JPH03504597A - インスリン様成長因子活性の強化および阻害方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はインスリン様成長因子活性を強化する方法に関する。また本発明は、こ の活性を有するヒトイン　５スリン様成長因子工およびＫ　（ＩＣＧ−Ｉおよび ■）結合タンパク質（刺激型）およびこの結合タンパク質を生成する方法に関す る。結合タンパク質（刺激型）はイＱ／トポ、およびインビトロで濾胞胤達の強 化、傷およびやけど治癒、潰瘍治癒の強化および腎臓、肺または皮膚の損傷した 組織の再上皮形成に用いられている。またこのタンパク質は損傷したニューロン および寡突起神経膠細胞の治癒の強化にも使用しつる。

さらに、本発明はヒトインスリン様成長因子結合タンパク質（阻害型）に関する 。ＩＧＦ結合タンパク質（阻害型）は腫瘍増殖の阻害アテローム性動脈硬化症班 の進行または増加の阻害および糖尿病性網膜症の阻害および肺線維症の阻害に使 用できる。

ツマトメディン（Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ）−Ｃとも命名されるヒトインスリン 様成長因子Ｉ　　（ＩＧＦ−Ｉ）は、血液中で循環し、多くの組織で合成される 成長ホルモン依存型成長因子である。成長因子ＩＧＦ−Ｉはインビトロの細胞成 長を促進するために細胞培養培地への添加物として有用である。ＥＧＦのような 血漿中で循環する他の成長因子あように、インスリン様成長因子は、担体タンパ ク質−ＩＧＦ−Ｉ複合体を形成し、そして運搬機能を果たすと信じられている結 合タンパク質に結合する。この結合タンパク質の部分的に精製された形態はＩＣ Ｇ−１のインスリン様作用を阻止することが示されている。この複合体の酸に安 定な結合サブユニットは血液から精製されており、その分、泌は成長ホルモンに より刺激されつる。

ヒトインスリン様成長因子■は成長ホルモン依存度が低いかまたは全くなく、多 くの組織で合成される。

ＩＧＦ−Ｉのように、それは運搬機能を果たすと信じられている結合タンパク質 と結合して循環する。

上記成長因子結合タンパク質とは対照的に、を髄、リンパ、および羊水のような 細胞外液および脳、胎盤および脳下垂体の組織抽出物は、種々の分子量を育し、 そして成長ホルモンに依存しないＩＦＧ結合タンパク質の形態を含有する。それ らは１０”　−１０”ｍ””範囲の親和力でＩＧＦ−Ｉおよび（ＦＧ−Ｉ［の両 者と結合する。またＩＧＦ結合タンパク質はヒト線維芽細胞およびＭＤＡ−２３ １細胞を包含する培養中のいくつかの細胞型により分泌されることも示されてい る。羊水からのタンパク質およびラット肝臓細胞より分泌される類似のタンパク 質の純粋でない調製物は、線維芽細胞のＤＮＡ合成および軟骨組織中への硫酸塩 の取り込みにおよぼすｒＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの作用を阻害することが示 されている。

しかしながら、従来のヒトタンパク質は全て、実際には２種以上のタンパク質の 混合物であった。本発明者らは初めて、これらの結合タンパク質を分離する方法 を開発した。羊水からのタンパク質混合物は少なくとも２種のタンパク質構成物 を実際に含有していることが見出された。これらのタンパク質構成物は顕著に異 なる活性、すなわち一方はＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を刺激または増 強することができ、もう一方はＩＧＦ−■およびＩＧＦ−ＩＩの成長因子活性を 阻止することができることが見出された。これら２種の構成分タンパク質（これ らを実質的な純度に単離することはここに初めて記載される）は、この出願の目 的のためにそれぞれＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）およびＩＧＦ結合タンパク 質（阻害型）と呼ばれるタンパク質は翻訳後修飾型、おそらくジスルフィド結合 配置において異なることを実験は示している。かかる変化は細胞またはＩＧＦＢ Ｐおよびそれらの生物学的活性のマトリックス結合に観察される相異の原因とな りつる凝集程度の相異に導くでンパク質は本発明者らによりヒト線維芽細胞馴化 培地から単離された。ＩＧＰ結合タンパク質のようなこの形態は羊水からの刺激 型のようなＩＧＦの作用を強化する。

これはＩＧＦ（刺激型）に対するポリクローナル抗体と交差反応するが、同じタ ンパク質ではないかもしれない。

精製したＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）は３２−３８にダルトンの推定分子量 を有する。これらの精製タンパク質は細胞表面に付着した場合、　ＩＧＦレセプ ターおよび細胞表面に結合するＩＧＦの量を増大させる。驚くべきことにこの増 大した結合ＩＧＦ量はＩＧＦ活性の相乗的強化作用を生じる。

実質的に精製されたＩＧＦ結合タンパク質（阻害型）も３２−３８ＫＤの分子量 を有するが、細胞表面に付着せずＤＥＡＥセルロースカラムで後から溶出する。

以下に続く考案において、ＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質またはＩＧＦ−ＩＩ結合タ ンパク質についての言及は文脈が別に指示しなければ、いずれか一方または両者 の種に関するものと考えるべきである。また、略語ＩＧＦＢＰはＩＧＦ結合タン パク質について言及するために使用されることがある。

発明の要約 本発明の目的は、ある特定の成長因子の活性を増大することが可能な化合物を提 供することである。特に、本発明、の目的はインスリン様成長因子Ｉおよび■型 （ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−Ｉ［）の活性の増大を可能にする化合物を提供する ことである。

また本発明の目的はＩＧＦ−Ｉおよび［ＧＦ−ＩＩの作用を妨げることが可能な 化合物を提供することである。

さらに本発明の特別な目的はこれらのタンパク質のそれぞれを実質的に精製され た形で得る方法を提供することである。これらの化合物の精製を提供する方法は 、化合物がそれらの相対的ＩＧＦ作用活性の保持を可能にする。これらの方法は 自然に存在するタンパク質を精製する方法および他の細胞または培養細胞中にＩ ＧＦＢＰを生成する組換えＤＮＡ法、そしてこれらのタンパク質を精製する方法 の両者を包含する。

これらの目的を達成するためそして本発明の目的に従って、　ＩＧＦの細胞成長 作用を強化する方法が提供される。この方法は （ａ）　　実質的に精製された形のＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）を得ること 、お−よ−び５２７、（ｂ）　　成長を刺激しようとする細胞をＩＧＦ結合タン パク質（刺激型）およびＩＧＦにさらすことを包含する。

また本発明の目的を達成するためにも、そしてこれらの目的にも従って、ＩＧＦ の細胞成長作用を低下させる方法が提供される。この方法は （ａ）　　実質的に精製された形のＩＧＦ結合タンパク質（阻害型）を得ること 、および （ｂ）　　成長を阻止しようとする細胞をＩＧＦ結合タンパク質（阻害型）にさ らすこと、から成る。

本発明の目的をさらに達成するために、そしてその目的にさらに従って、　ＩＧ Ｆ結合タンパク質（刺激型）および（阻害型）を精製する方法が提供される。こ れらの方法は、　ＩＧＦ結合タンパク質の両方の型をそのＩＧＦ作用活性を保持 する実質的に精製された状態で提供する。

上記の一般的記載および下記の詳細な記載の両者は例示および説明のためだけの ものであり、特許請求されている本発明を制限するものではないと理解される。

この明細書に取り込まれてその一部を成す添付の図面は本発明の一実施態様を示 し、記載事項とともに本発明の詳細な説明するのに役立つ。

図面の簡単な説明 第１図はＩＧＦ−Ｉおよび結合タンパク質によるブタ大動脈平滑筋細胞（Ａ）、 ニワトリ（Ｂ）、マウス（Ｃ）の胚線維芽細胞中でのＤＮＡ合成の強化を示す。

平滑筋細胞はマイクロテスト９６ウエルプレートにおいてａ、ｏｏｏ細胞／ウェ ルで継代培養し、細胞が休止状態になるまで５日間そのままにした。分析に先だ ち、培養物を血清を含まないＤＭＥＮで２回洗浄し、続いて０．５μＣｉ　”Ｈ −チミジンおよび１％ヒト乏血小板血漿（ＰＰＰ）を補充したＤＭＥＭｏ、２− 中の試験物質を添加した。ニワトリ胚線維芽細胞（第２継代）を、９６ウエルマ イクロテストブレー）（Ｆａｌｃｏｎ　３００４）において３．０００細胞／ウ エルで１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で継代培養した。塗布５日後に、休止 状態の単層を列記した試験因子プラス０．５μＣｉ　’Ｈチミジンおよび１％Ｐ ＰＰにさらした。第３−第５継代のマウス胚線維芽細胞培養物を使用し、細胞を ｓ、ｏｏ。

細胞／ウェルで塗布したことを除いては、ニワトリ胚線維芽細胞について記載し たようにして実験を行った。

全ての培養物は漸増濃度のヒト血清、インシュリン、ＩＧＦ−Ｉ、　ＩＧＦ−Ｉ プラスＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型）（ｌｏｏｎｇ／ｍｌ）またはインス リンおよびＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型）に３６時間さらし、３Ｈ−チミ ジン取込みを定量した。その結果は３組の培養物の平均値として示される。

第２図はＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型）による培養ヒト線維芽細胞中のＤ ＮＡ合成の刺激を示す。第４−第８継代を用い細胞をｓ、ｏｏｏ細胞／ウェルの 密度で１０％ウシ血清を補充したＭＥＭの入った９６ウエルマイクロテストプレ ートで継代培養した。塗布５日後、培養物は血清を含まないＭＥＭで洗浄し、続 いて０．５μＣｉ’Ｈ−チミジン、１％ＰＰＰおよび記載された濃度の試験物質 を含有するＭＥＭｏ、２１ｎｌを加えた。漸増濃度の試験物質を加えた。漸増濃 度のヒト血清、ＩＧＦ−Ｉ、インスリン、ＩＧＦ−ＩプラスＩＧＦ−Ｉ結合タン パク質（刺激型）またはインスリンプラスＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型） を休止状態のヒト線維芽細胞単層に添加した。３６時間インキュベージコンした 後、ＤＮＡ合成を測定した。結果は３組の培養物の平均として示される。

第３図はＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型）に応答する平滑筋細胞ＤＮＡ合成 の、濃度依存性増大を示す。漸増濃度の純粋ＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型 ）（１０−５００ｎｇ／ｄ）を１０ｎｇ／ｒｎｌＩＧＦ−Ｉおよびヒト１％ＰＰ Ｐとともにインキュベートした。平滑筋細胞培養物を調製し、第１図で記載した ように″Ｈ−チミジン組み込みを測定した。結果は３組の培養物の平均３Ｈ−チ ミジン組み込みとして示される。

第４図はＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型）に応答する培養 線維芽細胞および平滑筋細胞の成長を示す。ブタ平滑筋細胞（Ａ）およびヒト線 維芽細胞（Ｂ）をＭＥＭと１０％ウシ血清（線維芽細胞）またはＤＭＥＭとｌθ ％ウシ胎児血清（平滑筋）の入った２４ウエルブレー）　（Ｆａｌｃｏｎ、　３ ００４）に１５．０００細胞／ウエルで塗布した。

２時間後、培地を１％ＰＰＰを含有するＭＥＭまたはＤＭＥＭに変えた。続いて さらに１２時間インキュベートし、培地を取り除き試験試薬を１％ＰＰＰを含有 するＤＭＥＭまたはＭＢＭｏ、５１ｄ！に添加した。４８時間インキュベートし た後、細胞数を測定した。結果は４組の培養物の＋ＩｓＤとして示される。

第５図は高等真核細胞中の［ＧＦＢＰのための発現ベクターの構築を示す。

第６図は２４アミノ酸シグナル配列を有するＩＧＦＢＰのアミノ酸およびヌクレ オチド配列である。

第７図はＩＧＦＢＰコード配列を含有するプラスミドｐＪＵ１０２０の作製を示 す。

第８図はＩＧＦＢＰコード配列を含有するプラスミドｐＪＵ１０２１の作製を示 す。

第９図はＩＧＦＢＰコード配列を含有するプラスミドｐＪＵ１０２２０作製を示 す。

好ましい実施態様の詳細な記載 以下に本発明の現在好ましい実施態様に関して詳細に記載され、これは図面およ び下記の実施例とともに本発明の詳細な説明するのに役立つ。

上記のように本発明は一部はインスリン様成長因子（ＩＧＦ）の細胞におよぼす 作用を強化する方法に関する。

ＩＧＦはＤＮＡ合成の速度を増大するにより成長因子として機能をすることが知 られている。

本発明者らはＩＧＦ−Ｉの成長促進作用を強化するタンパク質を実質的に精製さ れた状態で得た。このタンパク質はＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）と命名され ている。細胞成長を促進するＩＧＦ−１の能力におよぼすＩＧＦ結合タンパク質 （刺激型）の強化作用は第１−第４図に示されている。

この強化作用を得るために、　ＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）を実質的に精製 された状態で得た。ひとつの実施態様において、この実質的に精製されたｒＧＦ 結合タンパク質（刺激型）をまず標的細胞の表面に付着させる。増大。次いで付 着したＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）を有する標的細胞をＩＧＦ−Ｉにさらす 。平滑筋細胞を使用した場合、付着したＩＧＦ結合タンパク質の存在といっしょ にＩＧＦ−Ｉにさらすと細胞の増殖速度が少なくとも約４倍増となるが、一方Ｉ ＧＦ−Ｉ単独にさらすと細胞の増殖の速度は約２５％増となった。

第２の実施態様において、ＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）およびＩＧＦ−Ｉは 標的細胞にそれらを添加する前にあらかじめ混合した。

本発明のＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）は、ひとつの実施態様において、ヒト 組織からの単離により実質的に精製された形で得られる。特に、実質的に精製さ れたｒＧＦ結合タンパク質（刺激型）をヒトの細胞外液から単離できる。これら の細胞外液は羊水およびを髄液を包含する。この実施態様の好ましい形式におい て、ＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）はヒト羊水から単離される。細胞外液から のこの特別なＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）の単離のための詳細な方法論は以 下に続（実施例１に記載されている。

別の実施態様において、本発明のＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）はヒト細胞系 により馴化された培地から、実質的に精製された形で単離することができる。細 胞系はＧＭＩＯのような線維芽細胞系およびＭＤＡ−２３１のような乳癌細胞系 を包含するが、これらに限定されない。

