JPH03503567A - 酵素的に増幅された圧電特異的結合アツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素的に増幅された圧電特異的結合アッセイ発明の分野 本発明は、液状試料中に存在することが疑われる分析物を捕捉因子により石英結 晶の微量てんびんの上にまたはそれに近接して結合しており、そして結合した分 析物を抗分析物因子／酵素接合体と反応させる、酵素的に増幅された圧電特異的 結合アッセイに関する。接合体はその酵素に対して特異的である基質と反応させ て、石英結晶の微量てんびんの表面と反応しおよび／またはその上に蓄積するこ とができる産生物を形成する。これらの反応から生ずる石英結晶の微量てんびん の表面上の質量の変化は、石英結晶の微量てんびんの共鳴振動数を変化させ、こ の変化を使用して試料中の分析物の濃度を決定することができる。

発明の背景 イムノアッセイにおける石英結晶の微量てんびん（また、圧電共振器として知ら れている）は従来記載された。これらの装置は２つの電極の間に挟まれた単結晶 のウェーファーから成る。電極は、これらの装置を、石英結晶をその共鳴振動数 で駆動する外部の共振器回路へ接続する手段を有する。この振動数は結晶の質量 、ならびにその結晶の電極区域に拘束される層の質量に依存する。こうして、振 動数は電極の表面上の質量またはそれらの電極上の層の変化により変更する。一 般に、これらの装置の共鳴振動数の変化は質量の変化に関係づけることができる ；石英結晶の微量てんびんおよびそれに取り付けられた層が硬質の挙動に従う場 合、質量の変化はサラエルプレイ（Ｓａｕｅｒｂｒｅ３’）の関係により振動数 の変化から決定することができる：ここで△ｆは測定した振動数偏移であり、ｆ ｏは石英結晶の親振動数に示す、Δｍは質量の変化であり、Ａは圧電的に活性な 面積であり、−１は石英の密度（２，６４８ｇｃｍ一つであり、モしてμ、は剪 断弾性係数（ＡＴ切断石英について２．９４７Ｘ１０”ダインｃｍ−りである。

ションズ（Ｓｈｏｎｓ）らは、溶液中の抗体活性の決定のために変更した、圧電 石英結晶の微量てんびんを記載している。抗原を予備コーティングした石英結晶 を、変化する濃度および特異性の抗血清に暴露する。

抗原のコーティングに対して特異的な抗血清は、結晶上の追加のタンパク質層を 形成するであろう。乾燥した結晶の振動数偏移により測定した、抗体層の厚さは 、溶液中の特異的抗体の濃度に比例する。［Ｊ、Ｂｉ。

ｍｅｄ、Ｍａ　ｔｅ　ｒ、Ｒｅ　ｓ、　、Ｖｏ　１．６、ｐＩ）、５ｅｓ−５７ ０（１９７２）］。

米国特許第４．２３５．９８３号（ＲｉｃｅＳ　１９８０年１２月２日発行）は 、抗体の特定のサブクラスの決定の方法を開示している。この方法は、決定すべ き抗体に対して特異的な抗原を、その表面に結合して有する圧電共振器を利用す る。抗体をコーティングした抗原を、未知の量の抗体を含有する溶液に暴露する 。溶液中の抗体を共振器上の抗原に取り付けた後、決定する抗体の特定のサブク ラスに選択的に結合する、いわゆるサントイツチング物質にこの共振器を暴露す る。共振器の振動数を、サンドイツチング物質への暴露の前後に、乾燥した状態 で測定する。振動数の変化を共振器に結合した抗体のサブクラスの量に関係づけ 、そして溶液中の抗体のサブクラスの量を標準曲線を参照して決定することがで きる。

レデレル（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ）らは、圧電石英結晶、ことに表面音波装置を使用 するその場のイムノアッセイを開示している。ヤギ抗ヒトＩｇｃを石英結晶の表 面上にカップリング剤で固定化する。次いで、圧電結晶を電気共振器回路中に配 置し、そして抗原ヒト■ｇＧの検出のために使用する。検出は、吸着により表面 質量の変化を結晶の共鳴振動数の偏移として反映されるという事実にに基づく。

著者らは、この方法は劣った感受性および劣った検出限界の両者に悩まされると 結論した。著者らは、また、検出すべき抗原は高分子量をもたなくてはならない と結論した；低分子量の分析物はこの方法により直接検出することができない。

［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＳＶｏｌ、５５、（１９不−ン グヮイビ（Ｎｇｓ　ｈ−Ｎｇｗａ　ｉ　ｎ　ｂ　ｉ）らは、気相中のバラチオン のアッセイに使用する、バラチオンに対する抗体でコーティングした圧電石英結 晶の使用を記載している。コーティングした抗体が気相中の直接反応によりバラ チオンと結合するとき、結晶上の生ずる質量の変化は農薬の濃度に対して比例す る振動数偏移を発生する。［Ｊ、Ｍａｔ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、Ｖｏｌ、１０８ 、ｐｐ、５４４４−５４４７（１９８６）］ 欧州特許出願筒０　２１５　６６９号（１９８７年３月２５日発行）は、生化学 的物質、微生物および細胞のその場の分析のための分析装置および方法を開示し ている。再び、この方法は、検出すべき分析物に対して特異的な受容体物質がそ の上に固定化された、圧電結晶の表面上の変化により引き起こされる共鳴振動数 の変化についてであると断定される。

