JPH0361488A

JPH0361488A - 発現用ビークルから成る組成物とそれにより形質転換された宿主とそれにより生産される蛋白質及び蛋白質から成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワクチン

Info

Publication number: JPH0361488A
Application number: JP1162823A
Authority: JP
Inventors: Michael Mccaman; マイケル　マッカマン; Jeffrey D Gabe; ジェフリー　デー　ゲーブ; Elizabeth Dragon; エリザベス　ドラゴン; William H Andrews; ウィリアム　エッチ　アンドリュース
Original assignee: ML Technology Ventures LP
Current assignee: ML Technology Ventures LP
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1991-03-18
Also published as: GR3015074T3; DE68919553D1; EP0350715B1; ES2067501T3; ATE114716T1; EP0350715A1; DE68919553T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】この発明はトレポネマ・ヒオジセンテリエ−（Ｔｒｅｐ
ｏｎｅｍａ　　ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅ−ｒｉａｅ　（Ｔ
、ｈｙｏ、））に関し、より詳しく組換えトレポネマ・
ヒオジセンテリエー抗原に関する。更にこの発明はブタ
赤痢用ワクチンに関する。

ブタ赤痢はすべての主要なブタ飼育地方に見られる重大
な感染性疾病である。ブタ赤痢の兆候は重大な粘液出血
性下痢、脱水及び体重減少である。

ブタ赤痢は嫌気性のＢ−溶血性スピロヘータであるトレ
ポネマ・ヒオジセンテリエーによって引き起こされるこ
とが発見された。

この疾病は一般に、急性感染又は無症候性保菌ブタから
のトレポネマ・ヒオジセンテリエーを含む糞便の摂取も
しくは農場設備又は取扱い者により散布される糞便によ
り起こる。

トレポネマ・ヒオジセンテリエーに対するワクチンを作
る多くの試みがなされたが、それらは−般に童画の使用
を含むものであった。

この発明は組換えＴ、ｈｙｏ、の抗原の調製及びそのワ
クチンとしての使用に関する。

この発明の１９の態様により、少なくとも１９のＴ、ｈ
ｙｏ、抗原のエピトーブを認識する少なくとも１９の抗
体を引き出すことのできる少なくとも１９の蛋白質をコ
ード化するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子もしくは
発現用又はクローニング用ビークル（ベクター又はプラ
スミド）が提供される。

この発明の他の態様により、少なくとも１９のそのよう
な蛋白質を発現することのできるような発現用ビークル
で形質転換された宿主が提供される。

この発明の更に別の態様により、そのような宿主によっ
て発現された少なくとも１９のそのような蛋白質を含む
ワクチンが提供される。

より詳しくは、そのような発現用プラスミド又はヘクタ
ーに含まれるＤＮＡ配列は約１９ｋＤａないし約９０ｋ
Ｄａの範囲の分子量を持つ少なくとも１９のＴ、ｈｙｏ
、抗原のエピトーブ（１９又は複数）を認識する抗体を
引き出すことのできる少なくとも１９の蛋白質をコード
化し、そのような抗原は最も一般的には少なくとも２５
ｋＤａで６５ｋＤａより大きくない分子量を持つ。

更により詳しくは、ＤＮＡ配列は次のＴ、ｈｙＯ５抗原
、すなわち、１９ｋＤａ、２９ｋＤａ。

３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３４ｋＤａ、３６ｋＤａ、３
８ｋＤａ、３９ｋＤａ、４２ｋＤａ、４４ｋＤａ及び６
０ｋＤａのＴ、ｈｙｏ、抗原の少なくとも１９の又は複
数のエピトーブ（１９又は複数）を認識する抗体を引き
出すことのできる少なくとも１９の蛋白質をコード化す
る。特に好ましい具体化においては、ＤＮＡ配列は３８
ｋＤａ。

３９ｋＤａ及び６０ｋＤａのＴ、ｈｙｏ、抗原の少なく
とも１９のエピトーブ（１９または複数）を認識する抗
体を生産することのできる蛋白質をコード化する。

ＤＮＡ配列は、そのようなりＮＡ配列から生産される蛋
白質は免疫後Ｔ、ｈｙｏ、抗原のエピトーブを認識する
抗体を引き出すことを条件として全抗原、又は抗原の断
片又は誘導体、もしくは抗原又は断片と他の蛋白質との
融合生成物をコート化することができる。

従って、例えばＤＮＡ配列は６０ｋＤａの抗原の断片（
１０ｋＤａの分子量を持ち、６０ｋＤａの抗原ペプチド
ｎ列の一部を含む蛋白質）であるかそれを含む蛋白質を
、そのような断片が６０ｋＤａのエピトーブを認識する
抗体を生産することを条件としてコード化することがで
きる。

同様に、ＤＮＡ配列は抗原の誘導体例えばペプチド頻に
おける１９又は複数のアミノ酸の変異である蛋白質を、
そのような誘導体が上述のＴ、ｈｙｏ、抗原のエピトー
ブ（１９又は複−ａ）を認識する抗体を引き出す限りコ
ード化することかできる。

ＤＮＡ配列は上述のＴ、ｈｙｏ、抗原のエピトーブ（１
９又は複数）を認識する抗体を生産する蛋白質と他の蛋
白質（例えばキモシン）との融合生成物である蛋白質を
コード化することができる。

結果として、用語「上述のＴ、ｈｙｏ、抗原のエピトー
ブ（１９又は複数）に認識する抗体を生産する蛋白質を
コード化するＤＮＡ配列」は適当な抗原、抗原の断片、
抗原の誘導体又はそのような抗原、抗原の断片又は抗原
の誘導体と他の蛋白質との融合生成物であることができ
る蛋白質をコード化するか及び／又は適当な形質転換さ
れた細胞中で発現するＤＮＡ配列を包含する。

又、細胞中に導入されるベクター中に存在するＤＮＡ配
列はそのようなりＮＡ配列によってコード化される蛋白
質の一部のみを発現するのであり、発現される蛋白質部
分は上述のＴ、ｈｙｏ。

抗原の１９又は複数のエピトーブ（１９又は複数）を認
識する抗体を生産することを条件としてそのようなりＮ
Ａ配列は上述の定義の範囲内にあると理解すべきである
。例えはＤＮＡ配列は全抗原をコード化することができ
るが、発現される蛋白質は抗原の断片である。

個別の分子量を持つ発現された蛋白質は種々な形で存在
することもでき、すなわち、特別な分子量を持つ蛋白質
のアミノ酸配列は全配列にわたって同一でない場合もあ
る。従って、例えば３９ｋＤａの分子量を持つＴ、ｈｙ
ｏ、抗原は種々な形で存在することができ、すなわち、
３９ｋＤａの分子量を持ち、共に８０％近くのアミノ酸
配列の同一性を持つにも拘らず相互に異なるアミノ酸配
列を持つ少なくとも２つの異なるＴ、）１３１０゜抗原
がある。従って、本発明はクローニング・ビークルとそ
のようなりローニング・ビークルを使用して発現される
蛋白質を含み、前記発現される蛋白質（１９又は複数）
は分子量は同一であるが、アミノ酸配列は変動するＴ、
ｈｙｏ、抗原。

断片又は誘導体であることができる。同様に、そのよう
な場合、発現される蛋白質は同一の分子量を持つがアミ
ノ酸配列に若干の相違がある１９又は複数のＴ、ｈｙｏ
、抗原のエピトーブ（１９又は複数）を認識する抗体を
引き出すことができる。

適当なりＮＡ配列が任意の広範囲の種類のベクター又は
プラスミドに含まれることができる。そのようなベクタ
ーは染色体、非染色体及び合成りＮＡ配列、例えばＳＶ
４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母
プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡ、又は種痘ウ
ィルス、アデノウィルス、感染性上皮腫ウィルス及び偽
狂犬病ウィルスのようなウィルスＤＮＡとの組合せによ
り得られるベクターを含む。

適当なりＮＡ配列は種々な方法によりベクター中に挿入
することができる。一般に、ＤＮＡ配列は当該技術分野
で公知の方法により適当な制限エンドメクレアーゼ部位
（１９又は複数）に挿入することができる。これらの方
法は当業者が容易に到達できる範囲内にある打考えられ
る。

発現用ベクター中のＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成に向かう
適当な発現制御配列（１９又は複数）くプロモーター）
に有効に連結される。そのようなプロモーターの代表例
としてＬ　Ｔ　Ｒ又は５Ｖ４０プロモーター、イー・コ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のｌａｃまたはｔｒｐ、ファージ・
ラムダＰＬプロモーター及び他の原核又は真核細胞又は
それらのウィルスにおいて遺伝子の発現を制御すること
が知られているプロモーターを挙げる事ができる。発現
用ベクターは翻訳開始及び転写終了遺伝子のリポソーム
結合部位も含む。ベクターは又適当な発現を増幅するた
めの配列も含む事ができる。