線維芽細胞馴化培地からのこの特別なＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）の単離に 関する詳細な方法論は、以下に続〈実施例５に記載されている。この第２のＩＧ Ｆ結合タンパク質（刺激型）は細胞外液から単離可能なタンパク質に密接に関連 しているが同一ではない。

どちらかの型のＩＧＦ結合タンパク質（刺激型）が単離されている場合、正しい タンパク質が単離されたか否かを決定するのに役立てるために一連の検定が開発 されている。これらの検定はｒＧＦ結合タンパク質（刺激型）の単離を確認する ために単独でまたはいくつかを組合せて使用することができる。

これらの検定の第１番目は単離したタンパク質がＩＧＦ−Ｉに結合できるか否か を決定することである。

この決定を行う方法は、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、　Ｄ、によりＪ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７７：１５４８−１５５６　（１９８６）に記載されており、 その開示はこの参考文献としてここに明白に取り込まれる。第２の検定は相乗作 用的にＩＧＦ−Ｉの作用を促進する能力である。この検定を実施するひとつの方 法は実施例２に記載されている。

第３の検定は単離したタンパク質がＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（刺激型）に対す る抗体と反応する能力である。

特にポリクローナル抗体は、ここに含まれる教示を特に考慮し、当業者に知られ た任意の方法によりこのタンパク質に対するものとしてあげるこができ、結合タ ンパク質の同定を確認するために使用することができる。

上記記載において、　“実質的に精製された”という用語が使用されている。本 出願の目的のために、この用語は、タンパク質がＳＤＳ　ＰＡＧＥにより測定し て不純物の少なくとも約５０％を含まないことを意味することを意図している。

好ましくは、タンパク質は不純物の少なくとも約７０％を含まず、さらに好まし くは不純物の少なくとも約９０％を含まない。以前に単離されたＩＧＦ結合タン パク質はＩＧＦ結合タンパク質（阻害型）および（刺激型）の混合物として自然 に存在することに注目すべきである。したがって、ここに記載されるＩＧＦ結合 タンパク質は不純物の少なくとも約５０％を含まない場合は“実質的に純粋”で あるが、これらの結合タンパク質は少なくとも相互に約７５％分離されているべ きである。本発明のＦＧＦ結合タンパク質の単離および精製は実施例１に記載さ れている。

ＩＧＦ結合タンパク質の配列は実施例３に記載されている。ＩＧＦ結合タンパク 質をコードする遺伝子の単離は実施例４に記載されている。

別の実施態様において、本発明は、インスリン様成要因子結合タンパク質をコー ドする移動性ＤＮＡ配列に関する。これらの移動性ＤＮＡ配列は種々の宿主微生 物および真核生物細胞においてヒトＩＧＦ結合タンパク質の産生に導くことがで きる。この文脈における“移動性ＤＮＡ配列“は、完全な長さのＤＮＡクローン または合成で作製された類似物または両者の任意の組合せ物のいずれかについて 言及することを意図している。この明細書の目的のために、　“ヒト様成長因子 結合タンパク質′とは、アミノ酸配列の細胞内産生を導き、そして翻訳後修飾を 包含しまたは包含しないことのあるデオキシリボ核酸配列中に存在するコドンに より定義されるタンパク質の第１次構造を意味することを意図している。本発明 により産生される“ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質”は自然に存在す るヒトタンパク質と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好 ましくは少なくとも８０％同一である。ここで考察されるパーセント同一性は、 −列にならべるのを助けるために１００アミノ酸につき４ギヤツプが許される場 合に、比較して、配列の同一のアミノ酸残基とならぶ２つの配列のうち小さい方 に見い出されるアミノ酸残基の百分率として計算される。

好ましい実施態様において、移動性ＤＮＡ配列はＩＧＦ結合タンパク質の産生を 導くことができる。特に好ましい実施態様において、移動性ＤＮＡ配列はヒト羊 水または線維芽細胞調整培地から以前単離されたそれと生物学的に同等のＩＧＦ 結合タンパク質の産出を導くことができる。この明細書および請求の範囲におい て使用される“生物学的に同等の”とは、本発明の移動性ＤＮＡ配列を使用して 産出されたＩＧＦ結合タンパク質が、ヒト羊水または線維芽細胞馴化培地から単 離されたＩＧＦ結合タンパク質により産生されたそれと定性的および定量的に同 等する強化または阻害された細胞成長活性を誘導することができる形態に活性化 可能であることを意味する。

先に記載したように、本発明の移動性ＤＮＡ配列は合成でつくることができる。

これらのポリヌクレオチド配列を合成でつくる方法は、ここに含まれる教示を特 に考慮すると、当業者に一般に知られているものであると考えられる。ポリヌク レオチド合成に関連する現在の技術水準の例としては、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　 Ｍ、Ｄ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　 Ｓｏｃ、　１０３：３１８５　（１９８１）およびＢｅａＵＣｈｅｅ、　Ｓ、　 Ｌ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２２：　１８５９　（１９８１）があり 、各々はここに参考として編入される。

さらに、移動性ＤＮＡ配列は自然の配列のフラグメントである。すなわち自然に 存在し、本発明者らにより初めて単離され精製されたポリヌクレオチドのフラグ メントである。ひとつの実施態様として、移動性ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡライブ ラリーから単離された制限フラグメントである。この好ましい実施態様において 、ｃＤＮＡライブラリーは実施例４に記載されているように作られた。

別の実施態様において、移動性ＤＮＡ配列はヒトゲノムライブラリーから単離さ れる。この実施態様に有用なかかるライブラリーの一例はＬａｗｎらによりｃｅ ｌｌ　１５：１１５７−１１７４（１９７８）に記載されており、ここに参考と して編入される。

上記のように、本発明は、それぞれがここに記載する移動性ＤＮＡ配列の少なく ともひとつを含有する一連のベクターに関する。所望のＩＧＦ結合タンパク質を 多量に産出する宿主生物または真核細胞の能力を増大させるために、移動性ＤＮ Ａ配列の追加のコピーを単一のベクター中に包含させうることが考えられる。さ らに、本発明の範囲内でクローニングベクターは移動性ＤＮＡ配列に先行するま たは後続する補足ヌクレオチド配列を含有することができる。補足配列は、移動 性ＤＮＡ配列の転写を妨害せず、下記にもっと十分に記載するようにいくつかの 場合には、転写、翻訳または機能性の第３次形態と推定される生成したＩＧＦ結 合タンパク質の第１次アミノ酸構造の能力を強化するであろう。

上記の性質を有し、したがって本発明における使用に好適であるクローニングベ クターがさらに現在存在するかまたは発見されるであろうことは当然である。

またこれらのベクターも、任意の必要な操作エレメントとともにｃＤＮＡ配列を 導入することのできる開示した一連のクローニングベクターの範囲内のものであ るとして考えられ、その改変されたベクターはさらにまた本発明の範囲に包含さ れ、そして下記でもっと十分に記載する組換えＤＮＡ法において使用することが できるであろう。これらの特徴を有するいくつかのの好ましいベクターは以下に 続〈実施例中に記載されている。

■、微生物細胞中でのＩＧＦ結合タンパク質の遺伝子発現 下記にすぐ続＜Ａ、Ｂおよび０項は微生物宿主中での移動性ＤＮＡ配列の産出に 関する。

Ａ、微生物のために好ましいベクターの特徴本発明のいくつかの実施態様は、こ こに記載されたｃＤＮＡ配列のひとつまたはそれ以上を含有する既知のまたは現 在未発見のベクターを使用することを想定している。特に、これらのベクターは 次の特徴のいくつかまたは全てを有することが好ましい。すなわち（１）宿主生 物配列の最小数を保有する、（２）所望の宿主中で安定に維持され増殖される、 （３）所望の宿主中に多くのコピー数で存在することができる、（４）関心のあ る遺伝子の転写を促進するために配置された調節可能なプロモーターを保有する 、（５）移動性ＤＮＡ配列を挿入する部分から離だプラスミドの一部分上に存在 する選択可能な特色をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を有する、および （６）転写を終止することができるＤＮＡ配列。

種々の好ましい実施態様において、本発明のｃＤＮＡ配列を含有し発現すること ができるこれらのクローニングベクターは、種々の操作エレメントを含有する。

これらの“操作エレメント”は、ここに考察されているように少なくとも１個の プロモーター、少なくとも１個のシャインーダルガルノ配列および開始コドン、 および少なくとも１個の終止コドンを包含する。好ましくは、またこれらの“操 作エレメント”は少なくとも１個のオペレーター、細胞内空間から搬出されるタ ンパク質ための少なくとも１個のリーダー配列、調節タンパク質のための少なく とも１個の遺伝子、およびベクターＤＮＡの適切な転写およびそれに続く翻訳に 必要なまたは好ましい任意の他のＤＮＡ配列をも包含する。

いくつかのこれらの操作エレメントは本発明の好ましいベクターのそれぞれに存 在していてよい。当業者に知られた方法を使用して、ここの教示を特に考慮して 、必要とされる任意のさらなる操作エレメントを、これらのベクターに加えるこ とも考えられる。

実際、容易に単離し、組み立てそして交換することか可能な方法でこれらのベク ターのそれぞれを構築することが可能である。これは、これらのエレメントおよ びｃＤＮＡ配列のコード領域の組合せからの数々の機能性遺伝子の組立てを容易 にする。さらに、これらのエレメントは１個以上の宿主に適用されるであろう。

い（つかの好ましい実施態様において、ベクターはレギュレーター（“オペレー ター′）として機能することができるＤＮＡ配列およびレギュレータータンパク 質をコードすることができる他のＤＮＡ配列を含有することがさらに考えられる 。

１、調節因子 ひとつの実施態様において、これらの調節因子はある環境条件の存在下でｃＤＮ Ａ配列の発現を妨ぎ、他の環境条件の存在下においてはｃＤＮＡ配列によりコー ドされるタンパク質の転写およびそれに続く発現を可能にするであろう。特に、 調節部分を、例えばイソプルピルチオ−ベーターガラクトシドの非存在下でｃＤ ＮＡ配列の発現が起こらないかまたは非常に減少した程度で起こるようにベクタ ーに挿入するのが好ましい。この状態において、ｃＤＮＡ配列を含有する形質転 換した微生物はＩＧＦ結合タンパク質の発現開始前に所望の密度で増殖できる。

この実施態様において、所望のタンパク質の発現は、所望の密度が達成された後 にそのＤＮＡ配列の発現を生じることができる物質を微生物の環境に添加するこ とにより誘導される。

２、プロモーター 発現ベクターはそれ自体のタンパク質発現のために大部分の生物に使用できるプ ロモーターを含有しなければならない。ラクトースプロモーター系か一般に使用 されているが、他の微生物のプロモーターが単離され、特性決定されており、当 業者が組換えｒＧＦ結合タンパク質の発現のためにそれらを使用することを可能 にしている。

３、転写ターミネータ− ここで考えられる転写ターミネータ−は、ベクターを安定するのに役立つ。特に Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、およびＣｏｕｒｔ、　Ｄ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｇｅｎｅｔ、　１３：３１９−３５３　（１９７９）に記載されているこれら の配列は、ここに参考として詳細に編入されており、本発明における使用が考え られる。

４、非翻訳配列 好ましい実施態様において、３°または５゛非非翻訳列を遺伝子転写物に組み込 むのを可能にするためにコード領域の３°または５゛末端を再構築することも望 ましいということが注目される。これら非翻訳配列中において包含されるものは 、ここに参考として編入されたＳｃｈｍｅｉｓｓｎｅｒ、　　Ｕ、、　ＭｃＫｅ ｎｎｅｙ、　　Ｋ、、　　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　　ＭおよびＣｏｕｒｔ、　Ｄ 、Ｐ　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７６：３９−５３　（１９８４）により 同定されたｍＲＮＡを安定化する配列である。

５、リポソーム結合部位 外来タンパク質の微生物内での発現はリポソーム結合部位を包含するがそれらに 限定されないいくつかの操作エレメントを必要とする。その特別のエレメントは 、Ｇｏｌｄ、　　Ｌ、、ら、Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　　３ ５：　５５７−５８０またはＭａｒｑｕｉｓ、　Ｄ、Ｍ、、ら、Ｇｅｎｅ　４２ ：２７５−１８３　（１９８６）に記載されているように、タンパク質合成の開 始においてリポソームが認識して結合する配列である。これらの文献は参考とし てここに編入される。

ここで考察されているように操作エレメントは先行の文献およびここに含まれる 教示を考慮して当業者により決まりきった手順で選択できる。これらの操作エレ メントの一般的例は、ここに参考として編入されるＢ、　Ｌｅｗｉｎ、　Ｇｅｎ ｅｓ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３）に記載 されている。好適な操作エレメントの種々の例は上記考察したベクターに見い出 され、前記ベクターの基本的特徴を考察している出版物を参照することにより明 りょうになる。

６、リーダー配列および翻訳カプラー さらに、適切な分泌用リーダー（シグナル）配列をコードするＤＮＡが移動性Ｄ ＮＡ配列の５°末端に存在することが好ましい。リーダー配列のＤＮＡは、リー ダー配列が阻害因子にじかに隣接しかつ共有結合している融合タンパク質の産出 を可能にする位置になければならず、すなわち２つのＤＮＡコード配列の間には 転写または翻訳終止シグナルがあってはならない。リーダー配列の存在は一部に は下記の理由のひとつまたはそれ以上のために所望される。第一に、リーダー配 列の存在はＩＧＦ結合タンパク質の宿主プロセシングを容易にする。特に、リー ダー配列はリーダーペプチダーゼによる最初の翻訳産物の切断に導き、リーダー 配列を取り除き、そしてありうるタンパク質活性を有するアミノ酸配列を有する ポリペプチドを残すことができる。第二に、リーダー配列の存在は［ＧＦ結合タ ンパク質を細胞の細胞質の外に導くことにより、そのタンパク質の精製を容易に することができる。宿主微生物のいくつかの種において、適切なリーダー配列の 存在は、いくつかのエシェリヒア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）の場合のように、完 成したタンパク質をペリプラズム空間へ移送するのを可能にするであろう。いく つかのＥ、ｃｏｌｉ、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびバ チルス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ） の株の場合、適切なリーダー配列はタンパク質が細胞膜を通過し細胞外の培地に 入る移送を可能にするであろう。この状態において、タンパク質は細胞外タンパ ク質から精製される。第三に、本発明により調製されたいくつかのタンパク質の 場合、リーダー配列の存在はその活性構造をとるために完成したタンパク質が折 り重なりつる環境にある必要があり、この構造は適切なタンパク質活性を有する 。