グラッペ（Ｇｒａｂｂｅ）らは、銀電極においてヒトＩｇＧおよび抗ＩｇＧの結 合を研究するために、サイクル的電圧測定に関して使用する、石英結晶の共鳴子 を記載している。［Ｇ、Ｅ］ｅｃｔｒｏａｎａ１．Ｃｈｅｍ、Ｖｏ　１．２２３ 、ｐｐ、６７−７８　（１９８７）］レデレル（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ）らが論じて いるように、抗原と抗体との間の免疫学的反応にのみに質量の変化が起因する、 圧電結晶に基づくイムノアッセイは、ある環境下で、劣った感度および劣った検 出限界に悩まされうる。結局、結合因子とその配位子との間の反応を増幅して、 より感度および信頼性があるアッセイを提供することができる、圧電結晶に基づ く特異的結合アッセイが、この分野において、要求されている。

発明の要約 この要求は、本発明により満足され、ここで本発明は１つの面において、酵素お よび抗分析物因子または分析物からなる接合体を利用する分析物を測定する方法 である。この接合体は捕捉因子により石英結晶の微量てんびんに間接に結合した 分析物と反応（または競争）することができ、捕捉因子は石英結晶の微量てんび んの表面に直接に結合している。

石英結晶の微量てんびんは、分析物への暴露前に、化学的に反応性、プライミン グ、コーティングまたは杭分析物の層により変性された少なくとも１つの表面を 有する。このような変性された石英結晶の微量てんびんは、ここでは生物学的に 変性される石英結晶の微量てんびん、またはＢＭＱＣＭと呼ぶ。いっｔ；ん接合 体がＢＭＱＣＭ結合分析物に結合すると、酵素に対して特異的な基質を系に添加 する。酵素は反応を触媒し、この反応において基質は産生物に転化され、この産 生物は（１）ＢＭＱＣＭの使用上に蓄積し；　（２）ＢＭＱＣＭと反応し、引き 続いて、静電的に、共有結合的に、あるいは簡単な吸着により、その中に組み込 まれるか：あるいは（３）ＢＭＱＣＭと反応するが、酵素反応産生物以外の種の 組み込みを生ずる。生ずる質量の変化は、外部の共振器回路および振動数メータ ーにより測定されるように、石英結晶の共鳴振動数の対応する変化を生成する。

他の面において、本発明は反応室を利用する分析物を測定する方法であり、ここ で石英結晶の微量てんびんはその上に吸着した捕捉因子を有する表面に対向しか つそれと近接して配置される。試料に暴露すると、分析物は捕捉因子により結合 される。次いで、生ずる結合しＩ；複合体を酵素および抗分析物因子または分析 物からなる接合体と反応させる。次いで、基質を導入する。酵素は反応を触媒し 、この反応において基質は産生物に転化され、この産生物は石英結晶の微量てん びんの使用上に蓄積し、これによりその質量および共鳴振動数を変化させる。微 量てんびん上の産生物の蓄積は、微量てんびん１の反応性層により仲介されるこ とができる。反応性層は、例えば、触媒作用の産生物の物理学的吸着、イオン錯 化または共有結合による取り付けにより、質量の蓄積を仲介するように選択する ことができる。あるいは、反応性層は、触媒作用の産生物が反応性層を変化させ て、反応媒質中ガ他の因子の簡単な吸着、イオン錯化または共有結合による取り 付けを生ずるように、選択すること図面は８つの図面から成る。第１図〜第７図 は本発明を実施する種々のモードを描写する。第８図は、ＢＭＱＣＭの共鳴振動 数を測定する適当な回路を描写する。

発明の詳細な説明 本発明は図面を参照することによって理解することができ、ここで同様な参照数 字を使用して同様な要素を示す。

ここで第１図を参照すると、参照数字１０により全体的に示す生物学的に変性さ れた石英結晶の微量てんびん（ＢＭＱＣＭ）が見られる。ＢＭＱＣＭは２つの電 極１４．１６の間に挾まれた石英結晶のウェーファー１２からなる。捕捉因子２ ０は電極１６の１つの表面１８に吸着されている。

分析物２２を含有する溶液（図示せず）に、結合した捕捉因子を有するＢＭＱＣ Ｍを暴露すると、分析物２２は吸着された捕捉因子２０により結合され、こうし て結合しｊ；複合体を形成する。適当なインキュベーション期間後、結合しない 分析物を洗浄する。

次いで、ＱＣＭを抗分析物因子および酵素、全体的にＥで表示する、からなる接 合体２４と接触する。適当なインキュベーション後、結合しない接合体を洗浄す る。。

それに結合したを有するＱＣＭを、全体的にＳで表示し、酵素Ｅに対して特異的 な基質を含有する溶液と接触させる。次いで、この酵素は、基質が産生物Ｐに転 化される反応を触媒する。酵素および基質の系は、産生物Ｐが不溶性でありかつ ＢＭＱＣＭ表面上に沈澱可能であるように選択する。産生物Ｐが表面１８上に蓄 積し、これにより、外部の回路２６により測定されるように、質量の変化、それ ゆえ共鳴振動数の変化に導くであろう。

適当な抗分析物因子および捕捉因子は、分析物との複合化反応に参加することが できる因子を包含する。好ましい因子は、抗体、レフチア、キレート剤、結合性 タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリ核酸グローブ、および細胞受容体を包含 する。因子の選択は、測定すべき分析物に依存するであろう。抗分析物因子およ び捕捉因子は、化学的に同一であるか、あるいは異なることができる。

適当な分析物は、タンパク質、ホルモン、酵素、抗体、薬物、炭水化物、核酸な どを包含する。

ＢＭＱＣＭの表面上に蓄積することができる不溶性産生物を産生ずることができ る、酵素／基質の系の例は、アルカリ性ホスファターