JPH03504597A - インスリン様成長因子活性の強化および阻害方法 - Google Patents
インスリン様成長因子活性の強化および阻害方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明はインスリン様成長因子活性を強化する方法に関する。また本発明は、こ
の活性を有するヒトイン 5スリン様成長因子工およびK (ICG−Iおよび
■)結合タンパク質(刺激型)およびこの結合タンパク質を生成する方法に関す
る。結合タンパク質(刺激型)はイQ/トポ、およびインビトロで濾胞胤達の強
化、傷およびやけど治癒、潰瘍治癒の強化および腎臓、肺または皮膚の損傷した
組織の再上皮形成に用いられている。またこのタンパク質は損傷したニューロン
および寡突起神経膠細胞の治癒の強化にも使用しつる。
さらに、本発明はヒトインスリン様成長因子結合タンパク質(阻害型)に関する
。IGF結合タンパク質(阻害型)は腫瘍増殖の阻害アテローム性動脈硬化症班
の進行または増加の阻害および糖尿病性網膜症の阻害および肺線維症の阻害に使
用できる。
ツマトメディン(Somatomedin)−Cとも命名されるヒトインスリン
様成長因子I (IGF−I)は、血液中で循環し、多くの組織で合成される
成長ホルモン依存型成長因子である。成長因子IGF−Iはインビトロの細胞成
長を促進するために細胞培養培地への添加物として有用である。EGFのような
血漿中で循環する他の成長因子あように、インスリン様成長因子は、担体タンパ
ク質−IGF−I複合体を形成し、そして運搬機能を果たすと信じられている結
合タンパク質に結合する。この結合タンパク質の部分的に精製された形態はIC
G−1のインスリン様作用を阻止することが示されている。この複合体の酸に安
定な結合サブユニットは血液から精製されており、その分、泌は成長ホルモンに
より刺激されつる。
ヒトインスリン様成長因子■は成長ホルモン依存度が低いかまたは全くなく、多
くの組織で合成される。
IGF−Iのように、それは運搬機能を果たすと信じられている結合タンパク質
と結合して循環する。
上記成長因子結合タンパク質とは対照的に、を髄、リンパ、および羊水のような
細胞外液および脳、胎盤および脳下垂体の組織抽出物は、種々の分子量を育し、
そして成長ホルモンに依存しないIFG結合タンパク質の形態を含有する。それ
らは10” −10”m””範囲の親和力でIGF−Iおよび(FG−I[の両
者と結合する。またIGF結合タンパク質はヒト線維芽細胞およびMDA−23
1細胞を包含する培養中のいくつかの細胞型により分泌されることも示されてい
る。羊水からのタンパク質およびラット肝臓細胞より分泌される類似のタンパク
質の純粋でない調製物は、線維芽細胞のDNA合成および軟骨組織中への硫酸塩
の取り込みにおよぼすrGF−IおよびIGF−IIの作用を阻害することが示
されている。
しかしながら、従来のヒトタンパク質は全て、実際には2種以上のタンパク質の
混合物であった。本発明者らは初めて、これらの結合タンパク質を分離する方法
を開発した。羊水からのタンパク質混合物は少なくとも2種のタンパク質構成物
を実際に含有していることが見出された。これらのタンパク質構成物は顕著に異
なる活性、すなわち一方はIGF−IおよびIGF−IIの活性を刺激または増
強することができ、もう一方はIGF−■およびIGF−IIの成長因子活性を
阻止することができることが見出された。これら2種の構成分タンパク質(これ
らを実質的な純度に単離することはここに初めて記載される)は、この出願の目
的のためにそれぞれIGF結合タンパク質(刺激型)およびIGF結合タンパク
質(阻害型)と呼ばれるタンパク質は翻訳後修飾型、おそらくジスルフィド結合
配置において異なることを実験は示している。かかる変化は細胞またはIGFB
Pおよびそれらの生物学的活性のマトリックス結合に観察される相異の原因とな
りつる凝集程度の相異に導くでンパク質は本発明者らによりヒト線維芽細胞馴化
培地から単離された。IGP結合タンパク質のようなこの形態は羊水からの刺激
型のようなIGFの作用を強化する。
これはIGF(刺激型)に対するポリクローナル抗体と交差反応するが、同じタ
ンパク質ではないかもしれない。
精製したIGF結合タンパク質(刺激型)は32−38にダルトンの推定分子量
を有する。これらの精製タンパク質は細胞表面に付着した場合、 IGFレセプ
ターおよび細胞表面に結合するIGFの量を増大させる。驚くべきことにこの増
大した結合IGF量はIGF活性の相乗的強化作用を生じる。
実質的に精製されたIGF結合タンパク質(阻害型)も32−38KDの分子量
を有するが、細胞表面に付着せずDEAEセルロースカラムで後から溶出する。
以下に続く考案において、IGF−I結合タンパク質またはIGF−II結合タ
ンパク質についての言及は文脈が別に指示しなければ、いずれか一方または両者
の種に関するものと考えるべきである。また、略語IGFBPはIGF結合タン
パク質について言及するために使用されることがある。
発明の要約
本発明の目的は、ある特定の成長因子の活性を増大することが可能な化合物を提
供することである。特に、本発明、の目的はインスリン様成長因子Iおよび■型
(IGF−IおよびIGF−I[)の活性の増大を可能にする化合物を提供する
ことである。
また本発明の目的はIGF−Iおよび[GF−IIの作用を妨げることが可能な
化合物を提供することである。
さらに本発明の特別な目的はこれらのタンパク質のそれぞれを実質的に精製され
た形で得る方法を提供することである。これらの化合物の精製を提供する方法は
、化合物がそれらの相対的IGF作用活性の保持を可能にする。これらの方法は
自然に存在するタンパク質を精製する方法および他の細胞または培養細胞中にI
GFBPを生成する組換えDNA法、そしてこれらのタンパク質を精製する方法
の両者を包含する。
これらの目的を達成するためそして本発明の目的に従って、 IGFの細胞成長
作用を強化する方法が提供される。この方法は
(a) 実質的に精製された形のIGF結合タンパク質(刺激型)を得ること
、お−よ−び527、(b) 成長を刺激しようとする細胞をIGF結合タン
パク質(刺激型)およびIGFにさらすことを包含する。
また本発明の目的を達成するためにも、そしてこれらの目的にも従って、IGF
の細胞成長作用を低下させる方法が提供される。この方法は
(a) 実質的に精製された形のIGF結合タンパク質(阻害型)を得ること
、および
(b) 成長を阻止しようとする細胞をIGF結合タンパク質(阻害型)にさ
らすこと、から成る。
本発明の目的をさらに達成するために、そしてその目的にさらに従って、 IG
F結合タンパク質(刺激型)および(阻害型)を精製する方法が提供される。こ
れらの方法は、 IGF結合タンパク質の両方の型をそのIGF作用活性を保持
する実質的に精製された状態で提供する。
上記の一般的記載および下記の詳細な記載の両者は例示および説明のためだけの
ものであり、特許請求されている本発明を制限するものではないと理解される。
この明細書に取り込まれてその一部を成す添付の図面は本発明の一実施態様を示
し、記載事項とともに本発明の詳細な説明するのに役立つ。
図面の簡単な説明
第1図はIGF−Iおよび結合タンパク質によるブタ大動脈平滑筋細胞(A)、
ニワトリ(B)、マウス(C)の胚線維芽細胞中でのDNA合成の強化を示す。
平滑筋細胞はマイクロテスト96ウエルプレートにおいてa、ooo細胞/ウェ
ルで継代培養し、細胞が休止状態になるまで5日間そのままにした。分析に先だ
ち、培養物を血清を含まないDMENで2回洗浄し、続いて0.5μCi ”H
−チミジンおよび1%ヒト乏血小板血漿(PPP)を補充したDMEMo、2−
中の試験物質を添加した。ニワトリ胚線維芽細胞(第2継代)を、96ウエルマ
イクロテストブレー)(Falcon 3004)において3.000細胞/ウ
エルで10%FBSを補充したDMEM中で継代培養した。塗布5日後に、休止
状態の単層を列記した試験因子プラス0.5μCi ’Hチミジンおよび1%P
PPにさらした。第3−第5継代のマウス胚線維芽細胞培養物を使用し、細胞を
s、oo。
細胞/ウェルで塗布したことを除いては、ニワトリ胚線維芽細胞について記載し
たようにして実験を行った。
全ての培養物は漸増濃度のヒト血清、インシュリン、IGF−I、 IGF−I
プラスIGF−I結合タンパク質(刺激型)(loong/ml)またはインス
リンおよびIGF−I結合タンパク質(刺激型)に36時間さらし、3H−チミ
ジン取込みを定量した。その結果は3組の培養物の平均値として示される。
第2図はIGF−I結合タンパク質(刺激型)による培養ヒト線維芽細胞中のD
NA合成の刺激を示す。第4−第8継代を用い細胞をs、ooo細胞/ウェルの
密度で10%ウシ血清を補充したMEMの入った96ウエルマイクロテストプレ
ートで継代培養した。塗布5日後、培養物は血清を含まないMEMで洗浄し、続
いて0.5μCi’H−チミジン、1%PPPおよび記載された濃度の試験物質
を含有するMEMo、21nlを加えた。漸増濃度の試験物質を加えた。漸増濃
度のヒト血清、IGF−I、インスリン、IGF−IプラスIGF−I結合タン
パク質(刺激型)またはインスリンプラスIGF−I結合タンパク質(刺激型)
を休止状態のヒト線維芽細胞単層に添加した。36時間インキュベージコンした
後、DNA合成を測定した。結果は3組の培養物の平均として示される。
第3図はIGF−I結合タンパク質(刺激型)に応答する平滑筋細胞DNA合成
の、濃度依存性増大を示す。漸増濃度の純粋IGF−I結合タンパク質(刺激型
)(10−500ng/d)を10ng/rnlIGF−Iおよびヒト1%PP
Pとともにインキュベートした。平滑筋細胞培養物を調製し、第1図で記載した
ように″H−チミジン組み込みを測定した。結果は3組の培養物の平均3H−チ
ミジン組み込みとして示される。
第4図はIGF−IおよびIGF−I結合タンパク質(刺激型)に応答する培養
線維芽細胞および平滑筋細胞の成長を示す。ブタ平滑筋細胞(A)およびヒト線
維芽細胞(B)をMEMと10%ウシ血清(線維芽細胞)またはDMEMとlθ
%ウシ胎児血清(平滑筋)の入った24ウエルブレー) (Falcon、 3
004)に15.000細胞/ウエルで塗布した。
2時間後、培地を1%PPPを含有するMEMまたはDMEMに変えた。続いて
さらに12時間インキュベートし、培地を取り除き試験試薬を1%PPPを含有
するDMEMまたはMBMo、51d!に添加した。48時間インキュベートし
た後、細胞数を測定した。結果は4組の培養物の+IsDとして示される。
第5図は高等真核細胞中の[GFBPのための発現ベクターの構築を示す。
第6図は24アミノ酸シグナル配列を有するIGFBPのアミノ酸およびヌクレ
オチド配列である。
第7図はIGFBPコード配列を含有するプラスミドpJU1020の作製を示
す。
第8図はIGFBPコード配列を含有するプラスミドpJU1021の作製を示
す。
第9図はIGFBPコード配列を含有するプラスミドpJU10220作製を示
す。
好ましい実施態様の詳細な記載
以下に本発明の現在好ましい実施態様に関して詳細に記載され、これは図面およ
び下記の実施例とともに本発明の詳細な説明するのに役立つ。
上記のように本発明は一部はインスリン様成長因子(IGF)の細胞におよぼす
作用を強化する方法に関する。
IGFはDNA合成の速度を増大するにより成長因子として機能をすることが知
られている。
本発明者らはIGF−Iの成長促進作用を強化するタンパク質を実質的に精製さ
れた状態で得た。このタンパク質はIGF結合タンパク質(刺激型)と命名され
ている。細胞成長を促進するIGF−1の能力におよぼすIGF結合タンパク質
(刺激型)の強化作用は第1−第4図に示されている。
この強化作用を得るために、 IGF結合タンパク質(刺激型)を実質的に精製
された状態で得た。ひとつの実施態様において、この実質的に精製されたrGF
結合タンパク質(刺激型)をまず標的細胞の表面に付着させる。増大。次いで付
着したIGF結合タンパク質(刺激型)を有する標的細胞をIGF−Iにさらす
。平滑筋細胞を使用した場合、付着したIGF結合タンパク質の存在といっしょ
にIGF−Iにさらすと細胞の増殖速度が少なくとも約4倍増となるが、一方I
GF−I単独にさらすと細胞の増殖の速度は約25%増となった。
第2の実施態様において、IGF結合タンパク質(刺激型)およびIGF−Iは
標的細胞にそれらを添加する前にあらかじめ混合した。
本発明のIGF結合タンパク質(刺激型)は、ひとつの実施態様において、ヒト
組織からの単離により実質的に精製された形で得られる。特に、実質的に精製さ
れたrGF結合タンパク質(刺激型)をヒトの細胞外液から単離できる。これら
の細胞外液は羊水およびを髄液を包含する。この実施態様の好ましい形式におい
て、IGF結合タンパク質(刺激型)はヒト羊水から単離される。細胞外液から
のこの特別なIGF結合タンパク質(刺激型)の単離のための詳細な方法論は以
下に続(実施例1に記載されている。
別の実施態様において、本発明のIGF結合タンパク質(刺激型)はヒト細胞系
により馴化された培地から、実質的に精製された形で単離することができる。細
胞系はGMIOのような線維芽細胞系およびMDA−231のような乳癌細胞系
を包含するが、これらに限定されない。