７、翻訳ターミネータ− ここで考えられる翻訳ターミネータ−はｍＲＮＡの翻訳を停止するのに役立つ。

それらはＫｏｈｉｌ、　Ｊ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１８２：４３０−４３９　（１９１）に記載されているように自 然のものであるか、またはＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｆ、　Ｇｅｎｅ　２４ ：１５−１７　（１９８３）に記載されているように合成されたものであり、こ れら両文献はここに参考として編入される。

８、選択可能なマーカー さらに、クローニングベクターは、薬剤耐性マーカーまたは宿主微生物により選 択可能な質の発現を生じる他のマーカーのような選択可能なマーカーを含有する ことが好ましい。本発明のひとつの実施態様において、アンピシリン耐性の遺伝 子はベクターに包含される一方、他のプラスミドにはテトラサイクリン耐性また はクロラムフェニコール耐性用遺伝子が包含される。

かかる薬剤耐性または他の選択可能なマーカーは、一部は形質転換物の選択を容 易にするために意図される。さらに、クローニングベクター中のかかる選択可能 マーカーの存在は汚染微生物が培養培地で増殖することを抑えるのに用いること ができる。この実施態様において、形質転換した宿主微生物のかかる純粋な培養 物は誘導される表現型が生存のために必要な条件のもとで微生物を培養すること により得られるであろう。

Ｂ、微生物用のベクター組立て 上記したクローニングベクターの必要であり所望の全ての構成部分の合成および ／または単離に際して、ベクターは当業者に一般に知られている方法により組立 てられる。かかるベクターの組立ては、当業者が行なう職務の範囲内であると思 われ、そのようなものであるので、過度の実験なしに行なうことができる。例え ば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ 　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎ、Ｙ、　（１９８２）に記載されているように、同様のＤＮＡ配列は適切なり ローニングベクターに連結されており、この文献は参考としてここに編入される 。

Ｃ０宿主微生物 ここに開示したベクターおよび方法は、広範囲の原核生物および真核生物にわた る宿主細胞中で使用するのに好適である。ＤＮＡ配列のクローニングのためおよ び遺伝子発現のためには原核生物が好ましい。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５．　Ｊ Ｍ１０７およびＪＭ１０９　（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）ならびにバチ ルスおよびシュードモナス種は遺伝子の発現に使用できる。原核生物に加えて、 サツカロミセス　セレビシェ（Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核微生物を遺 伝子の発現に使用できる。

一般に、宿主細胞と適合する種に由来する操作エレメントを含有するプラスミド ベクターを使用する。例えばＢ、ｃｏｌｉは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のプラスミドｐ ＢＲ３２２を使用して典型的には形質転換される。第１表は宿主生物および適合 するベクターの一覧を示す。

（本頁以下余白） １、シュードモナスベクター 第１表に記載したベクターに加えて、広範囲のダラム陰性菌中に自律複製するい くつかのベクタープラスミドを、ニードモナス属の宿主中でクローニングベヒク ルとして使用するのが好ましい。これらは　Ｔａ１ｔ。

Ｒ，Ｃ，、Ｃ１ｏｓｅ、　Ｔｊ、、　Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ、　Ｒ，Ｃ，、Ｈａｑ ｉｙａ、　Ｍ、。

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｒ，Ｌ、、およびＫａｄｏ、　Ｃ，１，Ｉｎ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｍａｙ、　　１９８３．　ｐｐ、２６９−２７５；　Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ、　 Ｎ、Ｊ、　　ｉｎ　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐ ｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、１６３−１８５（１９８１）； およびＳａｋａｇｕｃｋｉ、　Ｋ、　　ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃ　ｉ ｎ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９６：３１− ４５　（１９８２）Ｇ：記載されており、各文献は参考としてここに編入される 。

ひとつの特に好ましい構築方法は、Ｂａｇｄａｓａｒ　ｉａｎ。

Ｍ、、　Ｂａｇｄａ−ｓａｒｉａｎ、　Ｍ、Ｍ、、　Ｃｏｌｅｍａｎ、　Ｓ、、 およびｔｉｍｍｉｓ。

Ｋ、Ｎ、　ｉｎ　　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ ｍｅｎｔａｌ　ａｎｄＣｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ、　Ｔｉｍ ｍ１ｓ、　Ｋ、Ｎ、　ａｎｄ　Ｐｕｈｌｅｒ。

Ａ、（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ（１９７９）（ここに参考として編入される）に記載されて いるように、プラスミドＲＳＦＩＯＩＯおよびその誘導体を使用することであろ う。Ｒ３Ｆ’１ＯＩＯの利点は、それがＥ、ｃｏｌｉおよびシュードモナスの両 種中に容易に形質転換されかつ安定的に維持される、比較的に小さくコピー数の 多いプラスミドであることである。この系においては、ニジエリ　ヒアについて 記載されているようにＴａｘ発現系を使用することが好ましいてあろう。なぜな らば、ε、ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーターは、Ｓａｋａｇｕｃｋｉ、　Ｋ、。

Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９６：３１−４５　　（１９８２）およびＧｒａｙ、　Ｇ、 Ｌ、、　ＭｃＫｅｏｗｎ、　Ｋ。

Ａ、、　Ｊｏｎｅｓ、　Ａ、Ｊ、Ｓ、、　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、および Ｈｅｙｎｅｋｅｒ。

Ｈ，Ｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｆｅｂ、１９８４．　ｐｐ、１６ １−１６５　（両文献は参考としてここに編入される）に記載されているように シュードモナスＲＮＡポリメラーゼにより容易に認識されると思われるからであ る。翻訳活性はそのプロモーターを、例えばＥ、ｃｏｌｉまたはシュードモナス ・エルギノーザ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　ｔｒｐプロモーターと交換す ることを要求することにより、さらに最大にすることができる。さらに、Ｅ、ｃ ｏｌｉの１ａｃｉ＠株の１ａｃｌ遺伝子も調節を行うためにプラスミド中に包含 されるであろう。

実施例中に記載されるように、任意のＥ、ｃｏｌｉタンパク質の翻訳開始ならび に阻害因子の細胞内発現を生じるために宿主の多量に発現される任意のタンパク 質の開始部位に翻訳を結合できる。

宿主シュードモナス種の制限を欠く株が入手できない場合、Ｅ、ｃｏｌｉから単 離されたプラスミド構築物での形質転換効率は低い。したがって、ここの参考文 献欄に詳細に編入されているようにＢａｇｄａｓａｒｉａｎ、　Ｍ、、ら、Ｐｌ ａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　 ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＩｍｐｏｒｔａｎｃｅ、　　ｐｐ、４１１−４２２．　　 Ｔｉｍｍ１ｓ　ａｎｄ　Ｐｕｈｌｅｒ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　 ｈｏｌｌａｎｄ　　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｐｒｅｓｓ（１９７９）（参考と してここに編入される）に記載されているように、所望の宿主の形質転換前にシ ュードモナスクローニングベクターを、もうひとつの種のｒ−ｒｎ”株に継代さ せることが望ましい。

２、バチルスベクター さらに、バチルス属が宿主である好ましい発現系は、クローニングベヒクルとし てプラスミドｐＵＢ１１０の使用を伴う。他の宿主ベクター組織におけるように 、バチルス中で本発明のＩＧＦ結合タンパク質を細胞内または分泌タンパク質の いずれかとして発現することが可能である。本実施態様には両方の系が包含され る。バチルスおよびＥ、Ｃ０１ｉの両者の中で複製するシャトルベクターは、Ｄ ｕｂｎａｕ、　Ｄ、、　Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、、　Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、　Ｓ、 、およびＳｈｉｖａｋｕｍａｒ、　Ａ、Ｇ、　ｉｎ　ＧｅｎｅｒｔｉｃＥｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｖｏｌ。

２、　Ｓｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　ｈｏｌｌａｎｄｅｒ（編）　、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐ ｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、ｌ１５−１３１　 （１９８０Ｘ参考としてここに編入される）で所望されるように、種々の遺伝子 を構築して検定するのに使用でき°る。Ｂ、サブチリスからのＩＧＦ結合タンパ ク質の発現および分泌のためには、アルファアミラーゼのシグナル配列は、その タンパク質のコード領域に結合されることが好ましい。細胞内阻害因子の合成の ためには、移動性ＤＮＡ配列がアルファアミラーゼリーダー配列のリポソーム結 合部位に翻訳により結合されるであろう。

これらの構築物のどちらかの転写は、アルファアミラーゼプロモーターまたはそ の誘導体により導かれることが好ましい。この誘導体は天然型アルファアミラー ゼプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有するが、　ｌａｃオペロン 領域も組み込んでいる。ペニシリナーゼ遺伝子プロモーターおよびｌａｃオペレ ーターから構築された類似のハイブリッドプロモーターは、参考としてここに詳 細に編入されるＹａｎｓｕｒａ。

Ｄ、　Ｇ、およびＨｅｎｎｅｒ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｉ、　Ｇａｎｅｓａｎ、　Ａ、Ｔ、　ａｎ ｄ　ｈｏｃｈ、　Ｊ、Ａ、、（編）、うな調節可能な仕方でバチルス宿主中で機 能することか示されている。またＥ、コリの１ａｃｌ″株のＩａｃｌ遺伝子も節 制を行うために配置中に包含されるであろう。

３、クロストリジウムベクター クロストリジウム中ての発現のためのひとつの好ましい１築法は、ここに参考と して編入される５ｑｕｉｒｅｓ。

Ｃ，Ｈ，ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１５９　　：　４６５−４７１　 （１９８４）に記載のプラスミドｐＪＵＩ２を、ここに参考として編入されるＪ 、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９：４６０−４６４（１９８４）に記載しであ るようなＨｅｅｆｎｅｒ、　Ｄ、Ｌ、　　らの方法によりＣ，バーフリンジェン ス中に形質転換することである。転写はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー ターにより導かれる。翻訳は、他の宿主中の使用に好適なベクターに関して上記 に大要を記載した方法に厳密に類似している仕方で、この同じｔｅｔ　’遺伝子 のシャインーダルガルノ配列に結合される。

４、酵母ベクター 酵母に導入された外来ＤＮＡの維持は、ここに参考として編入されるＢｏｔｓｔ ｅｉｎ、　Ｄ、、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、。

Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　５ｔｒａｔ ｈｅｒｎ、　Ｊｏｎｅｓａｎｄ　Ｂｒｏａｃｈ、　（編）、ｐｐ、６０７−６３ ６　（１９８２）に記載されているいくつかの方法により行うことができる。サ ツカロミセス属の宿主生物とともに使用するひとつの好ましい発現系は、２ミク ロンプラスミド上にＩＧＦ結合タンパク質遺伝子を含んでいる。２ミクロンサー クルの利点はｃｉｒ’株に導入された場合、比較的高いコピー数および安定性を 包含する。これらのベクターはＥ、コリ内において複写と選択を可能にするｐＢ Ｒ３２２からの複製開始点および少なくともひとつの抗生物質耐性マーカーを組 み込むことが好ましい。さらにプラスミドは、２ミクロン配列および酵母のＬＥ Ｕ２欠失変異種において同じ目的を果す酵母ＬＥＵ２遺伝子を有することが好ま しいであろう。

また本発明はＩＧＦ結合結合タンパ音質生ずる組換えＤＮＡ法にも関する。一般 に、この方法は、（ａ）　　宿主微生物中いてｒＧＦ結合結合タンパ音質生させ るをことができる移動性ＤＮＡ配列を調製し、（ｂ）　　移動性ＤＮＡ配列を、 宿主微生物中に移入することができそこで複写することができるベクターにクロ ーニングし、かかるベクターは移動性ＤＮＡ配列のために操作エレメントを含有 しており、 （Ｃ）　　移動性ＤＮＡ配列および操作エレメントを含有するベクターをＩＧＦ 結合結合タンパ音質現することができる宿主微生物に移し、 （ｄ）　　ベクターの増殖およびＩＧＦ結合結合タンパ音質現に適切な条件下で 宿主微生物を培養し、そして、（ｅ）　　どちらかの順序で：（ｉ）ＩＧＦ結合 結合タンパ音質取すること、および（ｉｉ）ＩＧＦ結合結合タンパ音質性の第三 次構造をとるようにすることを包含する。

この方法において、移動性ＤＮＡ配列は、上記の合成のまたは自然に存在するポ リヌクレオチドである。本方法の好ましい実施態様において、移動性ＤＮＡ配列 はその単離が実施例４に記載されているｃＤＮＡにより定義されるヌクレオチド 配列を有する。

本方法に有用であると考えられるベクターは上記に記載されたベクターである。

好ましい実施態様において、Ｅ、コリの複製開始点、大腸菌ファージＴ７ブロモ ーターおよびテトラサイクリン耐性のマーカーを含有するクローニングベクター が使用される。ＩＧＦ結合結合タンパ音質伝子はＴ７φ（ファイ）１０タンパク 質のフラグメントと翻訳により結合される。

このようにして得られたベクターは次いで適切な宿主微生物、例えばｌａｃプロ モーターから転写される、大腸菌ファージＴ７からの遺伝子ｌの染色体コピーを 含有するＥ、コリに移される。外来のＤＮＡを取り込み、これらの遺伝子を発現 する能力を有し、そして操作エレメントが存在する任意の微生物を選択できると 考えられる。宿主微生物は嫌気性、通性嫌気性または好気性であることが好まし い。この方法において好ましく使用しうる特別の宿主は酵母および細菌を包含す る。特定の酵母はサツカロミセス属の酵母、特にサツカロミセス・セラビシエを 包含する。

特定の細菌は、バチルス属およびエシェリヒア属およびシュードモナス属の細菌 を包含する。他の種々の好ましい宿主は上記第１表に記載されている。さらにま た本発明の他の好ましい実施態様において、バチルス・サブチリス、Ｅ、コリま たはシュードモナス・エルギノーザが宿主微生物として選択される。

宿主生物およびベクターが選択された後、ベクターは当業者に一般に知られてい る方法を使用して、宿主生物に移される。かかる方法の例は、ここに参考として 編入されるＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｂｙ　 Ｒ，Ｗ。

