JPH03503602A - スブチリシンの突然変異 - Google Patents
スブチリシンの突然変異Info
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- JPH03503602A JPH03503602A JP1504388A JP50438889A JPH03503602A JP H03503602 A JPH03503602 A JP H03503602A JP 1504388 A JP1504388 A JP 1504388A JP 50438889 A JP50438889 A JP 50438889A JP H03503602 A JPH03503602 A JP H03503602A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
スブチリシンの突然変異
発明の分野
本発明は、増強された熱安定性を有する改良型のスブチリシン酵素、および該ス
ブチリシン酵素をコードしている遺伝子に関する。
発明の背景
タンパク質はアミノ酸の線状ポリマーである。タンパク質を生成する重合反応に
よってそれぞれのアミノ酸から水1分子が失われることになるので、タンパク質
はアミノ酸「残基」で構成されていると表現されることが多い。天然のタンパク
質分子は20種はどの異なるアミノ酸残基を含むことができ、そのそれぞれは特
有の側鎖を含有している。タンパク質中のアミノ酸配列はタンパク質の1次構造
を指定している。
タンパク質は3次元構造に折り畳まれている。この折り畳みは、アミノ酸の配列
によって、およびタンパク質の周囲環境によって決まる。タンパク質の顕著な性
質は、このタンパク質の3次元の立体配座に直接依存している。即ち、この立体
配座が、酵素の活性または安定性、結合タンパク質の能力および特異性、ならび
に受容体分子の構造的特性を決定している。
タンパク質の3次元構造は多数の方法で調べることができる。タンパク質の構造
を調べるための最良の既知の方法には、恐らくX線結晶学的方法の使用が含まれ
る。この方法の優れた概説を、Physical B 1ochea+1str
y[Van Ho1de、に、E、(Prentice−Hall、NJ (1
971) pp221−239) ;この文献は本明細書の一部を構成する]に
見ることができる。この方法を用いて、極めて精度高く3次元構造を解明するこ
とができる。また、円偏光二色性、光散乱を用いて、または放射エネルギーの吸
収および放出を測定することによって、タンパク質の3次元構造を精査すること
ができる[Van Ho1de、Physical BiocheIIlist
ry、 Prentice−Hall、 NJ (1971)]。さらに、中性
子デフラクションの技術を用いて、または核磁気共鳴によって、タンパク質の構
造を調べることができる[Physical Chemistry、 4th
Ed、 Moore、 W、 J、 、 Prentice−)tall、 N
J (1972) ;この文献は本明細書の一部を構成する]。
移しい数の天然タンパク質の3次元構造を調べることによって、多数の繰返しパ
ターンが明らかになった。αヘソックス、平行βシート、および非平行βシート
が、観察される最も普通のパターンである。このようなタンパク質パターンの優
れた記述は、D 1ckerson。
R,E、等がThe S tructure and Action or P
roteins[11,A、Benjawin、 Inc、 、 CA (19
69)]に記載している。各アミノ酸をこれらパターンの1つに割り当てると、
タンパク質の2次構造が決まる。タンパク質の2次構造のへリックス、シートお
よび折り返しが一緒になって夕・ンパク質の3次元構造が生じる。多くのタンパ
ク質の3次元構造は、内部表面(タンパク質が通常見い出される水性環境から離
れるように配回している)および外部表面(水性環境にすぐ近接して存在する)
を有するものと特徴付けることができる。多数の天然タンパク質の研究により、
疎水性残基(トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、インロ
イシン、バリン、またはメチオニンなど)は、タンパク質分子の内部表面に最も
