合) 0 Trp−+1e−^5p−Phe−Leu−Thr
プローブ名−[:OD 553TGG−ATT−GAT
−TTT−TTT−ACccc A ^ G デジエネラシー Ill =96層11is−Gl
y−Asn−Gin−Phe−Arg プローブ名−
COD 556CAT−GGT−AAT−CA^−TT
T−八GCG CG にCデジエネラシー A =128層 T、ho、DNAのゲノム−イブ−1−の 立て 48μgのT、hyo、b204株のゲノムDNAを6
単位のA]uIで消化した。酵素を添加する前、溶液を
37℃で10分間インキュヘートした。反応条件はBR
Lによって規定されているそれであり、全量は480μ
℃であった。酵素添加後反応物を37℃にインキュベー
トした。酵素添加後15秒、2分11秒、4分8秒、6
分4秒、8分にそれぞれ96μ角の試料を除いた。各試
料を直ちに96μ角のフェノール−CHCIt。
と混合し、4μkをアガロースゲル上を移動させた。U
V先光下消化されたDNAを視覚化させると、反応は以
前の分析用消化で予測された限りでは反応が進行してい
ることが示された。残りの水相を合併して460μmの
溶液を得、これをフェノール−CHC113で抽出し、
クロロホルムで再抽出し、DNAを酢酸アンモニウム/
EtOHで沈澱させた。次いでDNAを200μg /
m j!の濃度で再懸濁した。
V先光下消化されたDNAを視覚化させると、反応は以
前の分析用消化で予測された限りでは反応が進行してい
ることが示された。残りの水相を合併して460μmの
溶液を得、これをフェノール−CHC113で抽出し、
クロロホルムで再抽出し、DNAを酢酸アンモニウム/
EtOHで沈澱させた。次いでDNAを200μg /
m j!の濃度で再懸濁した。
見、ユ之に貞迦
リン酸化されたEcoRIリンカ−15’ pd[G
GAATTCC] 3’ をファルマシア(Pharm
ac ia)社から入手し、H,O中に1 m g /
m ILに希釈した。0.2μgのリンカ−を標準方
法により、”P−ATPを用いて酵素的にキナーゼ処理
した。
GAATTCC] 3’ をファルマシア(Pharm
ac ia)社から入手し、H,O中に1 m g /
m ILに希釈した。0.2μgのリンカ−を標準方
法により、”P−ATPを用いて酵素的にキナーゼ処理
した。
キナーゼ処理に続いて、この反応物を90”Cで10分
間インキュベートし、回転真空蒸発器中でで蒸発して乾
燥し、20μ文の1mg/m角の非放射能付線リン酸化
EcoRIリンカ−に再懸濁した。
間インキュベートし、回転真空蒸発器中でで蒸発して乾
燥し、20μ文の1mg/m角の非放射能付線リン酸化
EcoRIリンカ−に再懸濁した。
次いで、EcoRIリンカ−混合物をAlulで一部分
消化したT、hyo、DNA (上述の)に、50単位
/ m 1の濃度のBMBリガーゼを使用し、100μ
z / m Xのリンカ−濃度と133μg/mj1の
T、hyo、DNA濃度で連結した。反応物の全量は1
50μぶであった。連結は室温で一晩(16時間)イン
キュベートし、次いで1単位/μ角のりガーゼの3μ角
を添加して反応を促進した。これを室温で2時間インキ
ュベートした。更に5μ角の新鮮な10mMのrATP
と3μmのリガーゼを添加して再び反応を促進し、室温
で2時間インキュベートした。次いで、リガーゼを加熱
して不活性化した。これに続いて、連結反応混合物をE
coRI500’lL位/ m Itで37℃で2時間
消化した(この場合、T、hyo、DNAはEcoRI
消化に対して耐性であり、これはEcoR1部位がメチ
ル化されているからであろう)。次いで反応物をフェノ
ール抽出し、エタノールで沈澱した。沈澱したDNAを
を100μ角のH2Oに再懸濁した。
消化したT、hyo、DNA (上述の)に、50単位
/ m 1の濃度のBMBリガーゼを使用し、100μ
z / m Xのリンカ−濃度と133μg/mj1の
T、hyo、DNA濃度で連結した。反応物の全量は1
50μぶであった。連結は室温で一晩(16時間)イン
キュベートし、次いで1単位/μ角のりガーゼの3μ角
を添加して反応を促進した。これを室温で2時間インキ
ュベートした。更に5μ角の新鮮な10mMのrATP
と3μmのリガーゼを添加して再び反応を促進し、室温
で2時間インキュベートした。次いで、リガーゼを加熱
して不活性化した。これに続いて、連結反応混合物をE
coRI500’lL位/ m Itで37℃で2時間
消化した(この場合、T、hyo、DNAはEcoRI
消化に対して耐性であり、これはEcoR1部位がメチ
ル化されているからであろう)。次いで反応物をフェノ
ール抽出し、エタノールで沈澱した。沈澱したDNAを
を100μ角のH2Oに再懸濁した。
DNAを、0.3MNaCJZ、0.05MTr i
5Hcl (pH8,0)、1mMEDTA。
5Hcl (pH8,0)、1mMEDTA。
0.06%ナトリウム・アジドをカラム用M衝液として
使用するS−200(Pharmacia)カラム上で
分画した。80個の100μぶ:i、)−7を集め、シ
ンチレーションカウンターで計数した。最初のピークは
画分21〜33(T、hyo、DNA)に銭察され、第
2のピークは両分38〜80(遊離のリンカ−及び遊離
のATP)に認められた。画分2!〜33をプールし、
エタノールで沈澱した。DNAを40.35μ見のH2
Oに再懸濁し、濃度を200μg/mflとした。
使用するS−200(Pharmacia)カラム上で
分画した。80個の100μぶ:i、)−7を集め、シ