Ｄａｖｉｓら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）に見い出す ことができる。

ひとつの実施態様において温度調節は下記に記載するように操作エレメントを使 用することにより遺伝子発現を調節する方法として考えられるので、形質転換は 低い温度で起ることが好ましい。もうひとつの実施態様において、もし浸透圧調 節剤がベクターに挿入されている場合、形質転換中の塩濃度の調節は合成遺伝子 の適切な制御を確実にするために必要となるであろう。

組換えＩＧＦ結合結合タンパ音質母中で最終的に発現させることを考えるならば 、クローニングベクターを、はじめにＥ、コリ中に移入し、その中でベクターを 複写し、増幅の後、そこからベクターを得て精製することか好ましい。続いてベ クターはＩＧＦ結合結合タンパ音質終的発現のために酵母中に移されるであろう 。

宿主微生物はＩＧＦ結合タンパク質発現に適切な条件下で培養される。これらの 条件は宿主生物に一般に特定的であり、かかる生物のための成育条件に関する出 版された文献、例えばここに参考として編入されるＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ ａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒ４ｏ１ｏｇｙ。

８ｔｈ　ｅｄ、、　Ｗｅｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、 　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

Ｍａｒｙ　１ａｎｄを考慮すれば、当業者により容易に決定される。

ベクター中に挿入されたまたは存在する任意の操作エレメントに依存するＤＮＡ 配列の発現を調節するのに必要な任意の条件は、形質転換および培養段階で有効 であろう。ひとつの実施態様において、ＤＮＡ配列の発現を阻害する適切な調節 条件の存在下で、細胞は高い密度にまで増殖する。最適の細胞密度に近づいた場 合、環境条件を移動性ＤＮＡ配列の発現に適切な条件に変化させる。したがって 、ＩＧＦ結合結合タンパ音質生は宿主細胞の増殖が最適密度付近になった後の時 間帯に起り、そして生じたＩＧＦ結合結合タンパ音質場合によってはその発現に 必要な調節条件が誘導された後に採取されるであろうことが考えられる。

本発明の好ましい実施態様において、組換えＩＧＦ結合結合タンパ音質取の後で それが活性構造をとる前に精製される。本発明者らは、タンパク質がはじめに精 製される場合は高収量の再び折り重なったタンパク質を回収するのが容易になる と考えるので、この実施態様が好ましい。しかしながら、ひとつの好ましい別の 実施態様においは、ＩＧＦ結合結合タンパ音質び折り重なって精製の前にその天 然型構造をとることが許されうる。さらに他の好ましい別の実施態様においては 、ＩＧＦ結合結合タンパ音質養培地からの回収る際して、そのふたたび折り重な った状態をとるようにされる。

ある状況において、　ＩＧＦ結合結合タンパ音質主微生物中で発現される際およ びそのタンパク質か細胞壁もしくは膜を通ってまたはべりプラズム空間に移送さ れる際に、その特育の活性構造をとるであろう。もし適切なリーダー配列をコー ドするＤＮＡが組換えタンパク質をコードするＤＮＡに結合されている場合、こ れが一般に起こるであろう。本発明の好ましいＩＧＦ結合結合タンパ音質胞内膜 から転位する際に成熟した活性形態をとるであろう。数々のシグナルペプチドの 構造は、ここに参考として編入される例えばＭａｒｉｏｎε、Ｅ。

Ｗａｔｓｏｎ、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１２：５１５−５１６４　（１ ９８４）に出版されている。これらのリーダー配列は移動性ＤＮＡとともに、細 胞膜を通り移送され、細胞から放出される際に切断されるリーダー配列部分を有 する融合タンパク質の細胞内産生を導くであろう。

好ましい実施態様において、Ｅ、コリＯｍｐＡタンパク質のシグナルペプチドが リーダー配列として使用され夏ＧＦ結合タンパク質構造をコードする移動性ＤＮ Ａ配列と連続した位置に配置される。

さらに、好ましいリーダー配列は、ベータラクタマーゼ、カルボキシペプチダー ゼＧ２およびヒトシグナルタンパク質のリーダー配列を包含する。これらのおよ び他のリーダー配列は記載されている。

もしＩＧＦ結合結合タンパ音質その適当な構造をとらない場合、形成された任意 のジスルフィド結合および／または生じた非共存の相互作用は、　ｒＧＦ結合結 合タンパ肪質の活性構造をとることができる前に、例えば塩化グアニジウムおよ びベータメルカプトエタノールのような変性および還元剤ではじめに切断され、 次いで希釈しこれらの剤は制御された条件下で酸化されるであろう。

ここで考えられている翻訳ターミネータ−はベクターを安定化するのに役立つ。

特に、ここに参考として編入されるＧｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８：４９３６−４９４０　（１９８１）に記載さ れているこれらの配列は、本発明での使用が考えられる。

■、動物細胞中におけるＩＧＦ結合結合タンパ音質伝子発現 高等真核細胞中のＩＧＦ結合結合タンパ音質現のために上記に匹敵する方法は実 施例６に記載されている。

下記の実施例により本発明の目下好ましい種々の実施態様を説明する。これらの 実施例であげられる出版物はここに参考として編入される。

実施例 実施例１−タンパク質調製 Ａ、材料 ヒト羊水は廃棄された羊水穿刺試料から採取した。

硫酸アンモニウムおよび塩化ナトリウムはＥＭ　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｃｈｅｒｒｙ　Ｈｉｌｌ、　ＮＪより購入した。ＤＥＡＥセルロース、過硫酸ア ンモニウム、ナトリウムチオシアネート、セファデックスＧ−１００、ポリエチ レングリコール（ＭＷ　８．０００）および炭酸アンモニウムはＳｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯより購入した。フェニルセファロースＣＬ−４−ＢはＰｈａ ｒｍａｃｉａ　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪより購入した。ＤＥＡＥセルロー スはＷｈａｔｍａｎより、そしてＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムはＶｙｄａｃ、　Ｈ ｅ５ｐｅｒｉａ、　ＣＡより購入した。アセトニトリル、　Ｇｅｌ　Ｃｏｄｅ’ 銀染色キットおよびトリフルオロ酢酸はＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ルより購入した。トリス、ＳＤＳおよびＴＥＭＥＤ はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤより購入した。グリシン、ブロモフェノールブルー、 ５ｅｒｖａｌｙｔ”等電点電気泳動ＰｒｅｃｏｔｅｓｌＩおよびグリセロールは 、５ｅｒｖａ。

Ｈｅｉｄｅｌｂｃｒｇ、***より入手した。組織培養プレートはＦａｌｃｏｎ　 Ｌａｂｗａｒｅ、　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ。

０ｘｎａｒｄ、　ＣＡより購入した。

Ｂ、刺激性および阻害性のＩＧＦ結合タンパクの羊水からの精製 粗製羊水（２３０ｄ）に硫酸アンモニウム（３３％ｗ／ｖ）４５グラムを添加し て平衡化し、溶液を８°Ｃで３０分間攪拌した。この混合物を２０分間２７．０ ００　Ｘ　ｇで遠心分離し、ペレットを０．０５Ｍ　）リスＨＣ！！　（１）ｌ （７，４）　５０ｃｃ中に再構成した。この溶液を５０％硫酸アンモニウムとな るように調整し、３０分間攪拌し、遠心分離段階を繰り返した。ペレットを０． ０５Ｍ　）リス（ｐＨ７，４）　５０ｃｃに再懸濁し、飽和硫酸アンモニウム１ ．２−を添加して最終濃度０．１４Ｍとした。この溶液を予めｌＯ％硫酸アンモ ニウム中０．０５ＭトリスｐＨ７，４で平衡化しておいたフェニルセファロース カラム（Ｚ　２　ｘ１５．０ａｎ）に適用した。試料適用の後、吸光度（２８０ １Ｍ）がベースラインに戻るまで、負荷緩衝液で洗浄した。カラムは、（１）０ ．０５Ｍ　）リス、１）Ｈ７，４゜０．５ナトリウムチオシアネート、　ｐＨ７ ，４：　（２）０．０５Ｍ　）リス、　ｐＨ７，４；　（３）　０．０２Ｍ　） リス、ｐｌ（９，０；および（４）Ｈ＊を含有する段階的塩濃度勾配を用いて溶 離した。後記する実施例１．Ｆ、に記載のとおり、各画分のＩＧＦ−Ｉ結合活性 を検定した。活性画分を合わせ、１．０Ｍ酢酸で１）Ｈを７．２とし、予め０． ＯＩＭ　（ＮＨｉ）ｔｃＯｓ、　０．０１Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，２で平衡化し ておいたＤＥＡＥセファロースカラムに溶液を直接適用した。試料適用後、吸光 度（２８０１Ｍ）がベースラインに戻るまで、平衡緩衝液でカラムを充分洗浄し た。カラムを、負荷緩衝液中０．１　、０．２５および０．５および１．０Ｍの ＮａＣ１を含有する段階的塩濃度勾配を用いて溶離した。両分のＩＧＦ結合活性 を前記したように検定した。活性の８０％を超える量が１００または２５０ｎＭ のＮａＣｌで溶離した。これらの２つのピークを、ＢおよびＣと命名し、を別々 に精製した。ピークＢブールの１．５　ｃｃを予め０．０４％ＴＦＡで平衡化し ておいたＣ−４Ｖｙｄａｃ逆相ＨＰＬＣカラム（０，４６Ｘ　２５ａｎ　）に適 用した。移動相を５分間、定組成溶媒溶離し、次いで、２５分間かけて０−１ａ ｎ％アセトニトリル＋０，０４％ＴＦＡの直線状勾配溶離を行った。各画分のＩ ＧＦ結合タンパク活性を測定し、活性画分を合わせて一２０℃で保存した。

イオン交換カラムから溶出したブールＣを先ずセファデックスＧ−１００カラム クロマトグラフイーで精製した。プールＣの１０ｃｃを、予め０．０１（ＮＨ４ ）ＣＯ，、０，０５ＭＮａＣ１，ｐＨ７，２で平衡化しておいた２、２Ｘ９０ａ ｏカラムに適用し、約９ｃｃの画分を回収した。ＩＧＦ−Ｉ結合活性を測定し、 前記したように逆相Ｃ−４カラムに直接適用した活性画分プールを用いた。

Ｃ０物理化学的分析 ピークＢおよびＣの純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し た。泳動ゲルは０．３７５Ｍ　）リス、ｐＨ８，８を含有する１２％アクリルア ミド、試料添加集積ゲルは０．１２５Ｍ　トリス、ｐＨ６，８中の４％アクリル アミドを用いた。試料０．１−１０Ｍｇを０．１Ｍ　トリス、　ｐｌ６．８．１ ０％グリセロール、５％ＳＤＳおよび０．０２％ブロモフェノール中に希釈して ７５μｌとし、試料を５分間１００°Ｃに加熱した。上清を清澄化し、ゲルレー ンに適用し、６５ボルトで１４時間タンパクを分離した。銀染色はＧｅｌ　ｃｏ ｄｅ”銀染色キットを用いて実施した。この方法の検知下限は既知タンパク標準 物を用いて測定したところ２５ｎｇであった。ゲルを５時間、５０％エタノール 、５％酢酸中に固定し、次に４時間にわたり、脱イオン水を４回交換して洗浄し た。最終的水洗は銀溶液と交換しく２０ｍｊ７銀濃縮液＋２８〇−水）で６０分 間、穏やかに振とうした。短時間水で洗浄した後、還元剤アルデヒド＋還元剤塩 基（使用直前に混合）に含有する還元溶液を添加し、充分な強度のタンパク質バ ンドが観察されるまで８〜ｌＯ分間穏やかに振とうした。還元剤溶液を２〇−安 定剤塩基＋８８０−水を含有する安定他剤溶液を用いる３回連続した３０分間洗 浄出置きかえた。

Ｄ、アミノ酸組成および配列の分析 各タンパク５００ｎｇを真空下、１５０℃で１時間、０．１％フェノールを含有 する６Ｎ塩酸下で凍結乾燥した。

アミノ酸をフェニルイソチオシアネートで誘導体化し、標識したアミノ酸をＮｏ ｖａＰａｋ−Ｃ１８逆相を用いて分離した。アミノ酸配列の決定は実施例３に記 載した。

Ｅ、炭水化物含量の測定 ピークＢまたはＣの何れかが炭水化物を含有するかどうかを調べるため、各ピー ク５．０μｇを１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに負荷し、前記したように して１４時間分離した。フェチユインは標準物質として平行して泳動された。ゲ ルを１０％酢酸／２５％イソプロパツールで固定した。次にゲルを順次（１）０ ．５％過ヨウ素酸；（２）０．５％亜砒酸ナトリウム；（３）０．１％亜砒酸ナ トリウム５％酢酸；　（４）　５％酢酸；（５）シッフ試薬；および（６）０． ６％メタ重亜硫酸ナトリウム１０．ＯＩＭ塩酸で洗浄し、２時間染色した。

ピークＢまたはＣが炭水化物を含有するかどうか更に調べるために、各タンパク ２．０μｇを予め０．０２　）リス、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＣａＣ１ｔおよび ２　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔで平衡化させておいたコンカナバリン−Ａ−セファロース カラムに適用した。カラムに２時間かけてゆっくり負荷し、２２°Ｃで４５分間 放置した。カラムを更に出発緩衝液２〇−で洗浄し、次に糖タンパクを０．５Ｍ メチル−Ｄ−マンノシ下および０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、０２Ｍ　） リス、　ｐＨ７，５の１０ｍ１で溶離した。１時間後カラムを溶離した。

次にカラムに再度同じ溶液を満たし、８℃で一夜放置した後に、溶離した。カラ ムを更に、０．５Ｍメチル−Ｄ−マンノシドおよび１ＭＮａｃｌを含有する０、 ０２Ｍ　）リス、ｐＨ７，５で溶離し、画分のＩＧＦ結合活性を前記したように して測定した。

Ｆ、　”’Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ結合能 カラム画分のＩＧＦ−Ｉ結合活性を以下のとおり測定した。即ち、各画分を１０ ｕｌを、０．１　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　０．１％ＢＳＡ、　０．０１％トリトンＸ −１００，４４ｍＭ　ＮａＨＣＯｚ、　０．０２％ＮａＮ５．　ｐＨ６，０（総 量２５０μｌ）中２２°Ｃで、６０分間、４０．０００ＣＰＭ　”’Ｉ−ＩＧＦ −Ｉ　（１５０μＣｉ／μｇ）とともにインキュベートした。［ＧＦ−ＩはＥ’ Ｅｒｃｏｌｅ、　Ａ、Ｊ、、　Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、　Ｌ。