多く見い出されることがわかった。対照的に、親水性残基(アスパラギン酸、ア
スパラギン、グルタメート、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セ
リン、トレオニン、グリシン、およびプロリンなど)は、外部タンパク質表面に
最も多く見い出される。アミノ酸アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニン
は、内部および外部タンパク質表面の両方に等しい頻度で見い出される。
タンパク質は、折り畳まれた秩序ある状態と折り畳まれていない無秩序の状態の
間の動的平衡の状態で存在する。この平衡の一部は、タンパク質の構造を安定化
させる傾向にあるポリペプチド鎖の異なるセグメント間の短い範囲の相互作用、
およびその一方の、分子のランダム化を促進する傾向にある熱力学的な力を反映
している。
天然タンパク質の最大の群は酵素を構成している。通常、それぞれの酵素は別種
の化学反応を触媒し、その機能が極めて特異的であるのが普通である。酵素が研
究され、酵素の3次元構造とその活性または安定性の間の関係が調べられた。
酵素のアミノ酸配列が酵素の性質を決定し、酵素のアミノ酸配列は該酵素をコー
ドI7ている遺伝子のヌクレオチド配列によって指定される。酵素のアミノ酸配
列を変化させるど、アミノ酸配列中の変化の位置、性質および/または強さに応
じて、程度を変えつつ酵素の性質を変化させることができ、また、酵素を不活性
にすることすらできる。
ある生物種内の別種類の天然酵素においてわずかな変異が存在することがあるが
、通常、同一の種の生物によって産生される特定の種類の酵素は、基質特異性、
熱安定性、種々の条件下(例えば、温度およびpH)での活性レベル、酸化安定
性などについては実質的に同一である。このような天然あるいは「野生型」酵素
の性質は、酵素の天然環境外で利用する際には、必ずしも最適なものではない。
従って、酵素の天然の性質を変えて酵素のある種の性質を特定の使用のために、
または特定の環境において使用するために最適化することが望ましいこともある
。
発明の要約
本発明は、増強された熱安定性を有する改良型のスブチリシン酵素に関する。さ
らに、本発明は、野生型スブチリシンを越える増強された熱安定性を有する少な
くとも1つのアミノ酸置換を有するスブチリノン物質をコードしているクローン
された突然変異遺伝子に関する。
定−負
本発明を説明する際に次の定義を用いる。
タンパク質:タンパク質は生細胞によって産1生され、アミノ酸によって構成さ
れるヘテロポリマーである。通常のタンパク質は100〜1000個のアミノ酸
からなる。アミノ酸の正確な配列がタンパク質の構造および機能を決定する。
アミノ酸ニアミノ酸はタンパク質のビルディングプロ、りである天然の化合物で
ある。通常、天然アミノ酸は3文字または1文字のどちらかに短縮して表される
。最も普通のアミノ酸とそれらの記号を第1表に挙げる。アミノ酸は頭部から尾
部に結合されて長い主鎖を形成する。それぞれのアミノ酸種は異なった側鎖を有
している。
アスパラギン酸 Asp D阪五各:すべでのアミ
ノ酸は主鎖に同じ原子を有し、側鎖においてのみ異なっている。主鎖の原子は1
個の窒素、2個の炭素、および1個の酸素である。最初の原子は窒素であり、N
で示される。次の原子は炭素であり、α−炭素と呼ばれる。側鎖の基はこのα−
炭素に結合している。α−炭素はCで示されるカルボニル炭素に結合している。
Cはカルボニル酸素(0で示される)に結合し、そして次の残基のNに結合して
いる。側鎖基の原子には、元素記号(C10、N、S)、ギリシャ文字(α、β
、γ、δ、ε、ζおよびη)、そして側鎖基が分岐しているときには恐らくはア
ラビア数字からなる名称が与えられる。
発明の詳細な説明
本発明は、スブチリシン酵素をコードしている種々のヌクレオチド配列に突然変
異を加えることによって修飾したスブチリシン酵素に関する。本発明の修飾され
たスブチリシン酵素は増強された熱安定性を有している。
本発明のスブチリシン酵素は、プロテアーゼとして知られている酵素群に属する
0プロテアーゼは、ペプチド結合の切断のための触媒である。この切断の例を以
下に挙げるニブロチアーゼの1種はセリンプロテアーゼである。セリンプロテア
