JPH03503758A

JPH03503758A - 被包細菌

Info

Publication number: JPH03503758A
Application number: JP1502168A
Authority: JP
Inventors: ゾーマー，エリーザー; スピールマン，アンドルー; ペローネ，ジョゼフ　ビー．
Original assignee: プレジデント　アンド　フェロウズ　オブ　ハーバード　カレッジ
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1991-08-22
Also published as: EP0401249A4; IL89243A; WO1989007447A1; CN1036226A; EP0401249B1; CA1340319C; AU3049089A; IL89243A0; DE68915159D1; DE68915159T2; EP0401249A1; KR900700120A; BR8907243A; AU631359B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】７、前記細菌を、集落を胞子形成のｍ段階で収穫して製造する特許請求の範囲第１項記載の細菌。

８、前記ポリマーが非イオン性、ポリアニオン性或はポリカチオン性である特許請求の範囲第１項記載の細菌。

９、前記ポリマーをデキストラン、デンプン、ゼラチン、アルギネート、カラジーナン、キトサン及びポリオキシエチレンとスアミンからなる群より選ぶ特許請求の範囲第１項記載の細菌。

１０、前記ポリマーを架橋させる特許請求の範囲第１項記載の細菌。

１１、前記ポリマーをホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＤＭＡ、　ＤＭＳ、　Ｂ５０ＣＯＥＳ、　ＤＳＴ、ポリホスフェートイオン或は金属で架橋させる特許請求の範囲第８項記載の細菌。

１２、前記ポリマーが日光遮断用発色団、食欲刺激剤（ファゴスチミュラント）及び虫誘引剤からなる群より選ぶ添加剤を含む特許請求の範囲第１項記載の細菌。

１３、特許請求の範囲第１項記載の細菌を含む細菌細胞の集合体。

１４、直径１０〜１００ミクロンを有する特許請求の範囲第１３項記載の集合体。

１５、直径２０〜５０ミクロンを有する特許請求の範囲第１３項記載の集合体。

１６、虫毒素をコード化する遺伝子を有する細菌を成長させて毒素を形成し、細菌をポリマーで被包する工程を含む殺虫剤の製造方法。

１７、前記細菌が胞子形成体でありかつ前記成長が細菌を胞子形成のｍ段階に入らせることを含む特許請求の範囲第１６項記載の方法。

１８、前記被包が前記細菌の外膜な前記ポリマーで被覆することを含む特許請求の範囲第１６項記載の方法。

１９、前記細菌に、虫消化管消化液をしみ通しかつ細菌を分解することができる生物学的剤を実質的に透過させないポリマーを被覆する特許請求の範囲第１６項記載の方法。

浄書（内容に変更なし）明　　　　　細　　　　　書被　　包　　細　　菌庄」を形成する過程の間に、バラスポーラル（ｐａｒａｓｐｏｒａ　ｌ）を吉晶として知られている細胞内殺虫性毒素を形成する。この毒素を蚊のような虫が吸い、毒素は虫の消化管のアルカリ性内容物によって分解され１．消化管の崩壊を引き起こして虫を殺す、虫毒素は一般に、ＢＴＩを発酵させて細胞マスを形成し、これらの細胞の胞子形成を誘発し、毒素生成及び胞子形成を行わせ、次いで母細胞の溶解を行わせて胞子及びパラスポーラル結晶を培地に放出させることによって製造する。結晶及び付随する胞子な次し）で収穫し、殺虫剤を配合して容器に入れる。この殺虫剤を部位の上にまく０例えば下記を参照：　５ｕｂｂａ　［Ｅｄ、］０ｘｆｏｒｄ　ＩＢＨ（１９８２）、＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３９７　Ｊｊ以降、Ｃｈ、１５．アイザワ、、Ｍｉｃｒ’ｏｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｐｅ５ｔｓ”　；　Ｌａｃｅｙ等、Ｊ、　Ａｍ、　Ｍｏ５ｑ、　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ａｓｓ、　　ｌの　Ａｂｓｔｒａｏｔ：　４９３〜４９７頁（１９８５）；　Ｎｏｖａｋ等、Ｊ、’　Ａｍ、　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｓｓ、　１のＡｂｓｔｒａｃｔ；　　４４９〜４５３頁（１９８５）。

