JPH03504924A - Rapid homoarginine-sensitive alkaline phosphatase (FHAP) immunoassay and antibodies useful therefor - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 迅速ホモアルギニン感応性アルカリ ホスファターゼ（ＦＨＡＰ）免疫検定法およびこれに有用な抗体 １皿丘！ 本発明は、一般的には、血清のＦＨＡＰ　（癌マーカ）の免疫検定法に関する。[Detailed description of the invention] Rapid homoarginine sensitive alkaline Phosphatase (FHAP) immunoassay and antibodies useful therein One plate hill! The present invention generally relates to a serum FHAP (cancer marker) immunoassay.

より詳細には、本発明は、疾病のインディケータとしての２つのＦＨＡＰ成分の 物理的会合の測定に関する。More specifically, the present invention describes the use of two FHAP components as indicators of disease. Concerning the measurement of physical association.

１１孜１ 組織の退化に関する疾病を持つ人間の血液は、高レベルの膜小片をしばしば含む 。一般的には、ジンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉ）等のキャン・レス（Ｃａｎ、　Ｒｅ ｓ、）第３２巻、第２３０７−２３１３頁（１９７２年）を参照されたい。この 論文並びにここにおいて言及されるその他の全ての論文および特許の記載は、本 明細書において引用して、本明細書中に十分に説明されているものとして記載に 代える。１つのかかる小片であるｒＦＨＡＰＪは電気泳動により分離され（例え ば、米国特許第４．１６６、７６６号参照）、アルカリホスファターゼ活性によ り最初に検出された。その独特の（迅速な（ｆａｓｔ）　）電気泳動移動度とホ モアルギニンによる抑制に対する感応性が、その頭字語の根拠である。この点に 関して、ＦＨＡＰは、ある種の酢酸セルロース電気泳動において肝臓アルカリホ スファターゼよりも迅速である。11 Kei 1 Blood from people with diseases related to tissue degeneration often contains high levels of membrane debris . Generally, Can, Re, such as Shinkai, etc. 32, pp. 2307-2313 (1972). this This article and all other articles and patent references mentioned herein are incorporated herein by reference. Referenced in the specification as if fully set forth herein. Replace. One such piece, rFHAPJ, is separated by electrophoresis (e.g. (see, for example, U.S. Pat. No. 4,166,766), alkaline phosphatase activity. was first detected. Its unique (fast) electrophoretic mobility and Sensitivity to inhibition by moarginine is the basis for its acronym. to this point Regarding FHAP, liver alkaline phosphatase is detected in certain types of cellulose acetate electrophoresis. Faster than sphatase.

ＦＨＡＰは種々の癌のマーカであることが、研究により示されている。例えば、 ボウサーフィン（Ｂｏｗｓｅｒ−Ｆｉｎｎ）等のチューマー・バイオロジイ（Ｔ ｕｍｏｕｒ　Ｂｉｏ−１ｏｇｙ）第７巻、第３４３−３５２頁（１９８６年）を 参照されたい。Ｆ　ＨＡ、　Ｐは、当初はイソエンザイムであると考えられてい たが、この物質は実際には、大きな複合体、とりわけアルカリホスファターゼ、 ロイシンアミノペプチダーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼおよび５° ヌクレオチダーゼを特に含む大きな複合体である。これらの酵素は膜に存在する 酵素であるので、ＦＨＡＰはある種の疾病の種々の段階において発生される細胞 膜の小片からなることが現在では明らかである。Studies have shown that FHAP is a marker for various cancers. for example, Tumer Biology (T) such as Bowser-Finn umour Bio-1ogy) Volume 7, pp. 343-352 (1986) Please refer. FHA, P was initially thought to be an isoenzyme. However, this substance is actually a large complex, especially alkaline phosphatase, Leucine aminopeptidase, gamma glutamyl transferase and 5° It is a large complex that specifically contains nucleotidases. These enzymes are present in membranes As an enzyme, FHAP is a cellular enzyme that occurs during various stages of certain diseases. It is now clear that it consists of small pieces of membrane.