Ｅ、、　Ｖａｎ　Ｗｙｋ、　Ｊ、Ｊ、、　Ｄｅｃｅｄｕｅ、　Ｃ，Ｊ、、および Ｆｏｕｓｈｅｅ。

Ｄ、Ｂ　（１９７６）の「成長ホルモンと関連ペプチド（ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍ ｏｎｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　Ｊ　（Ｐｅｃｉｌｉ、 　Ａ、、およびＭｕｅｌｌｅｒ、　Ｅ、Ｅ、編）　ｐｐ、　１９０−２０１．　 Ｅｘｃｅｒｐｔａ　ＭＥｄｉｃａ。

Ａｍｓｔｅｒｄａｍに記載のとおりヨウ素化したが、この記載は参考のため本明 細書に組み込まれる。最終濃度１２．５％となるように１％免疫血清グロブリン および２５％ポリエチレンゲルコール（ＭＷ　８．０００）　５００μｌを添加 することにより、結合および遊離の”’Ｉ−ＩＧＦ−Ｉを分離した。混合物を１ ０時間８．０００Ｘｇで遠心分離し、次に、ペレットを６．２５％で洗浄し、最 終ペレットをガンマスペクトル分析器で計数した。活性画分の各プールを幾つか の濃度で再検定し、結合能をヒト羊水標準物質と比較した。結果を用いて単位値 を各プールについて設定した。各単位は最大ＩＧＦ−Ｉ結合の５０％を達成する のに必要な物質の量とした。

純粋なＩＧＦ結合タンパクのＩＧＦ−１に対する結合能および親和性を測定する ために、放射性標識ＩＧＦ−１（４０，０００ｃｐｍ／試験管）を、０．０２Ｍ リン酸塩緩衝液、　ｐＨ７，４０，５ｉ中、各結合タンパク１０ｎｇ／ｒｎｌお よび漸増の濃度の未標識ＩＧＰ−Ｉとともにインキュベートした。４℃４８時間 の後、結合タンパクに対抗するウサギ抗体１：１．０００希釈液を添加すること により結合および遊離の１２Ｓ（−ＩＧＦ−Ｉを分離し、インキュベーションを １２時間継続した。この時点で、ヤギ抗ウサギ血清２μｌを添加し、混合物を２ ２°Ｃで１時間インキュベートし、次に、正常ウサギ血清２μｌを添加し、混合 物を更に１時間インキュベートした。１０分間８．０００Ｘｇで遠心分離するこ とにより結合および遊離の成長因子を分離した。

Ｇ、　　ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取り込みの測定純粋なピークＢおよびＣの物 質の生物学的活性は、ブタ大動脈平滑筋細胞におけるＤＮＡ合成を刺激する各物 質の能力を測定することにより評価した。Ｒｏｓｓ、　Ｒ。

（１９７１）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　ｂｉｏｌ、　５０．１７２−１８６に記載のと おり、平滑筋細胞を単離し、保存培養物として維持した。この文献は参考のため 本明細書に組み込まれる。保存培養物から取出した細胞は、１０％ウシ胎児血清 含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、８．０００細胞／ウエルで接種することにより 、９６ウエルのマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　３００４）中で継代培養した 。接種５日後、ウェルを１同焦血清ＤＭＥＭで洗浄し、次に、被験因子を、１％ 乏血小板血漿（ＰＰＰ）および０．５μｃｉ”）（−チミジンを添加した０、　 ２　ｍｌＤＭＥＭ以上、各ウェルに添加した。ＰＰＰはＣｌｅｍｍｏｎｓ、　Ｄ 、Ｒ，（１９８３）のＪ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１４．６１−６７に 記載の方法に従って調製した。この文献は参考のために本明細書に組み込まれる 。

Ｈ０等電点電気泳動 等電点を測定するために、ピークＢおよびＣのタンパク２５μｇをｐＨ３−１０ のブレカスト等電点電気泳動プレー）　（Ｓｅｒｖａｌｙｔ”　Ｐｒｅｃｏｔｅ ｓ”）に適用し、既知標準物質２０μｇを平行レーンで泳動した。タンパク質を ２００ボルトで１．５時間、次に１０００ボルトで１．５時間、等電点電気泳動 した。ゲルを２分割し、一方を１０％ＴＣＡに固定し、次いでクマシーブルーで 染色した。もう一方は０．５　ａｎの断片に切断し、０．０４％ＴＦＡで溶離し た。溶出液のＩＧＦ結合活性を前記したように分析した。

Ｉ、　　ＩＧＦ結合タンパクの特性 羊水２３０ｃｃの硫酸アンモニウム沈澱は３３および５０％ペレットの両方でＩ ＧＦ結合活性回収を示した。活性の大部分は５０％ペレットに存在しており、こ れをそれ以降の精製のために選択した。フェニルセファロースクロマトグラフィ ーの間、混入タンパクの大部分は０．０５Ｍナトリウムチオシアネートで溶離さ せた。ＩＧＦ結合タンパク質を含有するピークは０．０２Ｍ　）リス、ｐＨ９， ０で溶離し、これは９．５倍に精製されていた。イオン交換クロマトグラフィー により更に精製すると、１００および２５０ｍＭ塩で溶出する２つの主要な結合 活性のピークが分離された（第２図）。これらのピーク（ピークＢおよびＣ）を 更に別々に精製した。ピークＣの物質はセファデックスＧ−１００クロマトグラ フイーにより精製した。結合タンパク活性は巾広いピークにわたり溶離したが、 より大きい分子量の混入物質からは分離された（第３図）。Ｇ−１００精製物質 の６０Ｍｇを更にＣ−４カラムに逆相ＨＰＬＣにより精製した。活性物質は５０ ％アセトニトリルで単一ピークとして溶離し、３ケ月迄の期間、この緩衝液中で 安定に保存された（第４Ａ図）。

ピークＢは逆相ＨＰＬＣを用いてＣと同様の方法で精製し、この段階で９．４倍 の精製がなされた（第４図）。

各タンパクの純度を測定し、分子量を推定するために、各精製段階におけるピー クＣのタンパクを非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、その 後、銀染色を行なった。第５図に示される通り、純粋な生成物は３４Ｋｄであり 、最終精製段階後は単一バンクとして出現している。フェニルセファロースを用 いた段階が混入タンパクの除去のためには最も効果的な操作であると考えられた 。ピークＢおよびピークＣを比較すると、両方が５ＯＳ−ＰＡＧＥにおいて同一 のＲｆ値を有することが示される。推定分子量は非還元条件下では３６Ｋｄであ ったが、タンパクを還元上後に電気泳動に付した場合は３８Ｋｄに増大した。ピ ークＢおよびＣのアミノ酸組成を測定したところ、第■表に示す通り、はぼ同一 のアミノ酸比が得られた。

第■表 ＩＧＦ−Ｉ結合タンパクのアミノ酸組成アスパラギン酸　　　　　　　７．３　 　　　７．６およびアスパラギン セリン　　　　　　　　　　８．５　　　８．７グリシン　　　　　　　　　　 　９．０　　　　７．７ヒスチジン　　　　　　　　　２．１　　　　２．１ア ルギニン　　　　　　　　　　４．９　　　　４．６スレオニン　　　　　　　 　　３．８　　　　４．５アラニン　　、　　　　　　　　１２．４　　　　１ １．１プロリン　　　　　　　　　　　　８．０　　　　　８．８チロシン　　 　　　　　　　　２．８　　　　２．５バリン　　　　　　　　　　３．８　　 　　３．８メチオニン　　　　　　　　　０．７　　　　０．６システイン　　 　　　　　　　４．４”　　　　　５．６”イソロイシン　　　　　　　　３． ６３．９０イシン　　　　　　　　　　　８．１　　　　８．２フエニルアラニ ン　　　　　　２．０　　　　１．７ａ、加水分解後のシスティン標準物質の回 収率に基づく。

ｂ、加水分解後にトリプトファンは検出できなかった。

アミノ酸配列決定に伴うピークＢの還元およびアルキル化により、後の実施例３ に示すＮ末端配列が解った。両方のタンパク質は１０分間１００°Ｃに加熱した 後にも安定であり、そしてｐＨ２，５でも安定であったが、Ｉ）Ｈ２，０ではＩ ＧＦ結合活性は破壊された。

純粋なピークＢまたはＣの調製物がコンカナバリンＡに付着したことが注目され たため、更に物理化学的分析を行なって、炭水化物側鎖が存在するかどうかを調 べた。各タンパク２μｇをＣｏｎ　Ａカラムに適用したところ、ピークＣの５１ ％が付着し、０．５Ｍアルファメチルマンノシドで溶離したが、ピークＢは僅か ２４％が付着したのみであった。一方、ピークＢまたはＣの各々２０μｇをシッ フ塩基で染色したところ、炭水化物は何れのタンパク質でも検出されなかった。

フエチェイン標準物質の染色強度に基づけば、タンパク質は炭水化物として、そ の重量の０．８％未満を含有していた。

ＩＧＰ−Ｉへの各タンパク質の親和性を調べるために、漸増の濃度の未標識ＩＧ Ｆ−Ｉおよび１２’Ｉ−ＩＧＦをピークＢまたはＣとインキュベートし、結合複 合体を免疫沈降させた。データはスカッチャードブロットにより分析した。両方 のタンパク質は、高親和性および低親和性の結合部位を有する２部位モデルまた は、負協同性を有する１部位モデルの何れかに合致する結合特性を有している。

ピークＢおよびＣタンパクの高親和性部位の相対親和性は極めて類似しており、 それぞれ、１゜０６および１．　Ｉ　Ｘ　１０１０Ｌ／Ｍであった。

ピークＢおよびＣ物質の物理化学的類似性にもかかわらず、これらの物質は著名 に異なる生物学的特性を有することが解った。純粋なビークＢ物質はＩＧＦ−Ｉ への平滑筋細胞ＤＮＡ合成応答を大きく強化するが、単独または等価濃度のヒト インスリンの存在下では作用を示さなかった。一方、ピークＣの物質は基礎およ びＩＧＦ−Ｉ刺激のｉＨ−チミジン取り込みを阻害し、ピークＢ　＋　ＩＧＦ− Ｉへの応答を顕著に阻害した。この作用は、１、　Ｏｎｇ／ｒｎｌでピークＣも の低濃度で検知可能であり、そして、２ｏｎｇ／−で最大となった。従って、２ つの形態のＩＧＦ結合タンパクがヒト羊水に存在し、これらは生物学的系で試験 する場合に顕著に異なる生物学的特性を有することと考えられた。

実施例２−ＩＧＦ結合タンパクによるＩＧＦ−Ｉの強化１、細胞培養方法 ブタ大動脈平滑筋細胞を前記したＲｏｓｓ（１９７１）の方法により単離した。

保存培養物を１０ａｎプラスチック培養皿（Ｆａｌｃｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ　Ｄ ｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ。

０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ　＃３００１）中８．０００細胞／ａｌで接種した。保存 培養物は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅｌａｂｓ。

Ｏｇｄｅｎ、　ＵＴ）添加ダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｒａｎ ｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　ＣＯ，、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、 　ＮＹ）（Ｇｉｂｃｏ）中に維持した。これらはトリプシン０．０３％。

ＥＤＴＡ　Ｏ，０２％（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を取出し、１：５希釈度で再度植え 継ぎすることにより１０−１２に日毎に継代した。

全実験は４代目および７代目の間の細胞を用いて行なった。個々の実験は１０％ ＦＢＳ添加０．２　ｍＪ　ＤＭＥＭ中、９６ウエルのマイクロプレー）　（Ｆａ ｌｃｏｎ　＃３００４）中で、８、０００細胞／ウエルで植菌し、５日間増殖さ せた培養物を用いて行なった。この時点で血清含有培地を除去し、１％乏ヒト血 小板血漿（ＰＰＰ）および０．５μＣｉ’Ｈ−チミジン（１５Ｃｉ／ミリモル） 　（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｍａｎｎ、　Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、　ＮＹ）を添加し たＤＭＥＭ　Ｏ，２７７Ｌ７７に被験物質を添加した。対照群のウェルには１％ ＰＰＰまたは種々の濃度のヒト血清１−１０％を含有するＤＭＥＭを入れた。Ｐ ＰＰおよび血清はＣｌｅｍｍｏｎｓ、　Ｄ、Ｒ，（１９８３）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　 Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１４：６１−６７に記載のとおり調製した。ＰＰＰはＲＩ Ａにより約２０ｐｇ／−血漿根因子■を有することが解った。３６時間のインキ ュベーションの後、反応を停止し、ＤＮＡに取り込まれた３Ｈ−チミジンの量を Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、　Ｄ、Ｒ，（１９８３）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　 １１４：６１−６７に記載の方法により測定した。

ニワトリ胚線維芽細胞を１４〜１６日齢のニワトリ胚皮膚から単離した。−次外 植片を４％ＦＢＳ　（Ｈｙｃｌｏｎｅ）。

１０％ニワトリ血清、ペニシリン１００Ｕ／ｙ＋＋／およびストレプトマイシ１ ００　ｕ　ｇ／　ｍｅ　（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ）を添加した培地１９９（Ｇｉｂｃｏ ）に接種した。外植片から増殖した細胞を１回植え継ぎ、次に１０％ＦＢＳ添加 ＤＭＥλ１中３．０００細胞／ウエルで９６ウエルのプレーｈ（Ｆａｌｃｏｎ　 ＃３００４）継代した。５日後、単層を洗浄し被験因子を０．５μＣｉ”Ｈ−チ ミジンおよび１％ＰＰＰを含有するＤＭＥＭ　０．２−とともに添加し、次に、 前記したように３６時間インキュベートした後に３Ｈ−チミジンの取り込みを測 定した。マウス胚線維芽細胞を１８日齢のＢａ１ｂ／Ｃマウス（皮膚）から採取 し、ｌＯ％ＦＢＳ、　１０ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ 、　ＭＯ）およびペニシリン１００Ｕ／ｙｄ、ストレプトマイシン１００ｍｃｇ 　／ｍｊ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ中で成長させた。３代目および５代 目の間の培養物を全試験に用いた。