ンチレーションカウンターで計数した。最初のピークは
画分21〜33(T、hyo、DNA)に銭察され、第
2のピークは両分38〜80(遊離のリンカ−及び遊離
のATP)に認められた。画分2!〜33をプールし、
エタノールで沈澱した。DNAを40.35μ見のH2
Oに再懸濁し、濃度を200μg/mflとした。
脱リン酸したラムダgt11EcoRI処理物をプロメ
ガ・バイオチク(PromegaBiotec)から5
00μg/mj2の濃度で入手した。T、hyo、DN
Aを、全量6.25μs中80 μg / m Itの
T、hyo、DNAfi度と200μg/muのラムダ
gtll濃度で、BMBリガーゼを100単位/ m
Itの濃度で使用してラムダに連結した。連結は室温で
2時間インキュベートした。次いで、連結反応液の4μ
互をストラタジン(Stratagene)(サン・デ
イエゴ(San D i ego)、カリホルニア)
から入手したインビトロパッケージ用キット、rギガパ
ック(Gi gapack)Jを使用してラムダ・バク
テリオファージに封入した。次いで、ファージ量をE、
col 1Y10907株(Promega Bio
tec)の定常ファージ培養により測定した。青色(組
換え体)と白色(非組換え体)のプラーク数を計数し、
元のファージ保存培養には0.5mff1の全量中に1
.4X10’ pfu/m角含まれていることが示され
た(その内、91%は組換え体であった)。遺伝子ライ
ブラリーは12の無作為に選別した白色プラークをミニ
選別することにより特徴付けられた(ヘルムス・シー(
Helms、C)外、DNA(1985年)、5巻、3
9〜49ページ)。すべての12株は挿入部を持ち、平
均の挿入部の大きさは1325bPであった。
ガ・バイオチク(PromegaBiotec)から5
00μg/mj2の濃度で入手した。T、hyo、DN
Aを、全量6.25μs中80 μg / m Itの
T、hyo、DNAfi度と200μg/muのラムダ
gtll濃度で、BMBリガーゼを100単位/ m
Itの濃度で使用してラムダに連結した。連結は室温で
2時間インキュベートした。次いで、連結反応液の4μ
互をストラタジン(Stratagene)(サン・デ
イエゴ(San D i ego)、カリホルニア)
から入手したインビトロパッケージ用キット、rギガパ
ック(Gi gapack)Jを使用してラムダ・バク
テリオファージに封入した。次いで、ファージ量をE、
col 1Y10907株(Promega Bio
tec)の定常ファージ培養により測定した。青色(組
換え体)と白色(非組換え体)のプラーク数を計数し、
元のファージ保存培養には0.5mff1の全量中に1
.4X10’ pfu/m角含まれていることが示され
た(その内、91%は組換え体であった)。遺伝子ライ
ブラリーは12の無作為に選別した白色プラークをミニ
選別することにより特徴付けられた(ヘルムス・シー(
Helms、C)外、DNA(1985年)、5巻、3
9〜49ページ)。すべての12株は挿入部を持ち、平
均の挿入部の大きさは1325bPであった。
えフ −ジの
39に遺伝子の混合したオリゴヌクレオチドの選別を行
う場合、次の方法を使用した。
う場合、次の方法を使用した。
1、ラムダgtll(一部分A1uI)ライブラリーを
使用した。15ma+のベトリ皿当り約10.000の
プラークをYl 090γ細胞上に平板培養した。6枚
を使用し、各平板当り4枚のニトロセルロースフィルタ
ーを引き上げた(ダブリュー・デイ−・ベントン(W、
D、Benton)及びアール・ダブリュー・デービス
(R,W、Davi s)、サイエンス(Scienc
e)(1977年)、196巻、180ページに記述の
方法)。
使用した。15ma+のベトリ皿当り約10.000の
プラークをYl 090γ細胞上に平板培養した。6枚
を使用し、各平板当り4枚のニトロセルロースフィルタ
ーを引き上げた(ダブリュー・デイ−・ベントン(W、
D、Benton)及びアール・ダブリュー・デービス
(R,W、Davi s)、サイエンス(Scienc
e)(1977年)、196巻、180ページに記述の
方法)。
2、混合したオリゴヌクレオチド・プローブを4〜1l
Ox105cp/ngの比活性までキナーゼ処理した。
Ox105cp/ngの比活性までキナーゼ処理した。
各プローブで2枚のフィルターをハイブリダイズし、各
フィルターは約10’cpm(1〜2プローブ/フイル
ター)のプローブ結合がなされた。
フィルターは約10’cpm(1〜2プローブ/フイル
ター)のプローブ結合がなされた。
3、ハイブリダイゼーション溶液は
5xDenharts。
0.1μm rATP。
250μg/mIt E、colitRNA、6xNE
T(1xNET=0.15M NaC1,15mM
Tr i 5−HCIL (pH7,5)1mM
EDTA)、 0.5% NP40゜ 1mM ビロリン酸ナトリウム、 から成る。
T(1xNET=0.15M NaC1,15mM
Tr i 5−HCIL (pH7,5)1mM
EDTA)、 0.5% NP40゜ 1mM ビロリン酸ナトリウム、 から成る。
4、フィルター(上の1におけるような)はハイブリダ
イゼーションに先立ち、 1.50mMTr i 5−HCIt (p)18)、
IMNaCj2.1mMEDTA、0.1%SO5から
成る溶液中で37℃2時間予備洗浄し、2、ハイブリダ
イゼーション緩衝液(上の3におCするような)中、3
7℃で2時間ブレハイブソダイゼーションする ことにより予備処理を行った。