血清中のＦＨＡＰはセルロースポリアセテート電気泳動により測定することがで きるが、この方法の比較的乏しい感度は、その有用性を、ＦＨＡＰ濃度が遊離の 肝朦／骨／腎臓アルカリホスファターゼ濃度に近い数少ない場合に限定する。血 清中のＦＨＡＰレベルはまた、イオン交換分離および米国特許第４．１６６、７ ６６号に詳述されている酵素検定法により測定することができる。しかしながら 、これは、測定当たりかなりの量の血清と、過度のコストおよび時間とを必要と する。更に、検定の感度は、ある場合には、健康コントロールの血清に存在する ＦＨＡＰ様の物質の検出を許す。FHAP in serum can be measured by cellulose polyacetate electrophoresis. However, the relatively poor sensitivity of this method limits its usefulness when the FHAP concentration is Limited to a few cases near liver/bone/kidney alkaline phosphatase concentrations. blood FHAP levels in the serum can also be determined by ion exchange separation and U.S. Patent No. 4.166,7. It can be measured by the enzymatic assay method detailed in No. 66. however , this requires significant amounts of serum per measurement and excessive cost and time. do. Additionally, the sensitivity of the assay may, in some cases, be greater than that present in the serum of healthy controls. Allows detection of FHAP-like substances.

免疫検定の開発に向けた第１段階として、ＦＨＡＰに対する抗体を開発する試み がなされてきた。しかしながら、本発明の以前は、これらの努力は不首尾に終っ ていた。別の問題として、先行技術の検定法は定量レベルに関する情報を提供す るが、癌の種類または癌の段階については殆ど何も知らせないことがある。Attempt to develop antibodies against FHAP as a first step towards developing an immunoassay has been done. However, prior to this invention, these efforts were unsuccessful. was. Another problem is that prior art assays do not provide information on the level of quantification. However, they may tell you little about the type of cancer or the stage of the cancer.

か（して、疾病について多量の情報を提供するとともに、使用がより簡単なＦＨ ＡＰ試験が待望されている。FH (which provides a large amount of information about the disease and is easier to use) The AP exam is eagerly awaited.

及旦Ａ目１立 本発明は、Ｆ　ＨＡ　Ｐの抗体を提供するものである。A 1st stand The present invention provides antibodies for FHAP.

本発明はまた、ＦＨＡＰの抗体、好ましくは、モノクロナル抗体を生産すること ができるハイブリドーマを提供するものである。The invention also provides for producing antibodies, preferably monoclonal antibodies, of FHAP. The aim is to provide hybridomas capable of

本発明の別の局面は、検定法を提供する。好ましい形態においては、検体（例え ば、大血清）を、ＦＨＡＰの第１部分を認識する化合物（例えば、抗体）にさら す。次に、検体における血清中のＦＨＡＰの第２の別の部分の存在とこれが第１ の部分と物理的に会合する程度とを測定する。次に、検定結果を対照レベルと比 較して、疾病のおきる可能性の特徴を提供する。Another aspect of the invention provides an assay method. In a preferred form, the specimen (e.g. (e.g., large serum) is exposed to a compound (e.g., an antibody) that recognizes the first portion of FHAP. vinegar. Next, the presence of a second separate portion of FHAP in the serum in the specimen and this and the degree of physical association. Next, compare the test results to the control level. It provides characteristics of the likelihood of disease occurrence.

特に好ましい形態においては、暴露工程に先立って、ＦＨＡＰに対するマウス抗 体を得て、これを固体表面（例えば、ウェル（ｗｅｌｌ））に固定する。抗体を ウェルに直接吸収させるが、または羊の抗マウスＩｇＧを使用してマウス抗体を ウェルにリンクさせることにより、これを行なうことができ、抗マウスＩｇＧは ウェルに予め取着される。暴露工程においては、ＦＨＡＰの第１の部分は、マウ ス抗体に結合され（か（してウェルに取着される）。第１のＦＨＡＰ部分はＦＨ ＡＰの第２の部分に結合されたままであるので、第２のＦ　ＨＡ　Ｐ部分もまた 、溶液から「引出される」。被覆されたウェルの代わりとして、抗体をＦＨＡＰ に暴露する前または後に、沈澱化化合物を抗体に結合することができる。In a particularly preferred form, prior to the exposure step, mouse antibodies against FHAP are A body is obtained and immobilized on a solid surface (eg, a well). antibodies Mouse antibodies can be absorbed directly into the wells or using sheep anti-mouse IgG. This can be done by linking the anti-mouse IgG to the well. pre-attached to the well. In the exposure step, the first part of FHAP is The first FHAP moiety is bound to the FHAP antibody (and attached to the well). Since it remains coupled to the second part of the AP, the second FHAP part also , "pulled" out of solution. As an alternative to coated wells, antibodies were added to FHAP The precipitated compound can be bound to the antibody before or after exposure to the antibody.