更に、発現用ベクターは真核細胞培養のためのジヒドロ
葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、もしくはＥ、ｃｏ
ｌｉにおけるテトライタリン又はアンピシリン耐性のよ
うな形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性
を具える遺伝子を含むのか好ましい。

上述の適当なりＮＡ配列、並びに適当なプロモーター又
は制御配列を含むベクターは適当な宿主を蛋白質を発現
し得るように形質転換させるために使用することかでき
る。適当な宿主の代表例として、Ｅ、ｃｏｌｉ、サルモ
ネラーティフィムリューム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　
ｔｙｐｈｉ　−ｍｕ　ｒ　ｉ　ｕｍ）のような細菌ｍ胞
、酵母のようなカビ細胞、ＣＨＯ又はボウニス（Ｂｏｗ
ｅｓ）メラノーマのような動物細胞、植物細胞などが挙
げられる。適当な宿主の選択はここに示したことにより
当業者が容易に到達し得る範囲内にあると考えられる。

上に述べたように、選択された部位に挿入される適当な
りＮＡ配列を含む発現用ビークルは上述のＴ、ｈｙｏ、
抗原（１９又は複数）のエピトーブ（１９又は複数）を
認識する抗体を生産することができる蛋白質をコード化
する遺伝子の部分ではないＤＮＡ又は遺伝子配列を含む
事ができる。

例えば、所望のＤＮＡ配列は同じ読み取り機構の中に発
現に寄与するか又は精製を改ぷするか又は適当な蛋白質
の発現を許容するＤＮＡ配列を融合させることができる
。例えば本発明の代表的具体化に示すように、適当なり
ＮＡ配列として小生キモシンをコート化する遺伝子をベ
クターの同じ読み取り機構の中に挿入し、所望の蛋白質
は子牛キモシンとの融合ペプチドとして発現される。

ワクチンを開発することが望まれる場合、中和又は保護
抗体は自然抗原の不連続構造依存性エピトーブを標的と
することができる。従って組換え発現系から得られる蛋
白質は本来の蛋白質分子の自然環境下におけるそれと実
質的に異なる三次元構造を持つことができるか否かを考
慮しなければならない。従って分離される蛋白質の免疫
原的性質により、適当な分子構造を復活するため本来の
性質に戻すことが必要になる場合がある。多くの蛋白質
を復元する方法が科学文献に記載されており、それらは
（１）アルカリ、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）
、有機溶剤及びイオン性界面活性剤のような薬品の使用
と引き続く希釈、透析又はｐ＋＋調整により変性剤を除
去することにより達成される復元段階による不適当に折
り重なった蛋白質の変性（広げ）と、（２）免疫原性蛋
白質のための膜様環境を再生するための蛋白質の脂質二
層又はリボゾーム中への再構築を含む。

本発明の他の態様により、上述の種類のクローニング・
ビークルで形質転換した宿主から生産される蛋白質は、
ブタ赤痢特にＴ、ｈｙｏ、によって誘導されるブタ赤痢
に対して保護するため生理的に受容可能な賦形剤と共に
使用することができる。上で述べたように、そのような
蛋白質は上述のＴ、ｈｙｏ、の１９又は複数のエピトー
ブ（１９又は複数）を認識する抗体を引き出すことがで
きる。そのような発現された蛋白質は、今後時には「組
換えＴ、ｈｙｏ、抗原」と称するが、しかしながら上述
のようにそのような蛋白質は断片、誘導体又は融合生成
物も含むことがある点でＴ、ｈｙｏ、抗原に相当しない
場合がある。用語「組換えＴ、ｈｙｏ、抗原」はそのよ
うな断片。

誘導体及び融合生成物も含むものである。

組換えＴ、ｈｙｏ、抗原はブタ赤痢から保護するための
有効量をワクチンに使用する。

一般に、ワクチンの各投与はそのような組換えＴ、ｈｙ
ｏ、抗原の少なくとも５マイクログラム及び好ましくは
少なくとも１００マイクログラムを含む。大部分の場合
、ワクチンはそのような組換えＴ、ｈｙｏ、抗原を２０
ミリグラムより多い量を含むことはない。

用語「保護」又は「保護する」はここに記述するブタ赤
痢用ワクチンに関連して使用する場合、ワクチンがブタ
赤痢を予防し及び／又はブタ赤痢の重篤度を軽減するこ
とを意味する。

一般に多投与を行う場合は、それらは６週間に３回投与
を超えない。

組換えＴ、ｈｙｏ、抗原と共に使用する賦形剤は広範囲
の種類の賦形剤の任意の１９を使用することができる。

適当な賦形剤の代表例として、鉱物油、ミョウバン、合
成ポリマーなどが挙げられる。ワクチン用賦形剤は当該
技術分野で公知であり、適当な賦形剤の選択はここに示
したことにより当業者が容易に到達し得る範囲内にある
と考えられる。適当な賦形剤の選択はワクチンが投与さ
れる方法にも依存する。ワクチンは注射可能な投与形態
とすることができ、筋肉内、静脈内又は皮下投与により
投与することができる。又、ワタチンを錠剤形態などを
作り、飼料又は水と活性成分を混合して経口的に投与す
ることもできる。

他のワクチンの投与方法はここに示したことにより当業
者に明白であり、従ってこの発明の範囲は個別の供給形
態に限定されるものではない。

又、ワクチンには上述の組換えＴ、ｈｙｏ、抗原または
その断片の外に活性成分又はアジュバントを含むことも
できると理解すべきである。

この発明は、更に次の実施例との関連で説明するが、こ
の発明の範囲はそれによって限定されるものではない。

実施例においては、別記せぬ限りＭ製、消化及び連結は
コールド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）、マ：アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）外著「モ
レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　　
１ａｂｏｒｔａｔｏｒｙ　　ｍ　ａ　　ｎ　　ｕ　　ａ
　　ｌ　　）　　」に記述された方法により行った。次
の実施例において、別記せぬ限り形質転換はコーエン（
Ｃｏｈｅｎ）外、ブロシーデインダス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＰＮＡＳ）（１９
７３年）、６９巻、２１．１０ページに記述の方法によ
り行った。

実施例１発狂発病性Ｔ、ｈｙｏ、Ｂ２０４株を２℃発酵漕巾で嫌気的
（Ｎ２９０％、Ｃｏ、１０％から成る大気）に培養し、
その際ｐ）１６．８、温度３７℃に、保った。培地はプ
レイン・ハート・インフユージＢン（Ｂｒａｉｎ−Ｈｅ
ａｒｔ　　１ｎｆｕｓ−ｉｏｎ）、５％ウシ胎児血清、
デキストロース及びスベクチノマイシン・二塩酸から成
っていた。

細胞濃度約５×１０８／ｍＱのときｉ＊！！物を収穫し
た。細胞を遠心分離てし集め、１５０ｍＭＫＣｌをを含
むｐＨ４，７５の１０ｍＭ酢ａ！２緩衝液で洗浄１八遠
心分離した。洗浄操作を２回以上繰返し、最終の細胞ベ
レットを一２０℃で保存した。

近ｎ３しと症ｌ凍結細胞を融解し、次いで典型的には元の培養液量の１
／２０である光学密度２５〜３゜（６００ｍｍｌ、’：
おける）が達成されるまで（溶液希釈液につき測定）ｐ
Ｈ４，７５の１０ｍＭ酢酸カリウムに再懸濁した。次い
でツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（非イオン性界面活性
剤）を細胞懸濁液に添加し、最終濃度を０．２％とした
。１０分間穏やかに攪拌した後細胞を遠心分離した（１
０．ＯＯＯｘｇ、１０分）。この上澄液画分を棄却し、
細胞を酢酸Ｍ衝液に再懸濁し、次いで２．０％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０で抽出した。遠心分Ｉｌｌ後２％Ｔｗｅｅｎの
上澄液（界面活性剤で可溶化した抗原のプール）を貯蔵
し、ｍ胞ベレットを再懸濁し、７　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　−
２０の濃度を約２％から約１０％まで増加しながら順次
更に３回繰返して再抽出を行った。界面活性剤可溶化上
澄液画分をプールした。この抽出操作は細菌を溶菌又は
破壊することな（Ｔ、ｈｙｏ、の表面蛋白質を選択的に
（定損的ではないが）可溶化する。

１０　、　ＯＯＯｇ　Ｘ　ｇ　テ高速遠心分Ｍａ、Ｔｗ
ｅｅｎ−２０可溶化蛋白質からのベレットを元の培養液
量の１７５００の液量の２５ｍＭトリス（Ｔｒ　ｉ　ｓ
）　−Ｃ１（ｐＨ６、８）に超音波処理により再懸濁し
た（全蛋白質濃度２０ｍｇ／ｍｊ２）。次いでこの懸濁
液を６Ｍの尿素を含む元の培養液量の３／１００の同一
緩衝液に室温で穏やかに攪拌しながら混合した。この段
階で元のベレット中の蛋白質の約８０％が可溶化される
。尿素不溶性蛋白質（ＵＰＩ）をｆｏｏＫＸｇの超遠心
分離を４℃で９０分間行って捕集し、元の培養ＮｉＨの
ｌ１５００の２５ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｃｌ１（ｐＨ６，
８）に再懸濁し、６Ｍの尿素を含む元の培養液はの３／
１００の同一緩衝液で穏やかに攪拌しなから室温で１時
間２回目の抽出を行った。