線維芽細胞馴化培地からのこの特別なIGF結合タンパク質(刺激型)の単離に
関する詳細な方法論は、以下に続〈実施例5に記載されている。この第2のIG
F結合タンパク質(刺激型)は細胞外液から単離可能なタンパク質に密接に関連
しているが同一ではない。
どちらかの型のIGF結合タンパク質(刺激型)が単離されている場合、正しい
タンパク質が単離されたか否かを決定するのに役立てるために一連の検定が開発
されている。これらの検定はrGF結合タンパク質(刺激型)の単離を確認する
ために単独でまたはいくつかを組合せて使用することができる。
これらの検定の第1番目は単離したタンパク質がIGF−Iに結合できるか否か
を決定することである。
この決定を行う方法は、Clemmons、 D、によりJ、 Cl1n。
Invest、 77:1548−1556 (1986)に記載されており、
その開示はこの参考文献としてここに明白に取り込まれる。第2の検定は相乗作
用的にIGF−Iの作用を促進する能力である。この検定を実施するひとつの方
法は実施例2に記載されている。
第3の検定は単離したタンパク質がIGF−I結合タンパク質(刺激型)に対す
る抗体と反応する能力である。
特にポリクローナル抗体は、ここに含まれる教示を特に考慮し、当業者に知られ
た任意の方法によりこのタンパク質に対するものとしてあげるこができ、結合タ
ンパク質の同定を確認するために使用することができる。
上記記載において、 “実質的に精製された”という用語が使用されている。本
出願の目的のために、この用語は、タンパク質がSDS PAGEにより測定し
て不純物の少なくとも約50%を含まないことを意味することを意図している。
好ましくは、タンパク質は不純物の少なくとも約70%を含まず、さらに好まし
くは不純物の少なくとも約90%を含まない。以前に単離されたIGF結合タン
パク質はIGF結合タンパク質(阻害型)および(刺激型)の混合物として自然
に存在することに注目すべきである。したがって、ここに記載されるIGF結合
タンパク質は不純物の少なくとも約50%を含まない場合は“実質的に純粋”で
あるが、これらの結合タンパク質は少なくとも相互に約75%分離されているべ
きである。本発明のFGF結合タンパク質の単離および精製は実施例1に記載さ
れている。
IGF結合タンパク質の配列は実施例3に記載されている。IGF結合タンパク
質をコードする遺伝子の単離は実施例4に記載されている。
別の実施態様において、本発明は、インスリン様成要因子結合タンパク質をコー
ドする移動性DNA配列に関する。これらの移動性DNA配列は種々の宿主微生
物および真核生物細胞においてヒトIGF結合タンパク質の産生に導くことがで
きる。この文脈における“移動性DNA配列“は、完全な長さのDNAクローン
または合成で作製された類似物または両者の任意の組合せ物のいずれかについて
言及することを意図している。この明細書の目的のために、 “ヒト様成長因子
結合タンパク質′とは、アミノ酸配列の細胞内産生を導き、そして翻訳後修飾を
包含しまたは包含しないことのあるデオキシリボ核酸配列中に存在するコドンに
より定義されるタンパク質の第1次構造を意味することを意図している。本発明
により産生される“ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質”は自然に存在す
るヒトタンパク質と少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、さらに好
ましくは少なくとも80%同一である。ここで考察されるパーセント同一性は、
−列にならべるのを助けるために100アミノ酸につき4ギヤツプが許される場
合に、比較して、配列の同一のアミノ酸残基とならぶ2つの配列のうち小さい方
に見い出されるアミノ酸残基の百分率として計算される。
好ましい実施態様において、移動性DNA配列はIGF結合タンパク質の産生を
導くことができる。特に好ましい実施態様において、移動性DNA配列はヒト羊
水または線維芽細胞調整培地から以前単離されたそれと生物学的に同等のIGF
結合タンパク質の産出を導くことができる。この明細書および請求の範囲におい
て使用される“生物学的に同等の”とは、本発明の移動性DNA配列を使用して
産出されたIGF結合タンパク質が、ヒト羊水または線維芽細胞馴化培地から単
離されたIGF結合タンパク質により産生されたそれと定性的および定量的に同
等する強化または阻害された細胞成長活性を誘導することができる形態に活性化
可能であることを意味する。
先に記載したように、本発明の移動性DNA配列は合成でつくることができる。
これらのポリヌクレオチド配列を合成でつくる方法は、ここに含まれる教示を特
に考慮すると、当業者に一般に知られているものであると考えられる。ポリヌク
レオチド合成に関連する現在の技術水準の例としては、Matteucci、
M、D、およびCaruthers、 M、H,、J、 Am、 Chem、
Soc、 103:3185 (1981)およびBeaUChee、 S、
L、およびCaruthers、 M、H,。
Tetrahedron Lett、 22: 1859 (1981)があり
、各々はここに参考として編入される。
さらに、移動性DNA配列は自然の配列のフラグメントである。すなわち自然に
存在し、本発明者らにより初めて単離され精製されたポリヌクレオチドのフラグ
メントである。ひとつの実施態様として、移動性DNA配列は、cDNAライブ
ラリーから単離された制限フラグメントである。この好ましい実施態様において
、cDNAライブラリーは実施例4に記載されているように作られた。
別の実施態様において、移動性DNA配列はヒトゲノムライブラリーから単離さ
れる。この実施態様に有用なかかるライブラリーの一例はLawnらによりce
ll 15:1157−1174(1978)に記載されており、ここに参考と
して編入される。
上記のように、本発明は、それぞれがここに記載する移動性DNA配列の少なく
ともひとつを含有する一連のベクターに関する。所望のIGF結合タンパク質を
多量に産出する宿主生物または真核細胞の能力を増大させるために、移動性DN
A配列の追加のコピーを単一のベクター中に包含させうることが考えられる。さ
らに、本発明の範囲内でクローニングベクターは移動性DNA配列に先行するま
たは後続する補足ヌクレオチド配列を含有することができる。補足配列は、移動
性DNA配列の転写を妨害せず、下記にもっと十分に記載するようにいくつかの
場合には、転写、翻訳または機能性の第3次形態と推定される生成したIGF結
合タンパク質の第1次アミノ酸構造の能力を強化するであろう。
上記の性質を有し、したがって本発明における使用に好適であるクローニングベ
クターがさらに現在存在するかまたは発見されるであろうことは当然である。
またこれらのベクターも、任意の必要な操作エレメントとともにcDNA配列を
導入することのできる開示した一連のクローニングベクターの範囲内のものであ
るとして考えられ、その改変されたベクターはさらにまた本発明の範囲に包含さ
れ、そして下記でもっと十分に記載する組換えDNA法において使用することが
できるであろう。これらの特徴を有するいくつかのの好ましいベクターは以下に
続〈実施例中に記載されている。
■、微生物細胞中でのIGF結合タンパク質の遺伝子発現
下記にすぐ続<A、Bおよび0項は微生物宿主中での移動性DNA配列の産出に
関する。
A、微生物のために好ましいベクターの特徴本発明のいくつかの実施態様は、こ
こに記載されたcDNA配列のひとつまたはそれ以上を含有する既知のまたは現
在未発見のベクターを使用することを想定している。特に、これらのベクターは
次の特徴のいくつかまたは全てを有することが好ましい。すなわち(1)宿主生
物配列の最小数を保有する、(2)所望の宿主中で安定に維持され増殖される、
(3)所望の宿主中に多くのコピー数で存在することができる、(4)関心のあ
る遺伝子の転写を促進するために配置された調節可能なプロモーターを保有する
、(5)移動性DNA配列を挿入する部分から離だプラスミドの一部分上に存在
する選択可能な特色をコードする少なくとも1個のDNA配列を有する、および
(6)転写を終止することができるDNA配列。
種々の好ましい実施態様において、本発明のcDNA配列を含有し発現すること
ができるこれらのクローニングベクターは、種々の操作エレメントを含有する。
これらの“操作エレメント”は、ここに考察されているように少なくとも1個の
プロモーター、少なくとも1個のシャインーダルガルノ配列および開始コドン、
および少なくとも1個の終止コドンを包含する。好ましくは、またこれらの“操
作エレメント”は少なくとも1個のオペレーター、細胞内空間から搬出されるタ
ンパク質ための少なくとも1個のリーダー配列、調節タンパク質のための少なく
とも1個の遺伝子、およびベクターDNAの適切な転写およびそれに続く翻訳に
必要なまたは好ましい任意の他のDNA配列をも包含する。
いくつかのこれらの操作エレメントは本発明の好ましいベクターのそれぞれに存
在していてよい。当業者に知られた方法を使用して、ここの教示を特に考慮して
、必要とされる任意のさらなる操作エレメントを、これらのベクターに加えるこ
とも考えられる。
実際、容易に単離し、組み立てそして交換することか可能な方法でこれらのベク
ターのそれぞれを構築することが可能である。これは、これらのエレメントおよ
びcDNA配列のコード領域の組合せからの数々の機能性遺伝子の組立てを容易
にする。さらに、これらのエレメントは1個以上の宿主に適用されるであろう。
い(つかの好ましい実施態様において、ベクターはレギュレーター(“オペレー
ター′)として機能することができるDNA配列およびレギュレータータンパク
質をコードすることができる他のDNA配列を含有することがさらに考えられる
。
1、調節因子
ひとつの実施態様において、これらの調節因子はある環境条件の存在下でcDN
A配列の発現を妨ぎ、他の環境条件の存在下においてはcDNA配列によりコー
ドされるタンパク質の転写およびそれに続く発現を可能にするであろう。特に、
調節部分を、例えばイソプルピルチオ−ベーターガラクトシドの非存在下でcD
NA配列の発現が起こらないかまたは非常に減少した程度で起こるようにベクタ
ーに挿入するのが好ましい。この状態において、cDNA配列を含有する形質転
換した微生物はIGF結合タンパク質の発現開始前に所望の密度で増殖できる。
この実施態様において、所望のタンパク質の発現は、所望の密度が達成された後
にそのDNA配列の発現を生じることができる物質を微生物の環境に添加するこ
とにより誘導される。
2、プロモーター
発現ベクターはそれ自体のタンパク質発現のために大部分の生物に使用できるプ
ロモーターを含有しなければならない。ラクトースプロモーター系か一般に使用
されているが、他の微生物のプロモーターが単離され、特性決定されており、当
業者が組換えrGF結合タンパク質の発現のためにそれらを使用することを可能
にしている。
3、転写ターミネータ−
ここで考えられる転写ターミネータ−は、ベクターを安定するのに役立つ。特に
Rosenberg、 M、およびCourt、 D、、 Ann、 Rev、
Genet、 13:319−353 (1979)に記載されているこれら
の配列は、ここに参考として詳細に編入されており、本発明における使用が考え
られる。
4、非翻訳配列
好ましい実施態様において、3°または5゛非非翻訳列を遺伝子転写物に組み込
むのを可能にするためにコード領域の3°または5゛末端を再構築することも望
ましいということが注目される。これら非翻訳配列中において包含されるものは
、ここに参考として編入されたSchmeissner、 U、、 McKe
nney、 K、、 Rosenberg、 MおよびCourt、 D
、P J、 Mo1. Biol、 176:39−53 (1984)により
同定されたmRNAを安定化する配列である。
5、リポソーム結合部位
外来タンパク質の微生物内での発現はリポソーム結合部位を包含するがそれらに
限定されないいくつかの操作エレメントを必要とする。その特別のエレメントは
、Gold、 L、、ら、Ann、 Rev、 Microbio、 3
5: 557−580またはMarquis、 D、M、、ら、Gene 42
:275−183 (1986)に記載されているように、タンパク質合成の開
始においてリポソームが認識して結合する配列である。これらの文献は参考とし
てここに編入される。
ここで考察されているように操作エレメントは先行の文献およびここに含まれる
教示を考慮して当業者により決まりきった手順で選択できる。これらの操作エレ
メントの一般的例は、ここに参考として編入されるB、 Lewin、 Gen
es、 Wiley & 5ons、 New York (1983)に記載
されている。好適な操作エレメントの種々の例は上記考察したベクターに見い出
され、前記ベクターの基本的特徴を考察している出版物を参照することにより明
りょうになる。
6、リーダー配列および翻訳カプラー
さらに、適切な分泌用リーダー(シグナル)配列をコードするDNAが移動性D
NA配列の5°末端に存在することが好ましい。リーダー配列のDNAは、リー
ダー配列が阻害因子にじかに隣接しかつ共有結合している融合タンパク質の産出
を可能にする位置になければならず、すなわち2つのDNAコード配列の間には
転写または翻訳終止シグナルがあってはならない。リーダー配列の存在は一部に
は下記の理由のひとつまたはそれ以上のために所望される。第一に、リーダー配
列の存在はIGF結合タンパク質の宿主プロセシングを容易にする。特に、リー
ダー配列はリーダーペプチダーゼによる最初の翻訳産物の切断に導き、リーダー
配列を取り除き、そしてありうるタンパク質活性を有するアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを残すことができる。第二に、リーダー配列の存在は[GF結合タ
ンパク質を細胞の細胞質の外に導くことにより、そのタンパク質の精製を容易に
することができる。宿主微生物のいくつかの種において、適切なリーダー配列の
存在は、いくつかのエシェリヒア・コリ (E、coli)の場合のように、完
成したタンパク質をペリプラズム空間へ移送するのを可能にするであろう。いく
つかのE、coli、サツカロミセス(Saccharomyces)およびバ
チルス(Baci 1lus)およびシュードモナス(Pseudmonas)
の株の場合、適切なリーダー配列はタンパク質が細胞膜を通過し細胞外の培地に
入る移送を可能にするであろう。この状態において、タンパク質は細胞外タンパ
ク質から精製される。第三に、本発明により調製されたいくつかのタンパク質の
場合、リーダー配列の存在はその活性構造をとるために完成したタンパク質が折
り重なりつる環境にある必要があり、この構造は適切なタンパク質活性を有する
。
7、翻訳ターミネータ−
ここで考えられる翻訳ターミネータ−はmRNAの翻訳を停止するのに役立つ。
それらはKohil、 J、、 Mo1. Gen。
Genet、 182:430−439 (191)に記載されているように自
然のものであるか、またはPettersson、 R,F、 Gene 24
:15−17 (1983)に記載されているように合成されたものであり、こ
れら両文献はここに参考として編入される。
8、選択可能なマーカー
さらに、クローニングベクターは、薬剤耐性マーカーまたは宿主微生物により選
択可能な質の発現を生じる他のマーカーのような選択可能なマーカーを含有する
ことが好ましい。本発明のひとつの実施態様において、アンピシリン耐性の遺伝
子はベクターに包含される一方、他のプラスミドにはテトラサイクリン耐性また
はクロラムフェニコール耐性用遺伝子が包含される。
かかる薬剤耐性または他の選択可能なマーカーは、一部は形質転換物の選択を容
易にするために意図される。さらに、クローニングベクター中のかかる選択可能
マーカーの存在は汚染微生物が培養培地で増殖することを抑えるのに用いること
ができる。この実施態様において、形質転換した宿主微生物のかかる純粋な培養
物は誘導される表現型が生存のために必要な条件のもとで微生物を培養すること
により得られるであろう。
B、微生物用のベクター組立て
上記したクローニングベクターの必要であり所望の全ての構成部分の合成および
/または単離に際して、ベクターは当業者に一般に知られている方法により組立
てられる。かかるベクターの組立ては、当業者が行なう職務の範囲内であると思
われ、そのようなものであるので、過度の実験なしに行なうことができる。例え
ば、Maniatis、 T、、ら、Mo1ecular Cloning:A
Library Manual、 Co1d SpringHarbor L
aboratory。
N、Y、 (1982)に記載されているように、同様のDNA配列は適切なり
ローニングベクターに連結されており、この文献は参考としてここに編入される
。
C0宿主微生物
ここに開示したベクターおよび方法は、広範囲の原核生物および真核生物にわた
る宿主細胞中で使用するのに好適である。DNA配列のクローニングのためおよ
び遺伝子発現のためには原核生物が好ましい。E、coli株JM105. J
M107およびJM109 (Pharmaciaから入手可能)ならびにバチ
ルスおよびシュードモナス種は遺伝子の発現に使用できる。原核生物に加えて、
サツカロミセス セレビシェ(Cerevisiae)のような真核微生物を遺
伝子の発現に使用できる。
一般に、宿主細胞と適合する種に由来する操作エレメントを含有するプラスミド
ベクターを使用する。例えばB、coliは、E、coli由来のプラスミドp
BR322を使用して典型的には形質転換される。第1表は宿主生物および適合
するベクターの一覧を示す。
(本頁以下余白)
1、シュードモナスベクター
第1表に記載したベクターに加えて、広範囲のダラム陰性菌中に自律複製するい
くつかのベクタープラスミドを、ニードモナス属の宿主中でクローニングベヒク
ルとして使用するのが好ましい。これらは Ta1t。
R,C,、C1ose、 Tj、、 Lundquist、 R,C,、Haq
iya、 M、。
Rodriguez、 R,L、、およびKado、 C,1,In Biot
echnology。
May、 1983. pp、269−275; Panopoulos、
N、J、 in GeneticEngineering in the P
lant 5ciences、 Praeger Publishers、 N
ew York、 New York、 pp、163−185(1981);
およびSakagucki、 K、 in Current Topic i
n Micro−biologyand Immunology 96:31−
45 (1982)G:記載されており、各文献は参考としてここに編入される
。
ひとつの特に好ましい構築方法は、Bagdasar ian。
M、、 Bagda−sarian、 M、M、、 Coleman、 S、、
およびtimmis。
K、N、 in Plasmids of Medical Environ
mental andCommercial Importance、 Tim
m1s、 K、N、 and Puhler。
A、(編)、Elsevier/North holland Biomedi
cal Press(1979)(ここに参考として編入される)に記載されて
いるように、プラスミドRSFIOIOおよびその誘導体を使用することであろ
う。R3F’1OIOの利点は、それがE、coliおよびシュードモナスの両
種中に容易に形質転換されかつ安定的に維持される、比較的に小さくコピー数の
多いプラスミドであることである。この系においては、ニジエリ ヒアについて
記載されているようにTax発現系を使用することが好ましいてあろう。なぜな
らば、ε、coli trpプロモーターは、Sakagucki、 K、。
Current Topics in Microbiology and I
mmunology96:31−45 (1982)およびGray、 G、
L、、 McKeown、 K。
A、、 Jones、 A、J、S、、 Seeburg、 P、H,、および
Heyneker。
H,L、、 Biotechnology、 Feb、1984. pp、16
1−165 (両文献は参考としてここに編入される)に記載されているように
シュードモナスRNAポリメラーゼにより容易に認識されると思われるからであ
る。翻訳活性はそのプロモーターを、例えばE、coliまたはシュードモナス
・エルギノーザ(P、 aeruginosa) trpプロモーターと交換す
ることを要求することにより、さらに最大にすることができる。さらに、E、c
oliの1aci@株の1acl遺伝子も調節を行うためにプラスミド中に包含
されるであろう。
実施例中に記載されるように、任意のE、coliタンパク質の翻訳開始ならび
に阻害因子の細胞内発現を生じるために宿主の多量に発現される任意のタンパク
質の開始部位に翻訳を結合できる。
宿主シュードモナス種の制限を欠く株が入手できない場合、E、coliから単
離されたプラスミド構築物での形質転換効率は低い。したがって、ここの参考文
献欄に詳細に編入されているようにBagdasarian、 M、、ら、Pl
asmids of Medical、Environmental and
CommercialImportance、 pp、411−422.
Timm1s and Puhler(編)、Elsevier/North
holland Biomedical Press(1979)(参考と
してここに編入される)に記載されているように、所望の宿主の形質転換前にシ
ュードモナスクローニングベクターを、もうひとつの種のr−rn”株に継代さ
せることが望ましい。
2、バチルスベクター
さらに、バチルス属が宿主である好ましい発現系は、クローニングベヒクルとし
てプラスミドpUB110の使用を伴う。他の宿主ベクター組織におけるように
、バチルス中で本発明のIGF結合タンパク質を細胞内または分泌タンパク質の
いずれかとして発現することが可能である。本実施態様には両方の系が包含され
る。バチルスおよびE、C01iの両者の中で複製するシャトルベクターは、D
ubnau、 D、、 Gryczan、 T、、 Contente、 S、
、およびShivakumar、 A、G、 in GenerticEngi
neering、 Vol。
2、 Setlow and hollander(編) 、Plenum P
ress、 NewYork、 New York、 pp、l15−131
(1980X参考としてここに編入される)で所望されるように、種々の遺伝子
を構築して検定するのに使用でき°る。B、サブチリスからのIGF結合タンパ
ク質の発現および分泌のためには、アルファアミラーゼのシグナル配列は、その
タンパク質のコード領域に結合されることが好ましい。細胞内阻害因子の合成の
ためには、移動性DNA配列がアルファアミラーゼリーダー配列のリポソーム結
合部位に翻訳により結合されるであろう。
これらの構築物のどちらかの転写は、アルファアミラーゼプロモーターまたはそ
の誘導体により導かれることが好ましい。この誘導体は天然型アルファアミラー
ゼプロモーターのRNAポリメラーゼ認識配列を含有するが、 lacオペロン
領域も組み込んでいる。ペニシリナーゼ遺伝子プロモーターおよびlacオペレ
ーターから構築された類似のハイブリッドプロモーターは、参考としてここに詳
細に編入されるYansura。
D、 G、およびHenner in Genetics and Biote
chnologyof Bacilli、 Ganesan、 A、T、 an
d hoch、 J、A、、(編)、うな調節可能な仕方でバチルス宿主中で機
能することか示されている。またE、コリの1acl″株のIacl遺伝子も節
制を行うために配置中に包含されるであろう。
3、クロストリジウムベクター
クロストリジウム中ての発現のためのひとつの好ましい1築法は、ここに参考と
して編入される5quires。
C,H,ら、J、 Bacteriol、 159 : 465−471
(1984)に記載のプラスミドpJUI2を、ここに参考として編入されるJ
、 Bacteriol、 159:460−464(1984)に記載しであ
るようなHeefner、 D、L、 らの方法によりC,バーフリンジェン
ス中に形質転換することである。転写はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターにより導かれる。翻訳は、他の宿主中の使用に好適なベクターに関して上記
に大要を記載した方法に厳密に類似している仕方で、この同じtet ’遺伝子
のシャインーダルガルノ配列に結合される。
4、酵母ベクター
酵母に導入された外来DNAの維持は、ここに参考として編入されるBotst
ein、 D、、およびDavis、 R,W、。
The Mo1ecular Biology of the Yeast S
accharomyces。
Co1d Spring Harbor Laboratory、 5trat
hern、 Jonesand Broach、 (編)、pp、607−63
6 (1982)に記載されているいくつかの方法により行うことができる。サ
ツカロミセス属の宿主生物とともに使用するひとつの好ましい発現系は、2ミク
ロンプラスミド上にIGF結合タンパク質遺伝子を含んでいる。2ミクロンサー
クルの利点はcir’株に導入された場合、比較的高いコピー数および安定性を
包含する。これらのベクターはE、コリ内において複写と選択を可能にするpB
R322からの複製開始点および少なくともひとつの抗生物質耐性マーカーを組
み込むことが好ましい。さらにプラスミドは、2ミクロン配列および酵母のLE
U2欠失変異種において同じ目的を果す酵母LEU2遺伝子を有することが好ま
しいであろう。
また本発明はIGF結合結合タンパ音質生ずる組換えDNA法にも関する。一般
に、この方法は、(a) 宿主微生物中いてrGF結合結合タンパ音質生させ
るをことができる移動性DNA配列を調製し、(b) 移動性DNA配列を、
宿主微生物中に移入することができそこで複写することができるベクターにクロ
ーニングし、かかるベクターは移動性DNA配列のために操作エレメントを含有
しており、
(C) 移動性DNA配列および操作エレメントを含有するベクターをIGF
結合結合タンパ音質現することができる宿主微生物に移し、
(d) ベクターの増殖およびIGF結合結合タンパ音質現に適切な条件下で
宿主微生物を培養し、そして、(e) どちらかの順序で:(i)IGF結合
結合タンパ音質取すること、および(ii)IGF結合結合タンパ音質性の第三