測定工程は、ウェルに結合された物質のアルカリホスファターゼ酵素活性を測定 を有しているのが好ましい。見出された１つの抗体はアルカリホスファターゼに 向けられていなかったので、この測定工程により、２つの異なるＦＨＡＰパラメ ータの会合を測定することができた。これにより、癌の原因と段階とを一層詳細 に認識することができるとともに、遊離のアルカリホスファターゼの干渉が極力 押えられるので、間違った陽性が著しく少なくなる。The measurement step measures the alkaline phosphatase enzyme activity of the substance bound to the well. It is preferable to have the following. One antibody discovered was directed against alkaline phosphatase. This measurement step yields two different FHAP parameters. We were able to measure the association of data. This allows for a more detailed understanding of the causes and stages of cancer. In addition to being able to recognize This reduces the number of false positives significantly.

ＦＨＡＰに対する抗体をスクリーン処理するこれまでの試みは不成功であったこ とが理解されるべきである。本発明の−の局−面は、従って、抗体を形成するハ イブリドーマを検圧する手段を設計することにあった。スクリーニング助剤（ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｉｄ）として洗浄剤を使用することが必要であることがわ かった。本発明の目的は、従って、 （ａ）上記した種類の抗体とハイブリドーマを提供し、 （ｂ）上記した種類の免疫検定法を提供し、かつ、 （ｃ）使用が安価で、信頼性があり、しかも情報を与えることができる上記した 種類の検定法を提供するものである。本発明のこれらのおよび更に別の目的と利 点は、以下の説明から明らかになるであろう。Previous attempts to screen for antibodies against FHAP have been unsuccessful. It should be understood that Aspects of the present invention are therefore The objective was to design a means to detect ibridomas. Screening aid (s It is clear that it is necessary to use detergents as cleaning aids. won. The object of the invention is therefore to: (a) providing an antibody and a hybridoma of the type described above; (b) providing an immunoassay of the type described above, and (c) those mentioned above that are cheap to use, reliable, and informative; It provides different types of assay methods. These and further objects and advantages of the invention The point will become clear from the description below.

日を　　するだめの　　のジ態 Ａ、ＦＨＡＰのサンプルを′ること ＦＨＡＰを単離する１つの方法が米国特許第４．１６６゜７６６号に記載されて いる。別の好ましい技術は、１．１００ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭ）リス（４°に おいてｐＨ８）°、１ｍＭＭｇＣ１，，２０）ＭＺｎＣｌを含む６００容量の透 析緩衝液に対し４℃で１８時間人血清の透析を行なう。The state of being unable to spend the day A. Get a sample of FHAP One method of isolating FHAP is described in U.S. Pat. No. 4,166°766. There is. Another preferred technique is 1.100mM NaCl, 20mM) 600 volumes of transparent water containing 1mM MgCl,,20)MZnCl at pH 8)°. Human serum is dialyzed against analysis buffer at 4°C for 18 hours.

２．７０００ｘｇ　（１５分間）遠心分離を行なう。2. Perform centrifugation at 7000xg (15 minutes).

３、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−４００カラム（７４ｘｌＯｃ ｍ）により６００ｍ１／時間の流速でゲルろ過を行なう。3. Sephacryl S-400 column (74xlOc Gel filtration is carried out using m) at a flow rate of 600 ml/h.

４．３０ｘ１．６ｃｍＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カラムにかけ た空隙率留分（ｐｏｏｌｅｄ　ｖｏｉｄｖｏｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集 める。２００ｍ１のサンプル緩衝液で洗浄する。０．１−０．６Ｍ直線状傾斜で 溶離する。Applied to a 4.30x1.6cm DEAE-Sephacel column. Collect the pooled void volume fraction. Melt. Wash with 200ml sample buffer. 0.1-0.6M linear slope Elute.

５、最高の特定活性の物質を集める。5. Collect the substances with the highest specific activity.

Ｂ、ＦＨＡＰに・　る　　を′ること ハイブリドーマおよび抗体形成の幾つかの技術が現在周知である（一般的には、 ビー・イー（Ｐ、　Ｅｙ）等のイミュノケミストリイ［ｆｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ）第１５巻、第４２９−４３６頁（１９７８年）参照）が、ＦＨＡＰに対 する抗体をスクリーン処理する試みはこれまでは不首尾であることが知られてい る。これらの問題点を克服するため、次の手順が使用された。B. To enter FHAP Several techniques for hybridoma and antibody formation are currently well known (generally Immunochemistry [fmunochemis] such as B.E. (P, Ey) etc. Try) Vol. 15, pp. 429-436 (1978)) for FHAP. Previous attempts to screen for antibodies that Ru. To overcome these problems, the following procedure was used.

１、ＢＡＬＢ／ｃマウスを部分的に精製されたＦＨＡＰで免疫付与する。1. Immunize BALB/c mice with partially purified FHAP.

２、標準的な技術を使用してマウスの牌およびヒニーズ（ｆｕｓｅ）の牌の細胞 をＮＳ−１骨髄腫細胞とともに除去する。2. Mouse tile and fuse tile cells using standard techniques are removed along with NS-1 myeloma cells.

３、候補の抗体をスクリーニングすることによりＦＨＡＰに対する抗体を形成す るハイブリドーマを次のようにして検出する。3. Forming antibodies against FHAP by screening candidate antibodies Detect hybridomas as follows.

（ａ）ポリスチレンマイクロタイタブレートに羊の抗マウスＩ　ｇＧ　（ＳＡＭ Ｉ　ｇＧ）を被覆する。(a) Sheep anti-mouse IgG (SAM IgG).

（ｂ）１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００（洗浄剤）１０容量％を組 織培養上澄み液に加える（新工程）。(b) Contains 10% Triton X-100 (cleaning agent) by volume. Add to tissue culture supernatant (new process).

（ｃ）ＳＡＭＩｇＧを被覆したプレートのウェルにおいて組織培養上澄み液（０ ，１ｍ１）を培養する。(c) Tissue culture supernatant (0 , 1 ml).

（ｄ）プレートを洗浄する。(d) Wash the plate.

（ｅ）高レベルのＦＨＡＰを含むことが知られている集めた大血清を加える。(e) Add collected large serum known to contain high levels of FHAP.

（ｆ）プレートを洗浄する。(f) Wash the plate.

（ｇ）２０　）ＭＺｎＣｌｚと１　、０　ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘを含む、１．０ Ｍ２−アミノ−２−メチル−１−プロパツールに溶解した０、２ｍｇ／ｍｌの４ −メチルーウンブリフェリルホスフェート、ｐＨ９，９を加える（これにより、 アルカリホスファターゼの存在下における時間の関数としての、ＦＨＡＰが有す る蛍光が増加する）。(g) 20) Contains MZnClz and 1,0 mM g Cl x, 1.0 0.2 mg/ml of 4 dissolved in M2-amino-2-methyl-1-propatur - add methyl-umbriferyl phosphate, pH 9.9 (this results in FHAP has as a function of time in the presence of alkaline phosphatase (increases fluorescence).

（ｈ）０分と９０分での蛍光レベルを測定する。蛍光の差を算出する。(h) Measure fluorescence levels at 0 and 90 minutes. Calculate the difference in fluorescence.

（ｉ）算８された差が陰性の対照媒体（ＮＳ−１細胞からの組織培養上澄み液） の場合に観察される差よりも有意に大きい場合には、試験は陽性である。(i) Control medium with negative calculated difference (tissue culture supernatant from NS-1 cells) The test is positive if the difference is significantly greater than the difference observed when .

独特のスクリーン処理剤であるトリトンＸ−１００洗浄剤が使用されることに留 意されたい。マウスのハイブリドーマは、培養基において成長すると自然に膜の 小片を解放するので、洗浄剤を使用しなければならないことがわかった。ハイブ リードからの小片は、従って、免疫グロブリンとアルカリホスファターゼとを有 し、かくして、アルカリホスファターゼに基づ（スクリーニング試験を使用する と、抗体の特殊性に拘らず、間違った陽性の結果を与えることになる。トリトン Ｘ−１００は、マウスの膜小片を破壊して免疫グロブリンとアルカリホスファタ ーゼを分離しく次に、洗浄剤とアルカリホスファラーゼを工程ｅにおいて洗い落 す）。このようにして、小片を工程（ｅ）において加えられた人血清からのアル カリホスファターゼと結合させる抗体だけを検出する。The unique screen treatment agent Triton X-100 cleaning agent is used. I want to be understood. Mouse hybridomas naturally develop membranes when grown in culture. I found that I had to use a cleaning agent as it released bits and pieces. hive The pieces from the lead therefore contain immunoglobulins and alkaline phosphatase. Thus, using an alkaline phosphatase-based (screening test) This will give a false positive result, regardless of the specificity of the antibody. triton X-100 destroys small pieces of mouse membranes and releases immunoglobulins and alkaline phosphatase. The detergent and alkaline phosphalase are then washed away in step e. vinegar). In this way, the small pieces are removed from the alkaline solution from the human serum added in step (e). Only antibodies that bind to calyphosphatase are detected.