１豆立１１発明は、第一の態様では、殺虫性毒素を含有する細菌を特徴とし、細菌を、目標とする虫の消化性酵素を高いアルカリ性ｐＨ（例えば、９．０より高いｐＨ）において透過させる非リビング樹脂状保護材料で被包する。被包とはポリマー材料で完全に囲み、こうして環境で経験するｐＨレベル（例えば、８．５より低いｐＨ）において、熱、湿気及び溶液、例えば雨水から生成される炭酸を含む環境要因から保護することを意味する。「保護」とは、材料が被包細菌の崩壊を、使用する農業環境において経験する条件下で有意に遅延させることを意味する。

好ましい実施態様では、毒素はバラスポーラル結晶毒素であり、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓであり；ポリマーは農業環境において、例えば土壌中或は植物の葉の上で安定であり：特に、ポリマーは熱安定性であり（少なくとも約１２０下（４９℃）まで）かつ水（８，５より低いｐＨ）　、紫外線及び農業環境において経験する他の条件によって急速に劣化されない。その上、ポリマーは胞子嚢を微生物或は酵素崩壊のような他の環境崩壊に対して保護する。ポリマーは、胞子嚢を溶解する主情化管液（例えば、ｐＨ１０より高い）によって容易に透過されるならば、虫消化管において有意に分解される必要はない、ポリマーはそれらの条件下で毒素を透過して毒素を虫消化管に放出すべきである。毒素は細菌を胞子形成のｍ段階に成長させて産生される。ポリマーは非イオン性、ポリアニオン性或はポリカチオン性にすることができる。適した非イオン性ポリマーはデキストラン、デンプン或はゼラチンであり、適したポリアニオン性ポリマーはアルギネート或はカラジーナンであり、適したポリカチオン性ポリマーはキトサン或はポリオキシエチレンビスアミンである。他の好ましいポリマー特性は下記の通りである：（ａ）ポリマーが最も好ましくは下記で架橋される：ホルムアルデヒド；グルタルアルデヒド：　ＤＭＡ　（Ｗａｔｅｒｍａｎ等（＋９７５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、６３巻、５８０〜５８７頁に開示されている通りのジメチルアジビミデート２８ＣＩ）　　；　ＤＭＳ（Ｐａｃｋｍａｎ等（１９８２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１巻、５１７１〜５１７５頁に開示されている通りのジメチルスペルイミデート　２８ＣＩ）；　Ｂ５０ＣＯＥＳ（Ｚａｒｌｉｎｇ等（１９８０）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２４巻、　　９１３〜９２０頁に開示されている通りのビス［２−（スクシンイミド−オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）：ＤＳＴ（Ｂｒａｇｇ等（１９８０）、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０６巻、４９５〜５０３頁に開示されている通りのジスクシンイミジルタータレート）；スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ　（Ｚａｒｌｉｎｇ等）；スルホ−ＤＳＴ（Ｂｒａｇｇ等）；ポリホスフェートイオン：或は金属イオン（例えば、Ｃａ　”″）及び（ｂ）ポリマーは添加剤、例えば日光遮断用発色団、風味剤、或は誘引剤、例えばフェロモンを含有する。

発明は、第二の態様では、上述した細菌を含有する細菌細胞の集合体を特徴とする。集合体は直径１０〜１００ミクロンを有するのが好ましく、２０〜５０ミクロンを有するのが最も好ましい。

発明は、第三の態様では、被包殺虫剤の製造方法を特徴とする。その方法は虫毒素についてコード化する遺伝子を有する細菌を成長させて殺虫剤を生成しかつ細菌をポリマーで被包することを含む。