ヒト線維芽細胞をＨｕｍａｎ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｊ＋　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ −ｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｃａｍｄｅｎ、　ＮＪ）から購入した。これらを１．００ ０／Ｔｎｉペニシリン、１００μｇ／ｒｎｌ！ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ血清（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃｏ、、　Ｄｅｎｖｅｒ、　ＣＯ） を添加した最小必須培地（ＭＥＭＸＧｉｂｃｏ）中の保存培養物中に維持した。

これらを、ｌ：４の継代希釈比で７日毎に植え継いだ。４代目および５代目の間 の培養物を、マイクロプレート上にｓ、　ｏｏｏ細胞／ウェルの密度で接種し、 個々の実験に用いた。５日後、培養物を２回ＭＥＭで、そして１％ＰＰＰ、０． ５μＣｉ　”Ｈ−チミジン添加０、２１ｎＩＭＥＭで洗浄し、被験物質を添加し 、次に前記したように３６時間後に３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。

結合タンパクがＩＧＦ−Ｉへの細胞増殖応答を強化するかどうかを判定するため 、ヒト線維芽細胞または平滑筋細胞を、１．０ｃｃ　ＤＭＥＭ＋　１０％ＦＢＳ 　（平滑筋）またはＭＥＭ＋ｌＯ％仔ウシ血清（線維芽細胞）を含有する２４ウ エルのプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３００３）中、１５．０００細胞／Ｃｉの密 度で接触した。２時間後、細胞の結合を行なうために培地を吸引し、１％ＰＰＰ を含有する培地１．０　ｃｃを添加した。１２時間インキュベーションして、細 胞を静止させたのち、培地を除去し、１％ＰＰＰおよび被験物質を含有するＭＥ Ｍ　１．０　ｃｃと交換した。４８時間のインキュベーションの後、培養物を３ ７°Ｃで１０分間１．０　ｃｃの０．５％トリプシン、０．０３％ＥＤＴＡに曝 露した。これを取り出し、０．５　ｍＭ　ＮａＣ１９，０ｃｃに添加し、細胞数 を粒子データ計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ、　ＺＢＩ型）を用いて測定した。

実施例１でヒト羊水から精製した結合タンパクを静止期のブタ大動脈平滑筋細胞 培養物とともにインキュベートした。この細胞型を選択した理由は、これがその 細胞表面へ付着するＩＧＦ結合タンパクを有さないためである。ＩＧＦ結合タン パクのみを添加した場合は、３Ｈ−チミジン取り込みの刺激は最小であった（第 １Ａ図）　、　ＩＧＦ−Ｉ　（２０ｎｇ／ｍｊ）またはインスリン（１０μｇ／ −）の添加では、それぞれ１５および３８％の３Ｈ−チミジン取り込み増大が生 じたのみであった。一方、ＩＧＦ−Ｉ　（２ｏｎｇ／ｄ）十純粋結合タンパク（ １００ｎｇ／ｍｌ）の添加では、１０％ウシ胎児血清への細胞応答を超える４、 ４倍刺激が生じた。ｌＯμｇ／−の濃度では、インスリンはＩ型ＩＧＦ受容体に は結合するが、結合タンパクには結合しない。これらの濃度のインスリンを結合 タンパクとともに添加した場合は、細胞複製応答の強化は存在せず、このことは 結合タンパク作用の活性化はＩＧＦに特異的であることを示している。

種々の種の細胞型が同様の様式ではＩＧＦ結合タンパクに応答するかどうかを判 定するために、このタンパク＋ＩＧＦ−Ｉの作用をニワトリおよびマウスの胚線 維芽細胞培養物を用いて試験した。これらの細胞型を選択した理由は、ニワトリ 細胞はＩＧＦ結合タンパクを合成しないが、Ｉ型ＩＧＦ受容体を有するためであ る。マウス細胞は異なる形態のＩＧＦ結合タンパク（ＭＷ推定２２Ｋ）を分泌し 、何れの細胞型もＩＧＦ結合タンパクを有さす、何れの細胞型においても３Ｈ− チミジン取り込みの機会は最小限のみであった（第１Ｂ図および０図）。一方、 １００　ｎｇ／−の結合タンパク＋ＩＧＦ−ＩはＩＧＦ−Ｉ　ヘ（７）細胞応答 の明らかな強化を示した。ニワトリ線維芽細胞は特に感受性が大きく、僅か５　 ｎｇ／−のＩＧＦ−Ｉを含有する１０％ヒト血清により誘発された最大応答の８ １％に達した（第１Ｂ図）。マウス線維芽細胞もまたＩＧＦ結合タンパクおよび ＩＧＦ−Ｉの共インキュベーションの作用に対して感受性であった（第１Ｃ図） 。何れの細胞型もインスリン＋ＩＧＦ結合タンパクに応答せず、このことは３Ｈ −チミジン取り込みの最大の刺激を達成するためには、結合タンパクＩＧＦ−Ｉ 複合体が形成されなければならないことを示している。

ヒト線維芽細胞、即ちＩＧＦ結合タンパクを合成する細胞型がやはり外から添加 したペプチドに対して応答するかどうか調べるために、静止期のヒト線維芽細胞 培養物を第２図に示すように調製した。漸増濃度のＩＧＦ−Ｉを添加することに より、ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取り込みは増大し、２０ｎｇ／ｒｎ１で最大と なり、１％ＰＰＰのみに曝露した対照培養物より８２％大きい値を示した。

ニワトリまたはマウスの線維芽細胞に比較して、ＩＧＦ−■のみへの応答が増強 されているのは、内因性分泌ＩＧＦ結合タンパクに起因すると考えられる。　Ｉ ＧＦ結合タンパクのみの添加では、ＤＮＡ合成の増大は生じなかった。しかしな がら、このタンパク１１００ｎ／ｍｌを漸増濃度のＩＧＦ−Ｉとともに添加した 場合、ＤＮＡ合成は１０％ヒト血清と同等の水準まで増大した。本発明者等は、 Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、　Ｄ、Ｒ，、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７７：１ ５４８−１５５６（１９８６）に記載の通り、これらの細胞がＩＧＦ結合タンパ クを合成し培地中に分泌すること、および、このタンパクか細胞表面に結合でき ることも判定している。しかしながら、線維芽細胞は培地中濃度２２−５ｎ／ｍ ｌとするのに充分な結合タンパクを分泌するのみでありそして、これらの培養物 には５０ｎｇ／ｍｌか添加されているため、この差か恐らくは、観察された３Ｈ −チミジン取り込みの付加的な増大をもたらしたものと考えられる。

これらの応答が結合タンパクの濃度に依存するかどうかを調べるため、漸増の濃 度（１−１００ｎｇ／　ｍｌ）の結合タンパク十一定濃度のＩＧｆ−Ｉ　（ｌｏ ｎｇ／　ｍｅ＞を平滑筋細胞培養物とともにインキュベートした。培養物は２Ｈ −チミジン取り込みの顕著な増大を伴って結合タンパク２ｎｇ／ｄに応答したが 、最大作用は１１００ｎ／ｍｅを使用するまで観察されなかった（第２図および 第３図）。

培養した線維芽細胞は２−５　ｎｇ／−の範囲のＩＧＦ結合タンパクを分泌する ため、この結果は、線維芽細胞は、恐らくは最大ＤＮＡ合成応答を達成するのに 充分な量の結合タンパクを分泌していなかったことを示している。

ＩＧＦ−Ｉ＋結合タンパクにより刺激された細胞が全細胞周期を経過できるかど うかを調べるため、平滑筋細胞およびヒト線維芽細胞を低密度で接種し、血清除 去により静止させた。１２時間後、結合タンパクおよびＩＧＦ−Ｉまたはインス リンを被験培養物に添加し、６０時間培養した後に、細胞数を測定した。ＩＧＦ −Ｉまたはインスリンのみを添加した場合、平滑筋細胞数は３％および１１％の 増大がみられたが、結合タンパク＋ＩＧＦ−Ｉ（１０ｎｇ／ｍｌ）は２．．４倍 の増大をもたらした。この増大は１０％ヒト血清で誘発されたものよりも大きか った（第４Ａ図）。ＩＧＦ−Ｉ単独の作用がより大きかったものの、同様の結果 がヒト線維芽細胞でも得られた（第４Ｂ図）。ＩＧＦ−Ｉ単独では、３１％増大 が観察されたのに対し、結合タンパク＋ＩＧＦ−Ｉの組合せでは４８時間後の細 胞数は２．１倍が観察された。

実施例３　１ＧＦ−Ｉ結合タンパクの配列１、　２つの方法を用いて、羊水から 精製した刺激性ＩＧＦＢＰのアミノ酸配列を測定した。このタンパクを３７℃で １時間０．　ＯＩＭ　ＤＴＴ中で還元し、０．１Ｍヨード酢酸でアルキル化した 。生成物を逆相ＨＰＬＣカラムを用いて再精製した。方法１では、逆相ＨＰＬＣ カラムから得たタンパク質を濃縮しＡｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４ ７０Ａ気相シークエンサーのフィルターに直接適用した。

方法２では、０．１Ｍ炭酸アンモニウムｐＨ８，０中、１２時間、タンパク質を トリプシン消化（重量でタンパク質の量の１１５０）に付した。トリプシン処理 ペプチドを、０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリルの濃度勾配を用いたＣ８およ び０４カラム上の逆相ＨＰＬＣにより分離した。５ｐｅｅｄｖａｃ内での濃縮の 後、ペプチドをシークエンサー′に供し、製造元の指示に基づき配列決定した。

以下の配列が得られた。

１、　ＡＰＷＣＡＰＣＳＡＥＫＬＡＬ（Ｅま７’、：ハ５）ＰＰＶＳＡＳＥＳＣ ＶＴＲ（、：れはＮ末端配列） ２、ＷＫＥＰＣＣＩＥＬＹＲ ３、ＡＬＰＧＥＱＱＰＬＨＡＬＴＲ ４、ＮＧＦＹＨ３Ｒ ５、ＦＹＬＰＮＣＮＫ ６、　　ＧＱＧＡＴＶＱＥＳＤＡＳＡＰ７、　　ｖｖＥＳＬＡＫ ８、　　ＩＰＧＳＰＥＩＲ ９、ＡＬＨＶＴＮＩＫＫ これらのペプチドを重複させるため、そして、その他のペプチドを得るためには 、タンパクを別のプロテアーゼ、例えば下顎プロテアーゼ（Ａｒｇ特異的）、Ｌ ｙｓ−Ｃプロテアーゼ（Ｌｙｓ特異的）、およびｖ８−プロテアーゼ（Ｇｌｕ特 異的）で消化し、そしてペプチドを上記したように逆相ＨＰＬＣで分画し、配列 決定しなければならない。

２、羊水から得た精製阻害［ＧＦＢＰ（前記実施例１の精製を参照）およびＧＭ ＩＯ線維芽細胞から得た精製刺激性ＩＧＦＢＰＯ（後記実施例５の精製を参照） 、および他の細胞により馴化された培地のアミノ酸配列は、羊水からの刺激性Ｉ ＧＦＢＰに関する上記の方法と同様にして得ることができる。

実施例４　１ＧＦＢＰ遺伝子の単離 羊水の刺激性ＩＧＦＢＰに対して調製された抗体を用いて、　ＩＧＦＢＰを作る 様々な細胞系を同定した。これらの細胞にはＧＭＩＯおよびＧＭ４９８系統（Ｈ ｕｍａｎ　Ｍｕｔａｎｔ　ＧｅｎｅｔｉｃＣｅｌ）　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、　 Ｃａｍｄｅｎ、　ＮＪ）、ＭＤＡ２３１系統（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　　１２３０１２　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ ｒ、。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２−１７７６）およびＨＥＣ−ＩＲ糸系 統Ａ、　Ｔ。

Ｃ，Ｃ，）が包含される。これらの細胞からＩＧＦＢＰの遺伝子を単離するため に、まず第一に１０１０Ｘ１５０プレートで供給者によって指定された培地中で これらの細胞を集密に増殖させ、ＮＰ−４０溶解法を用いて、ＲＮＡをこれらの 細胞から単離しなければならない（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　（１９８２ ）　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 　ｐｐ、１９１−１９３）。オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーによ りポリＡ”ＲＮＡを精製することができる（Ａｖｉｖ、　Ｈ，およびＬｅｄｅｒ 、　Ｐ、　（１９７２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｌ ＩＳＡ）　６９．１４０８−１４１２）　、このＲＮＡ５μｇを用いて、Ｇｕｂ ｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎにより記載された方法（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、およ びＨｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、　Ｊ。

（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６９）によって、プラントエンドの 二本鎖のｃＤＮＡを合成しなければならない。ＥｃｏＲ［リンカ−をつけ、その 結果生じたｃＤＮＡをラムダｇｔｌｌにクローニングする（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ， Ａ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ。

（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８ ０．１１９４−１１９８）。

得られたライブラリーは１０’以上の独立したクローンを含存するはずであるが 、実施例１に記載のようにして精製された羊水由来刺激性ＩＧＦＢＰに対する適 当なポリクローナルウサギ抗体を用い、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓにより記載 されたスクリーニング条件を用いて、そのライブラリーをＥ、コリＹ１０９０で スクリーニングすることができる。第二の抗体（ヤギ抗−ウサギＰｒｏＭｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）に接合したアルカリフォスファターゼを用い、製造業者による記 載にしたかって、陽性のシグナルが検出されよう。この抗体に対して陽性である ことを調べたクローンを次にＩＧＦＢＰアミノ酸配列（前記）に基づく３種の混 合配列オリゴヌクレオチドプローブを用いて探査した。プローブ＃１，２３７− は、アミノ酸配列ＷＫＥＰＣＣＩＥに対して可能なすべてのＤＮＡ配列からなる １９２の配列の混合物である。プローブ＃２．１７マーは、アミノ酸配列ＷＱＣ ＡＰＣに対して可能なすべてのＤＮＡ配列からなる６４配列の混合物である。ク ローン＃３．１７７−は、アミノ酸配列ＰＧＥＱＱＰに対して可能なすべてのＤ ＮＡ配列からなる６４配列の混合物である。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔ ｅｍｓ　ＤＮＡシンセサイザーでこれらのプローブを合成することができ、その ５°末端は［ガンマ−３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを 用いて比活性４−６　Ｘ　１０＠ｃｐｍ／ｌ）モルに標識されるべきである。抗 体に対して陽性であることを調べたクローンをＥ、コリＹ１０８８に塗布し、（ Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　（１９７７）Ｓｃ ｉｅｎｃｅ　１９６．１８０−１８２）に記載のようにニトロセルロースに移さ なければならない。