好ましいハイブリドーマは、１９８８年２月８日に、アメリカ合衆国、メリーラ ンド州、ロックビルでのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）においてＡ ＴＣＣ−ＨＢ９６４３として寄託され、生育性が１９８８年２月１０日に確認さ れた。培養物は、適用される特許法が必要とする場合に、入手することができる 。かかる入手性は、ライセンスとして意図されない。菌株は、抗ＦＨＡＰねずみ バイプリドーマに１６０Ｃ２−Ｂ２、ＩＧと表示されている。これが生産する抗 体は、ＦＨＡＰのロイシンアミノペプチダーゼ部分を認識する。A preferred hybridoma was published on February 8, 1988 in Melia, United States of America. American Type Culture Collection in Rockville, India erican Type Curture Co11ection) A It was deposited as TCC-HB9643 and its viability was confirmed on February 10, 1988. It was. Cultures may be obtained if required by applicable patent law. . Such availability is not intended as a license. The strain is anti-FHAP mouse The bilidoma is labeled 160C2-B2, IG. This produces anti- The body recognizes the leucine aminopeptidase portion of FHAP.

Ｃ１免ｉ挾」Ｌ珠 ９６のウェル・フロー・ラボラトリーズ・タイターチック（Ｗｅｌｌ　Ｆｌｏｗ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）ポリスチレンＥＩＡプレート を、精製したＫｌ　６０Ｃ２−Ｂ２抗体で被覆した。抗体を、０．１５ＭＮａＣ １，０，１０Ｍトリス（ヒドロキメチル）アミノメタン緩衝液、ｐＨ９，０に２ ５℃で１０マイクログラム／ｍ１溶解した。次に、カラム３．４．７．８．１１ および１２の各ウェルに０．１ｍｌの抗体溶液を加え、次いで、ベルコ・ミニオ ービタル・シェーカ（Ｂｅｌｌｃ。C1 Immunity” L beads 96 Well Flow Laboratories Titanium Laboratories Titertek) Polystyrene EIA plate was coated with purified Kl 60C2-B2 antibody. Antibody in 0.15M NaC 1,0,10M tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer, pH 9,0 to 2 10 micrograms/ml dissolved at 5°C. Then column 3.4.7.8.11 and 0.1 ml of antibody solution to each well of 12 and then - Vital Sheka (Bellc.

Ｍｉｎｉｏｒｂｉｔａｌ　５ｈａｋｅｒ）を用い、スピード７で５秒間、プレー トの渦混合を行なった。その後、プレートをカバーし、密閉したプラスチックバ ッグに入れて２５℃で１５−１８時間プレートを培養した。その後、プレートを ０．１５ＭＮａＣ１、Ｏ，ＩＯＭ）−リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩 衝液、ｐＨ９，０で５回洗浄した。次に、プレートを逆にしてペーパタオルに叩 いて残留している緩衝液を除去し、次に、プレートを空気乾燥し、カバーしであ るプレートを４℃で保存した。ウェルは、抗体がプラスチックウェルに直接吸収 するタイプのものである。Miniorbital 5haker), play for 5 seconds at speed 7. Vortex mixing was performed. Then cover the plate with a sealed plastic bag. Plates were incubated for 15-18 hours at 25°C in a cage. Then the plate 0.15M NaC1,O,IOM)-lis(hydroxymethyl)aminomethane Washed 5 times with buffer solution, pH 9.0. Then invert the plate and pat it onto a paper towel. Remove any remaining buffer, then air dry the plate and cover. The plates were stored at 4°C. Wells allow antibodies to absorb directly into plastic wells This is the type of thing that does.