好ましい実施態様では、細菌は胞子形成体であり、細菌を胞子形成の■段階に成長させ、被包は細菌の外膜な被覆することを含む。

発明は微生物細胞壁の特性を利用してセルラーポリマを引き寄せ、こうして被包させる。これらの被包製剤を化学架橋によって安定にすることが、虫を防除するのに適した極めて安定な生成物を生じ、かつ公衆衛生及び農業の両方について重要である。好ましい態様では、毒素は胃毒素であり、マイクロ被包は標的虫が摂取するのを増進させ、かつまた標的虫の消化管のアルカリ性媒質内で働く消化酵素による毒素の放出及び活性化を可能にする。特に好ましい実施態様では、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓを使用し、プロセスは細胞を完全な胞子嚢として保つ。

被包毒素は現場条件下で極めて安定であり、これより従来の殺虫剤に比べて適用する頻度が少な（ですみ、使用の費用を低減させる。更に、これらの殺虫剤の製造方法は比較的に安価である。毒素が細菌内に残るのが好ましいので、発酵プロセスが短縮される０例えば、胞子形成細菌は、産生を完了するまで、すなわち胞子形成の■段階まで成長させる必要があるだけである。この点で、細胞に直接被包用ポリマーを被覆し、この状態で販売し、頒布し、農業生成物に適用することができる。被包毒素は天然及びシミュレーテッド現場条件下で非被包毒素に比べて相当に長い半減期を有する。更に、細胞はポリマーを架橋することによって集合させることができるので、集合体の直径は標的虫の摂取要件が最適になるように選ぶことができる０例えば、蚊（それらの内のいくつかは濾過摂食体（フィルターフィーダー）である）に関し、粒子の直径が２５〜１００ミクロンの場合に、毒性の増大が観測され、一層小さい幼虫については、１０〜２０ミクロンの大きさが一層良好である。

本発明の付加された特徴は日光遮断用発色団食品添加剤、染料及びフェロモンをポリマーに加入する機会及び能力である。発色団は被包毒素をＵＶ照射から保護し、こうしてその安定性を高める０食品添加剤及びフェロモンは、虫が毒素を食べる機会を高める。

発明の他の特徴及び利点は下記の好ましい実施態様の記載及び請求の範囲の記載から明らかになるものと思う。

女ましい　　、　の６本発明において適した毒素は殺虫性毒素を含む。適した毒素は一般に用いられているものを含み、通常の使用の農業環境において不安定な場合がいくつかある。

これらの毒素はＢＴＩ或はＢ、　ｔｈｕｒ　１ｅｎｓｉｓ　ｅｎｔｏｍｏｔｓｉｄｅｓのパラスポーラル結晶毒素及び関連するかかる毒素を含む、一般的には上記のアイザヮの４００頁を参照、毒素は普通に用いられている手順によって作ってもよく或は下記に記載するような改正手順によって作ってもよい。

毒素は、また、ＭｃＬｅａｎ及びＷｈｉｔｅｌｙ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１６９　（３）　、　＋０１７−１０２３頁（１９８７年）及びＷａｒｄ等、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１９１．１３〜２２頁（１９８６年）が開示する通りの標準技法を用いて、毒素コード化遺伝子をＥ、　Ｃｏ１１或はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのような他の細菌内で発現させることによって作ってもよい、毒素は被包プロセスの間、これらの細菌内に残存するのが好ましい。

１１皿ヱユ１＝上記の毒素を被包するのに適したポリマーは種々の非イオン性、ボッアニオン性及びポリカチオン性ポリマーを含む、このようなポリマーの例はデキストラン、例えばデンプン、タンパク質、例λばゼラチン、アルギネート或はカロジーナン、キトサン及びポリオキシエチレンとスアミンである。これらのポリマーは広く生物分解性のバイオポリマーであるのが普通であるが、広範囲の通常の農業タイプの条件に十分に耐えて毒素をそれが摂取される期間の間保護し、適用の間の時間を実質的に短縮させるのが好ましい、ポリマーは胞子嚢の細菌或は酵素分解に対して保護する。ポリマーは虫の消化管におけるようなアルカリ性条件及び消化酵素を極めてしみ通しくｐｏｒｏｕｓ）かつこれらに接近し得る。

例本例では、ＢＴＩのバラスポーラル結晶毒素を含有する胞子嚢を種々の被包用ポリマーの内の１種によって被包する。

本例は発明を限定するものでなく、当業者ならば本例において上述した毒素及び被包用ポリマーを代えて用い得ることを了解するものと思う。

バッフル式シェーカーフラスコを１１００ｒｐで使用して、ＢＴＩの細胞を液内培養で３２℃において約１２〜１８時間成長させる。別に、細胞を発酵装置において、媒質１容積当り空気０．８容積を用いて、細胞が胞子形成の■段階に達するまで成長させる。この段階は、標準手順によって、例えば顕微鏡により、或は細菌の代謝出熱によって求める。５！酵のこの段階で、温度を３２℃から２２℃ に下げ、或は硫酸を加えてｐＨを７から６に下げる。これらの環境変化は細菌の溶解を２４時間より長くおくらせるのを助ける。この遅延は細菌の被包を、毒素結晶を胞子形成母細胞或は胞子嚢から放出させないで、進行させる。

胞子嚢を下記する３つのタイプのポリマーの内の１つで被包する。（細胞は、このプロセスの前に、単に細胞を沈降させかつ沈殿より上に残る液体の約８０％をデカントして濃縮してもよい、別法として、細胞を懸濁状態のままにしてもよい、）ａ）可溶性デンプンのような非イオン性ポリマーを培地に加えた後に、エタノール或はアセトンのような有機溶媒を容積の５ｏ％まで加える。これらの溶媒はコアセルベーティング剤として作用し、被覆された細胞を培地から沈殿させる０通常、デンプンの添加量は媒質中の細胞の量にほぼ等しく、その濃度は約０．５〜５重量％である。ポリマーは、また、急速温度シフトによって溶媒から沈殿させることができる。

ｂ）キトサンのようなポリカチオン性ポリマーを（約０．４〜４重量％で）媒質に加える。キトサンを酢酸（０，２〜０．５Ｍ）で酸性にしてｐＨを約５より低くしておく、負に荷電した胞子嚢壁は可溶性ポリマーを引き寄せる。次いで、ポリマーをポリホスフェートイオン（０，１〜０．２Ｍ）で安定にする。

Ｃ）アルギネートのようなアニオン性ポリマーを（約０．４〜４重量％で）媒質に加える。これらのポリマーは細胞に引き寄せられる１次いで、カルシウム塩（０゜１〜０．２Ｍ）を加えてポリマーを架橋させ、多層のポリマーを有する細胞を生じる。

染料或は　Ｕ、Ｖ、遮断化合物、例えばバラアミノ安、ワ、香酸のような着色誘引剤をこの段階で加える。

コーティングプロセスは数分かかるにすぎないが、混合物を１〜２時間放置するのがよい。被覆胞子嚢を添加剤と共に、今、化学的に架橋させて最終生成物を安定にする。架橋用物質（約０．１〜０．０１重量％）は、アルデヒド、例えばホルムアルデヒド或はグルタルアルデヒド、二官能価アミドエステル、例えばＤＭＡ或はＤＭＳ、二官能価Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えばＢ５０ＣＯＥＳ或は　ＤＳＴ及びその他Ｐｉｅｒｃｅ）１ａｎｄｂｏｏｋ　　及びＣａｔａｌｏｇ　（１９８６−７，３１１〜３４０頁）に挙げられているものが適している。最も適しているかかる架橋剤は塩基可逆性であり、これより標的虫の消化管内で開裂される０例えば、上に挙げた２ａｒｌｉｎｇ等を参照。これらの架橋用物質はこのようにして消化管内での毒素の放出を高め、終局的に毒素を活性化させることを可能にする。