この２回口の尿素抽出は、３８ｋＤａの蛋白質とＵＰ２
の小量成分である２９ｋＤａを選択的に可溶化する。２
時間の尿素抽出で可溶化されない他の蛋白質は１００Ｋ
Ｘｇで４℃、９０分の超遠心分離により除去した。２時
間尿素可溶化の上澄液（ＵＳ２）は１０　ｍ　Ｍ　Ｎ　
Ｈ４ＨＣＯ３に透析して尿素を除き５次いで凍結乾燥し
た。次いでこの物質を２５ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｃ１１（
ｐＨ６，８）に可溶化し、−２０℃で貯蔵した。湿ｆＲ
重蛍１０　ｇ　ｍのＴ、ｈｙｏ、細胞ペースト（培養液
１．５Ｌ）から出発して、Ｕ３２画分中に４ｍｇの３８
ｋＤａ蛋白質と０．４ｍｇの２９ｋＤａ蛋白質が得られ
る。

３８ｋＤａ　　　　の　ミノ３８ｋＤａ蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列を自動化
されたアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ
　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）気相蛋白質配列測定装置で
連続的エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解法を用いて測定する
。３８ｋＤａｉ白買から遊離したアミノ酸はインチオシ
アン酸フェニル（ＰＩＴＣ）で誘導体化し、ＨＰＬＣで
分離し分析した。このようにして決定した蛋白１１の最
初の３０個のアミノ酸の実態は下図の通りである。

２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０？−Ｖａｌ−＋１ｅ−Ａｓｎ−＾５ｎ−Ａｓｎ−Ｔ
ｌｅ−５ｅｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｓｎ−０Ａｌａ−Ｇｌｎ−八ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−０Ｌｙｓ−？−Ａｓｐ−？−Ａｌａ−Ｍｅｔ−１１ｅ−３
８ｋＤａ蛋白質からの別のアミノ酸配列が、３８０μｇ
のＵＳ２　（１ナノモル）を１１３μｍの５０ｍＭＴ　
ｒ　ｉ　５−ＣＩＬ　（ｐＨ６，８）中で８μｇのエン
ドプロテイナーゼＬｙｓＣで３７℃、４時間消化するこ
とにより得られた。この消化物から得られるペプチド断
片を０．１％トリフルオロ酢酸中０〜１００％アセトニ
トリル：イソプロパノール（２：１）のグラジェントを
使用するＣ４カラム上のＨＰＬＣにより分離した。

吸収を２１４ｎｍと２８０ｎｍで監視した。主要なピー
クを含む画分を凍結乾燥し、０．１％ＳＤＳに再懸濁し
、上のように配列を測定した。３８ｋＤａ蛋白質の２つ
の内部蛋白分解断片からアミノ酸配列が得られ、これを
下に示す。

（ペプチド１）Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ？−１１ｅ−八ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−０Ａｒｇ−Ｍｅｔ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ−？−０Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−？Ｐｈｅ−１１ｅ−？−Ｔｈｒ− ０Ｇｌｕ−？−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｔｈｒ−（ペプチド２）Ｌｅｕ−＾ｓｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−？−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｐｈｅ−０＾１ａ−＾ｒｇ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−＾
ｓｎ−０Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＡＩａ−５ｅｒ−？−Ｔｒｐ
−Ｌｅｕ−０Ｈ４ｓ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−＾ｓｎ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ− Ｔ、）１　　ｏ、ＤＮＡの・。

Ｔ、ｈｙｏ、８２０４株の１リツトルの培養液を遠心分
離し、細菌細胞を６ｍｆＬのリン酸Ｎ！衝液化食塩水に
再懸濁した（全波ｆｉ９．５ｍＩＬとなる）。次いでこ
れを１０ｍＩＬのＡ溶液（ＣｓＣＩｌｌ　１３．６ｇ、
ＴＥＡ！衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ／１ｍＭＥＤＴＡ　（
ｐ）１８．０）　）　８７．６ｍｊ２）と７昆合し、細
胞を溶解するため６．８８ｍ角の界面活性剤、２０％サ
ルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙ　１　）を添加した。次いで
３．５ｍｕのＴＥ緩衝液と６．１２ｍ１の１０ｍｇ／ｍ
ｕＥｔＢｒを添加し、溶液をソーパル（Ｓｏｒｖａｌ　
１）ＴＶ８５０ローター中で４３．ＯＯＯｒｐｍで一晩
回転した。ゲノムＤＮＡのバンドを１８ゲージの注射器
で抜き取り、５０％（ｗ／ｗ）ＣｓＣ文と混合し、５ｏ
ｒｖａｌｌＴＶ８６５ｔ１７−ター中で５５．０００ｒ
ｐｍで７時間回転した。ゲノムＤＮＡを再び抜き取り、
Ｃ５ＣＪＺ中、ＴＶ８６５０−ター中で一晩回転した。

ゲノムＤＮＡを抜き取った後、臭化エチジウムをイソプ
ロパツールで抽出して除いた。次いでＤＮＡをＴＥ緩衝
液に対して十分透析し、−２０℃で保存した。

オリゴメクレオ　ド・プローブＴ、ｈｙｏ、３８ｋＤａ抗原にライての部分的アミノ酸
配列については上で記述した。蛋白質のＮ末端の最初の
６つのアミノ酸領域をコード化できるすべての可能性の
あるＤＮＡ配列を決定し、混合したプローブを生成させ
た。この混合したプローブは下に示すような標的領域の
アミノ酸配列をコード化できるヌクレオチドの可能性の
ある組合せのすべてを含む配列のプールである。そのよ
うな混合したプローブをデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｅ）と称する。各プローブは１７ヌクレオチドの
長さである。従って、このプローブＣ０Ｄ４５０は９６
層のデジェネレートである。Ｃ０Ｄ４５０はＤＮＡ合成
装置で作った。

０Ｄ４５０Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−１１ｅＣＧＡ（：Ｃ（：ＧＴＴ　　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　　ＡＴＴ　　ＡＴ
Ｔ、ｈ　　ｏ、ＤＮＡのＴ、ｈｙｏ、８２０４株のＤＮＡをＨｉｎｄ■で消化し
、１％アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）ゲル上を泳動させ
た。次いでゲルをサウザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）７去（
ＪＭＢ、９８二５０３）によりプロットし、Ｃ０Ｄ４５
０をプローブとして調べた。ハイブリダイゼーションの
条件は下記の通りである。

乾燥したフィルターを０．９ＭＮａＣ息、９０ｍＭＴｒ
ｉ　５−ＨＣｆｌ　（ｐＨ７，５）、６ｍＭＥＤＴＡか
ら成る溶液中で再度ぬらした。次いでフィルターをバッ
グに入れ、２．５ｍＪ２のプレハイブダイゼーション溶
液をフィルターに添加した。

プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ン溶液は６ｘＮＥＴ。

５ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ、０．１ｍＭ　　ｒＡＴＰ、１、ＯｍＭ　　ＮａＰＰ１゜１０．０ｍＭ　　リン酸ナトリウム（＋１＋（７，５）
。

０．２％　ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｕ　　Ｍ音波処理したサケ***ＤＮＡ、２５０μＨ／ｍｕ　　Ｅ、ｅｏｌｉのｔＲＮＡ、を含む
。

ブレハイブリダイゼーションは３７℃で２・１／２時間
行った。

次いでプレハイブリダイゼーション溶液をバッグから排
出し、各バッグに３ｍｊ２の第２のプレハイブリダイゼ
ーション溶液を添加した。第２のプレハイブリダイゼー
ション溶液は５０ｍｆ１当り１ｍｆｆ１の１００ｍｇ／
ｍｕラムダｇｔｌｌＤＮＡと５ｍｆｆ１の３６２μｇ／
ｍｉＥ、ｃｏｆｉＤＮＡを添加する以外第１と同様であ
った。両方のＤＮＡは使用直前５００ｂｐ以下まで超音
波処理し、１０分間煮沸し、速やかに冷却した。フィル
ターはこの溶液中で３７℃で２・１／２時間プレハイブ
リダイズした。

プローブは６．２４μ角のＣ０Ｄ４５０（１，５７０Ｄ
／ｍ２）を８０μ文反応液中３７７１１１の”Ｐ−ＡＴ
Ｐ　（７０００Ｃｉ／ｍＭｏ１ｅ）を使用して２０ユニ
ツトのＢＭＢキナーゼと混合してキナーゼ処理した。

キナーゼ処理したプローブ、Ｃ０Ｄ４５０を３０ｍ２の
プレハイブリダイゼーション溶液に添加した。バッグか
らプレハイブリダイゼーション溶液を排出し、ハイブリ
ダイゼーション溶液を含むプローブを添加した。これを
３７℃で一晩（１６時間）インキュベートした。