次構造をとるようにすることを包含する。
この方法において、移動性DNA配列は、上記の合成のまたは自然に存在するポ
リヌクレオチドである。本方法の好ましい実施態様において、移動性DNA配列
はその単離が実施例4に記載されているcDNAにより定義されるヌクレオチド
配列を有する。
本方法に有用であると考えられるベクターは上記に記載されたベクターである。
好ましい実施態様において、E、コリの複製開始点、大腸菌ファージT7ブロモ
ーターおよびテトラサイクリン耐性のマーカーを含有するクローニングベクター
が使用される。IGF結合結合タンパ音質伝子はT7φ(ファイ)10タンパク
質のフラグメントと翻訳により結合される。
このようにして得られたベクターは次いで適切な宿主微生物、例えばlacプロ
モーターから転写される、大腸菌ファージT7からの遺伝子lの染色体コピーを
含有するE、コリに移される。外来のDNAを取り込み、これらの遺伝子を発現
する能力を有し、そして操作エレメントが存在する任意の微生物を選択できると
考えられる。宿主微生物は嫌気性、通性嫌気性または好気性であることが好まし
い。この方法において好ましく使用しうる特別の宿主は酵母および細菌を包含す
る。特定の酵母はサツカロミセス属の酵母、特にサツカロミセス・セラビシエを
包含する。
特定の細菌は、バチルス属およびエシェリヒア属およびシュードモナス属の細菌
を包含する。他の種々の好ましい宿主は上記第1表に記載されている。さらにま
た本発明の他の好ましい実施態様において、バチルス・サブチリス、E、コリま
たはシュードモナス・エルギノーザが宿主微生物として選択される。
宿主生物およびベクターが選択された後、ベクターは当業者に一般に知られてい
る方法を使用して、宿主生物に移される。かかる方法の例は、ここに参考として
編入されるAdvanced Bacterial Genetics by
R,W。
Davisら、Co1d Spring Harbor Press、 Co1
d SpringHarbor、 New York (1980)に見い出す
ことができる。
ひとつの実施態様において温度調節は下記に記載するように操作エレメントを使
用することにより遺伝子発現を調節する方法として考えられるので、形質転換は
低い温度で起ることが好ましい。もうひとつの実施態様において、もし浸透圧調
節剤がベクターに挿入されている場合、形質転換中の塩濃度の調節は合成遺伝子
の適切な制御を確実にするために必要となるであろう。
組換えIGF結合結合タンパ音質母中で最終的に発現させることを考えるならば
、クローニングベクターを、はじめにE、コリ中に移入し、その中でベクターを
複写し、増幅の後、そこからベクターを得て精製することか好ましい。続いてベ
クターはIGF結合結合タンパ音質終的発現のために酵母中に移されるであろう
。
宿主微生物はIGF結合タンパク質発現に適切な条件下で培養される。これらの
条件は宿主生物に一般に特定的であり、かかる生物のための成育条件に関する出
版された文献、例えばここに参考として編入されるBergey’s Manu
al of Determinative Bacter4o1ogy。
8th ed、、 Welliams & Wilkins Company、
Baltimore。
Mary 1andを考慮すれば、当業者により容易に決定される。
ベクター中に挿入されたまたは存在する任意の操作エレメントに依存するDNA
配列の発現を調節するのに必要な任意の条件は、形質転換および培養段階で有効
であろう。ひとつの実施態様において、DNA配列の発現を阻害する適切な調節
条件の存在下で、細胞は高い密度にまで増殖する。最適の細胞密度に近づいた場
合、環境条件を移動性DNA配列の発現に適切な条件に変化させる。したがって
、IGF結合結合タンパ音質生は宿主細胞の増殖が最適密度付近になった後の時
間帯に起り、そして生じたIGF結合結合タンパ音質場合によってはその発現に
必要な調節条件が誘導された後に採取されるであろうことが考えられる。
本発明の好ましい実施態様において、組換えIGF結合結合タンパ音質取の後で
それが活性構造をとる前に精製される。本発明者らは、タンパク質がはじめに精
製される場合は高収量の再び折り重なったタンパク質を回収するのが容易になる
と考えるので、この実施態様が好ましい。しかしながら、ひとつの好ましい別の
実施態様においは、IGF結合結合タンパ音質び折り重なって精製の前にその天
然型構造をとることが許されうる。さらに他の好ましい別の実施態様においては
、IGF結合結合タンパ音質養培地からの回収る際して、そのふたたび折り重な
った状態をとるようにされる。
ある状況において、 IGF結合結合タンパ音質主微生物中で発現される際およ
びそのタンパク質か細胞壁もしくは膜を通ってまたはべりプラズム空間に移送さ
れる際に、その特育の活性構造をとるであろう。もし適切なリーダー配列をコー
ドするDNAが組換えタンパク質をコードするDNAに結合されている場合、こ
れが一般に起こるであろう。本発明の好ましいIGF結合結合タンパ音質胞内膜
から転位する際に成熟した活性形態をとるであろう。数々のシグナルペプチドの
構造は、ここに参考として編入される例えばMarionε、E。
Watson、 Nuc、Ac1d Res、 12:515−5164 (1
984)に出版されている。これらのリーダー配列は移動性DNAとともに、細
胞膜を通り移送され、細胞から放出される際に切断されるリーダー配列部分を有
する融合タンパク質の細胞内産生を導くであろう。
好ましい実施態様において、E、コリOmpAタンパク質のシグナルペプチドが
リーダー配列として使用され夏GF結合タンパク質構造をコードする移動性DN
A配列と連続した位置に配置される。
さらに、好ましいリーダー配列は、ベータラクタマーゼ、カルボキシペプチダー
ゼG2およびヒトシグナルタンパク質のリーダー配列を包含する。これらのおよ
び他のリーダー配列は記載されている。
もしIGF結合結合タンパ音質その適当な構造をとらない場合、形成された任意
のジスルフィド結合および/または生じた非共存の相互作用は、 rGF結合結
合タンパ肪質の活性構造をとることができる前に、例えば塩化グアニジウムおよ
びベータメルカプトエタノールのような変性および還元剤ではじめに切断され、
次いで希釈しこれらの剤は制御された条件下で酸化されるであろう。
ここで考えられている翻訳ターミネータ−はベクターを安定化するのに役立つ。
特に、ここに参考として編入されるGentzら、Proc、 Natl、 A
cad、 Sci、 USA78:4936−4940 (1981)に記載さ
れているこれらの配列は、本発明での使用が考えられる。
■、動物細胞中におけるIGF結合結合タンパ音質伝子発現
高等真核細胞中のIGF結合結合タンパ音質現のために上記に匹敵する方法は実
施例6に記載されている。
下記の実施例により本発明の目下好ましい種々の実施態様を説明する。これらの
実施例であげられる出版物はここに参考として編入される。
実施例
実施例1−タンパク質調製
A、材料
ヒト羊水は廃棄された羊水穿刺試料から採取した。
硫酸アンモニウムおよび塩化ナトリウムはEM 5cience。
Cherry Hill、 NJより購入した。DEAEセルロース、過硫酸ア
ンモニウム、ナトリウムチオシアネート、セファデックスG−100、ポリエチ
レングリコール(MW 8.000)および炭酸アンモニウムはSigma C
hemical Co、、 St。
Louis、 MOより購入した。フェニルセファロースCL−4−BはPha
rmacia Piscataway、 NJより購入した。DEAEセルロー
スはWhatmanより、そしてC−4逆相HPLCカラムはVydac、 H
e5peria、 CAより購入した。アセトニトリル、 Gel Code’
銀染色キットおよびトリフルオロ酢酸はPierce Chemical Co
、、 Rockville、ルより購入した。トリス、SDSおよびTEMED
はBethesda Re5earchLaboratories、 Gait
hersburg、 MDより購入した。グリシン、ブロモフェノールブルー、
5ervalyt”等電点電気泳動PrecoteslIおよびグリセロールは
、5erva。
Heidelbcrg、***より入手した。組織培養プレートはFalcon
Labware、 Division、 Becton Dickinson。
0xnard、 CAより購入した。
B、刺激性および阻害性のIGF結合タンパクの羊水からの精製
粗製羊水(230d)に硫酸アンモニウム(33%w/v)45グラムを添加し
て平衡化し、溶液を8°Cで30分間攪拌した。この混合物を20分間27.0
00 X gで遠心分離し、ペレットを0.05M )リスHC!! (1)l
(7,4) 50cc中に再構成した。この溶液を50%硫酸アンモニウムとな
るように調整し、30分間攪拌し、遠心分離段階を繰り返した。ペレットを0.
05M )リス(pH7,4) 50ccに再懸濁し、飽和硫酸アンモニウム1
.2−を添加して最終濃度0.14Mとした。この溶液を予めlO%硫酸アンモ
ニウム中0.05MトリスpH7,4で平衡化しておいたフェニルセファロース
カラム(Z 2 x15.0an)に適用した。試料適用の後、吸光度(280
1M)がベースラインに戻るまで、負荷緩衝液で洗浄した。カラムは、(1)0
.05M )リス、1)H7,4゜0.5ナトリウムチオシアネート、 pH7
,4: (2)0.05M )リス、 pH7,4; (3) 0.02M )
リス、pl(9,0;および(4)H*を含有する段階的塩濃度勾配を用いて溶
離した。後記する実施例1.F、に記載のとおり、各画分のIGF−I結合活性
を検定した。活性画分を合わせ、1.0M酢酸で1)Hを7.2とし、予め0.
OIM (NHi)tcOs、 0.01M NaC1゜pH7,2で平衡化し
ておいたDEAEセファロースカラムに溶液を直接適用した。試料適用後、吸光
度(2801M)がベースラインに戻るまで、平衡緩衝液でカラムを充分洗浄し
た。カラムを、負荷緩衝液中0.1 、0.25および0.5および1.0Mの
NaC1を含有する段階的塩濃度勾配を用いて溶離した。両分のIGF結合活性
を前記したように検定した。活性の80%を超える量が100または250nM
のNaClで溶離した。これらの2つのピークを、BおよびCと命名し、を別々
に精製した。ピークBブールの1.5 ccを予め0.04%TFAで平衡化し
ておいたC−4Vydac逆相HPLCカラム(0,46X 25an )に適
用した。移動相を5分間、定組成溶媒溶離し、次いで、25分間かけて0−1a
n%アセトニトリル+0,04%TFAの直線状勾配溶離を行った。各画分のI
GF結合タンパク活性を測定し、活性画分を合わせて一20℃で保存した。
イオン交換カラムから溶出したブールCを先ずセファデックスG−100カラム
クロマトグラフイーで精製した。プールCの10ccを、予め0.01(NH4
)CO,、0,05MNaC1,pH7,2で平衡化しておいた2、2X90a
oカラムに適用し、約9ccの画分を回収した。IGF−I結合活性を測定し、
前記したように逆相C−4カラムに直接適用した活性画分プールを用いた。
C0物理化学的分析
ピークBおよびCの純度をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た。泳動ゲルは0.375M )リス、pH8,8を含有する12%アクリルア
ミド、試料添加集積ゲルは0.125M トリス、pH6,8中の4%アクリル
アミドを用いた。試料0.1−10Mgを0.1M トリス、 pl6.8.1
0%グリセロール、5%SDSおよび0.02%ブロモフェノール中に希釈して
75μlとし、試料を5分間100°Cに加熱した。上清を清澄化し、ゲルレー
ンに適用し、65ボルトで14時間タンパクを分離した。銀染色はGel co
de”銀染色キットを用いて実施した。この方法の検知下限は既知タンパク標準
物を用いて測定したところ25ngであった。ゲルを5時間、50%エタノール
、5%酢酸中に固定し、次に4時間にわたり、脱イオン水を4回交換して洗浄し
た。最終的水洗は銀溶液と交換しく20mj7銀濃縮液+28〇−水)で60分
間、穏やかに振とうした。短時間水で洗浄した後、還元剤アルデヒド+還元剤塩
基(使用直前に混合)に含有する還元溶液を添加し、充分な強度のタンパク質バ
ンドが観察されるまで8〜lO分間穏やかに振とうした。還元剤溶液を2〇−安
定剤塩基+880−水を含有する安定他剤溶液を用いる3回連続した30分間洗
浄出置きかえた。
D、アミノ酸組成および配列の分析
各タンパク500ngを真空下、150℃で1時間、0.1%フェノールを含有
する6N塩酸下で凍結乾燥した。
アミノ酸をフェニルイソチオシアネートで誘導体化し、標識したアミノ酸をNo
vaPak−C18逆相を用いて分離した。アミノ酸配列の決定は実施例3に記
載した。
E、炭水化物含量の測定
ピークBまたはCの何れかが炭水化物を含有するかどうかを調べるため、各ピー
ク5.0μgを12%SDSポリアクリルアミドゲルに負荷し、前記したように
して14時間分離した。フェチユインは標準物質として平行して泳動された。ゲ
ルを10%酢酸/25%イソプロパツールで固定した。次にゲルを順次(1)0
.5%過ヨウ素酸;(2)0.5%亜砒酸ナトリウム;(3)0.1%亜砒酸ナ
トリウム5%酢酸; (4) 5%酢酸;(5)シッフ試薬;および(6)0.