検定を行なうため、血清を溶液Ａ　（０，１５ＭＮａＣ１，０，０５Ｍトリス（ ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、２５℃でｐＨ７，４、Ｏ，ＯＯＩＭＭ ｇｃｌｚ　％０．０２ｍＭＺｎＣ１ｇ　、０．００４６ＭＮａＮ５．２．５ｇ／ Ｌゼラチン）で２０倍に希釈する。陽性の対照血清を、同じ緩衝液で適宜希釈し なければならない（例えば、１２０倍）。次に、同じ列の隣接する４つのウェル （例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４）のそれぞれにサンプル０．２ｍｌを分 配し、ウェルＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に溶液Ａを０．２ｍ１分配し、かつ、 ウェルＨ９、ＨＩＯ％Ｈ１１およびＨＩ３にＯ−２ｍｌの希釈した陽性の対照を 分配する。その後、カバーを行ない、スピード７で５秒間濃混合を行ない、水で 飽和した雰囲気において２５℃で４０−４２時間培養する。サンプルの希釈は、 血清サンプル中の遊離ＦＨＡＰ抗体（この場合には、非ＦＨＡＰが結合したロイ シンアミノペプチダーゼ）からの干渉を最小にするために必要となるものである 。To perform the assay, serum was mixed with solution A (0.15M NaCl, 0.05M Tris( Hydroxymethyl) aminomethane buffer, pH 7.4 at 25°C, O,OOIMM gclz%0.02mMZnC1g, 0.0046MNaN5.2.5g/ Dilute 20 times with L gelatin). Positive control serum was diluted appropriately in the same buffer. (e.g., 120 times). Next, four adjacent wells in the same column (e.g. B1, B2, B3 and B4). and dispense 0.2 ml of solution A into wells A1, A2, A3 and A4, and Add O-2 ml of diluted positive control to wells H9, HIO% H11 and HI3. distribute. After that, cover, mix thoroughly for 5 seconds at speed 7, and add water. Incubate for 40-42 hours at 25°C in a saturated atmosphere. Dilution of the sample is Free FHAP antibodies (in this case, non-FHAP-bound antibodies) in the serum sample This is necessary to minimize interference from cinaminopeptidase). .

次の工程は、未結合の物質を洗い落すためである。The next step is to wash away unbound substances.

これを行なうため、プレートを逆にし、自動プレート洗浄機を使用して溶液Ｂ　 （０，１５ＭＮａＣ１，０，０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩 衝液、２５℃でｐ）（’７．４、Ｏ，００１ＭＭｇＣ１２，０，０２ｍＭＺｎＣ １１，０，００４６ＭＮａＮ、）で５回洗浄する。その後、プレートを１度ベー パタオルに叩く。To do this, invert the plate and use an automatic plate washer to add solution B. (0,15M NaCl, 0,05M tris(hydroxymethyl)aminomethane p) ('7.4, O,001 MMgC12, 0,02 mM ZnC Wash 5 times with 11,0,0046M NaN, ). Then, bake the plate once. Hit Pataol.

次に、固体表面に結合している抗体により認識される抗原と物理的に会合してい る几ｌ（蛋白質（または非蛋白質抗原）の存在を測定する。この物質は、酵素、 蛋白質抗原または抗体により認識される蛋白質抗原と非共有的に会合している非 蛋白質抗原とすることができる。好ましい系は、溶液Ｃ（０，２ｍｇ／ｍｌナト リウム４−メチルウンベリフェリルホスフェート、１Ｍ２−アミノ２−メチル１ −プロパツール、２５℃でｐＨ１０，３、Ｏ、ＯＯＩ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２　 。It then physically associates with the antigen recognized by the antibody bound to the solid surface. This substance measures the presence of proteins (or non-protein antigens), such as enzymes, A protein antigen or non-covalently associated protein antigen recognized by an antibody. It can be a protein antigen. A preferred system is solution C (0.2 mg/ml nat. Lium 4-methylumbelliferyl phosphate, 1M 2-amino 2-methyl 1 - Propatool, pH 10.3 at 25°C, O, OOI M M g CI 2 .

０．０２０ｍＭＺｎＣ１ｇ　）０．２ｍｌを各ウェルに分配することにより、ウ ェルに結合した化合物のアルカリホスファターゼ酵素活性を測定するものである 。0.020mM ZnC1g) by distributing 0.2ml to each well. It measures the alkaline phosphatase enzyme activity of compounds bound to cells. .