次いで、フィルターを１リツトルの６ＸＳＳＣ中、室温
で４×５分洗浄し、次いで３Ｍ塩化テトラメチルアンモ
ニウム、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（１２（ｐＨ８，０）、
２ｍＭＥＤＴＡ、１　ｍｇ／ｍｕｓＤｓを含む溶液（Ｔ
ＭＡＣ）（ＤＮＡ、８２．１５８５〜ｆ　５８８）１０
０ｍＪ２中、室温で４×５分洗浄した。次いでフィルタ
ーを４００ｍｆｌのＴＭＡＣ中、５５℃で５分間洗浄し
た。次いでフィルターをプラスチック製ラップで包み（
最初の乾燥をしないで）、−８ｏ℃で２倍増強スクリー
ンと共にコダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ５フィルムに１
〜１／２時間露出した。

オートラジオグラフの分析により、２つのＤＮＡ断片が
Ｃ０Ｄ４５０にハイブリダイズし、それらの大きさは３
２００及び２３００ｂｐであることが示された。

５ｏｕｔｈｅ　ｒｎ　　プロットをプラスチック製ラッ
プから除き、４００ｍｕのＴＭＡＣ中で１回、６０℃で
５分間洗浄した。次いでこれを上述のようにＸＡＲ５フ
ィルムに再露出し、オートラジオグラフはＣ０Ｄ４５０
は３２００及び２３００ｂｐのＤＮＡ断片のいずれも溶
出したことを示した。

攬虹旦上通畳１１１４５．６μｇのＴ、ｈｙｏ、Ｂ２０４株のゲノムＤＮ
ＡをＨｉ　ｎｄＩＩＩ　（ＢＭＢ）で消化した。このＤ
ＮＡの８０μｇを３％アクリルアミドゲルで電気泳動を
行った。ＨｉｎｄＩ］Ｉで消化したラムダＤＮＡをサイ
ズマーカーとして使用し、２Ｋｂと３．５Ｋｂの間にあ
るＡ装用Ｔ、ｈｙｏ、消化物中のすべてをゲルから０．
　５ｃｌＩ＋スライスとして切り出した。この結果、各
々が異なる大きさ等級のＨｉｎｄｍ断片を含む全部で７
つのゲルスライスが得られた。各々のサイズ画分を電気
溶離し、フェノール抽出し、エタノール沈澱し、５０μ
文の水に再懸濁した。

各両分の５μｋを２００μ角の１０ｍＭＴｒｉ　５−Ｈ
Ｃｌ２　（ｐＨ７，４）と２０μｍの３ＭＮａＯＨに混
合し、６５℃で３０分間インキュベートした。次いで試
料を１５分間かけて室温まで冷却し、２００μにの２　
Ｍ　Ｎ　Ｈ４０Ａ　ｃを添加した。次いでこれらの試料
をシエライヒヤー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）とシュエル
（Ｓｃｈ−ｕｅｌｌ）が定めた装置とプロトコルを使用
し、ニトロセルロース上にスロットプロット（ｓｌｏｔ
　　ｂｌｏｔ）した。次いでスロットプロットしたフィ
ルターを６ｘＮＥＴ中で再びぬらし、プラスチック製バ
ッグに入れた。

Ｅ、ｃｏｌｉのｔＲＮＡを除く以外前回と同様に調製し
た５ｍＩＬのブレハイブリダイゼーション溶液を添加し
た。フィルターを３７°で５時間インキュベートした。

更にＣ０Ｄ４５０を上述のようにキナーゼ処理した。ス
ロットプロットしたフィルターを５ｏｕｔｈｅｒｎ　　
プロットについて上で述べたのと同じ方法でハイブリダ
イズし、洗浄し、フィルムに露出した。

オートラジオグラフの試験は、画分５が最も強いハイブ
リダイゼーションのシグナルを与えることを示した。画
分５ＤＮＡの試料はアガロースゲル上で約２３００〜２
７００ｂｐにサイズ分類された。画分５をクローニング
する両分として選んだ。

０．０３５μｇの画分５ＤＮＡを０．０１７μｇの）Ｉ
ｉｎｄｍ消化ｐＵＣ９と連結し、ＤＨ５取込み細胞（Ｂ
ＲＬ）に形質転換した。形質転換試料を５０μｇ　／　
ｍ　ＩｔのＸ−ｇａｊ２を含む平板上に平板培養した０
発生する２０６個の白色コロニーをすべて培養し、ミニ
選別を行った。

すべての２０６個のミニ選別の試料をＨｉｎｄｍで消化
し、上述のスロットプロット分析によりＣ０Ｄ４５０と
ハイブリダイズした。２つの陽性のクローンが確認され
、ｐＴｒｅｐ２及びｐＴｒｅｐ３と命名した。

ρＴｒｅｐ２からのプラスミドＤＮＡを３０の異なる制
限酵素で消化して制限マツプを作成した。消化物はＣ０
Ｄ４５０に対する５ｏｕｔｈ−ｅｒｎ　　ブロッティン
グにより分析した。得られた制限マツプを第１図に示す
。

Ｅ、ｃｏｌｉにお　　３８ｋＤａ　　　の３８ｋＤａ抗
原はベクターｐＷＨＡ９３を使用してプロキモシンとの
融合体として発現させることにした。

最初にｐＴｒｅｐ２のＨｉｎｄｎｌ挿入部位を利用可能
な制限部位として最良に使用できるように変換する必要
があった。ｐＴｒｅｐ２をＨｉｎｄｍで消化し、連結し
、Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ　ＪＭ８３株中で形質転換し、又ク
ローンｐＴｒｅｐ７はＨｉ　ｎｄＩＩ［断片上にｐＴｒ
ｅｐ２から逆方向で３８Ｋｄ遺伝子を持つことが確認さ
れた。

１　ｓμｇのｐＴｒｅｐ７をＮｄｅ　Ｉで消化し、２塩
基のＮｄｅ　Ｉオーバーハングを埋めるためＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＢＲＬ）で処理した。

ＤＮＡはＨｉ　ｎｄＩ［Ｉで消化するためフェノール抽
出し、エタノール沈澱し、適当な＆ｌｌ液液再懸濁した
。Ｈｉｎｃｌ［［で消化後、ＤＮＡを５％アクリルアミ
ドゲルで電気泳動を行った。１９００ｂρのＨｉ　ｎｃ
ｌＩＩ−Ｎｄｅ　Ｉ断片をゲルから切り出し、電気溶離
した。

発現用ベクターｐＷＨＡ９３をＨｉｎｄｍとＨｉｎｃＩ
Ｉて消化し、これをゲル上を移動させて３８７０ｂｐ断
片を電気溶離した。クッシュナー・ｊ−ス・アール（Ｋ
ｕｓｈｎｅｒ、Ｓ、Ｒ，）著、「ジェネティック・エン
ジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ）」（１９７８年、エルゼビア／ノース・ホーラン
ド・バイオメディカル・プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎ
ｏｒｔｈ　　Ｈｏ１ｌａｎｄ　　ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ
　　Ｐｒｅｓｓ）刊）、１７〜２３ベージの記述により
、Ｔ、ｈｙｏ、断片とｐＷＨＡ９３ヘクターを連結し、
ＪＭ８３株中で形質転換した。

この形質転換からｐＴｒｅｐ９がミニ選別分析により確
認された。このプラスミドの配列を測定し、３８ｋＤａ
開口読取り機構が同一相でプロキモシンの開口読取り機
構の下流に置かれる正しい融合を持つことが認められた
。

ｐＴｒｅｐ９の生産の順序は第２図に図式的に示されて
いる。

蛋白質の発現と回収は、後述のように３９ｋＤａ抗原に
ついて実行した〈実施例２）。

Ｅ、ｃｏｌｉにおいて、ｐＴｒｅｐ９は７３ｋＤａのプ
ロキモシン融合ポリペプチドの合成を指導することがｗ
４察されたが、このポリペプチドにおいて３２ｋＤａは
プロキモシンより大きい。

配列分析によると、３８ｋｄ抗原遺伝子の開口読取り機
構は３２ｋＤａのポリペプチドをコード化しているよう
に見える。

この融合蛋白質は、ウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ　　ｂ　１　ｏ　ｔ）でブタ赤痢から回収したブタ血
清又はＮ製した３８ｋＤａＴ、ｈｙｏ、蛋白質で超免疫
したマウス血清と反応させた場合、標準のＴ、ｈｙｏ、
３８ｋＤａ蛋白質と同等の免疫反応性を示した。

ＷＨＡ９３のふ− ｐＷＨＡ９３を一連の方法で組み立てた。プロキそシン
の全コード化配列を含むプラスミドｐＷＨＡ３１　Ｂ　
（ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、）（１９８６年）、２巻、１７７〜１９０ペ
ージ）を制限エンドヌクレアーゼＢｅ１ｌで消化した。