6%メタ重亜硫酸ナトリウム10.OIM塩酸で洗浄し、2時間染色した。
ピークBまたはCが炭水化物を含有するかどうか更に調べるために、各タンパク
2.0μgを予め0.02 )リス、 pH7,5,2mM CaC1tおよび
2 mM MgC1tで平衡化させておいたコンカナバリン−A−セファロース
カラムに適用した。カラムに2時間かけてゆっくり負荷し、22°Cで45分間
放置した。カラムを更に出発緩衝液2〇−で洗浄し、次に糖タンパクを0.5M
メチル−D−マンノシ下および0.1 M NaC1を含有する0、02M )
リス、 pH7,5の10m1で溶離した。1時間後カラムを溶離した。
次にカラムに再度同じ溶液を満たし、8℃で一夜放置した後に、溶離した。カラ
ムを更に、0.5Mメチル−D−マンノシドおよび1MNaclを含有する0、
02M )リス、pH7,5で溶離し、画分のIGF結合活性を前記したように
して測定した。
F、 ”’I−IGF−I結合能
カラム画分のIGF−I結合活性を以下のとおり測定した。即ち、各画分を10
ulを、0.1 M Hepes、 0.1%BSA、 0.01%トリトンX
−100,44mM NaHCOz、 0.02%NaN5. pH6,0(総
量250μl)中22°Cで、60分間、40.000CPM ”’I−IGF
−I (150μCi/μg)とともにインキュベートした。[GF−IはE’
Ercole、 A、J、、 Underwood、 L。
E、、 Van Wyk、 J、J、、 Decedue、 C,J、、および
Foushee。
D、B (1976)の「成長ホルモンと関連ペプチド(GrowthHorm
one and Re1ated Peptides) J (Pecili、
A、、およびMueller、 E、E、編) pp、 190−201.
Excerpta MEdica。
Amsterdamに記載のとおりヨウ素化したが、この記載は参考のため本明
細書に組み込まれる。最終濃度12.5%となるように1%免疫血清グロブリン
および25%ポリエチレンゲルコール(MW 8.000) 500μlを添加
することにより、結合および遊離の”’I−IGF−Iを分離した。混合物を1
0時間8.000Xgで遠心分離し、次に、ペレットを6.25%で洗浄し、最
終ペレットをガンマスペクトル分析器で計数した。活性画分の各プールを幾つか
の濃度で再検定し、結合能をヒト羊水標準物質と比較した。結果を用いて単位値
を各プールについて設定した。各単位は最大IGF−I結合の50%を達成する
のに必要な物質の量とした。
純粋なIGF結合タンパクのIGF−1に対する結合能および親和性を測定する
ために、放射性標識IGF−1(40,000cpm/試験管)を、0.02M
リン酸塩緩衝液、 pH7,40,5i中、各結合タンパク10ng/rnlお
よび漸増の濃度の未標識IGP−Iとともにインキュベートした。4℃48時間
の後、結合タンパクに対抗するウサギ抗体1:1.000希釈液を添加すること
により結合および遊離の12S(−IGF−Iを分離し、インキュベーションを
12時間継続した。この時点で、ヤギ抗ウサギ血清2μlを添加し、混合物を2
2°Cで1時間インキュベートし、次に、正常ウサギ血清2μlを添加し、混合
物を更に1時間インキュベートした。10分間8.000Xgで遠心分離するこ
とにより結合および遊離の成長因子を分離した。
G、 DNAへの3H−チミジン取り込みの測定純粋なピークBおよびCの物
質の生物学的活性は、ブタ大動脈平滑筋細胞におけるDNA合成を刺激する各物
質の能力を測定することにより評価した。Ross、 R。
(1971) J、 Ce1l biol、 50.172−186に記載のと
おり、平滑筋細胞を単離し、保存培養物として維持した。この文献は参考のため
本明細書に組み込まれる。保存培養物から取出した細胞は、10%ウシ胎児血清
含有DMEM(Gibco)中、8.000細胞/ウエルで接種することにより
、96ウエルのマイクロプレート(Falcon 3004)中で継代培養した
。接種5日後、ウェルを1同焦血清DMEMで洗浄し、次に、被験因子を、1%
乏血小板血漿(PPP)および0.5μci”)(−チミジンを添加した0、
2 mlDMEM以上、各ウェルに添加した。PPPはClemmons、 D
、R,(1983)のJ、Ce1l Physiol、 114.61−67に
記載の方法に従って調製した。この文献は参考のために本明細書に組み込まれる
。
H0等電点電気泳動
等電点を測定するために、ピークBおよびCのタンパク25μgをpH3−10
のブレカスト等電点電気泳動プレー) (Servalyt” Precote
s”)に適用し、既知標準物質20μgを平行レーンで泳動した。タンパク質を
200ボルトで1.5時間、次に1000ボルトで1.5時間、等電点電気泳動
した。ゲルを2分割し、一方を10%TCAに固定し、次いでクマシーブルーで
染色した。もう一方は0.5 anの断片に切断し、0.04%TFAで溶離し
た。溶出液のIGF結合活性を前記したように分析した。
I、 IGF結合タンパクの特性
羊水230ccの硫酸アンモニウム沈澱は33および50%ペレットの両方でI
GF結合活性回収を示した。活性の大部分は50%ペレットに存在しており、こ
れをそれ以降の精製のために選択した。フェニルセファロースクロマトグラフィ
ーの間、混入タンパクの大部分は0.05Mナトリウムチオシアネートで溶離さ
せた。IGF結合タンパク質を含有するピークは0.02M )リス、pH9,
0で溶離し、これは9.5倍に精製されていた。イオン交換クロマトグラフィー
により更に精製すると、100および250mM塩で溶出する2つの主要な結合
活性のピークが分離された(第2図)。これらのピーク(ピークBおよびC)を
更に別々に精製した。ピークCの物質はセファデックスG−100クロマトグラ
フイーにより精製した。結合タンパク活性は巾広いピークにわたり溶離したが、
より大きい分子量の混入物質からは分離された(第3図)。G−100精製物質
の60Mgを更にC−4カラムに逆相HPLCにより精製した。活性物質は50
%アセトニトリルで単一ピークとして溶離し、3ケ月迄の期間、この緩衝液中で
安定に保存された(第4A図)。
ピークBは逆相HPLCを用いてCと同様の方法で精製し、この段階で9.4倍
の精製がなされた(第4図)。
各タンパクの純度を測定し、分子量を推定するために、各精製段階におけるピー
クCのタンパクを非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、その
後、銀染色を行なった。第5図に示される通り、純粋な生成物は34Kdであり
、最終精製段階後は単一バンクとして出現している。フェニルセファロースを用
いた段階が混入タンパクの除去のためには最も効果的な操作であると考えられた
。ピークBおよびピークCを比較すると、両方が5OS−PAGEにおいて同一
のRf値を有することが示される。推定分子量は非還元条件下では36Kdであ
ったが、タンパクを還元上後に電気泳動に付した場合は38Kdに増大した。ピ
ークBおよびCのアミノ酸組成を測定したところ、第■表に示す通り、はぼ同一
のアミノ酸比が得られた。
第■表
IGF−I結合タンパクのアミノ酸組成アスパラギン酸 7.3
7.6およびアスパラギン
セリン 8.5 8.7グリシン
9.0 7.7ヒスチジン 2.1 2.1ア
ルギニン 4.9 4.6スレオニン
3.8 4.5アラニン 、 12.4 1
1.1プロリン 8.0 8.8チロシン
2.8 2.5バリン 3.8
3.8メチオニン 0.7 0.6システイン
4.4” 5.6”イソロイシン 3.
63.90イシン 8.1 8.2フエニルアラニ
ン 2.0 1.7a、加水分解後のシスティン標準物質の回
収率に基づく。
b、加水分解後にトリプトファンは検出できなかった。
アミノ酸配列決定に伴うピークBの還元およびアルキル化により、後の実施例3
に示すN末端配列が解った。両方のタンパク質は10分間100°Cに加熱した
後にも安定であり、そしてpH2,5でも安定であったが、I)H2,0ではI
GF結合活性は破壊された。
純粋なピークBまたはCの調製物がコンカナバリンAに付着したことが注目され
たため、更に物理化学的分析を行なって、炭水化物側鎖が存在するかどうかを調
べた。各タンパク2μgをCon Aカラムに適用したところ、ピークCの51
%が付着し、0.5Mアルファメチルマンノシドで溶離したが、ピークBは僅か
24%が付着したのみであった。一方、ピークBまたはCの各々20μgをシッ
フ塩基で染色したところ、炭水化物は何れのタンパク質でも検出されなかった。
フエチェイン標準物質の染色強度に基づけば、タンパク質は炭水化物として、そ
の重量の0.8%未満を含有していた。
IGP−Iへの各タンパク質の親和性を調べるために、漸増の濃度の未標識IG
F−Iおよび12’I−IGFをピークBまたはCとインキュベートし、結合複
合体を免疫沈降させた。データはスカッチャードブロットにより分析した。両方
のタンパク質は、高親和性および低親和性の結合部位を有する2部位モデルまた
は、負協同性を有する1部位モデルの何れかに合致する結合特性を有している。
ピークBおよびCタンパクの高親和性部位の相対親和性は極めて類似しており、
それぞれ、1゜06および1. I X 1010L/Mであった。
ピークBおよびC物質の物理化学的類似性にもかかわらず、これらの物質は著名
に異なる生物学的特性を有することが解った。純粋なビークB物質はIGF−I
への平滑筋細胞DNA合成応答を大きく強化するが、単独または等価濃度のヒト
インスリンの存在下では作用を示さなかった。一方、ピークCの物質は基礎およ
びIGF−I刺激のiH−チミジン取り込みを阻害し、ピークB + IGF−
Iへの応答を顕著に阻害した。この作用は、1、 Ong/rnlでピークCも
の低濃度で検知可能であり、そして、2ong/−で最大となった。従って、2
つの形態のIGF結合タンパクがヒト羊水に存在し、これらは生物学的系で試験
する場合に顕著に異なる生物学的特性を有することと考えられた。
実施例2−IGF結合タンパクによるIGF−Iの強化1、細胞培養方法
ブタ大動脈平滑筋細胞を前記したRoss(1971)の方法により単離した。
保存培養物を10anプラスチック培養皿(Falcon Labware D
ivision、 Becton Dickinson。
0xnard、 CA #3001)中8.000細胞/alで接種した。保存
培養物は10%ウシ胎児血清(FBS)(Hyclonelabs。
Ogden、 UT)添加ダルベツコ改変イーグル培地(DMEM)(Gran
d l5land Biologcal CO,、Grand l5land、
NY)(Gibco)中に維持した。これらはトリプシン0.03%。
EDTA O,02%(Gibco)で細胞を取出し、1:5希釈度で再度植え
継ぎすることにより10−12に日毎に継代した。
全実験は4代目および7代目の間の細胞を用いて行なった。個々の実験は10%
FBS添加0.2 mJ DMEM中、96ウエルのマイクロプレー) (Fa
lcon #3004)中で、8、000細胞/ウエルで植菌し、5日間増殖さ
せた培養物を用いて行なった。この時点で血清含有培地を除去し、1%乏ヒト血
小板血漿(PPP)および0.5μCi’H−チミジン(15Ci/ミリモル)
(Schwartz−Mann、 Orangeburg、 NY)を添加し
たDMEM O,277L77に被験物質を添加した。対照群のウェルには1%
PPPまたは種々の濃度のヒト血清1−10%を含有するDMEMを入れた。P
PPおよび血清はClemmons、 D、R,(1983) J、Ce1l
Physiol、 114:61−67に記載のとおり調製した。PPPはRI
Aにより約20pg/−血漿根因子■を有することが解った。36時間のインキ
ュベーションの後、反応を停止し、DNAに取り込まれた3H−チミジンの量を
Clemmons、 D、R,(1983)J、Ce1l Physiol、
114:61−67に記載の方法により測定した。
ニワトリ胚線維芽細胞を14〜16日齢のニワトリ胚皮膚から単離した。−次外
植片を4%FBS (Hyclone)。
10%ニワトリ血清、ペニシリン100U/y++/およびストレプトマイシ1
00 u g/ me (G i bco)を添加した培地199(Gibco
)に接種した。外植片から増殖した細胞を1回植え継ぎ、次に10%FBS添加
DMEλ1中3.000細胞/ウエルで96ウエルのプレーh(Falcon
#3004)継代した。5日後、単層を洗浄し被験因子を0.5μCi”H−チ
ミジンおよび1%PPPを含有するDMEM 0.2−とともに添加し、次に、
前記したように36時間インキュベートした後に3H−チミジンの取り込みを測
定した。マウス胚線維芽細胞を18日齢のBa1b/Cマウス(皮膚)から採取
し、lO%FBS、 10mMグルタミン(Sigma、 St、 Louis
、 MO)およびペニシリン100U/yd、ストレプトマイシン100mcg
/mj(Gibco)を添加したDMEM中で成長させた。3代目および5代
目の間の培養物を全試験に用いた。
ヒト線維芽細胞をHuman Mutant Genetj+ Ce1l Re
−pository(Camden、 NJ)から購入した。これらを1.00
0/Tniペニシリン、100μg/rnl!ストレプトマイシンおよび10%
ウシ血清(Colorado Serum Co、、 Denver、 CO)
を添加した最小必須培地(MEMXGibco)中の保存培養物中に維持した。
これらを、l:4の継代希釈比で7日毎に植え継いだ。4代目および5代目の間
の培養物を、マイクロプレート上にs、 ooo細胞/ウェルの密度で接種し、
個々の実験に用いた。5日後、培養物を2回MEMで、そして1%PPP、0.