イゼーションに先立ち、 1.50mMTr i 5−HCIt (p)18)、
IMNaCj2.1mMEDTA、0.1%SO5から
成る溶液中で37℃2時間予備洗浄し、2、ハイブリダ
イゼーション緩衝液(上の3におCするような)中、3
7℃で2時間ブレハイブソダイゼーションする ことにより予備処理を行った。
5、−晩37℃でハイブリダイゼーションした。
6、フィルターを6xNET、0.1%5DS(洗浄1
回当たり2L)中、室温で2回洗浄しく1回当たり20
分)、6xNET、0.1%SDS中、37℃で2回洗
浄しく1回当り20分〉、5XNET中、37℃で1回
洗浄した(1回当りの20分)。
回当たり2L)中、室温で2回洗浄しく1回当たり20
分)、6xNET、0.1%SDS中、37℃で2回洗
浄しく1回当り20分〉、5XNET中、37℃で1回
洗浄した(1回当りの20分)。
7、次いでフィルターを風乾し、裏部材にテープで止め
、KodakXAR5エックス線用フィルムに2倍増感
スクリーンを使用して露出した。
、KodakXAR5エックス線用フィルムに2倍増感
スクリーンを使用して露出した。
8、両方のプローブとハイブリダイゼーションしたこと
を示す適当なプラークを選択し9、両方のオリゴヌクレ
オチド・プローブで再選別を行つた。
を示す適当なプラークを選択し9、両方のオリゴヌクレ
オチド・プローブで再選別を行つた。
9、プラーク純化の手順を3回繰返した後、ファージ3
−5CIをプロトタイプ39に組換えファージとして選
んだ。
−5CIをプロトタイプ39に組換えファージとして選
んだ。
10、プローブとゲノムT、hyo、DNA。
ファージDNA、及び/又はプラスミドDNAとのハイ
ブリダイゼーションは5outhernの方法(ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J、Mo1
.Biof、)(1975年)、94巻、203ベージ
)により行った。
ブリダイゼーションは5outhernの方法(ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J、Mo1
.Biof、)(1975年)、94巻、203ベージ
)により行った。
11.77−ジDNAをシー・ヘルムス(C。
He1m5)等の方法(DNA (1985年)、48
.39〜49ページ)により単離した。このDNAはE
coRlによる消化により試験した結果、オリゴヌクレ
オチド553及び555とハイブリダイズし、従って3
9kDaのトレボネマ抗原をコード化している所望のT
、hyo、を含む1.6Kbの挿入部を含むことを認め
た。
.39〜49ページ)により単離した。このDNAはE
coRlによる消化により試験した結果、オリゴヌクレ
オチド553及び555とハイブリダイズし、従って3
9kDaのトレボネマ抗原をコード化している所望のT
、hyo、を含む1.6Kbの挿入部を含むことを認め
た。
39kDa の ブローニングと1.ファ
ージ3−5C1のEcoRIで切断した1、6kbのD
NA断片をアクリルアミドゲルの電気溶離により単離し
、EcoRIによる消化により直線化したプラスミドp
Uc19に連結した。これらのDNAは共に連結してE
、coli中に形質転換し、組換えプラスミドpTRF
P106(第8図)を含むクローンをプラスミドDNA
の分析又は制限消化により確認した。
ージ3−5C1のEcoRIで切断した1、6kbのD
NA断片をアクリルアミドゲルの電気溶離により単離し
、EcoRIによる消化により直線化したプラスミドp
Uc19に連結した。これらのDNAは共に連結してE
、coli中に形質転換し、組換えプラスミドpTRF
P106(第8図)を含むクローンをプラスミドDNA
の分析又は制限消化により確認した。
2、プラスミドpTREPは38S−メチオニンを含む
インビトロで結合した転写翻訳系における直接蛋白質合
成に使用し、この系の蛋白質生成物のSDSゲル電気泳
動は39kDaにT、hyo、DNA挿入部を欠く親プ
ラスミドには見られない種類の蛋白質の存在を示した。
インビトロで結合した転写翻訳系における直接蛋白質合
成に使用し、この系の蛋白質生成物のSDSゲル電気泳
動は39kDaにT、hyo、DNA挿入部を欠く親プ
ラスミドには見られない種類の蛋白質の存在を示した。
このことはクローン化したDNAはT、hyo。
39kDa抗原の完全なコード化配列を含み、E、co
liはトレボネマプロモーターとリポソーム結合部位を
認識し、この外来蛋白質の合成をt#’lすることがで
きることを示唆している。
liはトレボネマプロモーターとリポソーム結合部位を
認識し、この外来蛋白質の合成をt#’lすることがで
きることを示唆している。
3、プラスミドpTrep106で形質転換したE、c
oli株は著量の所望の39kDaT、hyo、抗原を
生産しない。このため、高水準の組換え抗原の発現を許
容するプラスミド構成を次のようにして作った。pTr
ep106のEcoRIで切断した1、6Kbの断片を
、EcoRIによる消化により直線化したプラスミドp
Uc1Bに連結した。次いで生成するブラミスドpTr
epH2をPstIとBamIで切断し、次いでエキソ
ヌクレアーゼ■で処理して39kDaのT、hyo、抗
原の予言されたATG開始コドンの上流にある非コード
化DNA配列を除去したく単一方向の方法で)。消化中
種々な時間にDNA試料を除き、フェノール抽出により
エキソmを不活性化し、残るDNAをヌクレアーゼS1
で消化して平滑末端とし、次いでこのDNAを再連結し