プロキモシン遺伝子停止コドンであるＴＧＡはＢａｎ制
限エンドヌクレアーゼ部位のメクレオチド配列、ＴＧＡ
ＴＣＡの中に含まれる。次いでムング・ビーン・ヌクレ
アーゼ（ｍｕｎｇ　　ｂｅａｎｎｕｃｌｅａｓｅ）にュ
ー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用してＢｃＩＩによ
って作られた末端を平滑にした。この段階の次にＥｃｏ
ＲＩで消化した。

次いでカルボキシ末端の２０５のアミノ酸をコード化す
る配列を含む６１８の塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片を単
離した。

ｐＵｃ１８（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　　Ｂｉ。

ｌ　ａｂｓ）を制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩで消化
し、ムング・ビーン・ヌクレアーゼで処理し、ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、２６７４ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。こ
の断片はベータラクタマーゼ選択可能マーカー（Ａｍｐ
’遺伝子）、ａＩ製起点、ラクトースオペロン（１ａｃ
）プロモーター、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、
ＸｂａＩ、５ａｌＩ、Ｐｓｔｌ、５ｐｈＩ、及びＨｉ　
ｎｄＩ［Ｉのポリリンカー含有部位、及びベータガラク
トシダーゼのアミン末端の８２のアミノ酸をコート化す
る配列を含む。

２６７４ｂｐのＤＮＡ断片を６１８ｂｐのＤＮＡ断片に
連結してｐＭＨ２２を形成した。プラスミドはポリリン
カーの一端に融合したプロキモシンのカルボキシ末端の
コード化配列を含み、一方位端はベータガラクトシダー
ゼのアミノ末端のコード化配列と融合している。プロキ
モシン停止コドン、ＴＧＡはムング・ビーン・ヌクレア
ーゼによって破壊され、２つのコード化配列は同じ翻訳
読み取り機構の中にある。

ｐＷＨＡ４３　　（Ｊ、Ｂｉ　ｏｔｅｃｈ、）（１９８
６年）、２＠、１７７〜１９０ページ）もｐＷＨＡ９３
を組み立てるのに使用した。このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、ムング・ビーン・ヌクレアーゼで処理し、
制限エンドヌクレアーゼＨｉ　ｎｄＩ［Ｉで消化した。

プロキモシン、Ａｍｐ’遺伝子、複製起点、及びＩａｃ
プロモーターのコード化配列のすべてを含む３６５４ｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離した。

ρＤＲ５４０（ビー・エル・バイオケミカルス（Ｐ−Ｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩで消化し、ムング・ビーン・ヌクレア
ーゼでＩＡ理し、Ｈｉ　ｎｄＩＩＩで消化した。Ｔａｃ
プロモーターを含む９２ｂＰのＤＮＡ断片を単離し、３
６５４ｂＰのＤＮＡ断片と連結してｐＷＨＡ４９を組み
立てた。このプラスミドは２つのＬａｃとＴａｃプロモ
ーターで制御されるプロキそシンの全コード化配列を持
っていた。

ρＷＨＡ４９を制限エンドメクレアーゼＮａｒＩとＥｃ
ｏＲＩで消化した。プロキモシンのアミン末端の１６０
のアミノ酸、Ｌａｃ及びＴａｃプロモーター、Ａｍｐ’
遺伝子、及び複製起点のコード化配列を含む３０４９ｂ
ｐのＤ’ＮＡ断片を単離した。

ｐＭＨ２２をＮａｒＩと）：ｃｏＲＩで消化し、プロキ
モシンのカルボキシ末端の２０５のアミノ酸のコード化
配列、ポリリンカー及びベータガラクトシダーゼのアミ
ノ末端の５２のアミノ酸のコード化配列を含む２００ｂ
ρのＤＮＡ断片を単離した。この２００ｂｐのＤＮＡ断
片を３０４９ｂｐのＤＮＡ断片と連結して、ｐＷＨＡ９
３を組み立て、このものはＩａｃとｔａｃプロモーター
に制御され、同時に融合した全プロキモシンコード化配
列、ポリリンカー、及びアミノ末端の８２のアミノ酸の
コード化配列を含んでいた。ｔａｃプロモーターは部位
特異的Ｍ換えの際ｐＷＨＡ９３から除かれ、完全なｌａ
ｃプロモーターが残ることが後に発見された。

実施例２　工生ｉ且！曵五羞発酵と蛋白質精製は実施例１のように達成した。

第二次尿素抽出液の遠心分離により得られる不溶性物質
は３９ｋＤａの単一の主要蛋白質成分を含む。この不溶
性蛋白質を３％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、及び７０ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ２　（ｐｉ（６，８）中で煮沸することにより可溶
化した。この溶液をセファ０−ス（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ
）６Ｂ（バイオラド（Ｂｉｏ　　Ｒａｄ）（リッチモン
ド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア）から入手）
の３０ｃｍのカラム上のゲル濾過クロマトグラフにかけ
た。３９ｋＤａのピークをカラム溶離液画分のゲル電気
泳動により確認し、適当な画分をプールし、蛋白質をア
セトンで沈澱させて濃縮し、遠心分離により集めた。ベ
レットを１、ｔ％ＳＤＳに溶解し、次いで残留ＳＤＳを
除くためクロロホルム／メタノールで処理した。

上で調製した３９ｋＤａ蛋白質のアミノ末端のアミノ酸
配列を自動化されたアプライド・バイオシステムス気相
配列測定装置中で連続的エドマン分解法を用いて求めた
。このようにして求めた蛋白質の最初の４１のアミノ酸
の実態を下に示す。

１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１０ＭｅＬ−Ｔｙｒ−ＧＩｙ−Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−０Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈ４ｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｐ
ｈｅ−＾ｒｇ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−＾ｓｎ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−１１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−？−？−八
ｒｇへオリゴヌクレオ　ド・プローブの一組のＤＮＡプローブを上に示したアミノ酸配列データ
を用いて合成した。それらの各々は下に示すような標的
領域のアミノ酸配列をコード化できるヌクレチドのすへ
ての可能な組合せを含むデジェネレート配列のプールか
ら成る。各プローブは長さが１７ヌクレオチドである。

Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ−Ａｒｇ−＾５ｐＡＴ
Ｇ−Ｔ八Ｔ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−＾ＧＴ−Ｇ＾ｃｃｃ＾　　　　　　＾Ｇプローブ名−ＣＯＤ５５デジエネラシー２１２８層　（１２８の組合せの混合）０Ｔｒｐ−＋１ｅ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　　
プローブ名−［：ＯＤ　５５３ＴＧＧ−ＡＴＴ−ＧＡＴ
−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＡＣｃｃｃＡ　　　　　　　　　＾Ｇ　　　デジエネラシーＩｌｌ　　　　　　　　　　　＝９６層１１ｉｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ　　プローブ名−
ＣＯＤ　５５６ＣＡＴ−ＧＧＴ−ＡＡＴ−ＣＡ＾−ＴＴ
Ｔ−八ＧＣＧ　　ＣＧ　　にＣデジエネラシーＡ　　　　　　　　　　＝１２８層Ｔ、ｈｏ、ＤＮＡのゲノム−イブ−１−の　立て４８μｇのＴ、ｈｙｏ、ｂ２０４株のゲノムＤＮＡを６
単位のＡ］ｕＩで消化した。酵素を添加する前、溶液を
３７℃で１０分間インキュヘートした。反応条件はＢＲ
Ｌによって規定されているそれであり、全量は４８０μ
℃であった。酵素添加後反応物を３７℃にインキュベー
トした。酵素添加後１５秒、２分１１秒、４分８秒、６
分４秒、８分にそれぞれ９６μ角の試料を除いた。各試
料を直ちに９６μ角のフェノール−ＣＨＣＩｔ。

と混合し、４μｋをアガロースゲル上を移動させた。Ｕ
Ｖ先光下消化されたＤＮＡを視覚化させると、反応は以
前の分析用消化で予測された限りでは反応が進行してい
ることが示された。残りの水相を合併して４６０μｍの
溶液を得、これをフェノール−ＣＨＣ１１３で抽出し、
クロロホルムで再抽出し、ＤＮＡを酢酸アンモニウム／
ＥｔＯＨで沈澱させた。次いでＤＮＡを２００μｇ　／
　ｍ　ｊ！の濃度で再懸濁した。

見、ユ之に貞迦リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカ−１５’　　ｐｄ［Ｇ
ＧＡＡＴＴＣＣ］　３’　をファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃ　ｉａ）社から入手し、Ｈ，Ｏ中に１　ｍ　ｇ　／
　ｍ　ＩＬに希釈した。０．２μｇのリンカ−を標準方
法により、”Ｐ−ＡＴＰを用いて酵素的にキナーゼ処理
した。

キナーゼ処理に続いて、この反応物を９０”Ｃで１０分
間インキュベートし、回転真空蒸発器中でで蒸発して乾
燥し、２０μ文の１ｍｇ／ｍ角の非放射能付線リン酸化
ＥｃｏＲＩリンカ−に再懸濁した。