5μCi ”H−チミジン添加0、21nIMEMで洗浄し、被験物質を添加し
、次に前記したように36時間後に3H−チミジン取り込みを測定した。
結合タンパクがIGF−Iへの細胞増殖応答を強化するかどうかを判定するため
、ヒト線維芽細胞または平滑筋細胞を、1.0cc DMEM+ 10%FBS
(平滑筋)またはMEM+lO%仔ウシ血清(線維芽細胞)を含有する24ウ
エルのプレート(Falcon #3003)中、15.000細胞/Ciの密
度で接触した。2時間後、細胞の結合を行なうために培地を吸引し、1%PPP
を含有する培地1.0 ccを添加した。12時間インキュベーションして、細
胞を静止させたのち、培地を除去し、1%PPPおよび被験物質を含有するME
M 1.0 ccと交換した。48時間のインキュベーションの後、培養物を3
7°Cで10分間1.0 ccの0.5%トリプシン、0.03%EDTAに曝
露した。これを取り出し、0.5 mM NaC19,0ccに添加し、細胞数
を粒子データ計数器(Coulter、 ZBI型)を用いて測定した。
実施例1でヒト羊水から精製した結合タンパクを静止期のブタ大動脈平滑筋細胞
培養物とともにインキュベートした。この細胞型を選択した理由は、これがその
細胞表面へ付着するIGF結合タンパクを有さないためである。IGF結合タン
パクのみを添加した場合は、3H−チミジン取り込みの刺激は最小であった(第
1A図) 、 IGF−I (20ng/mj)またはインスリン(10μg/
−)の添加では、それぞれ15および38%の3H−チミジン取り込み増大が生
じたのみであった。一方、IGF−I (2ong/d)十純粋結合タンパク(
100ng/ml)の添加では、10%ウシ胎児血清への細胞応答を超える4、
4倍刺激が生じた。lOμg/−の濃度では、インスリンはI型IGF受容体に
は結合するが、結合タンパクには結合しない。これらの濃度のインスリンを結合
タンパクとともに添加した場合は、細胞複製応答の強化は存在せず、このことは
結合タンパク作用の活性化はIGFに特異的であることを示している。
種々の種の細胞型が同様の様式ではIGF結合タンパクに応答するかどうかを判
定するために、このタンパク+IGF−Iの作用をニワトリおよびマウスの胚線
維芽細胞培養物を用いて試験した。これらの細胞型を選択した理由は、ニワトリ
細胞はIGF結合タンパクを合成しないが、I型IGF受容体を有するためであ
る。マウス細胞は異なる形態のIGF結合タンパク(MW推定22K)を分泌し
、何れの細胞型もIGF結合タンパクを有さす、何れの細胞型においても3H−
チミジン取り込みの機会は最小限のみであった(第1B図および0図)。一方、
100 ng/−の結合タンパク+IGF−IはIGF−I ヘ(7)細胞応答
の明らかな強化を示した。ニワトリ線維芽細胞は特に感受性が大きく、僅か5
ng/−のIGF−Iを含有する10%ヒト血清により誘発された最大応答の8
1%に達した(第1B図)。マウス線維芽細胞もまたIGF結合タンパクおよび
IGF−Iの共インキュベーションの作用に対して感受性であった(第1C図)
。何れの細胞型もインスリン+IGF結合タンパクに応答せず、このことは3H
−チミジン取り込みの最大の刺激を達成するためには、結合タンパクIGF−I
複合体が形成されなければならないことを示している。
ヒト線維芽細胞、即ちIGF結合タンパクを合成する細胞型がやはり外から添加
したペプチドに対して応答するかどうか調べるために、静止期のヒト線維芽細胞
培養物を第2図に示すように調製した。漸増濃度のIGF−Iを添加することに
より、DNAへの3H−チミジン取り込みは増大し、20ng/rn1で最大と
なり、1%PPPのみに曝露した対照培養物より82%大きい値を示した。
ニワトリまたはマウスの線維芽細胞に比較して、IGF−■のみへの応答が増強
されているのは、内因性分泌IGF結合タンパクに起因すると考えられる。 I
GF結合タンパクのみの添加では、DNA合成の増大は生じなかった。しかしな
がら、このタンパク1100n/mlを漸増濃度のIGF−Iとともに添加した
場合、DNA合成は10%ヒト血清と同等の水準まで増大した。本発明者等は、
Clemmons、 D、R,、J、 Cl1n、 Invest、 77:1
548−1556(1986)に記載の通り、これらの細胞がIGF結合タンパ
クを合成し培地中に分泌すること、および、このタンパクか細胞表面に結合でき
ることも判定している。しかしながら、線維芽細胞は培地中濃度22−5n/m
lとするのに充分な結合タンパクを分泌するのみでありそして、これらの培養物
には50ng/mlか添加されているため、この差か恐らくは、観察された3H
−チミジン取り込みの付加的な増大をもたらしたものと考えられる。
これらの応答が結合タンパクの濃度に依存するかどうかを調べるため、漸増の濃
度(1−100ng/ ml)の結合タンパク十一定濃度のIGf−I (lo
ng/ me>を平滑筋細胞培養物とともにインキュベートした。培養物は2H
−チミジン取り込みの顕著な増大を伴って結合タンパク2ng/dに応答したが
、最大作用は1100n/meを使用するまで観察されなかった(第2図および
第3図)。
培養した線維芽細胞は2−5 ng/−の範囲のIGF結合タンパクを分泌する
ため、この結果は、線維芽細胞は、恐らくは最大DNA合成応答を達成するのに
充分な量の結合タンパクを分泌していなかったことを示している。
IGF−I+結合タンパクにより刺激された細胞が全細胞周期を経過できるかど
うかを調べるため、平滑筋細胞およびヒト線維芽細胞を低密度で接種し、血清除
去により静止させた。12時間後、結合タンパクおよびIGF−Iまたはインス
リンを被験培養物に添加し、60時間培養した後に、細胞数を測定した。IGF
−Iまたはインスリンのみを添加した場合、平滑筋細胞数は3%および11%の
増大がみられたが、結合タンパク+IGF−I(10ng/ml)は2..4倍
の増大をもたらした。この増大は10%ヒト血清で誘発されたものよりも大きか
った(第4A図)。IGF−I単独の作用がより大きかったものの、同様の結果
がヒト線維芽細胞でも得られた(第4B図)。IGF−I単独では、31%増大
が観察されたのに対し、結合タンパク+IGF−Iの組合せでは48時間後の細
胞数は2.1倍が観察された。
実施例3 1GF−I結合タンパクの配列1、 2つの方法を用いて、羊水から
精製した刺激性IGFBPのアミノ酸配列を測定した。このタンパクを37℃で
1時間0. OIM DTT中で還元し、0.1Mヨード酢酸でアルキル化した
。生成物を逆相HPLCカラムを用いて再精製した。方法1では、逆相HPLC
カラムから得たタンパク質を濃縮しApplied biosystems 4
70A気相シークエンサーのフィルターに直接適用した。
方法2では、0.1M炭酸アンモニウムpH8,0中、12時間、タンパク質を
トリプシン消化(重量でタンパク質の量の1150)に付した。トリプシン処理
ペプチドを、0.1%TFAおよびアセトニトリルの濃度勾配を用いたC8およ
び04カラム上の逆相HPLCにより分離した。5peedvac内での濃縮の
後、ペプチドをシークエンサー′に供し、製造元の指示に基づき配列決定した。
以下の配列が得られた。
1、 APWCAPCSAEKLAL(Eま7’、:ハ5)PPVSASESC
VTR(、:れはN末端配列)
2、WKEPCCIELYR
3、ALPGEQQPLHALTR
4、NGFYH3R
5、FYLPNCNK
6、 GQGATVQESDASAP7、 vvESLAK
8、 IPGSPEIR
9、ALHVTNIKK
これらのペプチドを重複させるため、そして、その他のペプチドを得るためには
、タンパクを別のプロテアーゼ、例えば下顎プロテアーゼ(Arg特異的)、L
ys−Cプロテアーゼ(Lys特異的)、およびv8−プロテアーゼ(Glu特
異的)で消化し、そしてペプチドを上記したように逆相HPLCで分画し、配列
決定しなければならない。
2、羊水から得た精製阻害[GFBP(前記実施例1の精製を参照)およびGM
IO線維芽細胞から得た精製刺激性IGFBPO(後記実施例5の精製を参照)
、および他の細胞により馴化された培地のアミノ酸配列は、羊水からの刺激性I
GFBPに関する上記の方法と同様にして得ることができる。
実施例4 1GFBP遺伝子の単離
羊水の刺激性IGFBPに対して調製された抗体を用いて、 IGFBPを作る
様々な細胞系を同定した。これらの細胞にはGMIOおよびGM498系統(H
uman Mutant GeneticCel) Repository、
Camden、 NJ)、MDA231系統(AmericanType Cu
1ture Co11ection、 123012 Parklawn D
r、。
Rockville、 MD 20852−1776)およびHEC−IR糸系
統A、 T。
C,C,)が包含される。これらの細胞からIGFBPの遺伝子を単離するため
に、まず第一に1010X150プレートで供給者によって指定された培地中で
これらの細胞を集密に増殖させ、NP−40溶解法を用いて、RNAをこれらの
細胞から単離しなければならない(Maniatis、 T、。
Fr1tsch、 E、 F、、およびSambrook、 J、 (1982
) Mo1e−cular Cloning: A Laboratory M
anual、 Co1d SpringHarbor Laboratory、
pp、191−193)。オリゴdTセルロース上のクロマトグラフィーによ
りポリA”RNAを精製することができる(Aviv、 H,およびLeder
、 P、 (1972)Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 (L
ISA) 69.1408−1412) 、このRNA5μgを用いて、Gub
lerおよびHoffmanにより記載された方法(Gubler、 U、およ
びHoffman、 B、 J。
(1983) Gene 25.263−269)によって、プラントエンドの
二本鎖のcDNAを合成しなければならない。EcoR[リンカ−をつけ、その
結果生じたcDNAをラムダgtllにクローニングする(Young、 R,
A、およびDavis、 R,W。
(1983) Proc、 Natl、 Acad、 Sci、(USA) 8
0.1194−1198)。
得られたライブラリーは10’以上の独立したクローンを含存するはずであるが
、実施例1に記載のようにして精製された羊水由来刺激性IGFBPに対する適
当なポリクローナルウサギ抗体を用い、YoungおよびDavisにより記載
されたスクリーニング条件を用いて、そのライブラリーをE、コリY1090で
スクリーニングすることができる。第二の抗体(ヤギ抗−ウサギProMega
Biotec)に接合したアルカリフォスファターゼを用い、製造業者による記
載にしたかって、陽性のシグナルが検出されよう。この抗体に対して陽性である
ことを調べたクローンを次にIGFBPアミノ酸配列(前記)に基づく3種の混
合配列オリゴヌクレオチドプローブを用いて探査した。プローブ#1,237−
は、アミノ酸配列WKEPCCIEに対して可能なすべてのDNA配列からなる
192の配列の混合物である。プローブ#2.17マーは、アミノ酸配列WQC
APCに対して可能なすべてのDNA配列からなる64配列の混合物である。ク
ローン#3.177−は、アミノ酸配列PGEQQPに対して可能なすべてのD
NA配列からなる64配列の混合物である。Applied Bio−syst
ems DNAシンセサイザーでこれらのプローブを合成することができ、その
5°末端は[ガンマ−32P]−ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて比活性4−6 X 10@cpm/l)モルに標識されるべきである。抗
体に対して陽性であることを調べたクローンをE、コリY1088に塗布し、(
Benton、 W、 D、およびDavis、 R,W、 (1977)Sc
ience 196.180−182)に記載のようにニトロセルロースに移さ
なければならない。
プローブを用いた探査は1.0 M NaC1,0,1Mクエン酸ナトリウム、
2 x Denhardts溶液(Denhardt、 D、 T。
(1966) Biochem、 Biophys、 Res、 Com
mun、 23. 641−646)、0.1%SDS、 0.05%ビロリ
ン酸ナトリウムおよび150mg/nl酵母tRNAを含有するハイブリッド形
成バッファー中で行われるべきである。0.4pモル/ mlのオリゴヌクレオ
チドを用いて、各プールのオリゴヌクレオチドのうちでもっともATに富んだも
のについて計算されたTmより2°C低い温度で、そのフィルターを12−16
時間ハイブリッド形成させる(Suggs、 S、 V、(1981)。
Developmental Biology Using Purified
Genes、 Brown。
D、 D、およびFox、 C,F、(編)、Academic Press、
NewYork、 pp、683−693) 、これらの温度は以下の通りで
あるニブローブ#L60℃;プローブ#2.50°C;プローブ#3.50℃。
ハイブリッド形成後、フィルターを室温で45分間、I M NaC1,0,1
Mクエン酸ナトリウムおよび0.1%SDSで3回洗浄する。各プールのプロー