てE、coliを形質転換するために使用した。19の
そのような新しいクローンpTrepH2−1のプラス
ミドDNAのヌクレオチド配列を測定した結果、成熟し
たT、hyo、39kDa蛋白質をコード化する372
コドンとシグナル配列からの7つのアミノ酸が隣接して
配列し、これが親のpUc1BプラスミドのHi nd
111部位の下流に融合していることが認められた。こ
の融合は融合蛋白質をコード化する読取り機構の中でな
されており、前記融合蛋白質の発現はクローン化された
断片の方向付けがpUC9へのクローン化の際Hind
l11部位からEcoR1部位に変換された後このla
cプロモーターにより制御されるであろう。
oli株は著量の所望の39kDaT、hyo、抗原を
生産しない。このため、高水準の組換え抗原の発現を許
容するプラスミド構成を次のようにして作った。pTr
ep106のEcoRIで切断した1、6Kbの断片を
、EcoRIによる消化により直線化したプラスミドp
Uc1Bに連結した。次いで生成するブラミスドpTr
epH2をPstIとBamIで切断し、次いでエキソ
ヌクレアーゼ■で処理して39kDaのT、hyo、抗
原の予言されたATG開始コドンの上流にある非コード
化DNA配列を除去したく単一方向の方法で)。消化中
種々な時間にDNA試料を除き、フェノール抽出により
エキソmを不活性化し、残るDNAをヌクレアーゼS1
で消化して平滑末端とし、次いでこのDNAを再連結し
てE、coliを形質転換するために使用した。19の
そのような新しいクローンpTrepH2−1のプラス
ミドDNAのヌクレオチド配列を測定した結果、成熟し
たT、hyo、39kDa蛋白質をコード化する372
コドンとシグナル配列からの7つのアミノ酸が隣接して
配列し、これが親のpUc1BプラスミドのHi nd
111部位の下流に融合していることが認められた。こ
の融合は融合蛋白質をコード化する読取り機構の中でな
されており、前記融合蛋白質の発現はクローン化された
断片の方向付けがpUC9へのクローン化の際Hind
l11部位からEcoR1部位に変換された後このla
cプロモーターにより制御されるであろう。
生成するプラスミド丁rep301 (第7図及び第8
図)で形質転換したE、coliはイムノプロット及び
平板ELISA検定の両方でブタ血清(ブタ赤痢及びT
、hyo、かう生成した39kDafi白質で免疫した
動物から回収されるそれらの両方)と反応する不溶性4
0kDa抗原を生産した。
図)で形質転換したE、coliはイムノプロット及び
平板ELISA検定の両方でブタ血清(ブタ赤痢及びT
、hyo、かう生成した39kDafi白質で免疫した
動物から回収されるそれらの両方)と反応する不溶性4
0kDa抗原を生産した。
39kDa の え 能のプラスミドpT
rep301を含むE、coliJM83株を、アンピ
シリン2ooμg/mILを含む250m1!のルリア
肉汁(Lu r i abroth)中で増殖させた。
rep301を含むE、coliJM83株を、アンピ
シリン2ooμg/mILを含む250m1!のルリア
肉汁(Lu r i abroth)中で増殖させた。
培養は32〜37℃で18時間増殖させた。細胞を遠心
分離により回収し、1 m g / m flのリゾチ
ームを含む25mMTris、10mMEDTAから成
る緩衝液(p)18.0)の当初液量の1/20量に再
懸濁した。室温で30分間インキュベートして細胞を溶
解し、次いで超音波処理により更に細胞を破壊した。非
イオン性界面活性剤Tritonx−tooを2%の最
終濃度となるように添加し、細胞溶解液を室温で1時間
混合し、次いで10、OOO’Xgで遠心分離した。こ
れらの段階の後不溶性ベレット画分を貯蔵した。この画
分の主要蛋白質成分は試料をSDSゲル電気電気泳動フ
コマッシブルー(Comma s s i el) 1
11 e )で染色することにより判定した結果、約4
0kDaの分子量を持っていた。この同じ蛋白質成分は
W e s t e r nプロット分析においてUP
Z画分より得られた標準の39kDaT、hyo、蛋白
質に対して生成したブタとマウスの抗血清により認識さ
れた。又、この組換え蛋白質は天然のブタ赤痢から回収
したブタ血清をプローブとしたイムノプロット分析にお
いても認識された。
分離により回収し、1 m g / m flのリゾチ
ームを含む25mMTris、10mMEDTAから成
る緩衝液(p)18.0)の当初液量の1/20量に再
懸濁した。室温で30分間インキュベートして細胞を溶
解し、次いで超音波処理により更に細胞を破壊した。非
イオン性界面活性剤Tritonx−tooを2%の最
終濃度となるように添加し、細胞溶解液を室温で1時間
混合し、次いで10、OOO’Xgで遠心分離した。こ
れらの段階の後不溶性ベレット画分を貯蔵した。この画
分の主要蛋白質成分は試料をSDSゲル電気電気泳動フ
コマッシブルー(Comma s s i el) 1
11 e )で染色することにより判定した結果、約4
0kDaの分子量を持っていた。この同じ蛋白質成分は
W e s t e r nプロット分析においてUP
Z画分より得られた標準の39kDaT、hyo、蛋白
質に対して生成したブタとマウスの抗血清により認識さ
れた。又、この組換え蛋白質は天然のブタ赤痢から回収
したブタ血清をプローブとしたイムノプロット分析にお
いても認識された。
この実施例で得られる39kDaの組換え抗血清はT、
hyo、のUP2P2O39kDa抗原と極めて類似す