次いで、ＥｃｏＲＩリンカ−混合物をＡｌｕｌで一部分
消化したＴ、ｈｙｏ、ＤＮＡ　（上述の）に、５０単位
／　ｍ　１の濃度のＢＭＢリガーゼを使用し、１００μ
ｚ　／　ｍ　Ｘのリンカ−濃度と１３３μｇ／ｍｊ１の
Ｔ、ｈｙｏ、ＤＮＡ濃度で連結した。反応物の全量は１
５０μぶであった。連結は室温で一晩（１６時間）イン
キュベートし、次いで１単位／μ角のりガーゼの３μ角
を添加して反応を促進した。これを室温で２時間インキ
ュベートした。更に５μ角の新鮮な１０ｍＭのｒＡＴＰ
と３μｍのリガーゼを添加して再び反応を促進し、室温
で２時間インキュベートした。次いで、リガーゼを加熱
して不活性化した。これに続いて、連結反応混合物をＥ
ｃｏＲＩ５００’ｌＬ位／　ｍ　Ｉｔで３７℃で２時間
消化した（この場合、Ｔ、ｈｙｏ、ＤＮＡはＥｃｏＲＩ
消化に対して耐性であり、これはＥｃｏＲ１部位がメチ
ル化されているからであろう）。次いで反応物をフェノ
ール抽出し、エタノールで沈澱した。沈澱したＤＮＡを
を１００μ角のＨ２Ｏに再懸濁した。

ＤＮＡを、０．３ＭＮａＣＪＺ、０．０５ＭＴｒ　ｉ　
５Ｈｃｌ　（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡ。

０．０６％ナトリウム・アジドをカラム用Ｍ衝液として
使用するＳ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で
分画した。８０個の１００μぶ：ｉ、）−７を集め、シ
ンチレーションカウンターで計数した。最初のピークは
画分２１〜３３（Ｔ、ｈｙｏ、ＤＮＡ）に銭察され、第
２のピークは両分３８〜８０（遊離のリンカ−及び遊離
のＡＴＰ）に認められた。画分２！〜３３をプールし、
エタノールで沈澱した。ＤＮＡを４０．３５μ見のＨ２
Ｏに再懸濁し、濃度を２００μｇ／ｍｆｌとした。

脱リン酸したラムダｇｔ１１ＥｃｏＲＩ処理物をプロメ
ガ・バイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）から５
００μｇ／ｍｊ２の濃度で入手した。Ｔ、ｈｙｏ、ＤＮ
Ａを、全量６．２５μｓ中８０　μｇ　／　ｍ　Ｉｔの
Ｔ、ｈｙｏ、ＤＮＡｆｉ度と２００μｇ／ｍｕのラムダ
ｇｔｌｌ濃度で、ＢＭＢリガーゼを１００単位／　ｍ　
Ｉｔの濃度で使用してラムダに連結した。連結は室温で
２時間インキュベートした。次いで、連結反応液の４μ
互をストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（サン・デ
イエゴ（Ｓａｎ　　Ｄ　ｉ　ｅｇｏ）、カリホルニア）
から入手したインビトロパッケージ用キット、ｒギガパ
ック（Ｇｉ　ｇａｐａｃｋ）Ｊを使用してラムダ・バク
テリオファージに封入した。次いで、ファージ量をＥ、
ｃｏｌ　１Ｙ１０９０７株（Ｐｒｏｍｅｇａ　　Ｂｉｏ
ｔｅｃ）の定常ファージ培養により測定した。青色（組
換え体）と白色（非組換え体）のプラーク数を計数し、
元のファージ保存培養には０．５ｍｆｆ１の全量中に１
．４Ｘ１０’　ｐｆｕ／ｍ角含まれていることが示され
た（その内、９１％は組換え体であった）。遺伝子ライ
ブラリーは１２の無作為に選別した白色プラークをミニ
選別することにより特徴付けられた（ヘルムス・シー（
Ｈｅｌｍｓ、Ｃ）外、ＤＮＡ（１９８５年）、５巻、３
９〜４９ページ）。すべての１２株は挿入部を持ち、平
均の挿入部の大きさは１３２５ｂＰであった。

えフ　−ジの３９に遺伝子の混合したオリゴヌクレオチドの選別を行
う場合、次の方法を使用した。

１、ラムダｇｔｌｌ（一部分Ａ１ｕＩ）ライブラリーを
使用した。１５ｍａ＋のベトリ皿当り約１０．０００の
プラークをＹｌ　０９０γ細胞上に平板培養した。６枚
を使用し、各平板当り４枚のニトロセルロースフィルタ
ーを引き上げた（ダブリュー・デイ−・ベントン（Ｗ、
Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ）及びアール・ダブリュー・デービス
（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉ　ｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）（１９７７年）、１９６巻、１８０ページに記述の
方法）。

２、混合したオリゴヌクレオチド・プローブを４〜１ｌ
Ｏｘ１０５ｃｐ／ｎｇの比活性までキナーゼ処理した。

各プローブで２枚のフィルターをハイブリダイズし、各
フィルターは約１０’ｃｐｍ（１〜２プローブ／フイル
ター）のプローブ結合がなされた。

３、ハイブリダイゼーション溶液は５ｘＤｅｎｈａｒｔｓ。

０．１μｍ　　ｒＡＴＰ。

２５０μｇ／ｍＩｔ　Ｅ、ｃｏｌｉｔＲＮＡ、６ｘＮＥ
Ｔ（１ｘＮＥＴ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣ１，１５ｍＭ　
　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩＬ　（ｐＨ７，５）１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ）、０．５％　ＮＰ４０゜１ｍＭ　　ビロリン酸ナトリウム、から成る。

４、フィルター（上の１におけるような）はハイブリダ
イゼーションに先立ち、１．５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩｔ　（ｐ）１８）、
ＩＭＮａＣｊ２．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＯ５から
成る溶液中で３７℃２時間予備洗浄し、２、ハイブリダ
イゼーション緩衝液（上の３におＣするような）中、３
７℃で２時間ブレハイブソダイゼーションすることにより予備処理を行った。

５、−晩３７℃でハイブリダイゼーションした。

６、フィルターを６ｘＮＥＴ、０．１％５ＤＳ（洗浄１
回当たり２Ｌ）中、室温で２回洗浄しく１回当たり２０
分）、６ｘＮＥＴ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２回洗
浄しく１回当り２０分〉、５ＸＮＥＴ中、３７℃で１回
洗浄した（１回当りの２０分）。

７、次いでフィルターを風乾し、裏部材にテープで止め
、ＫｏｄａｋＸＡＲ５エックス線用フィルムに２倍増感
スクリーンを使用して露出した。

８、両方のプローブとハイブリダイゼーションしたこと
を示す適当なプラークを選択し９、両方のオリゴヌクレ
オチド・プローブで再選別を行つた。

９、プラーク純化の手順を３回繰返した後、ファージ３
−５ＣＩをプロトタイプ３９に組換えファージとして選
んだ。

１０、プローブとゲノムＴ、ｈｙｏ、ＤＮＡ。

ファージＤＮＡ、及び／又はプラスミドＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーションは５ｏｕｔｈｅｒｎの方法（ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｆ、）（１９７５年）、９４巻、２０３ベージ
）により行った。

１１．７７−ジＤＮＡをシー・ヘルムス（Ｃ。

Ｈｅ１ｍ５）等の方法（ＤＮＡ　（１９８５年）、４８
．３９〜４９ページ）により単離した。このＤＮＡはＥ
ｃｏＲｌによる消化により試験した結果、オリゴヌクレ
オチド５５３及び５５５とハイブリダイズし、従って３
９ｋＤａのトレボネマ抗原をコード化している所望のＴ
、ｈｙｏ、を含む１．６Ｋｂの挿入部を含むことを認め
た。

３９ｋＤａ　　　　　　　の　ブローニングと１．ファ
ージ３−５Ｃ１のＥｃｏＲＩで切断した１、６ｋｂのＤ
ＮＡ断片をアクリルアミドゲルの電気溶離により単離し
、ＥｃｏＲＩによる消化により直線化したプラスミドｐ
Ｕｃ１９に連結した。これらのＤＮＡは共に連結してＥ
、ｃｏｌｉ中に形質転換し、組換えプラスミドｐＴＲＦ
Ｐ１０６（第８図）を含むクローンをプラスミドＤＮＡ
の分析又は制限消化により確認した。

２、プラスミドｐＴＲＥＰは３８Ｓ−メチオニンを含む
インビトロで結合した転写翻訳系における直接蛋白質合
成に使用し、この系の蛋白質生成物のＳＤＳゲル電気泳
動は３９ｋＤａにＴ、ｈｙｏ、ＤＮＡ挿入部を欠く親プ
ラスミドには見られない種類の蛋白質の存在を示した。

このことはクローン化したＤＮＡはＴ、ｈｙｏ。

３９ｋＤａ抗原の完全なコード化配列を含み、Ｅ、ｃｏ
ｌｉはトレボネマプロモーターとリポソーム結合部位を
認識し、この外来蛋白質の合成をｔ＃’ｌすることがで
きることを示唆している。