ブのうちでもっともATに富んだものについて計算されたTm (すなわちハイ
ブリッド形成温度より2℃高い)で、5分間の緊縮洗浄を行う。フィルターを乾
燥させ、陽性のシグナルをオートラジオグラフィーによって検出する。抗体およ
び二つのプローブに対して陽性であることを調べたクローンをM13配列決定ベ
クターmp18およびmp19にサブクローニングしくYanjsch−Per
ron、 C,。
Vierira、 J、およびMessing、 J、 (1985) Gen
e 33゜103−119)、(Sanger、 F、およびCoul、son
、 A、 R,(1975)J、 Mo1. Biol、 94.441−44
8)の記載にしたがって配列決定する。
最初にライブラリースクリーニングで抗体陽性クローンがまったく得られない場
合には、全ライブラリーを上記のオリゴヌクレオチドスクリーニング法にかける
べきである。上記のオリゴヌクレオチドに加えて、さらに精製タンパク質で決定
されたタンパク質配列によって表されるオリゴヌクレオチドも使用すべきである
(実施例1および5参照)。これらのオリゴヌクレオチドプローブの設計および
合成は当業者に公知である。
細胞系統の他に、天然のヒト組織をRNA源として考慮すべきであり、これを用
いてcDNAライブラリーを作ることができる。好適な組織源は、子宮の脱落膜
である。
全長クローンはそれがIGFBPに存在することが知られているタンパク質配列
および開始および終止コドンをコードするオーブンリーディングフレームを含有
することによって特徴付けられよう。全長クローンがまったく単離されない場合
には当業者に公知の方法によって部分クローンおよび適切な合成りNAからなる
完全な−揃いのDNAから全長クローンを組立てることができる。全長クローン
由来の挿入物を実施例6に記載のように発現ベクターに移さなければならない。
実施例5−線維芽細胞IGFBPの精製ヒト皮膚線維芽細胞系統GMIOまたは
GM498 (HumanMutant Genetic Ce1l Re5p
ository、 Camden、 NJ)由来の馴化培地を、破片を除去する
ために20.0OOX gで20分間遠心分離する。その上清に硫酸アンモニウ
ムを、最終濃度65%となるように添加し、その溶液を4°Cで30分間ゆっく
りと攪拌しておく。30分間の20.000 X g遠心分離から得られたペレ
ットを、0.5 M NaC1を含有する10mM0mM炭酸アンモニウムルミ
2で抽出する。その抽出物を、抽出バッファーで平衡化したセファデックスG−
100クロマトグラフイーによって分取する。IGF−I結合活性を有するフラ
クションをプールし、65%硫酸アンモニウムで再沈澱させる。
30分間の20.0OOX g遠心分離から得られたペレットを、10mM炭酸
アンモニウムpH6,5で抽出し、50mM NaC1と等しい伝導度となるよ
うに蒸留水で希釈する。この溶液を、10mM炭酸ナトリウムpH6,5および
50mM NaC1で予め平衡化したヘパリンセファロースカラムに15rIL
l/時間の流速で加える。カラムを3倍容の1MNaC1含有平衡化バッファー
で洗浄し、その後3倍容の2MNaC1含有バッファーで洗浄する。2MNaC
1含有バッファーを含有するカラムを4°Cて一晩放置し、翌朝l容の2MNa
C1でもう一度溶出する。集めた2MNaC1洗浄液をプールし、10mM炭酸
アンモニウムpH6,5および50mM NaC1に対して逆透析する。
透析物を、2■のIGF−Iおよび3mt’のReactigel X(Pie
ce Chemical)から製造業者の説明にしたがって調製したIGF−I
アフィニティーカラムに、15m1/時間で加える。このカラムは10mM炭酸
アンモニウムpH6,5および50mM NaC1で予め平衡化した。このカラ
ムを5倍容の平衡化バッファーで洗浄した後、5倍容の10mM酢酸アンモニウ
ムpH4,5および50mM NaC1で洗浄する。
次にIGFBP活性を1M酢酸で溶出する。
活性フラクションをVydac C−4逆相HPLCカラムにかけ、5分間1r
nl/分で0.04%TFA水溶液で溶出し、その後3分間にわたって25%ま
でのアセトニトリル直線濃度勾配によって溶出する。次に、30分にわたって2
5%から100%アセトニトリル直線濃度勾配でタンパク質を溶出するが、溶出
は30%アセトニトリル付近である。もしこの状態で配列決定のために純度が不
十分であれば、タンパク質を水で希釈し、再度Vydac C−8カラムにかけ
る。タンパク質はC−4カラムにかけたのと同じ濃度勾配で溶出され、溶出は約
50%アセトニトリル付近である。
実施例6−動物細胞に於けるIGFBP遺伝子の発現動物細胞でIGFBPを発
現するために、以下の工程を行う必要がある:
1、発現ベクターの構築
2、宿主細胞系の選択
3、発現ベクターの細胞への導入
4、1GFBPの発現の導入
1、多くのそれぞれ異なる種類の細胞で機能するIGFBP発現ベクターを構築
するために、プラスミドは以下のように構築されねばならない。pBR322を
EcoRIで消化し、EcoRI粘着末端をdATPおよびdTTP存在下でフ
レナラDNAポリメラーゼで処理することによって平滑末端とする。大きなフラ
グメントを単離し、MTIプロモーターおよび単純ヘルペス1型チミジンキナー
ゼ(HSV−1tk)を担い、上記のように平滑末端としたpMK(Brins
ter ら、Ce1l 27:223−231. 1981)の4 kb Ec
oRIフラグメントと結合する。この結合混合物をE、コリJM109に形質転
換し、アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性形質転換体からプラスミドDN
Aを調製する。
このDNAを制限地図作成によって特性決定し、第5図に示す構蓬に一致するプ
ラスミドを以後の実験のために選択する。
このDNAをBglIIで消化し、直鎖状になったDNAに常法によってEco
RI部位を含有する合成りNAの適当な断片をクローニングすることによって、
このプラスミドのBglI[部位をEcoR1部位に変換する。その結果得られ
たプラスミド、pMK−SGEをE、コリで増殖し、常法により再び単離し、E
coRIで直鎖状とする。
EcoRIによるDNA消化およびゲル精製を包含する標準的な方法によってλ
gtllクローンのDNAから単離された全長IGFBP cDNAを、上記M
T−1プロモータープラスミドpMK−3GeのEcoR1部位に結合する。こ
の結合およびE、コリの形質転換後、制限地図作成によって決定されるMT−1
プロモーターと同方向にIGFBP cDNAの存在するクローンを選択する。
動物細胞の形質転換のためにプラスミドDNAを調製する。
2、活性IGFBPはまだ性質のはっきりしない翻訳後修飾を受ける可能性があ
るため、その起源の天然型細胞にできるだけ近い細胞で遺伝子を発現しなければ
ならない。それに続く方法を線維芽細胞由来の刺激性IGFBPの遺伝子を用い
てここに説明する。ひとたび好適な生産細胞系統が同定されたならば、他のタン
パク質の遺伝子についても同様の方法を続ける。その時まで、線維芽細胞はIG
FBPの生産細胞としても作用しよう。
3、発現ベクターをLtk細胞または他のTK−線維芽細胞系に導入するために
、HSV−I TK遺伝子を担うpH5V−106ブラスミドDNA (Bet
hesda Re5earch Labs)と発現ベクターを混合する。混合し
たDNAを標準的なリン酸カルシウム−DNA沈澱法(S、 L、 Graha
mおよびA、 J。
Von der Eb (1973) Virology 52:456−46
7)を用いて細胞に加える。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを
含有する培地での増殖能から安全な形質転換体を選択することができる(M、
Wiglerら、(1979)Cell 16:777−786)。
IGFBP発現ベクターDNAをTK−でない線維芽細胞に導入するために、ネ
オマイシン耐性(アミノグリコシド3゛−ホスホトランスフェラーゼ)遺伝子を
有するpKSV−10(Pharmacia)にSV40プロモーターを融合す
ることによって調製した選択ベクターと発現ベクターを混合し、上記のように細
胞に同時に形質転換する。抗生物質G418存在下での増殖能から安定な形質転
換体を選択することができる。
発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する第3の方法は、機能的なジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ(DHPR)遺伝子を担持するプラスミドと発現ベクターを同時に形
質転換することである。メトトレキセート中での細胞の増殖によって安定な形質
転換体を選択することができる。
この方法は特にDHPR−CHO細胞の安定なトランスフェクションに適してい
る(F、 McCormickら、(1984) Mo1Ce11. Biol
、 4:166−172)。
上記の安定に形質転換された動物細胞のそれぞれでIGFBP遺伝子の発現を誘
導するために、細胞、を増殖培地中で10mM硫酸カドミウムにさらす。この処
理によってMT−1プロモーターが誘導され、その結果IGFBP遺伝子の発現
が約7倍増加する(Mayo、 K、 E、、 R,WarrenおよびR,D
、 Poalmiter 1982. Ce1l 29:99−108)。
IGFBP発現をさらに増加させるために、IGF−I刺激剤DNAのコピー数
を以下の方法の一つによって増幅する。発現ベクターをTK遺伝子とともに同時
に形質転換した場合には、培地中のチミジン濃度を低下させるか、またはそれを
完全に除くことによって増幅できるはずである。DHPR遺伝子とともに形質転
換することによって発現ベクターを細胞に導入した場合には、培地中のメトトレ
キセート濃度を増加させることによってその遺伝子の増幅をもたらすはずである
(F、 McCormickら、(1984) Mo1. Ce11. Bio
l、 4:166−172)。
実施例7 組換え動物細胞からのIGFBPの精製このようなIGFBPは天然
型物質と同様に細胞から分泌されると予想されるので、天然型タンパク質の精製
に関する上記の方法によって同様の精製および組換えタンパク質の特性決定を行
うことができることが予想される。
実施例8
ラムダgt−11ヒト子宮脱落膜cDNAライブラリーを前記のように作成し、
実施例4に記載のようなYoungおよびDavisの方法により、刺激性イン
スリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)に対するウサギポリクローナル
抗体を用いてスクリーニングした。ウサギポリクローナル抗体は実施例1に記載
のものである。アルカリフォスファターゼ複合第二抗体(ヤギー抗−ウサギ、P
ro Mega Biotec)を用い、業者の記載にしたがって、陽性シグナ
ルを検出した。調べたライブラリーのクローンの約0.12%が抗体に対して陽
性であった。12個の独立のクローンを精製し、挿入物をアガロースゲル電気泳
動によって比較した。約15008Pの挿入物を有する一クローンをM13配列
決定ベクターmp18に両方向にサブクローニングし、Sangerらの方法に
よって配列を決定した。このクローンは、24アミノ酸シグナル配列の後に上記
のすべてのペプチド配列を包含する233アミノ酸ポリペプチドをコードする7
768Pからなる単一のオーブンリーディングフレームを含有した。
その配列を決定し第6図に示す。
この配列はトリペプチドArgG1yAspを含有する。
IGFBP配列由来のこのペプチド、またはこのトリペプチドを含有するペプチ
ド、および隣接する残基は、IGFBPの細胞やマトリクスへの付着を妨げる働
きをし、それによってIGF−I誘導細胞増殖に関する刺激効果を妨げる。
実施例9 原核細胞(E、コリ)に於けるIGFBP遺伝子の発現およびそれか
らの生物学的に活性なIGFBPの単離
A、 IGFBP発現ベクターの調製IGFBP cDNAをE、コリにクロ
ーニングし、以下の段階によるT7 RNAポリメラーゼ依存発現ベクターpJ
U1003を第7図に示す。
1、プラスミドpJU1003を制限酵素BamHIおよびEcoRIで消化し
、大きな直鎖状ベクターフラグメントを標準的なゲルを用いる方法によって精製
した。
2、 IGFBP cDNAコード配列を含有するλgtllクローンを酵素
EcoRIおよびBstEllで消化し、コドン26からC末端までの成熟IG
FBPコード配列およびさらに600bpの3°非翻訳領域を含有する1225
bpからなるフラグメントを放出した。このフラグメントも標準的なゲルを用い
る方法によって精製された。
3、第7図に示すIGFBPの最初の25アミノ酸およびN−末端メチ才二ン(
ATG)コドンをコードする102bpの合成二本鎖オリゴヌクレオチドを調製
した。コドンの選択は高度に発現する遺伝子に於ける特定のコドンに関するE、
コリの優先性を反映する。さらに、このオリゴヌクレオチドの5°末端は結果と
してRosenberg。
A、 H,、Lade、 B、 N、、 Chui、 D、、 Lin、 S、
、 Dunn、 J。
J、、 5tudier、 F、 W、、 Gene 56:125−135.