ーゼは、活性部位に必須のセリン残基が存在しているペプチド結合の加水分解を
触媒する。セリンプロテアーゼは、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっ
て、およびジイソプロピルフルオロホス7エートによって阻害することができる
。
スブチリシンはグラム陽性細菌または菌類によって産生されるセリンプロテアー
ゼである。7種のスブチリシンのアミノ酸配列が知られている。これらには、バ
シラス(Bacillus)株由来の5種のスブチリシンが含まれる(スブチリ
シンBPN’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシ
ン・アミロサラカリチフス、およびメセンチコペブチダーゼ)[rBacill
us amyloliquefaciens由来の中性プロテアーゼおよびアル
カリプロテアーゼの遺伝子はシグナル配列と成熟タンパク質をコードしている領
域の間に大きいオープン・リーディング・フレームを含有しているJ (Vas
antha etal、、J、Bacteriol、 159: 811−8
19(1984)) ; rBacillus licheniformis
由来のスブチリシン・カールスバーグの発現およびクローニング配列決定J (
Jacobs et al、、 Nucleic Ac1ds Res、 13
: 8913−8926(1985));「スブチリシンDYの全アミノ酸配
列の決定ならびにスブチリシンBPN’、カールスバーグおよびアミロサラカリ
チフスの一次構造との比較J (Nedkov et al、、Biol、Ch
em、Hoppe−8eyler 366: 421−430(1985))
; rスブチリシン・アミロサラカリチフスJ (Kurihara et
al、 、 J、 Biol、 Chew、 247 : 5619−5631
(1972)) ;および「アルカリ・メセンテリコペプチダーゼの全アミノ酸
配列J (Svendsenet al、、FEBS Lett、 196:
22g−232(1986))]。
T hermoactinomyces vu1garis由来のスブチリシン
・サーミターゼのアミノ酸配列も既知である[ r thermoactino
IIlyces vu1garis由来のサーミターゼの全1次構造およびスジ
チリシン型プロテアーゼ類に対する構造的特徴J (Meloun et al
、、FEBS Lett、 183: 195−200(1985))コ。
次の2種類の菌類プロテアーゼのアミノ酸配列が既知である:即ち、Triti
rachium album由来のプロテア−ゼK [r Tritirach
iunalbam Limber由来のプロテア−ゼK J (Jany et
al、、Biol、Chem。
Hopp、e−8eyler 366 : 485−492(1985))]な
らびに好熱性菌類Malbranchea pulchella由来のサーモミ
コラーゼ[[エンドペプチダーゼ類:サーモミコリンJ (Gaucher e
t al、、Methods Enzymol、 45+ 415−433(1
976))]である。
これらの酵素は、それらの1次配列および酵素的性質によってだけでなく、X線
結晶学データの比較によっても、スブチリシンBPN′に関連していることがわ
かった[「スブチリシン・カールスバーグと複合したヒル由来の阻害物質ニグリ
ンの結晶および分子構造」(McPhalen et al、、FEBS Le
tt、 188 : 55−58(1985))ならびに「菌類のプロテア−ゼ
にの3次元構造は細菌性スブチリシンとの類似性を示すJ (Pahler e
t al、、EMBOJ、 3: 1311−1314(1984))コ。
「突然変異が為されたか、または修飾が加えられたスブチリシン酵素(群)」な
る用語は、本発明で用いるときには、増強された熱安定性を有し、本発明のスブ
チリシン酵素と相同な、突然変異が為されたセリンプロテアーゼを含むものとす
る。また、本明細書ではこの突然変異が為されたか、または修飾が加えられたス
ブチリシン酵素を、「スブチリシン物質」とも記載する。本明細書で用いる際に
は、および突然変異が為されたかもしくは修飾が加えられたスブチリシン酵素ま