３、プラスミドｐＴｒｅｐ１０６で形質転換したＥ、ｃ
ｏｌｉ株は著量の所望の３９ｋＤａＴ、ｈｙｏ、抗原を
生産しない。このため、高水準の組換え抗原の発現を許
容するプラスミド構成を次のようにして作った。ｐＴｒ
ｅｐ１０６のＥｃｏＲＩで切断した１、６Ｋｂの断片を
、ＥｃｏＲＩによる消化により直線化したプラスミドｐ
Ｕｃ１Ｂに連結した。次いで生成するブラミスドｐＴｒ
ｅｐＨ２をＰｓｔＩとＢａｍＩで切断し、次いでエキソ
ヌクレアーゼ■で処理して３９ｋＤａのＴ、ｈｙｏ、抗
原の予言されたＡＴＧ開始コドンの上流にある非コード
化ＤＮＡ配列を除去したく単一方向の方法で）。消化中
種々な時間にＤＮＡ試料を除き、フェノール抽出により
エキソｍを不活性化し、残るＤＮＡをヌクレアーゼＳ１
で消化して平滑末端とし、次いでこのＤＮＡを再連結し
てＥ、ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。１９の
そのような新しいクローンｐＴｒｅｐＨ２−１のプラス
ミドＤＮＡのヌクレオチド配列を測定した結果、成熟し
たＴ、ｈｙｏ、３９ｋＤａ蛋白質をコード化する３７２
コドンとシグナル配列からの７つのアミノ酸が隣接して
配列し、これが親のｐＵｃ１ＢプラスミドのＨｉ　ｎｄ
１１１部位の下流に融合していることが認められた。こ
の融合は融合蛋白質をコード化する読取り機構の中でな
されており、前記融合蛋白質の発現はクローン化された
断片の方向付けがｐＵＣ９へのクローン化の際Ｈｉｎｄ
ｌ１１部位からＥｃｏＲ１部位に変換された後このｌａ
ｃプロモーターにより制御されるであろう。

生成するプラスミド丁ｒｅｐ３０１　（第７図及び第８
図）で形質転換したＥ、ｃｏｌｉはイムノプロット及び
平板ＥＬＩＳＡ検定の両方でブタ血清（ブタ赤痢及びＴ
、ｈｙｏ、かう生成した３９ｋＤａｆｉ白質で免疫した
動物から回収されるそれらの両方）と反応する不溶性４
０ｋＤａ抗原を生産した。

３９ｋＤａ　　　　の　　　え　　能のプラスミドｐＴ
ｒｅｐ３０１を含むＥ、ｃｏｌｉＪＭ８３株を、アンピ
シリン２ｏｏμｇ／ｍＩＬを含む２５０ｍ１！のルリア
肉汁（Ｌｕ　ｒ　ｉ　ａｂｒｏｔｈ）中で増殖させた。

培養は３２〜３７℃で１８時間増殖させた。細胞を遠心
分離により回収し、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｆｌのリゾチ
ームを含む２５ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭＥＤＴＡから成
る緩衝液（ｐ）１８．０）の当初液量の１／２０量に再
懸濁した。室温で３０分間インキュベートして細胞を溶
解し、次いで超音波処理により更に細胞を破壊した。非
イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎｘ−ｔｏｏを２％の最
終濃度となるように添加し、細胞溶解液を室温で１時間
混合し、次いで１０、ＯＯＯ’Ｘｇで遠心分離した。こ
れらの段階の後不溶性ベレット画分を貯蔵した。この画
分の主要蛋白質成分は試料をＳＤＳゲル電気電気泳動フ
コマッシブルー（Ｃｏｍｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅｌ）　１
１１　ｅ　）で染色することにより判定した結果、約４
０ｋＤａの分子量を持っていた。この同じ蛋白質成分は
Ｗ　ｅ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ　ｎプロット分析においてＵＰ
Ｚ画分より得られた標準の３９ｋＤａＴ、ｈｙｏ、蛋白
質に対して生成したブタとマウスの抗血清により認識さ
れた。又、この組換え蛋白質は天然のブタ赤痢から回収
したブタ血清をプローブとしたイムノプロット分析にお
いても認識された。

この実施例で得られる３９ｋＤａの組換え抗血清はＴ、
ｈｙｏ、のＵＰ２Ｐ２Ｏ３９ｋＤａ抗原と極めて類似す
るが同一ではない。しかしながら、それらは単一の血清
により認識される共通のエピトーブを持つ。

実施例３　６０に旦１益源実施例１に記述したように細胞を増殖させ、回収し、初
期の処理を行った。

界面活性剤で可溶化したプールを１００，０００Ｘｇで
９０分間遠心分離し、上澄液画分をＤＥＡＥ−３ｅｐｈ
ａｃｅ　１イオン交換クロマトグラフ用樹脂のカラムに
かけた。この蛋白質はカラムに結合し、過剰のＴｗｅａ
ｎ−２０界面活性剤を２　ｊｒ＋ｔＭＴ　ｒ　ｉ　ｓｏ
ｌ衝液（ｐＨ６，８）、０．１％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ、１０
ｍＭＮａＣｕから成る溶液で洗い去った。次いで蛋白質
をＴｒｉｓ／Ｔｗｅ　ｅ　ｎ１Ｊｉ街液中ＩＭＮａＣｊ
２で速やかに溶離した。蛋白質ピークを集め、低塩緩衝
液に対して透析し、次いでＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
上で再クロマトグラフした。今回は、蛋白質Ｔｒｉｓ−
Ｔｗｅｅｎ緩衝液中１０ｍＭ〜３００ｍＭＮ　ａ　Ｃ角
とＯ〜２％ツウィッタージェント（Ｚｗｉ　ｔｔｅｒｇ
ｅｎｔ）３−１２　（カルービオケム（ＣａＩｔ−Ｂｉ
　ｏｃｈｅｍ））の２成分リニアーグラジェントにより
溶離した。試料をＳＤＳゲル電気泳動により分析し、６
０ｋＤａ蛋白質を含む両分をプールした。蛋白質を９倍
量の冷アセトンで沈澱し、遠心分離により集め、１％Ｓ
ＤＳ、２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐｉ−１６，８）中１
４ｍＭ２−メルカプトエタノール、５ｍＭＥＤＴＡから
成る溶液中で煮沸して可溶化した。次いで可溶性蛋白質
を５ｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂカラム上の分子ふるいクロマ
トグラフにより分画した。６０ｋＤａ抗原を含む画分を
プールし、アセトン沈澱により濃縮し、１％ＳＯ５中２
５０μｇ　／　ｍ　Ｉｔの濃度とした。この標品中には
分子量の差異は極めて僅かであり（２０００以下）、そ
れらのすべてはブタ赤痢から回収したブタ血清と反応す
る３つの蛋白質の一組が存在することに注意すべきであ
る。

マ　スと　　ギの　＃に褐色ＣＢＳ−ＦＩマウスを上記の６０ｋＤａ抗原プール
の１２μｇで免疫したこの蛋白質を１００μにの水で希
釈し、十分に混合したフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完
全アジュバントの１００μ尼と混合し腹腔内に注射した
。血清を採取し、６０ｋＤａ抗原に対する特異性を証明
するためイムノプロット分析に使用した。ニューシーラ
ント（Ｎｅｗ　　Ｚｅａｌａｎｄ）白色ウサギに３週間
間隔でＦｒｅｕｎｄの完全と次に不完全アジュバントと
共に２５μｇの６０ｋＤａ抗原を２回接種した。ウサギ
から採取した血清もイムノプロット分析に使用した。

ゲノム−ブラリーの　立てゲノムライブラリーは実施例２におけるのと同様に組立
てた。

Ｔ、ｈｙｏ、ゲノムライブラリーを持つバクテリオファ
ージラムダｇｔｌｌの試料を混合した上層寒天にＥ、ｃ
ｏｌ　１ＬＥ３９２株を含む１組の寒天平板を作成した
。ファージプラークをニトロセルロースに移し、次いで
０．０５％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ−２０を含むリン酸Ｈａ液化
食塩水（ＰＢＳＴ）の１０００に対してマウス６０−２
血清の１を希釈した溶液と反応させた。次いでフィルタ
ーを第一抗体緩衝液（１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ
７，２）、０．９％ＮａＣＩＬ、０．５％ナトリウム・
アジド、及び３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ
）で洗浄し、次に　１２５１　（アマ−ジャム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ））でラベルしたヨウ素化ヒッジ抗マウス第
二抗体と反応させた。フィルターを第二抗体１衝液（上
記のＴｒｉｓ緩衝液化食枯水、アジド無添加及びＢＳＡ
の代りに１％ゼララン）中で洗浄し、次いでＫｏｄａｋ
Ｘ線用フィノ【ムに対して置き、陽性クローン（６０ｋ
Ｄａ抗店に対するマウス血清により認識される蛋白質を
４産したファージプラーク）は露光したスポットとして
観察された。次いでフィルムスポットを元ｅ寒天平板に
合わせて前記クローンのファージをＶ関し、２回以上再
培養（プラーク純化）して純粕なりローン化ファージ保
存培養を得た。次いで祠化した組換えファージをＥ、ｃ
ｏｌｊ上Ｃ再度斗板培養し、プラークをマウス６０−２
血清とウサギ抗６０ｋＤａ血清の両方に対して再度試験
した。両血清はパーオキシダーゼ連結第二抗体と色素生
成反応（ベクター・ラプス（Ｖｅｃｔｏｒｌ、ａｂｓ）
から入手した試薬）を使用するイムノプロット反応で強
い陽性反応を示した。