るが同一ではない。しかしながら、それらは単一の血清
により認識される共通のエピトーブを持つ。
hyo、のUP2P2O39kDa抗原と極めて類似す
るが同一ではない。しかしながら、それらは単一の血清
により認識される共通のエピトーブを持つ。
実施例3 60に旦1益源
実施例1に記述したように細胞を増殖させ、回収し、初
期の処理を行った。
期の処理を行った。
界面活性剤で可溶化したプールを100,000Xgで
90分間遠心分離し、上澄液画分をDEAE−3eph
ace 1イオン交換クロマトグラフ用樹脂のカラムに
かけた。この蛋白質はカラムに結合し、過剰のTwea
n−20界面活性剤を2 jr+tMT r i so
l衝液(pH6,8)、0.1%Twe e n、10
mMNaCuから成る溶液で洗い去った。次いで蛋白質
をTris/Twe e n1Ji街液中IMNaCj
2で速やかに溶離した。蛋白質ピークを集め、低塩緩衝
液に対して透析し、次いでDEAE−Sephacel
上で再クロマトグラフした。今回は、蛋白質Tris−
Tween緩衝液中10mM〜300mMN a C角
とO〜2%ツウィッタージェント(Zwi tterg
ent)3−12 (カルービオケム(CaIt−Bi
ochem))の2成分リニアーグラジェントにより
溶離した。試料をSDSゲル電気泳動により分析し、6
0kDa蛋白質を含む両分をプールした。蛋白質を9倍
量の冷アセトンで沈澱し、遠心分離により集め、1%S
DS、25mMTris緩衝液(pi−16,8)中1
4mM2−メルカプトエタノール、5mMEDTAから
成る溶液中で煮沸して可溶化した。次いで可溶性蛋白質
を5epharose6Bカラム上の分子ふるいクロマ
トグラフにより分画した。60kDa抗原を含む画分を
プールし、アセトン沈澱により濃縮し、1%SO5中2
50μg / m Itの濃度とした。この標品中には
分子量の差異は極めて僅かであり(2000以下)、そ
れらのすべてはブタ赤痢から回収したブタ血清と反応す
る3つの蛋白質の一組が存在することに注意すべきであ
る。
90分間遠心分離し、上澄液画分をDEAE−3eph
ace 1イオン交換クロマトグラフ用樹脂のカラムに
かけた。この蛋白質はカラムに結合し、過剰のTwea
n−20界面活性剤を2 jr+tMT r i so
l衝液(pH6,8)、0.1%Twe e n、10
mMNaCuから成る溶液で洗い去った。次いで蛋白質
をTris/Twe e n1Ji街液中IMNaCj
2で速やかに溶離した。蛋白質ピークを集め、低塩緩衝
液に対して透析し、次いでDEAE−Sephacel
上で再クロマトグラフした。今回は、蛋白質Tris−
Tween緩衝液中10mM〜300mMN a C角
とO〜2%ツウィッタージェント(Zwi tterg
ent)3−12 (カルービオケム(CaIt−Bi
ochem))の2成分リニアーグラジェントにより
溶離した。試料をSDSゲル電気泳動により分析し、6
0kDa蛋白質を含む両分をプールした。蛋白質を9倍
量の冷アセトンで沈澱し、遠心分離により集め、1%S
DS、25mMTris緩衝液(pi−16,8)中1
4mM2−メルカプトエタノール、5mMEDTAから
成る溶液中で煮沸して可溶化した。次いで可溶性蛋白質
を5epharose6Bカラム上の分子ふるいクロマ
トグラフにより分画した。60kDa抗原を含む画分を
プールし、アセトン沈澱により濃縮し、1%SO5中2
50μg / m Itの濃度とした。この標品中には
分子量の差異は極めて僅かであり(2000以下)、そ
れらのすべてはブタ赤痢から回収したブタ血清と反応す
る3つの蛋白質の一組が存在することに注意すべきであ
る。
マ スと ギの #に
褐色CBS−FIマウスを上記の60kDa抗原プール
の12μgで免疫したこの蛋白質を100μにの水で希
釈し、十分に混合したフロイント(Freund)の完
全アジュバントの100μ尼と混合し腹腔内に注射した
。血清を採取し、60kDa抗原に対する特異性を証明
するためイムノプロット分析に使用した。ニューシーラ
ント(New Zealand)白色ウサギに3週間
間隔でFreundの完全と次に不完全アジュバントと
共に25μgの60kDa抗原を2回接種した。ウサギ
から採取した血清もイムノプロット分析に使用した。
の12μgで免疫したこの蛋白質を100μにの水で希
釈し、十分に混合したフロイント(Freund)の完
全アジュバントの100μ尼と混合し腹腔内に注射した
。血清を採取し、60kDa抗原に対する特異性を証明
するためイムノプロット分析に使用した。ニューシーラ
ント(New Zealand)白色ウサギに3週間
間隔でFreundの完全と次に不完全アジュバントと
共に25μgの60kDa抗原を2回接種した。ウサギ
から採取した血清もイムノプロット分析に使用した。
ゲノム−ブラリーの 立て
ゲノムライブラリーは実施例2におけるのと同様に組立
てた。
てた。
T、hyo、ゲノムライブラリーを持つバクテリオファ
ージラムダgtllの試料を混合した上層寒天にE、c
ol 1LE392株を含む1組の寒天平板を作成した
。ファージプラークをニトロセルロースに移し、次いで
0.05%Twe e n−20を含むリン酸Ha液化
食塩水(PBST)の1000に対してマウス60−2
血清の1を希釈した溶液と反応させた。次いでフィルタ
ーを第一抗体緩衝液(10mMT r i s (pH
7,2)、0.9%NaCIL、0.5%ナトリウム・
アジド、及び3%ウシ血清アルブミン(BSA)画分V
)で洗浄し、次に 1251 (アマ−ジャム(Ame