たはスブチリシン物質の定義のもとでは、本発明の突然変異は、スブチリシンB
PN’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン・ア
ミロサラカリチフス、メセンチコベブチダーゼ、サーミターゼ、プロテア−ゼに
、またはサーノ酸配列相同性を有し、従って相同とみなすことができるあらゆる
セリンプロテアーゼ中に導入してよい。
本発明の突然変異が為されたスブチリシン酵素は、天然あるいは野生型スプチリ
シンを凌ぐ増強された熱安定性を有している。熱安定性は、タンパク質の全般的
な強靭さの良好な指標である。熱安定性の高いタンパク質は、カオトロピック物
質、デタージエントの存在下で、およびタンパク質を不活性化する傾向にあるそ
の他の条件下で安定であることが多い。従って、熱的に安定なタンパク質は、高
温、厳しい溶媒条件に対する耐性、または長期の貯蔵寿命が要求される多(の工
業および治療分野で有用であると予想される。
本発明においては、熱不活性化に対する耐性は、2組の代表的な条件下での熱不
活性化に対する耐性によって測定した。第1のものは10n+Mの塩化カルシウ
ムの存在下、65°Cであり、第2のものは溶液から遊離のカルシウムを除去す
る10mMのEDTAの存在下、45°Cである。カルシウムはスブチリシンを
安定化することが知られている。これら両極端のカルシウム濃度のもとての安定
性の測定は、安定なスブチリシンの可能性ある産業上の利用にはカルシウム量か
異なって存在する条件が含まれるために行ったものである。
野生型BPN’スブチリシンのT1/2は、10mMCaCρ、65°Cでは5
9±3分であり、1mM EDTA、45°Cでは14.4±0.05分である
。突然変異が為されたスブチリシンの熱安定性は、TI/2(突然変異体)をT
I/2(野生型)で割った比で表示する。
第2表に挙げた突然変異スブチリシン酵素は熱的に安定であることがわかった。
本発明の突然変異スブチリシン酵素は、熱安定性を増強する少なくとも1つの特
定のアミノ酸置換を有している。第2表は、このスブチリシンを分泌する宿主細
胞の菌株名称を示している。突然変異はアミノ酸置換であり、始めに天然のアミ
ノ酸およびその位置数を示し、右への矢印がアミノ酸置換を示している。野生型
のT1/2に対する突然変異体のT1/2の比を次に示している。
最後に、オリゴヌクレオチドが示されている。この最後の欄の最初の行は、特定
のオリゴヌクレオチドを示す番号(#)である。オリゴヌクレオチド番号の下の
2番目の行は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列または塩基対配列である
。突然変異はスブチリシンBPN’を用いて行った。しかし、本明細書において
説明するように、これらの突然変異は、オリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘
発を用いてセリンプロテアーゼ中の同様の位置に導入することができる。
!z老突然変異スブチリシンBPN’f素10mM CaCQ 1. OmM
EDTAGX7130 野生型 1.(11,0−−−GX71
74 VAL8 −ILE 2.0 0.8 $20102
1−marCCT TACGGCATCTCA CAA ATrGX7175
GLY169−ALA 5.9 1.1 #201121−
marGGCTACCCT G圓AAA TACCCTGX7195 TYR
217−LYS 3J 2.7 ft192819−m
erCGG GGCGAA AAA CGG TACGGX83Q3
MET 50 →PHE 0.76 1.4 H2O7
19−marGAG CCA GCT TCG TrCCTr CGX8309
SER24g−ASP 1.5 0.75 ft220
824−marCAA GTCCGCGACAGA TrAGAA AAC
SER249−ARG #220824−me
rGX8314 GLN 206 →CYS 2.4 5.1
#218119−merGTA TCT ATCTGT AGCACG
CGX8330 TYRZ17→LEU 2.0 1.8
#233119−merCGG GGCGCT TAA CGG TA
CGGX8336 GLN2(18→7M! 1.1 1.7
3242219−marGTA TCT ATCTACAGCACG
CGX8352 SER63→ASP 6.3
ft24942l−nerGACAACAACGACCACGGA ACTTY
R217→LYS #192819−merG
X8354 GLI+ 271 →GLU 1.3
#25221?−marCAA COT AGA AGCGGCAGGX8
363 THR22→LYS 1.3 2.1 :125
2418−merAGG CTA CAA AGG ATCAAAASN 76
→ASP #246320−merCGG C
TCTTG ACA ACT CAA TCGX8376 TYR104−V
AL 5.0 1.6 #233219−marCGG CCA
AGT TAG CTG GAT CGLY 128 →SER112:(3
819−marGCCTCG GCT CTCCTT CTG G第2表のスブ
チリシン酵素突然変異の情報を用いて、例えばスブチリシン・カールスバーグな
どの密接に関連した他のプロテアーゼ類を改良することができる。関連の深さは
アミノ酸配列の比較によって調べる。タンパク質配列を並べる方法は多数存在す
るが、関速度が非常に小さいときにそれらの相違が明白になるにすぎない。At
1as of P rotein S equence and S truc
ture[Margaret O,Dayhoff、1i1WA
Vol、5 Supplement 2.1976、National Bio
medical Re5earch Foundation、 Georget
own University Medical Center、 Washi
ngton、D、C,、p、3rr、標題5EARCHand ALIGN]に
記載されている方法は関速度を定義している。当分野で周知であるように、関連
タンパク質は、錆止のアミノ酸の数ならびに各アミノ酸の種類において異なるこ
とができる。即ち、2つの構造を酷似性が最大になるように並べたときに削除ま
たは挿入が存在し得る。例えば、スブチリシン・カールスバーグは274個のア
ミノ酸を有しているが、一方、スブチリシンBPN’は275個のアミノ酸を有
している・この2つの配列を並べると、カールスバーグはスブチリシンBPN’
のASN 56に対応する残基を含んでいないことがわかる。このように、例
えばカールスバーグのアミノ酸配列は、位置56にギャップが示されていなけれ
ば、BPN’とは非常に違って見えるであろう。従って、スブチリシン・カール
スバーグの位置217においてLYSの代わりにTYRを置換すると熱安定性が
増大するであろうことを、高い信頼度で予想することができる(ただし、カール
スバーグ中の残基はBPN’との相同性によって数が付されているものとする)
。
2つの相同なスブチリシンの一方がギャップを有しているときには、その位置で
構造が異なっていると推論するにちがいない。そのような相違の例は当分野では
周知である。これらの局所的な相違の故に、どちらかのスブチリシンが突然変異
の部位に、またはその部位にすぐ隣接してギヤノブを有しているときには、安定
化突然変異を移動させるべきではない。従って、アミノ酸配列を並べた後に、ギ
ャップでの、またはギヤツブの次の突然変異を望ましい突然変異のリストからは
ずし、突然変異を行わすイ。
この方法を用いて、本明細書に記載した熱安定性突然変異の全てを他の相同なセ
リンプロテアーゼに移すことができる。
簡単に説明すると、本発明の増強された熱安定性突然変異(群)を導入するため
には、通常、所望のスブチリシン物質をコードしている遺伝子を始めにその天然
の供給源から単離し、クローニングベクター中にクローンする。別法によれば、
所望の遺伝子から転写されるmRNAを供給源細胞から単離し、クローニングベ
クター中に挿入するために逆転写によってcDNAに変換することができる。ク
ローニングベクターはファージまたはプラスミドであってよく、通常、微生物の
ゲノムとは独立した微生物中のベクターの自律的な複製のためのレプリコンを含
有している。クローニングベクターは、ベクターで形質転換された微生物の選択
を助けるために、■またはそれ以上の抗生物質耐性をコードしているD N A
などの表現型マーカーを含有しているのが好都合である。
DNAまたはcDNAをクローニング用のベクター中に挿入するための方法は当
分野で周知である。通常、これらの方法は、スブチリシン物質をコードしている
遺伝子をベクター中の開裂された制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することを
含み、この遺伝子の末端にデオキシヌクレオチドのホモポリマー尾部を付加して
この遺伝子を相補性のホモポリマー尾部を有するクローニングベクターの開裂さ
れた末端に結合させることを含むこともある。次いで、オリゴヌクレオチド指向
性の突然変異誘発によってスブチリシン遺伝子に突然変異を行うことができる。
部位指向性の突然変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘
発はB ryan等[Proc、 Nat l。
Acad、 Sci、 USA 83 : 3743−3745(1986)
:この文献の開示は本明細書の一部を構成する]が詳細に記載している。
本発明の突然変異スブチリシン物質は、クリーニング、特に布類のクリーニング
に用いられる清浄剤などの洗浄調製物への添加物とl7°C用いることができる
。本発明の突然変異スブチリシン物質は野生型のスブチリシン物質よりも熱的に
安定であり、従って清浄剤を含む溶液中で保存したとき、あるいはクリーニング
で使用中に高温にかけたときに野生型と同じように早く活性を失うことはない。
本発明の突然変異スブチリシン物質を洗浄調製物の添加物として用いることによ
って、織物のタンパク質性の汚れの除去が改善される。
洗浄調製物への添加物として用いることができる突然変異スプチリノン物質の量
は、当分野で周知であり、通常の実験によって容易に確かめることができる。酵
素濃度の最適範囲が、酵素のコストおよび要求されるクリーニング結果に関係し
ているのは勿論である。通常、洗浄調製物に添加される突然変異スブチリシン物
質の量は、約2000〜約4000 Alkaline Delft Unit
s/洗浄調製物の重量(ADU/9)であろう。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものでは
ない。
大湾應」−熱安定性の検討
Bacillus amyloliquefaciens(スブチリシンBPN
’)由来のスブチリシン遺伝子をクローンし、予め配列決定し、Bacillu
s 5ubtilisにおいてその天然のプロモーター配列から高L/ベルで発
現させた[Vasantha et al、、Baeteriol、 159
: 881(1984) : Yells et al、、NueIeic A
c1ds Res、 11 : 7911(1983)]。突然変異を、プラス
ミド1こコードされているスジチリシン遺伝子中にインビトロで導入し、変異酵
素の熱安定性に及ぼす作用を分析した。
全ての突然変異体遺伝子をpUBlloに基づく発現プラスミド中に再クローン
し、これを用いてB、5ubtilisを形質転換した。宿主として用いるB、
5ubtilis株はそのスブチリシン遺伝子の染色体欠失を含んでおり、従っ
てバ・ツクグラウンドの野生型活性を生成しない。全ての突然変異酵素がこのベ
クターから効率的に発現され、約19/Qの濃度で培養培地に分泌された。この
系ではスブチリシンが主な分泌タンパク質であり、全細胞外タンノくり質のほぼ
80%を構成する。
捧−型
突然変異スブチリシン酵素を、次の3段階精製法によって細胞不含の発酵ブロス
から精製した:
(1)粗製の発酵ブロスのDEAEクロマトグラフィー。固体の2−(N−モル
ホリノ)エタンスルホン酸(Mes)を加えることによってブロスをpH7,0
に調節し、20111MのMes緩衝液(pH7,0)で予め平衡化しておいた
DE−52セルロース(Whatman)のベッド(13X5(J)に付した。
これらの条件のもとでは、スブチリシンは遅滞なく洗い流される。
(2)DEAE溶出液のアセトン分画。アセトン(−20°C)を4°CでDE
AE溶出液と撹拌lまた。スブチリシンは50〜70%のアセトンで沈澱する。
0〜50%アセトンの沈澱分画は捨てた。
(3)アセトン沈澱物のS E−53(Whatman)クロマトグラフィー。
アセトン沈澱させたスブチリシンを20+l1MのMesl衝液(pH6,0)
に溶解し、同じ緩衝液で平衡化した5E−53セルロースのカラム(2,5x
16cx)に付した。直線の塩勾配(0〜0.2M Na(J)を用いてスブチ
リシンを溶離した。
最も高い比活性を含む分画を集め、70%イソプロパツールまたは50%硫酸ア
ンモニウム沈澱物のどちらかとして一20°Cで保存した。
酵素活性
50mM トリス−HC(2(pH8,0)、50mMKCff中、25℃で
、基質スクシニル−(L)−Ala−(L)−Ala (L)−Pro (
L)−Phe−1)−ニトロアニリド(S A A P F −pN A ;
Ca1biochev+)のl。
OaiM溶液の加水分解をモニターすることによってスブチリシン活性を検定し
た。1単位の活性は、これらの条件下で1分間あたりに1%モルの基質を加水分
解する酵素量に対応している。加水分解産物の1つであるp−ニトロアニリドは
410nmで8800 M−’cr’の消衰係数を有しており、従って、酵素反
応のモニターを容易にする[Delmar et al、、A al、Bioc
hem、岨: 316−320(1979)]Dスブチリシン濃度は、EO(0
,1%)=1.17を用い、28Or+mで調べた[0ttesen & 5v
endson、唾ds in Enzymology(1976)、p、207
]。
熱不活性化に対する耐性
突然変異スブチリシン酵素を、溶液中での熱不活性化に対する耐性について試験
した。熱不活性化の検討は、10mM CaCCaCl2−15Qリス−HCC
’(pH8,0)または1.OmM EDTA、50mMトリス−HCl2(p
H8,0)に溶解したスブチリシン溶液をインキコベートすることによって行っ
た。CaCQ、の存在はスブチリシンを安定化する。10a+MのCaCQlの
存在下、65°Cで、または1mMのEDTAの存在下、45°Cで平衡化した
、サーモスタット調節の循環水浴中に浸漬したガラス製D urham管に試料
を入れた。試料管からの蒸発を、パラフィルムでシールすることによって防いだ
。その一部を種々の時間に採取し、検定溶液により25°Cで検定した。0時間
の測定は、試料を温浴に浸漬する前の5AAPF−pNAの加水分解速度であっ
た。その後の基質の加水分解速度の全ては、浴に浸漬した後に測定した。残存活
性と時間の対数プロットは、その大部分が、3半減期にわたって直線であること
を示した。即ち、1次の速度式を適用することができる。10 mM CaC(
b、50mMKCρ、および50mM トリス−HCρ(pH8,0)の存在
下、65℃での、菌株7130由来の野生型酵素およびスブチリシンの失活速度
は59±3分の半減期を有することがわかり、これは、同様の条件に対して文献
に報告されている値とよく一致した[Voordouv et al、。
Biochemistry 15 : 3716−3724(1976)]。こ
の速度は野生型酵素の基準点1.0を与えた。熱不活性化の半減期(TI/2)
を突然変異スブチリシン酵素について測定した。この結果を上記の第2表に示し
た。
上記の発明を明確にし、理解を助けるために例を示して説明したが、ある種の変
化および修飾を本発明の範囲内で行い得ることは明らかであり、本発明は添付の
請求の範囲によってのみ限定されるものである。
国際調査報告
tel@m*masl A11@l+cae7、。PC?/υ58910147
5’−mAm=Ikl−PCB10s89101475
Claims (19)
- 1.アミノ酸位置8にイソロイシンを含有するスブチリシン物質をコードしてい る突然変異スブチリシン遺伝子。
- 2.アミノ酸位置169にアラニンを含有するスブチリシン物質をコードしてい る突然変異スブチリシン遺伝子。
- 3.アミノ酸位置217にリジンを含有するスブチリシン物質をコードしている 突然変異スブチリシン遺伝子。
- 4.アミノ酸位置50にフェニルアラニンを含有するスブチリシン物質をコード している突然変異スブチリシン遺伝子。
- 5.アミノ酸位置248にアスパラギン酸およびアミノ酸位置249にアルギニ ンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
- 6.アミノ酸位置206にシステインを含有するスブチリシン物質をコードして いる突然変異スブチリシン遺伝子。
- 7.アミノ酸位置217にロイシンを含有するスブチリシン物質をコードしてい る突然変異スブチリシン遺伝子。
- 8.アミノ酸位置206にチロシンを含有するスブチリシン物質をコードしてい る突然変異スブチリシン遺伝子。
- 9.アミノ酸位置63にアスパラギン酸およびアミノ酸位置217にリジンを含 有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
- 10.アミノ酸位置271にグルタミン酸を含有するスブチリシン物質をコード している突然変異スブチリシン遺伝子。
- 11.アミノ酸位置22にリジンおよびアミノ酸位置76にアスパラギン酸を含 有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
- 12.アミノ酸位置104にバリンおよびアミノ酸位置128にセリンを含有す るスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
- 13.請求項1〜12のいずれかに記載の突然変異スブチリシン遺伝子によって コードされているスブチリシン物質。
- 14.スブチリシン物質がスブチリシンBPN′、スブチリシン・カールスバー グ、スブチリシンDY、スブチリシン・アミロサッカリトリクス、およびメセン テリコペブチダーゼからなる野生型スブチリシン群から選ばれるスブチリシンで ある請求項13記載のスブチリシン物質。
- 15.スブチリシン物質がスブチリシンに相同な突然変異セリンプロテアーゼで ある請求項13記載のスブチリシン物質。
- 16.請求項13記載のスブチリシン物質を2,000〜4,000Alkal ine Delft Unitsの濃度で含有する洗浄調製物。
- 17.織物を請求項16記載の洗浄調製物と接触させ、該洗浄調製物で汚れた織 物をクリーニングすることを特徴とする、織物のタンパク質性の汚れの除去を改 善するための方法。
- 18.オリゴヌクレオチド突然変異誘発によってスブチリシン物質に突然変異を 誘発して以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも1つを行うことを特徴とする、 スブチリシン物質の安定化方法:アミノ酸位置8にイソロイシン; アミノ酸位置169にアラニン; アミノ酸位置217にリジン: アミノ酸位置50にフェニルアラニン;アミノ酸位置248にアスパラギン酸お よびアミノ酸位置249にアルギニン; アミノ酸位置206にシステイン; アミノ酸位置217にロイシン; アミノ酸位置206にチロシン; アミノ酸位置63にアスパラギン酸およびアミノ酸位置217にリジン; アミノ酸位置271にグルタミン酸; アミノ酸位置22にリジンおよびアミノ酸位置76にアスパラギン酸;または アミノ酸位置104にバリンおよびアミノ酸位置128にセリン。
- 19.(a)スブチリシンのアミノ酸配列を得;(b)該スブチリシンのアミノ 酸配列をスブチリシンBPN′のアミノ酸配列と並べ: (c)突然変異が(a)のスブチリシンのアミノ酸配列中のギャップのところに 、またはギャップの隣に来ないような条件のもと、該スブチリシンをオリゴヌク レオチド指向性の突然変異誘発によって突然変異させて、以下に示す突然変異の 少なくとも1つを行い:アミノ酸位置8にイソロイシン; アミノ酸位置169にアラニン; アミノ酸位置2171にリジン; アミノ酸位置50にフェニルアラニン;アミノ酸位置248にアスパラギン酸お よびアミノ酸位置249にアルギニン; アミノ酸位置206にシステイン; アミノ酸位置217にロイシン; アミノ酸位置206にチロシン; アミノ酸位置63にアスパラギン酸およびアミノ酸位置217にリジン; アミノ酸位置271にグルタミン酸; アミノ酸位置22にリジンおよびアミノ酸位置76にアスパラギンのためのアス パラギン酸;または アミノ酸位置104にバリンおよびアミノ酸位置128にセリン;そして (d)熱的に安定な突然変異スブチリシン物質を製造すること;によって得られ る熱的に安定な突然変異スブチリシン物質。
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