次に、溶液Ｃｏ、２ｍｌを別のプレートの幾つかのウェルに分配し、希釈した対 照血清０．０１ｍ１を各ウェルに加える（例えば、溶液Ａで６４倍または１２８ 倍に希釈したシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ）の２Ｎ−エンザイム・コントロール（２Ｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏ ｎｔｒｏｌ）　）。Next, dispense 2 ml of solution Co into several wells of another plate and add the diluted Add 0.01 ml of control serum to each well (e.g. 64x or 128x with solution A). Sigma Chemical Company (Sigma Chemical C) diluted company)'s 2N-Enzyme Control (2N Enzyme Co ntrol)).

暗所において２４０分間２５℃で培養した後、３４０乃至４００ｎｍの光で励起 しかつ４５０ｎｍでの発行を測定することにより、各ウェルの蛍光を測定する。After incubating at 25°C for 240 minutes in the dark, excite with 340-400 nm light. The fluorescence of each well is then measured by measuring the emission at 450 nm.

グイナテック・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）のマイクロフルオロ・リーダ（Ｍｉｃｒ ｏｆｌｕｏｒ　Ｒｅａｄｅｒ）とフロー・ラボラトリーズ・タイターチック・フ ルオロスキャン（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｆ ｌｕｏｒｏｓｋａｎ）が適当な装置である。各サンプルに対して、抗体で被覆し たウェルの２つの値の平均と被覆を行なわなかったウェルの２つの値の平均との 差（例えば、［Ｂ３＋Ｂ４−Ｂｌ−Ｂ２］／２）を算出する。第２の化合物はま た、（第２の蛋白質に特有の放射性または酵素共役抗体（ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎ ｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）のような）免疫学的技術またはその他の手 段によって測定することもできるものである。Dynateck Laboratories Inc. (Dynateck L) aboratories, Inc.) microfluoro reader (Micr offluor Reader) and Flow Laboratories Titertic Fluor Flow Laboratories Titertek F luoroskan) is a suitable device. For each sample, coat with antibody The average of the two values for the wells coated and the average of the two values for the wells that were not coated. Calculate the difference (for example, [B3+B4-Bl-B2]/2). The second compound is (a radioactive or enzyme-conjugated antibody specific for the second protein) immunological techniques (such as jugated antibodies) or other methods It can also be measured in steps.

最後に、物理的に会合した第２の化合物の量を標準の上限と比較する。上記した 例においては、標準対照の上限は、抗体に１６０Ｃ２−Ｄ２により認識される抗 原と会合した０、２ＩＵ／Ｌアルカリホスフアターゼであった。この抗原と会合 したより高濃度のアルカリホスファクーゼが、癌、肝炎および糖尿病をもつ個体 においてしばしば観察される。Finally, the amount of physically associated second compound is compared to the upper limit of the standard. mentioned above In the example, the upper limit of the standard control is There were 0.2 IU/L alkaline phosphatase associated with the original. associated with this antigen higher concentrations of alkaline phosphacus in individuals with cancer, hepatitis, and diabetes. is often observed in

１１上立皿月１ 上記実施例において達成された、従来の方法を凌ぐ改良として、必要とされるサ ンプルの減少と、イオン交換、電気泳動またはゲルろ過分離工程の省略と、改良 された特異性とが挙げられる。更に、各患者の血清サンプルの膜小片の組成の別 の分析と組合わせてこの検定法を使用すると、疾病の原因または状態に関する情 報を得ることができる。11 Utachi Plate Month 1 As an improvement over conventional methods achieved in the above example, the required support sample reduction and the elimination and improvement of ion exchange, electrophoresis or gel filtration separation steps. specificity. Furthermore, the composition of membrane fragments in each patient's serum sample was When used in conjunction with analysis of You can get information.

１Δ皇土主 本発明は、単一の抗体もしくはハイブリドーマの使用またはこれらから誘導され る（例えば、直接または間接的に誘導される）使用に限定されるものではない。1Δ Imperial Landlord The invention contemplates the use of a single antibody or hybridoma or derivatives thereof. (e.g., directly or indirectly derived).

かくして、本発明は、好ましい実施例に限定されるものではない。むしろ、請求 の範囲が本発明の完全な範囲を定めるものとして参照される。Thus, the invention is not limited to the preferred embodiments. Rather, claim Reference is made to the scope of the invention as defining the full scope of the invention.