rsham))でラベルしたヨウ素化ヒッジ抗マウス第
二抗体と反応させた。フィルターを第二抗体1衝液(上
記のTris緩衝液化食枯水、アジド無添加及びBSA
の代りに1%ゼララン)中で洗浄し、次いでKodak
X線用フィノ【ムに対して置き、陽性クローン(60k
Da抗店に対するマウス血清により認識される蛋白質を
4産したファージプラーク)は露光したスポットとして
観察された。次いでフィルムスポットを元e寒天平板に
合わせて前記クローンのファージをV関し、2回以上再
培養(プラーク純化)して純粕なりローン化ファージ保
存培養を得た。次いで祠化した組換えファージをE、c
olj上C再度斗板培養し、プラークをマウス60−2
血清とウサギ抗60kDa血清の両方に対して再度試験
した。両血清はパーオキシダーゼ連結第二抗体と色素生
成反応(ベクター・ラプス(Vectorl、abs)
から入手した試薬)を使用するイムノプロット反応で強
い陽性反応を示した。
ージラムダgtllの試料を混合した上層寒天にE、c
ol 1LE392株を含む1組の寒天平板を作成した
。ファージプラークをニトロセルロースに移し、次いで
0.05%Twe e n−20を含むリン酸Ha液化
食塩水(PBST)の1000に対してマウス60−2
血清の1を希釈した溶液と反応させた。次いでフィルタ
ーを第一抗体緩衝液(10mMT r i s (pH
7,2)、0.9%NaCIL、0.5%ナトリウム・
アジド、及び3%ウシ血清アルブミン(BSA)画分V
)で洗浄し、次に 1251 (アマ−ジャム(Ame
rsham))でラベルしたヨウ素化ヒッジ抗マウス第
二抗体と反応させた。フィルターを第二抗体1衝液(上
記のTris緩衝液化食枯水、アジド無添加及びBSA
の代りに1%ゼララン)中で洗浄し、次いでKodak
X線用フィノ【ムに対して置き、陽性クローン(60k
Da抗店に対するマウス血清により認識される蛋白質を
4産したファージプラーク)は露光したスポットとして
観察された。次いでフィルムスポットを元e寒天平板に
合わせて前記クローンのファージをV関し、2回以上再
培養(プラーク純化)して純粕なりローン化ファージ保
存培養を得た。次いで祠化した組換えファージをE、c
olj上C再度斗板培養し、プラークをマウス60−2
血清とウサギ抗60kDa血清の両方に対して再度試験
した。両血清はパーオキシダーゼ連結第二抗体と色素生
成反応(ベクター・ラプス(Vectorl、abs)
から入手した試薬)を使用するイムノプロット反応で強
い陽性反応を示した。
次いでファージをE、col 1Y−1089株中で溶
原化し、この組換え株の細胞溶解液をゲル電気泳動と引
き続くニトロセルロースへの移転(Westernプロ
ット)により分析した。マウス60−2血清との反応は
、T、hyo、遺伝子の一部分のコード化配列がラムダ
ファージベクター中に存在するガラクトシダーゼ遺伝子
のそれと融合していることを期待するように、E、co
liのベータガラクトシダーゼ(12゜kDa)の大き
ざの位置に免疫反応的バンドを示した。
原化し、この組換え株の細胞溶解液をゲル電気泳動と引
き続くニトロセルロースへの移転(Westernプロ
ット)により分析した。マウス60−2血清との反応は
、T、hyo、遺伝子の一部分のコード化配列がラムダ
ファージベクター中に存在するガラクトシダーゼ遺伝子
のそれと融合していることを期待するように、E、co
liのベータガラクトシダーゼ(12゜kDa)の大き
ざの位置に免疫反応的バンドを示した。
組換えクローンのDNAを得るためファージ溶菌液を調
製し、2kbpのEcoRr断片を単離し、プラスセド
ベクターPυC19中に再クローン化してプラスミドp
Treplo1を得た。プラスミドDNAを標準方法に
より調製し、クローン化した部分の末端領域のヌクレオ
チド配列を測定した。EcoR1部位を横断してT、h
yo。
製し、2kbpのEcoRr断片を単離し、プラスセド
ベクターPυC19中に再クローン化してプラスミドp
Treplo1を得た。プラスミドDNAを標準方法に
より調製し、クローン化した部分の末端領域のヌクレオ
チド配列を測定した。EcoR1部位を横断してT、h
yo。
DNA断片に延びる開口読み取り機構がファージベクタ
ーのガラクトシダーゼのそれと調和していることが認め
られ、又、T、hyo、DNAのA1uI部位に付着し
ているEcoRIリンカ−の存在も示された(ゲノムラ
イブラリーの調製法と一政)。このT、hyo、DNA
の開口読取り機構は10kDaのペプチドをコード化し
、TGA停止コドンで終っており、これは”r、hyO
lの60kDa蛋白質のC末端部分のように思われる。
ーのガラクトシダーゼのそれと調和していることが認め
られ、又、T、hyo、DNAのA1uI部位に付着し
ているEcoRIリンカ−の存在も示された(ゲノムラ
イブラリーの調製法と一政)。このT、hyo、DNA
の開口読取り機構は10kDaのペプチドをコード化し
、TGA停止コドンで終っており、これは”r、hyO
lの60kDa蛋白質のC末端部分のように思われる。
特異なHindD1部位がクローン化した部分のEco
R1部位から41bpT流に認められた。
R1部位から41bpT流に認められた。
プラスミドpTreplo1をHindmで消化すると
1700bpの断片が遊着し、次にこれを発現用プラス
ミドpWHA93の特異なHind■部位にクローン化
してT、hyo、の開口読取り機構をpWHA93ベク
ター中のプロキモシンのそれに融合させた。ここで生成