1987(特に引例によりここに編入される)に記載のようなベクターにコード
されたT7010遺伝子のIGFBP遺伝子に対する翻訳カップリングを生じる
DNA配列を含有する。このオリゴヌクレオチドはBamHIおよびBstEl
l粘着末端を有する。
4、上記の三つのDNA配列を相互に結合し、その混合物を用いて5tudie
r、 F、 W、およびMoffatt、 B、、 J。
Mo1. Biol、189+113−130.1986 (特に引例によりコ
コに編入される)に記載のE、コリBL21/DB 3株を形質転換した。15
μg/rdテトラサイクリンに耐性のコロニーを選択し、上記実施例4に記載の
ような抗−rGFBP抗体を用いて、1mMイソプロピルB−D−チオガラクト
ピラノシド(IPTG)で誘導後の[GFBP生産でスクリーニングした。
5、陽性クローンからプラスミドDNAを調製し合成オリゴヌクレオチドに起因
する部分をJ、 Mo1. Biol。
94:441−448.1975 (特に参照としてここに編入される)に記載
のSangerおよびCoulsonの方法に従って配列決定した。
1)JtJ1020と称される形質転換体を上記のように単離し、液体培地で増
殖させた。精製天然型(羊水)IGFBPを標準として用いて、全細胞タンパク
質の5DS−PAGEにより、1mMIPTGによる誘導後生産されるIGFB
Pの総量を測定した。IGFBP約lμg/培養ml/A@ooユニットの生産
が測定された。重大なことには、この物質は天然型タンパク質の31kDと同じ
見かけの分子量でゲル中を移動した。以上の観察は、このような特徴により、天
然型IGFBPと同一の物質をE、コリ内で生産することができることを示す。
もっと効率のよいIGFBP生産株を作成するために、第8図に示すような以下
の方法でcDNAクローンの3°非翻訳領域をプラスミドpJU1020から除
去した。
1、プラスミドを制限酵素BamHIおよびHindl[[で消化した。
2、第8図に示す74bpの合成二本鎖オリゴヌクレオチドを調製した。このオ
リゴヌクレオチドは(a)ε、コリでよく用いられるコドンを用いたIGFBP
のC末端21コドンのコード配列; (b)IGFBPの翻訳終止コドン;(C
)別の翻訳解読枠に於ける付加的な翻訳終止コドン;(d)末端HindI[[
およびBam旧制限部位を含んでなる。
3、次に合成オリゴヌクレオチドを(1)に記載の消化済みDNAと混合し、相
互に連結した。連結後、混合物を酵素EcoRIで消化した。この部位はこの実
験に於いて当該のDNAに唯一の部位であるので、この操作は3′非翻訳DNA
を含有する分子のみを直鎖状にする。
4、次にこの混合物を用いてE、コリBL21/DE 3株を形質転換し、テト
ラサイクリン耐性(15μg/ml)クローンを選択した。1)JU1020構
築に関連して上に述べたようにクローンの合成オリゴヌクレオチド部分のDNA
配列の正確さ、およびIGFBP生産で、形質転換体をスクリーニングした。
陽性で正しいクローン(pJU1021)を増殖させ、上記のpJU1021構
築に関して記述したように、遺伝子発現の誘導後IGFBP生産を測定した。こ
のクローンは[GFBP約20μg/培地μi7/A、。。ユニットを生産する
。
上記のT7遺伝子10に結合したIGFBP配列を、第9図に示すような以下の
工程によって、deBoer、 H,A、。
Com5tock、 L、 J、およびVassar、 M、、によりProc
。
Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、 80:21−25.198
3 (特に参照としてここに編入される)に記載のように、tactプロモータ
ーを含有するプラスミドベクターに移した。
1、 tacIプロモーターを含有するE、コリ発現プラスミドであるプラスミ
ドpT3X I −2を酵素EcoRIおよびHindI[[で消化し、プロモ
ーター、抗生物質耐性遺伝子、および複製起点を含有する大きなフラグメントを
単離した。
2、プラスミドpJU1021を酵素Xba IおよびHindI[で消化し、
IGFBPコード配列を含有するフラグメントを単離した。このフラグメント
はT7遺遺伝子誘導後および上記pJLl1021構築に関連して記載したよう
な翻訳カップラーも含有する。
3、長さ20bpの合成オリゴヌクレオチドを調製した。
このフラグメントはプラスミドpJU1021のxba I部位のすぐ上流(5
′)のDNA配列を含有する。このDNAを用いてIGFBPコード配列をta
c Iプロモーター含有発現プラスミドに適合させる。
4、これら三つのDNA配列を相互に連結し、その混合物を用いてE、コリJM
107株を形質転換し、テトラサイクリン−耐性クローンを選択した。1mMI
PTGで遺伝子誘導後IGFBPを発現し、合成オリゴヌクレオチドの正しいD
NA配列を含有するクローンを上記のように同定した。陽性で正しい一クローン
をpJU1022と呼ぶ。
このクローンを増殖させ、遺伝子発現誘導後のIGFBP生産をpJU1020
構築についての記載のように測定した。
このクローンはIGFBPを約10μg/培養物■/Asooユニット生産する
。
B、B、コリからのIGFBPの生産
以下のようにしてE、コリから生物学的に活性なIGFBPを調製することがで
きた。プラスミドpJU1021を含有するE、コリBL21/DE3株を、1
5μg/−テトラサイクリン含有ルリアブロス中、37°CでA600が1.0
まで増殖させた。次に1mMのIPTGを添加してIGFBP遺伝子発現を誘導
し、さらに2時間増殖を続けた。次に、細胞を遠心分離によって集め、50mM
)リス、pH7,5でもとの培養量の20分の1に再懸濁し、フレンチプレス
で溶解した。15,000Xgで10分間遠心後、ベレット(不溶性タンパク質
)および上清(可溶性タンパク質)を、IGFBPの存在について5DS−PA
GE、ウサギ抗−IGFBP抗体を用いたウェスタンプロットにより分析した。
全IGFBPの約80%が不溶性画分中に見いだされた。
生物学的に活性なIGFBPはこの両分から3通りの方法により得られた。
■、ベレットを50mM )リス、pJ(7,5(もとの培養物量の1/20)
で洗浄することができる。その時的5%のIGFBPが可溶化され、遠心分離後
上清に残存するであろう。この物質はIGFBPの単量体、二量体および高分子
量体を含有し、上記ブタ大動脈平滑筋細胞バイオアッセイに於いてIGF−I活
性を増強することが示された。
2、上記のように調製した不溶性タンパク質ペレットを、6MグアニジンHCI
(もとの細胞培養物507711につき1−)に再懸濁し、室温で5分間放置
することができる。ジチオトレイトールを最終温度20mMまで添加し、その混
合物を室温で30分放置する。この混合物を13、OOOXgで15分遠心し上
清を酸化型グルタチオン最終濃度20mMと混合し、その混合物を室温に10分
間放置する。
もとの培養物50m1当り4.5艷の50mM )リスpH10,7、および最
終濃度1mMのシスティンを混合物に添加し室温で一晩放置する。次にその混合
物を50mM )リスpHgで15分間遠心分離する。
この方法で得られたIGFBPを「再び折り畳んだIGFBPJと称す。予め還
元することなしに5DS−PAGEによってこれを分析すると、二量体型IGF
BP(見かけの分子量50kDa)並びに単量体型(見かけの分子量25kDa
)を含有することが示される。非還元5DS−PAGE後にニトロセルロースフ
ィルターに移されたIGFBPに対する1281−標識IGF−Iの結合を示す
インビトロアッセイが示すように、これらの型はいずれもIGF−Iと結合する
。この再び折り畳んだ物質は記載のようなブタ大動脈平滑筋細胞を用いた***促
進アッセイに於いてIGF−I活性を増強する。
FPLC(Mono Q)によって、単量体IGFBPを二量体を含まぬように
精製することができ、単量体は0.28NaC1で溶出する。単量体のみを含有
するこの画分は、記載のようなブタ大動脈平滑筋細胞を用いた***促進アッセイ
に於いてIGF−I活性を増強しない。
3、ジチオトレイトールを添加しない以外は上記のようにして、不溶性タンパク
質ペレットを6Mグアニジン塩酸で可溶化することができる。この物質を次ぎに
50mM )リスpH7,5に対して透析する場合、沈澱が生成する。しかしな
がら、この沈澱および可溶性タンパク質を5DS−PAGEで比較すると、6M
グアニジンMCIで可溶化されたIGFBPの少なくとも50%が透析後も溶液
中に残存することがわかる。この可溶化物質が上記のようにIGF−Iに結合す
るIGFBPの単量体型および二量体型を含有することが示されうる。このグア
ニジン可溶化、透析IGFBPは、記載のようなブタ大動脈平滑筋細胞を用いた
***促進アッセイに於いてIGF−I活性を増強することが示された。
本発明の方法および産物について様々な修正および変更が可能であることは当業
者に明らかであろう。したがって、修正および変更が添付の請求の範囲およびそ
の均等物の範囲にあるならば、本発明はこのような本発明の修正および変更を包
含するものとする。
細胞数xlo−”
FIG、 5
平滑末端
FIG、 6
国際調査報告
Claims (15)
- 1.インスリン様成長因子の活性を阻害しうる、インスリン様成長因子結合タン パク質。
- 2.インスリン様成長因子の活性を強化しうる、インスリン様成長因子結合タン パク質。
- 3.第6図に示すアミノ酸配列を有するインスリン様成長因子結合タンパク質。
- 4.インスリン様成長因子結合タンパク質をコードするDNA配列を含有するベ クター。
- 5.ベクターが第6図に示すDNA配列を含有する、請求の範囲第4項記載のベ クター。
- 6. (a)前記ベクターが前記単細胞宿主に適合した複製起点をも含有する、請求の 範囲第4項記載のベクターで単細胞宿主を形質転換し、 (b)インスリン様成長因子結合タンパク質の生産に好適な条件下で、形質転換 された宿主を培養する、ことを含んでなる、インスリン様成長因子結合タンパク 質の生産のための組換えDNA法。
- 7.前記単細胞宿主がE.コリである、請求の範囲第6項記載の方法。
- 8.前記ベクターが第6図のDNA配列を含有する、請求の範囲第6項記載の方 法。
- 9.前記ベクターがpJU1020である、請求の範囲第6項記載の方法。
- 10.前記ベクターがpJU1021である、請求の範囲第6項記載の方法。
- 11.前記ベクターがpJU1022である、請求の範囲第6項記載の方法。
- 12.ベクターpJU1020。
- 13.ベクターpJU1021。
- 14.ベクターpJU1022。
- 15.請求の範囲第6項記載の方法により生産されたインスリン様成長因子結合 タンパク質。
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