次いでファージをＥ、ｃｏｌ　１Ｙ−１０８９株中で溶
原化し、この組換え株の細胞溶解液をゲル電気泳動と引
き続くニトロセルロースへの移転（Ｗｅｓｔｅｒｎプロ
ット）により分析した。マウス６０−２血清との反応は
、Ｔ、ｈｙｏ、遺伝子の一部分のコード化配列がラムダ
ファージベクター中に存在するガラクトシダーゼ遺伝子
のそれと融合していることを期待するように、Ｅ、ｃｏ
ｌｉのベータガラクトシダーゼ（１２゜ｋＤａ）の大き
ざの位置に免疫反応的バンドを示した。

組換えクローンのＤＮＡを得るためファージ溶菌液を調
製し、２ｋｂｐのＥｃｏＲｒ断片を単離し、プラスセド
ベクターＰυＣ１９中に再クローン化してプラスミドｐ
Ｔｒｅｐｌｏ１を得た。プラスミドＤＮＡを標準方法に
より調製し、クローン化した部分の末端領域のヌクレオ
チド配列を測定した。ＥｃｏＲ１部位を横断してＴ、ｈ
ｙｏ。

ＤＮＡ断片に延びる開口読み取り機構がファージベクタ
ーのガラクトシダーゼのそれと調和していることが認め
られ、又、Ｔ、ｈｙｏ、ＤＮＡのＡ１ｕＩ部位に付着し
ているＥｃｏＲＩリンカ−の存在も示された（ゲノムラ
イブラリーの調製法と一政）。このＴ、ｈｙｏ、ＤＮＡ
の開口読取り機構は１０ｋＤａのペプチドをコード化し
、ＴＧＡ停止コドンで終っており、これは”ｒ、ｈｙＯ
ｌの６０ｋＤａ蛋白質のＣ末端部分のように思われる。

特異なＨｉｎｄＤ１部位がクローン化した部分のＥｃｏ
Ｒ１部位から４１ｂｐＴ流に認められた。

プラスミドｐＴｒｅｐｌｏ１をＨｉｎｄｍで消化すると
１７００ｂｐの断片が遊着し、次にこれを発現用プラス
ミドｐＷＨＡ９３の特異なＨｉｎｄ■部位にクローン化
してＴ、ｈｙｏ、の開口読取り機構をｐＷＨＡ９３ベク
ター中のプロキモシンのそれに融合させた。ここで生成
するプラスミドｐＴｒｅｐ１０３　（第４図）はＥ、ｃ
ｏｌｉ中で大和の不溶性蛋白質の合成を指導し、前記不
溶性蛋白質はＴ、ｈｙｏ、蛋白質部分に融合したプロキ
モシンを含むことが認められた。蛋白質の発現と回収は
３９ｋＤａ蛋白質に関して記述したように行った。この
蛋白質は５０ｋＤａ　（４０ｋＤａプロキモシン＋１ｏ
ｋＤａＴ、ｈｙｏ、蛋白質部分）であることがゲル電気
泳動によって示された。この不溶性蛋白質はイムノプロ
ットにおいてＴ、ｈｙｏ、から精製した６０ｋＤａに対
して生成したマウス及びウサギ血清により認識される。

ｐＴｒｅｐ１０３の生産物はブタ赤痢から回収されるブ
タ血清によっても認識される。

ｐＴｒｅｐ１０３を調製する手順を第５図に図式的に示
す。

実施例４ブユニットワク　ン　　の実験条件：第！回ワクチン接種時ブタの体重は１８．１Ｋｇ（４０
ボンド）であり、１回目注射の５週間後ワクチンを再接
種した。２ｍＩＬのワクチン量に対して０．５ｍｊ２の
鉱物油アジュバントを混合し、筋肉的注射により投与し
た。動物は第２回ワクチン接種の３週間後Ｔ、ｈｙｏ、
培養として肉片又は寒天増殖菌のスラリーを経口接種す
ることにより感染させた。各動物は１０９の菌を受は取
った。

この発明はワチチンを生産するために発現された蛋白質
を使用することに関連して詳しく記述したが、発現され
た蛋白質はＴ、ｈｙｏ、抗体を決定するために診断用と
して使用することもできる。更に別の応用として、発現
された蛋白質を抗体を引き出すために使用し、又引き出
した抗体をワクチンとして使用することができる。多く
の本発明の変更と変動が上の記述に照らして可能であり
、従って上に詳細に記述した以外のことを本発明の特許
請求の範囲内で実施することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＴｒｅｐ２の制限地図であり、第２図は発現
用プラスミドｐＴｒｅｐ９の組立ての手順を示しており
、第３図は３８ｋＤａ遺伝子のＤ　Ｎ　Ａ’配列であり
、Ｔｊｃ４図はｐＴｒｅｐ１０３（６０ｋＤａ−プロキ
モシン）遺伝子融合のＤＮＡとアミノ酸配列を示してお
り、第５図はｐＴｒｅｐ１０３の組立ての手順を示して
おり、第６図は３９ｋＤａ遺伝子の配列を示しており、
第７図はｐＴｒｅｐ１０３発現用プラスミドのＤＮＡと
アミノ酸配列を示しており、第８図はｐＴｒｅｐ３０１
の制限地図である。１、事件の表示平成１年特許願第１６２８２３号ワクチン −〇椋

Claims

【特許請求の範囲】

（１）約１９ないし９０キロダルトン（ｋＤａ）の範囲
の分子量を持つ少なくとも１つのトレポネマ・ヒオジセ
ンテリエー（Ｔ．ｈｙｏ．）抗原の少なくとも１つのエ
ピトーブを認識することができる少なくとも１つの抗体
を引き出すことができる少なくとも１つの蛋白質をコー
ド化するＤＮＡ配列を含む発現用ビークルから成る組成
物。
（２）ＤＮＡ配列は３８キロダルトンのトレポネマ・ヒ
オジセンテリエー抗原を認識する抗体を引き出す少なく
とも１つの蛋白質をコード化する請求項１記載の組成物
。
（３）ＤＮＡ配列は３９キロダルトンのトレポネマ・ヒ
オジセンテリエー抗原を認識する抗体を引き出す少なく
とも１つの蛋白質をコード化する請求項１記載の組成物
。
（４）ＤＮＡ配列は６０キロダルトンのトレポネマ・ヒ
オジセンテリエー抗原を認識する抗体を引き出す少なく
とも１つの蛋白質をコード化する請求項１記載の組成物
。
（５）発現用ビークルは第３図に示すＤＮＡ配列を含む
請求項１記載の組成物。
（６）発現用ビークルは第６図に示すＤＮＡ配列を含む
請求項１記載の組成物。
（７）発現用ビークルは第４図に示すＤＮＡ配列を含む
請求項１記載の組成物。
（８）請求項１記載の発現用ビークルで形質転換された
宿主。
（９）請求項２記載の発現用ビークルで形質転換された
宿主。
（１０）請求項３記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。
（１１）請求項４記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。
（１２）請求項５記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。
（１３）請求項６記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。
（１４）請求項７記載の発現用ビークルで形質転換され
た宿主。
（１５）請求項８記載の宿主から生産される蛋白質から
成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワ
クチン。
（１６）請求項９記載の宿主から生産される蛋白質から
成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用ワ
クチン。
（１７）請求項１０記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。
（１８）請求項１１記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。
（１９）請求項１２記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。
（２０）請求項１３記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。
（２１）請求項１４記載の宿主から生産される蛋白質か
ら成るトレポネマ・ヒオジセンテリエーに対する保護用
ワクチン。
（２２）請求項８記載の宿主から生産される蛋白質。
（２３）請求項９記載の宿主から生産される蛋白質。
（２４）請求項１０記載の宿主から生産される蛋白質。
（２５）請求項１１記載の宿主から生産される蛋白質。
（２６）請求項１２記載の宿主から生産される蛋白質。
（２７）請求項１３記載の宿主から生産される蛋白質。
（２８）請求項１４記載の宿主から生産される蛋白質。
（２９）トレポネマ・ヒオジセンテリエー抗原は２５な
いし６５キロダルトンの分子量を持つ請求項１記載の組
成物。
（３０）請求項１６記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。
（３１）請求項１７記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。
（３２）請求項１８記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。
（３３）請求項１９記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。
（３４）請求項２０記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。
（３５）請求項２１記載のワクチンの有効量をブタに投
与することから成るブタ赤痢からブタを保護する方法。