プローブを用いた探査は１．０　Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍクエン酸ナトリウム、 ２　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　Ｄ、　Ｔ。

（１９６６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍ ｍｕｎ、　　２３．　６４１−６４６）、０．１％ＳＤＳ、　０．０５％ビロリ ン酸ナトリウムおよび１５０ｍｇ／ｎｌ酵母ｔＲＮＡを含有するハイブリッド形 成バッファー中で行われるべきである。０．４ｐモル／　ｍｌのオリゴヌクレオ チドを用いて、各プールのオリゴヌクレオチドのうちでもっともＡＴに富んだも のについて計算されたＴｍより２°Ｃ低い温度で、そのフィルターを１２−１６ 時間ハイブリッド形成させる（Ｓｕｇｇｓ、　Ｓ、　Ｖ、（１９８１）。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ 　Ｇｅｎｅｓ、　Ｂｒｏｗｎ。

Ｄ、　Ｄ、およびＦｏｘ、　Ｃ，Ｆ、（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、 　ＮｅｗＹｏｒｋ、　ｐｐ、６８３−６９３）　、これらの温度は以下の通りで あるニブローブ＃Ｌ６０℃；プローブ＃２．５０°Ｃ；プローブ＃３．５０℃。

ハイブリッド形成後、フィルターを室温で４５分間、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，０，１ Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳで３回洗浄する。各プールのプロー ブのうちでもっともＡＴに富んだものについて計算されたＴｍ　（すなわちハイ ブリッド形成温度より２℃高い）で、５分間の緊縮洗浄を行う。フィルターを乾 燥させ、陽性のシグナルをオートラジオグラフィーによって検出する。抗体およ び二つのプローブに対して陽性であることを調べたクローンをＭ１３配列決定ベ クターｍｐ１８およびｍｐ１９にサブクローニングしくＹａｎｊｓｃｈ−Ｐｅｒ ｒｏｎ、　Ｃ，。

Ｖｉｅｒｉｒａ、　Ｊ、およびＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　（１９８５）　Ｇｅｎ ｅ　３３゜１０３−１１９）、（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、およびＣｏｕｌ、ｓｏｎ 、　Ａ、　Ｒ，（１９７５）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９４．４４１−４４ ８）の記載にしたがって配列決定する。

最初にライブラリースクリーニングで抗体陽性クローンがまったく得られない場 合には、全ライブラリーを上記のオリゴヌクレオチドスクリーニング法にかける べきである。上記のオリゴヌクレオチドに加えて、さらに精製タンパク質で決定 されたタンパク質配列によって表されるオリゴヌクレオチドも使用すべきである （実施例１および５参照）。これらのオリゴヌクレオチドプローブの設計および 合成は当業者に公知である。

細胞系統の他に、天然のヒト組織をＲＮＡ源として考慮すべきであり、これを用 いてｃＤＮＡライブラリーを作ることができる。好適な組織源は、子宮の脱落膜 である。

全長クローンはそれがＩＧＦＢＰに存在することが知られているタンパク質配列 および開始および終止コドンをコードするオーブンリーディングフレームを含有 することによって特徴付けられよう。全長クローンがまったく単離されない場合 には当業者に公知の方法によって部分クローンおよび適切な合成りＮＡからなる 完全な−揃いのＤＮＡから全長クローンを組立てることができる。全長クローン 由来の挿入物を実施例６に記載のように発現ベクターに移さなければならない。

実施例５−線維芽細胞ＩＧＦＢＰの精製ヒト皮膚線維芽細胞系統ＧＭＩＯまたは ＧＭ４９８　（ＨｕｍａｎＭｕｔａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｐ ｏｓｉｔｏｒｙ、　Ｃａｍｄｅｎ、　ＮＪ）由来の馴化培地を、破片を除去する ために２０．０ＯＯＸ　ｇで２０分間遠心分離する。その上清に硫酸アンモニウ ムを、最終濃度６５％となるように添加し、その溶液を４°Ｃで３０分間ゆっく りと攪拌しておく。３０分間の２０．０００　Ｘ　ｇ遠心分離から得られたペレ ットを、０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有する１０ｍＭ０ｍＭ炭酸アンモニウムルミ ２で抽出する。その抽出物を、抽出バッファーで平衡化したセファデックスＧ− １００クロマトグラフイーによって分取する。ＩＧＦ−Ｉ結合活性を有するフラ クションをプールし、６５％硫酸アンモニウムで再沈澱させる。

３０分間の２０．０ＯＯＸ　ｇ遠心分離から得られたペレットを、１０ｍＭ炭酸 アンモニウムｐＨ６，５で抽出し、５０ｍＭ　ＮａＣ１と等しい伝導度となるよ うに蒸留水で希釈する。この溶液を、１０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ６，５および ５０ｍＭ　ＮａＣ１で予め平衡化したヘパリンセファロースカラムに１５ｒＩＬ ｌ／時間の流速で加える。カラムを３倍容の１ＭＮａＣ１含有平衡化バッファー で洗浄し、その後３倍容の２ＭＮａＣ１含有バッファーで洗浄する。２ＭＮａＣ １含有バッファーを含有するカラムを４°Ｃて一晩放置し、翌朝ｌ容の２ＭＮａ Ｃ１でもう一度溶出する。集めた２ＭＮａＣ１洗浄液をプールし、１０ｍＭ炭酸 アンモニウムｐＨ６，５および５０ｍＭ　ＮａＣ１に対して逆透析する。

透析物を、２■のＩＧＦ−Ｉおよび３ｍｔ’のＲｅａｃｔｉｇｅｌ　Ｘ（Ｐｉｅ ｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から製造業者の説明にしたがって調製したＩＧＦ−Ｉ アフィニティーカラムに、１５ｍ１／時間で加える。このカラムは１０ｍＭ炭酸 アンモニウムｐＨ６，５および５０ｍＭ　ＮａＣ１で予め平衡化した。このカラ ムを５倍容の平衡化バッファーで洗浄した後、５倍容の１０ｍＭ酢酸アンモニウ ムｐＨ４，５および５０ｍＭ　ＮａＣ１で洗浄する。

次にＩＧＦＢＰ活性を１Ｍ酢酸で溶出する。

活性フラクションをＶｙｄａｃ　Ｃ−４逆相ＨＰＬＣカラムにかけ、５分間１ｒ ｎｌ／分で０．０４％ＴＦＡ水溶液で溶出し、その後３分間にわたって２５％ま でのアセトニトリル直線濃度勾配によって溶出する。次に、３０分にわたって２ ５％から１００％アセトニトリル直線濃度勾配でタンパク質を溶出するが、溶出 は３０％アセトニトリル付近である。もしこの状態で配列決定のために純度が不 十分であれば、タンパク質を水で希釈し、再度Ｖｙｄａｃ　Ｃ−８カラムにかけ る。タンパク質はＣ−４カラムにかけたのと同じ濃度勾配で溶出され、溶出は約 ５０％アセトニトリル付近である。

実施例６−動物細胞に於けるＩＧＦＢＰ遺伝子の発現動物細胞でＩＧＦＢＰを発 現するために、以下の工程を行う必要がある： １、発現ベクターの構築 ２、宿主細胞系の選択 ３、発現ベクターの細胞への導入 ４、１ＧＦＢＰの発現の導入 １、多くのそれぞれ異なる種類の細胞で機能するＩＧＦＢＰ発現ベクターを構築 するために、プラスミドは以下のように構築されねばならない。ｐＢＲ３２２を ＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ粘着末端をｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ存在下でフ レナラＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端とする。大きなフラ グメントを単離し、ＭＴＩプロモーターおよび単純ヘルペス１型チミジンキナー ゼ（ＨＳＶ−１ｔｋ）を担い、上記のように平滑末端としたｐＭＫ（Ｂｒｉｎｓ ｔｅｒ　ら、Ｃｅ１ｌ　２７：２２３−２３１．　１９８１）の４　ｋｂ　Ｅｃ ｏＲＩフラグメントと結合する。この結合混合物をＥ、コリＪＭ１０９に形質転 換し、アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性形質転換体からプラスミドＤＮ Ａを調製する。

このＤＮＡを制限地図作成によって特性決定し、第５図に示す構蓬に一致するプ ラスミドを以後の実験のために選択する。

このＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、直鎖状になったＤＮＡに常法によってＥｃｏ ＲＩ部位を含有する合成りＮＡの適当な断片をクローニングすることによって、 このプラスミドのＢｇｌＩ［部位をＥｃｏＲ１部位に変換する。その結果得られ たプラスミド、ｐＭＫ−ＳＧＥをＥ、コリで増殖し、常法により再び単離し、Ｅ ｃｏＲＩで直鎖状とする。

ＥｃｏＲＩによるＤＮＡ消化およびゲル精製を包含する標準的な方法によってλ ｇｔｌｌクローンのＤＮＡから単離された全長ＩＧＦＢＰ　ｃＤＮＡを、上記Ｍ Ｔ−１プロモータープラスミドｐＭＫ−３ＧｅのＥｃｏＲ１部位に結合する。こ の結合およびＥ、コリの形質転換後、制限地図作成によって決定されるＭＴ−１ プロモーターと同方向にＩＧＦＢＰ　ｃＤＮＡの存在するクローンを選択する。

動物細胞の形質転換のためにプラスミドＤＮＡを調製する。

２、活性ＩＧＦＢＰはまだ性質のはっきりしない翻訳後修飾を受ける可能性があ るため、その起源の天然型細胞にできるだけ近い細胞で遺伝子を発現しなければ ならない。それに続く方法を線維芽細胞由来の刺激性ＩＧＦＢＰの遺伝子を用い てここに説明する。ひとたび好適な生産細胞系統が同定されたならば、他のタン パク質の遺伝子についても同様の方法を続ける。その時まで、線維芽細胞はＩＧ ＦＢＰの生産細胞としても作用しよう。

３、発現ベクターをＬｔｋ細胞または他のＴＫ−線維芽細胞系に導入するために 、ＨＳＶ−Ｉ　ＴＫ遺伝子を担うｐＨ５Ｖ−１０６ブラスミドＤＮＡ　（Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）と発現ベクターを混合する。混合し たＤＮＡを標準的なリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱法（Ｓ、　Ｌ、　Ｇｒａｈａ ｍおよびＡ、　Ｊ。

Ｖｏｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６−４６ ７）を用いて細胞に加える。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを 含有する培地での増殖能から安全な形質転換体を選択することができる（Ｍ、　 Ｗｉｇｌｅｒら、（１９７９）Ｃｅｌｌ　１６：７７７−７８６）。

ＩＧＦＢＰ発現ベクターＤＮＡをＴＫ−でない線維芽細胞に導入するために、ネ オマイシン耐性（アミノグリコシド３゛−ホスホトランスフェラーゼ）遺伝子を 有するｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にＳＶ４０プロモーターを融合す ることによって調製した選択ベクターと発現ベクターを混合し、上記のように細 胞に同時に形質転換する。抗生物質Ｇ４１８存在下での増殖能から安定な形質転 換体を選択することができる。

発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する第３の方法は、機能的なジヒドロ葉酸レ ダクターゼ（ＤＨＰＲ）遺伝子を担持するプラスミドと発現ベクターを同時に形 質転換することである。メトトレキセート中での細胞の増殖によって安定な形質 転換体を選択することができる。

この方法は特にＤＨＰＲ−ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクションに適してい る（Ｆ、　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、（１９８４）　Ｍｏ１Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、　４：１６６−１７２）。

上記の安定に形質転換された動物細胞のそれぞれでＩＧＦＢＰ遺伝子の発現を誘 導するために、細胞、を増殖培地中で１０ｍＭ硫酸カドミウムにさらす。この処 理によってＭＴ−１プロモーターが誘導され、その結果ＩＧＦＢＰ遺伝子の発現 が約７倍増加する（Ｍａｙｏ、　Ｋ、　Ｅ、、　Ｒ，ＷａｒｒｅｎおよびＲ，Ｄ 、　Ｐｏａｌｍｉｔｅｒ　１９８２．　Ｃｅ１ｌ　２９：９９−１０８）。

ＩＧＦＢＰ発現をさらに増加させるために、ＩＧＦ−Ｉ刺激剤ＤＮＡのコピー数 を以下の方法の一つによって増幅する。発現ベクターをＴＫ遺伝子とともに同時 に形質転換した場合には、培地中のチミジン濃度を低下させるか、またはそれを 完全に除くことによって増幅できるはずである。ＤＨＰＲ遺伝子とともに形質転 換することによって発現ベクターを細胞に導入した場合には、培地中のメトトレ キセート濃度を増加させることによってその遺伝子の増幅をもたらすはずである （Ｆ、　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、（１９８４）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　４：１６６−１７２）。

実施例７　組換え動物細胞からのＩＧＦＢＰの精製このようなＩＧＦＢＰは天然 型物質と同様に細胞から分泌されると予想されるので、天然型タンパク質の精製 に関する上記の方法によって同様の精製および組換えタンパク質の特性決定を行 うことができることが予想される。

実施例８ ラムダｇｔ−１１ヒト子宮脱落膜ｃＤＮＡライブラリーを前記のように作成し、 実施例４に記載のようなＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓの方法により、刺激性イン スリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に対するウサギポリクローナル 抗体を用いてスクリーニングした。ウサギポリクローナル抗体は実施例１に記載 のものである。アルカリフォスファターゼ複合第二抗体（ヤギー抗−ウサギ、Ｐ ｒｏ　Ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、業者の記載にしたがって、陽性シグナ ルを検出した。調べたライブラリーのクローンの約０．１２％が抗体に対して陽 性であった。１２個の独立のクローンを精製し、挿入物をアガロースゲル電気泳 動によって比較した。約１５００８Ｐの挿入物を有する一クローンをＭ１３配列 決定ベクターｍｐ１８に両方向にサブクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらの方法に よって配列を決定した。このクローンは、２４アミノ酸シグナル配列の後に上記 のすべてのペプチド配列を包含する２３３アミノ酸ポリペプチドをコードする７ ７６８Ｐからなる単一のオーブンリーディングフレームを含有した。

その配列を決定し第６図に示す。

この配列はトリペプチドＡｒｇＧ１ｙＡｓｐを含有する。

ＩＧＦＢＰ配列由来のこのペプチド、またはこのトリペプチドを含有するペプチ ド、および隣接する残基は、ＩＧＦＢＰの細胞やマトリクスへの付着を妨げる働 きをし、それによってＩＧＦ−Ｉ誘導細胞増殖に関する刺激効果を妨げる。