するプラスミドpTrep103 (第4図)はE、c
oli中で大和の不溶性蛋白質の合成を指導し、前記不
溶性蛋白質はT、hyo、蛋白質部分に融合したプロキ
モシンを含むことが認められた。蛋白質の発現と回収は
39kDa蛋白質に関して記述したように行った。この
蛋白質は50kDa (40kDaプロキモシン+1o
kDaT、hyo、蛋白質部分)であることがゲル電気
泳動によって示された。この不溶性蛋白質はイムノプロ
ットにおいてT、hyo、から精製した60kDaに対
して生成したマウス及びウサギ血清により認識される。
1700bpの断片が遊着し、次にこれを発現用プラス
ミドpWHA93の特異なHind■部位にクローン化
してT、hyo、の開口読取り機構をpWHA93ベク
ター中のプロキモシンのそれに融合させた。ここで生成
するプラスミドpTrep103 (第4図)はE、c
oli中で大和の不溶性蛋白質の合成を指導し、前記不
溶性蛋白質はT、hyo、蛋白質部分に融合したプロキ
モシンを含むことが認められた。蛋白質の発現と回収は
39kDa蛋白質に関して記述したように行った。この
蛋白質は50kDa (40kDaプロキモシン+1o
kDaT、hyo、蛋白質部分)であることがゲル電気
泳動によって示された。この不溶性蛋白質はイムノプロ
ットにおいてT、hyo、から精製した60kDaに対
して生成したマウス及びウサギ血清により認識される。
pTrep103の生産物はブタ赤痢から回収されるブ
タ血清によっても認識される。
タ血清によっても認識される。
pTrep103を調製する手順を第5図に図式的に示
す。
す。
実施例4
ブユニットワク ン の
実験条件:
第!回ワクチン接種時ブタの体重は18.1Kg(40
ボンド)であり、1回目注射の5週間後ワクチンを再接
種した。2mILのワクチン量に対して0.5mj2の
鉱物油アジュバントを混合し、筋肉的注射により投与し
た。動物は第2回ワクチン接種の3週間後T、hyo、
培養として肉片又は寒天増殖菌のスラリーを経口接種す
ることにより感染させた。各動物は109の菌を受は取
った。
ボンド)であり、1回目注射の5週間後ワクチンを再接
種した。2mILのワクチン量に対して0.5mj2の
鉱物油アジュバントを混合し、筋肉的注射により投与し
た。動物は第2回ワクチン接種の3週間後T、hyo、
培養として肉片又は寒天増殖菌のスラリーを経口接種す
ることにより感染させた。各動物は109の菌を受は取
った。
この発明はワチチンを生産するために発現された蛋白質
を使用することに関連して詳しく記述したが、発現され
た蛋白質はT、hyo、抗体を決定するために診断用と
して使用することもできる。更に別の応用として、発現
された蛋白質を抗体を引き出すために使用し、又引き出
した抗体をワクチンとして使用することができる。多く
の本発明の変更と変動が上の記述に照らして可能であり
、従って上に詳細に記述した以外のことを本発明の特許
請求の範囲内で実施することが可能である。
を使用することに関連して詳しく記述したが、発現され
た蛋白質はT、hyo、抗体を決定するために診断用と
して使用することもできる。更に別の応用として、発現
された蛋白質を抗体を引き出すために使用し、又引き出
した抗体をワクチンとして使用することができる。多く
の本発明の変更と変動が上の記述に照らして可能であり
、従って上に詳細に記述した以外のことを本発明の特許
請求の範囲内で実施することが可能である。
第1図はpTrep2の制限地図であり、第2図は発現
用プラスミドpTrep9の組立ての手順を示しており
、第3図は38kDa遺伝子のD N A’配列であり
、Tjc4図はpTrep103(60kDa−プロキ
モシン)遺伝子融合のDNAとアミノ酸配列を示してお
り、第5図はpTrep103の組立ての手順を示して
おり、第6図は39kDa遺伝子の配列を示しており、
第7図はpTrep103発現用プラスミドのDNAと
アミノ酸配列を示しており、第8図はpTrep301
の制限地図である。 1、事件の表示 平成1年特許願第162823号 ワクチン −〇 椋
用プラスミドpTrep9の組立ての手順を示しており
、第3図は38kDa遺伝子のD N A’配列であり
、Tjc4図はpTrep103(60kDa−プロキ
モシン)遺伝子融合のDNAとアミノ酸配列を示してお
り、第5図はpTrep103の組立ての手順を示して
おり、第6図は39kDa遺伝子の配列を示しており、
第7図はpTrep103発現用プラスミドのDNAと
アミノ酸配列を示しており、第8図はpTrep301
の制限地図である。 1、事件の表示 平成1年特許願第162823号 ワクチン −〇 椋
Claims (35)
- (1)約19ないし90キロダルトン(kDa)の範囲
の分子量を持つ少なくとも1つのトレポネマ・ヒオジセ
ンテリエー(T.hyo.)抗原の少なくとも1つのエ
ピトーブを認識することができる少なくとも1つの抗体
を引き出すことができる少なくとも1つの蛋白質をコー
ド化するDNA配列を含む発現用ビークルから成る組成
物。 - (2)DNA配列は38キロダルトンのトレポネマ・ヒ
オジセンテリエー抗原を認識する抗体を引き出す少なく
とも1つの蛋白質をコード化する請求項1記載の組成物
。 - (3)DNA配列は39キロダルトンのトレポネマ・ヒ
オジセンテリエー抗原を認識する抗体を引き出す少なく
とも1つの蛋白質をコード化する請求項1記載の組成物
。 - (4)DNA配列は60キロダルトンのトレポネマ・ヒ
オジセンテリエー抗原を認識する抗体を引き出す少なく