「覇　ｍ　　ｔｍ　　審　躯　牛 １ｍｅｍｍａｌ　＆−１−ｍ　　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００７３２``Conquest m tm trial body cow 1memmal &-1-m PCT/US 90100732

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] １．ＦＨＡＰに対する抗体。1. Antibodies against FHAP. ２．抗体がロイシンアミノペプチダーゼに対する抗原でもあることを特徴とする 請求項１に記載の抗体。2. Characterized by the fact that the antibody is also an antigen against leucine aminopeptidase The antibody according to claim 1. ３．抗体はＡＴＣＣ・ＨＢ９６４３のハイブリドーマまたはＡＴＣＣ・ＨＢ９６ ４３の子孫から誘導されたものであることを特徴とする請求項１に記載の抗体。3. Antibody is ATCC HB9643 hybridoma or ATCC HB96 The antibody according to claim 1, characterized in that it is derived from the progeny of 43. ４．ＦＨＡＰに対する抗体を形成することができるハイブリドーマ。4. A hybridoma capable of forming antibodies against FHAP. ５．ＦＨＡＰに対するモノクロナル性抗体を形成することができることを特徴と する請求項４に記載のハイブリドーマ。5. Characterized by being able to form monoclonal antibodies against FHAP The hybridoma according to claim 4. ６．ハイブリドーマが形成することができる抗体はまたロイシンアミノペプチダ ーゼに対する抗体でもあることを特徴とする請求項４に記載のハイブリドーマ。6. Antibodies that hybridomas can form also include leucine aminopeptidase 5. The hybridoma according to claim 4, which is also an antibody against enzyme. ７．ハイブリドーマはＡＴＣＣ・ＨＢ９６４３のハイブリドーマまたはＡＴＣＣ ・ＨＢ９６４３の子孫から誘導されたものであることを特徴とする請求項４に記 載のハイブリドーマ。7. Hybridoma is ATCC HB9643 hybridoma or ATCC - The product according to claim 4, characterized in that it is derived from a descendant of HB9643. Hybridomas listed. ８．ＦＨＡＰの第１の部分を認識する化合物に検体をさらす段階と、 検体におけるＦＨＡＰの第２の別の部分の存在と、該第２の部分が第１の部分と 物理的に会合する程度とを測定する段階とを備えることを特徴とする検定方法。8. exposing the specimen to a compound that recognizes the first portion of FHAP; the presence of a second distinct portion of FHAP in the specimen, and the second portion being the first portion; An assay method comprising the steps of measuring the degree of physical association. ９．化合物はＦＨＡＰの第１の部分に結合する抗体であることを特徴とする請求 項８に記載の検定方法。9. A claim characterized in that the compound is an antibody that binds to the first portion of FHAP. Verification method described in Section 8. １０．暴露段階に先立って、抗体が固体表面に固定されることを特徴とする請求 項９に記載の検定方法。10. A claim characterized in that, prior to the exposure step, the antibody is immobilized on a solid surface. Verification method described in Section 9. １１．固体表面は壁面であることを特徴とする請求項１０に記載の検定方法。11. 11. The assay method according to claim 10, wherein the solid surface is a wall surface. １２．暴露段階においてＦＨＡＰの第１の部分はＦＨＡＰの第２の部分に結合さ れたまま抗体を介して固体表面に結合されることを特徴とする請求項１０に記載 の検定方法。12. During the exposure step, the first part of FHAP is bound to the second part of FHAP. Claim 10, wherein the antibody is bound to a solid surface via an antibody while remaining intact. verification method. １３．測定段階はアルカリホスファターゼ酵素活性を測定することを特徴とする 請求項８に記載の検定方法。13. The measuring step is characterized by measuring alkaline phosphatase enzyme activity. The assay method according to claim 8. １４．疾病の可能性の兆候をみるために検定結果を対照レベルと比較する段階を 更に備えることを特徴とする請求項８に記載の検定方法。14. A step in which test results are compared to control levels for signs of possible disease. The assay method according to claim 8, further comprising: １５．他の抗体で被覆されたプレートを使用してＦＨＡＰ用の抗体を形成するこ とができるハイブリドーマの存在をスクリーニング処理する方法において、 スクリーニング処理の際に検体に洗浄剤を添加することを特徴とする方法。15. Generating antibodies for FHAP using plates coated with other antibodies In a method of screening for the presence of hybridomas capable of A method characterized by adding a detergent to a specimen during screening processing.