実施例９　原核細胞（Ｅ、コリ）に於けるＩＧＦＢＰ遺伝子の発現およびそれか らの生物学的に活性なＩＧＦＢＰの単離 Ａ、　　ＩＧＦＢＰ発現ベクターの調製ＩＧＦＢＰ　ｃＤＮＡをＥ、コリにクロ ーニングし、以下の段階によるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ依存発現ベクターｐＪ Ｕ１００３を第７図に示す。

１、プラスミドｐＪＵ１００３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し 、大きな直鎖状ベクターフラグメントを標準的なゲルを用いる方法によって精製 した。

２、　　ＩＧＦＢＰ　ｃＤＮＡコード配列を含有するλｇｔｌｌクローンを酵素 ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥｌｌで消化し、コドン２６からＣ末端までの成熟ＩＧ ＦＢＰコード配列およびさらに６００ｂｐの３°非翻訳領域を含有する１２２５ ｂｐからなるフラグメントを放出した。このフラグメントも標準的なゲルを用い る方法によって精製された。

３、第７図に示すＩＧＦＢＰの最初の２５アミノ酸およびＮ−末端メチ才二ン（ ＡＴＧ）コドンをコードする１０２ｂｐの合成二本鎖オリゴヌクレオチドを調製 した。コドンの選択は高度に発現する遺伝子に於ける特定のコドンに関するＥ、 コリの優先性を反映する。さらに、このオリゴヌクレオチドの５°末端は結果と してＲｏｓｅｎｂｅｒｇ。

Ａ、　Ｈ，、Ｌａｄｅ、　Ｂ、　Ｎ、、　Ｃｈｕｉ、　Ｄ、、　Ｌｉｎ、　Ｓ、 、　Ｄｕｎｎ、　Ｊ。

Ｊ、、　５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、　Ｗ、、　Ｇｅｎｅ　５６：１２５−１３５． １９８７（特に引例によりここに編入される）に記載のようなベクターにコード されたＴ７０１０遺伝子のＩＧＦＢＰ遺伝子に対する翻訳カップリングを生じる ＤＮＡ配列を含有する。このオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩおよびＢｓｔＥｌ ｌ粘着末端を有する。

４、上記の三つのＤＮＡ配列を相互に結合し、その混合物を用いて５ｔｕｄｉｅ ｒ、　Ｆ、　Ｗ、およびＭｏｆｆａｔｔ、　Ｂ、、　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８９＋１１３−１３０．１９８６　（特に引例によりコ コに編入される）に記載のＥ、コリＢＬ２１／ＤＢ　３株を形質転換した。１５ μｇ／ｒｄテトラサイクリンに耐性のコロニーを選択し、上記実施例４に記載の ような抗−ｒＧＦＢＰ抗体を用いて、１ｍＭイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクト ピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導後の［ＧＦＢＰ生産でスクリーニングした。

５、陽性クローンからプラスミドＤＮＡを調製し合成オリゴヌクレオチドに起因 する部分をＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

９４：４４１−４４８．１９７５　（特に参照としてここに編入される）に記載 のＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎの方法に従って配列決定した。

１）ＪｔＪ１０２０と称される形質転換体を上記のように単離し、液体培地で増 殖させた。精製天然型（羊水）ＩＧＦＢＰを標準として用いて、全細胞タンパク 質の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、１ｍＭＩＰＴＧによる誘導後生産されるＩＧＦＢ Ｐの総量を測定した。ＩＧＦＢＰ約ｌμｇ／培養ｍｌ／Ａ＠ｏｏユニットの生産 が測定された。重大なことには、この物質は天然型タンパク質の３１ｋＤと同じ 見かけの分子量でゲル中を移動した。以上の観察は、このような特徴により、天 然型ＩＧＦＢＰと同一の物質をＥ、コリ内で生産することができることを示す。

もっと効率のよいＩＧＦＢＰ生産株を作成するために、第８図に示すような以下 の方法でｃＤＮＡクローンの３°非翻訳領域をプラスミドｐＪＵ１０２０から除 去した。

１、プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌ［［で消化した。

２、第８図に示す７４ｂｐの合成二本鎖オリゴヌクレオチドを調製した。このオ リゴヌクレオチドは（ａ）ε、コリでよく用いられるコドンを用いたＩＧＦＢＰ のＣ末端２１コドンのコード配列；　（ｂ）ＩＧＦＢＰの翻訳終止コドン；（Ｃ ）別の翻訳解読枠に於ける付加的な翻訳終止コドン；（ｄ）末端ＨｉｎｄＩ［［ およびＢａｍ旧制限部位を含んでなる。

３、次に合成オリゴヌクレオチドを（１）に記載の消化済みＤＮＡと混合し、相 互に連結した。連結後、混合物を酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この部位はこの実 験に於いて当該のＤＮＡに唯一の部位であるので、この操作は３′非翻訳ＤＮＡ を含有する分子のみを直鎖状にする。

４、次にこの混合物を用いてＥ、コリＢＬ２１／ＤＥ　３株を形質転換し、テト ラサイクリン耐性（１５μｇ／ｍｌ）クローンを選択した。１）ＪＵ１０２０構 築に関連して上に述べたようにクローンの合成オリゴヌクレオチド部分のＤＮＡ 配列の正確さ、およびＩＧＦＢＰ生産で、形質転換体をスクリーニングした。

陽性で正しいクローン（ｐＪＵ１０２１）を増殖させ、上記のｐＪＵ１０２１構 築に関して記述したように、遺伝子発現の誘導後ＩＧＦＢＰ生産を測定した。こ のクローンは［ＧＦＢＰ約２０μｇ／培地μｉ７／Ａ、。。ユニットを生産する 。

上記のＴ７遺伝子１０に結合したＩＧＦＢＰ配列を、第９図に示すような以下の 工程によって、ｄｅＢｏｅｒ、　Ｈ，Ａ、。

Ｃｏｍ５ｔｏｃｋ、　Ｌ、　Ｊ、およびＶａｓｓａｒ、　Ｍ、、によりＰｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：２１−２５．１９８ ３　（特に参照としてここに編入される）に記載のように、ｔａｃｔプロモータ ーを含有するプラスミドベクターに移した。

１、　ｔａｃＩプロモーターを含有するＥ、コリ発現プラスミドであるプラスミ ドｐＴ３Ｘ　Ｉ　−２を酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ［［で消化し、プロモ ーター、抗生物質耐性遺伝子、および複製起点を含有する大きなフラグメントを 単離した。

２、プラスミドｐＪＵ１０２１を酵素Ｘｂａ　ＩおよびＨｉｎｄＩ［で消化し、 　ＩＧＦＢＰコード配列を含有するフラグメントを単離した。このフラグメント はＴ７遺遺伝子誘導後および上記ｐＪＬｌ１０２１構築に関連して記載したよう な翻訳カップラーも含有する。

３、長さ２０ｂｐの合成オリゴヌクレオチドを調製した。

このフラグメントはプラスミドｐＪＵ１０２１のｘｂａ　Ｉ部位のすぐ上流（５ ′）のＤＮＡ配列を含有する。このＤＮＡを用いてＩＧＦＢＰコード配列をｔａ ｃ　Ｉプロモーター含有発現プラスミドに適合させる。

４、これら三つのＤＮＡ配列を相互に連結し、その混合物を用いてＥ、コリＪＭ １０７株を形質転換し、テトラサイクリン−耐性クローンを選択した。１ｍＭＩ ＰＴＧで遺伝子誘導後ＩＧＦＢＰを発現し、合成オリゴヌクレオチドの正しいＤ ＮＡ配列を含有するクローンを上記のように同定した。陽性で正しい一クローン をｐＪＵ１０２２と呼ぶ。

このクローンを増殖させ、遺伝子発現誘導後のＩＧＦＢＰ生産をｐＪＵ１０２０ 構築についての記載のように測定した。

このクローンはＩＧＦＢＰを約１０μｇ／培養物■／Ａｓｏｏユニット生産する 。

Ｂ、Ｂ、コリからのＩＧＦＢＰの生産 以下のようにしてＥ、コリから生物学的に活性なＩＧＦＢＰを調製することがで きた。プラスミドｐＪＵ１０２１を含有するＥ、コリＢＬ２１／ＤＥ３株を、１ ５μｇ／−テトラサイクリン含有ルリアブロス中、３７°ＣでＡ６００が１．０ まで増殖させた。次に１ｍＭのＩＰＴＧを添加してＩＧＦＢＰ遺伝子発現を誘導 し、さらに２時間増殖を続けた。次に、細胞を遠心分離によって集め、５０ｍＭ 　）リス、ｐＨ７，５でもとの培養量の２０分の１に再懸濁し、フレンチプレス で溶解した。１５，０００Ｘｇで１０分間遠心後、ベレット（不溶性タンパク質 ）および上清（可溶性タンパク質）を、ＩＧＦＢＰの存在について５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ、ウサギ抗−ＩＧＦＢＰ抗体を用いたウェスタンプロットにより分析した。

全ＩＧＦＢＰの約８０％が不溶性画分中に見いだされた。

生物学的に活性なＩＧＦＢＰはこの両分から３通りの方法により得られた。

■、ベレットを５０ｍＭ　）リス、ｐＪ（７，５（もとの培養物量の１／２０） で洗浄することができる。その時的５％のＩＧＦＢＰが可溶化され、遠心分離後 上清に残存するであろう。この物質はＩＧＦＢＰの単量体、二量体および高分子 量体を含有し、上記ブタ大動脈平滑筋細胞バイオアッセイに於いてＩＧＦ−Ｉ活 性を増強することが示された。

２、上記のように調製した不溶性タンパク質ペレットを、６ＭグアニジンＨＣＩ 　（もとの細胞培養物５０７７１１につき１−）に再懸濁し、室温で５分間放置 することができる。ジチオトレイトールを最終温度２０ｍＭまで添加し、その混 合物を室温で３０分放置する。この混合物を１３、ＯＯＯＸｇで１５分遠心し上 清を酸化型グルタチオン最終濃度２０ｍＭと混合し、その混合物を室温に１０分 間放置する。

もとの培養物５０ｍ１当り４．５艷の５０ｍＭ　）リスｐＨ１０，７、および最 終濃度１ｍＭのシスティンを混合物に添加し室温で一晩放置する。次にその混合 物を５０ｍＭ　）リスｐＨｇで１５分間遠心分離する。

この方法で得られたＩＧＦＢＰを「再び折り畳んだＩＧＦＢＰＪと称す。予め還 元することなしに５ＤＳ−ＰＡＧＥによってこれを分析すると、二量体型ＩＧＦ ＢＰ（見かけの分子量５０ｋＤａ）並びに単量体型（見かけの分子量２５ｋＤａ ）を含有することが示される。非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ後にニトロセルロースフ ィルターに移されたＩＧＦＢＰに対する１２８１−標識ＩＧＦ−Ｉの結合を示す インビトロアッセイが示すように、これらの型はいずれもＩＧＦ−Ｉと結合する 。この再び折り畳んだ物質は記載のようなブタ大動脈平滑筋細胞を用いた***促 進アッセイに於いてＩＧＦ−Ｉ活性を増強する。

ＦＰＬＣ（Ｍｏｎｏ　Ｑ）によって、単量体ＩＧＦＢＰを二量体を含まぬように 精製することができ、単量体は０．２８ＮａＣ１で溶出する。単量体のみを含有 するこの画分は、記載のようなブタ大動脈平滑筋細胞を用いた***促進アッセイ に於いてＩＧＦ−Ｉ活性を増強しない。

３、ジチオトレイトールを添加しない以外は上記のようにして、不溶性タンパク 質ペレットを６Ｍグアニジン塩酸で可溶化することができる。この物質を次ぎに ５０ｍＭ　）リスｐＨ７，５に対して透析する場合、沈澱が生成する。しかしな がら、この沈澱および可溶性タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥで比較すると、６Ｍ グアニジンＭＣＩで可溶化されたＩＧＦＢＰの少なくとも５０％が透析後も溶液 中に残存することがわかる。この可溶化物質が上記のようにＩＧＦ−Ｉに結合す るＩＧＦＢＰの単量体型および二量体型を含有することが示されうる。このグア ニジン可溶化、透析ＩＧＦＢＰは、記載のようなブタ大動脈平滑筋細胞を用いた ***促進アッセイに於いてＩＧＦ−Ｉ活性を増強することが示された。

本発明の方法および産物について様々な修正および変更が可能であることは当業 者に明らかであろう。したがって、修正および変更が添付の請求の範囲およびそ の均等物の範囲にあるならば、本発明はこのような本発明の修正および変更を包 含するものとする。

細胞数ｘｌｏ−” ＦＩＧ、　５ 平滑末端 ＦＩＧ、　６ 国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．インスリン様成長因子の活性を阻害しうる、インスリン様成長因子結合タン パク質。
2. ２．インスリン様成長因子の活性を強化しうる、インスリン様成長因子結合タン パク質。
3. ３．第６図に示すアミノ酸配列を有するインスリン様成長因子結合タンパク質。
4. ４．インスリン様成長因子結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するベ クター。
5. ５．ベクターが第６図に示すＤＮＡ配列を含有する、請求の範囲第４項記載のベ クター。
6. ６． （ａ）前記ベクターが前記単細胞宿主に適合した複製起点をも含有する、請求の 範囲第４項記載のベクターで単細胞宿主を形質転換し、 （ｂ）インスリン様成長因子結合タンパク質の生産に好適な条件下で、形質転換 された宿主を培養する、ことを含んでなる、インスリン様成長因子結合タンパク 質の生産のための組換えＤＮＡ法。
7. ７．前記単細胞宿主がＥ．コリである、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記ベクターが第６図のＤＮＡ配列を含有する、請求の範囲第６項記載の方 法。
9. ９．前記ベクターがｐＪＵ１０２０である、請求の範囲第６項記載の方法。
10. １０．前記ベクターがｐＪＵ１０２１である、請求の範囲第６項記載の方法。
11. １１．前記ベクターがｐＪＵ１０２２である、請求の範囲第６項記載の方法。
12. １２．ベクターｐＪＵ１０２０。
13. １３．ベクターｐＪＵ１０２１。
14. １４．ベクターｐＪＵ１０２２。
15. １５．請求の範囲第６項記載の方法により生産されたインスリン様成長因子結合 タンパク質。