とも1つの蛋白質をコード化する請求項1記載の組成物
。 - (5)発現用ビークルは第3図に示すDNA配列を含む
請求項1記載の組成物。 - (6)発現用ビークルは第6図に示すDNA配列を含む
請求項1記載の組成物。 - (7)発現用ビークルは第4図に示すDNA配列を含む
請求項1記載の組成物。 - (8)請求項1記載の発現用ビークルで形質転換された
宿主。 - (9)請求項2記載の発現用ビークルで形質転換された
宿主。 - (10)請求項3記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。 - (11)請求項4記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。 - (12)請求項5記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。 - (13)請求項6記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。 - (14)請求項7記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。 - (15)請求項8記載の宿主から生産される蛋白質から
成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワ
クチン。 - (16)請求項9記載の宿主から生産される蛋白質から
成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワ
クチン。 - (17)請求項10記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。 - (18)請求項11記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。 - (19)請求項12記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。 - (20)請求項13記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。 - (21)請求項14記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。 - (22)請求項8記載の宿主から生産される蛋白質。
- (23)請求項9記載の宿主から生産される蛋白質。
- (24)請求項10記載の宿主から生産される蛋白質。
- (25)請求項11記載の宿主から生産される蛋白質。
- (26)請求項12記載の宿主から生産される蛋白質。
- (27)請求項13記載の宿主から生産される蛋白質。
- (28)請求項14記載の宿主から生産される蛋白質。
- (29)トレポネマ・ヒオジセンテリエー抗原は25な
いし65キロダルトンの分子量を持つ請求項1記載の組
成物。 - (30)請求項16記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。 - (31)請求項17記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。 - (32)請求項18記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。 - (33)請求項19記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。 - (34)請求項20記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。 - (35)請求項21記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US21326288A | 1988-06-29 | 1988-06-29 | |
US213,262 | 1988-06-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0361488A true JPH0361488A (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=22794386
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1162823A Pending JPH0361488A (ja) | 1988-06-29 | 1989-06-27 | 発現用ビークルから成る組成物とそれにより形質転換された宿主とそれにより生産される蛋白質及び蛋白質から成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワクチン |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0350715B1 (ja) |
JP (1) | JPH0361488A (ja) |
AT (1) | ATE114716T1 (ja) |
DE (1) | DE68919553T2 (ja) |
ES (1) | ES2067501T3 (ja) |
GR (1) | GR3015074T3 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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