最終生成物は胞子嚢を架橋ポリマーで被包させてなり、エマルションとしてスプレー乾燥或は販売し、直接標的植物に適用することができる。スプレー乾燥は、アトマイザ−を使用し、混合物を適当な通りにカルシウム或はポリホスフェート溶液にスプレーする標準手順によって行う、別法として、混合物を、安息香酸或はソルビン酸を加えて保存することができ、これらの酸は食品防腐剤として０１％で用いるのが普通である。このような溶液及び乾燥生成物は数カ月及び数年の間でさえ安定である。それらは標準技法によって植物及び現場に適用するが、適用頻度は少なくてすむことから、殺虫剤の使用量は従来の配合物よりも少ない。

他の実施態様は下記の請求の範囲内である。

手続補正書（放）事件の表示　平成１年特許願第５０２１６８号発明の名称　被包細菌補正をする者事件との関係　　　　　　　　　特許出願人名　称　　プレジデント　アンド　フェロウズ　オブハーバード　カレッジ住　所　　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号住所　同上　　　　　　　／）補正命令通知の日付　平成３年４月１６日補正の対象特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の

Claims

【特許請求の範囲】

１．アルカリ性の高いｐＨにおいて虫消化性酵素を透過させる非リビング、樹脂状、保護ポリマー材料によって被包された、殺虫性毒素を含む被包細菌。
２．前記毒素がバラスボーラル結晶毒素である特許請求の範囲第１項記載の細菌。
３．前記細菌がＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの胞子■である特許請求の範囲第２項記載の細菌。
４．前記ポリマーが農業環境において安定である特許請求の範囲第１項記載の細菌。
５．前記ポリマーが虫消化管消化液をしみ通す特許請求の範囲第１項記載の細菌。
６．前記ポリマーが前記細菌を分解することができる生物剤を実質的に透過させない特許請求の範囲第１項記載の細菌。
７．前記細菌を、集落を胞子形成のＩＩＩ段階で収穫して製造する特許請求の範囲第１項記載の細菌。
８．前記ポリマーが非イオン性、ポリアニオン性或はポリカチオン性である特許請求の範囲第１項記載の細菌。
９．前記ポリマーをデキストラン、デンプン、ゼラチン、アルギネート、カラジーナン、キトサン及びポリオキシエチレンビスアミンからなる群より選ぶ特許請求の範囲第１項記載の細菌。
１０．前記ポリマーを蚊架橋させる特許請求の範囲第１項記載の細菌。
１１．前記ポリマーをホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＤＭＡ、ＤＭＳ、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＳＴ、ポリホスフェートイオン或は金属で架橋させる特許請求の範囲第８項記載の細菌。
１２．前記ポリマーが日光遮断用発色団、食欲刺激剤（ファゴスチミュラント）及び虫誘引剤からなる群より選ぶ添加剤を含む特許請求の範囲第１項記載の細菌。
１３．特許請求の範囲第１項記載の細菌を含む細菌細胞の集合体。
１４．直径１０〜１００ミクロンを有する特許請求の範囲第１３項記載の集合体。
１５．直径２０〜５０ミクロンを有する特許請求の範囲第１３項記載の集合体。
１６．虫毒素をコード化する遺伝子を有する細菌を成長させて毒素を形成し、細菌をポリマーで被包する工程を含む殺虫剤の製造方法。
１７．前記細菌が胞子形成体でありかつ前記成長が細菌を胞子形成のＩＩＩ段階に入らせることを含む特許請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．前記被包が前記細菌の外膜を前記ポリマーで被覆することを含む特許請求の範囲第１６項記載の方法。
１９．前記細菌に、虫消化管消化液をしみ通しかつ細菌を分解することができる生物学的剤を実質的に透過させないポリマーを被覆する特許請求の範囲第１６項記載の方法。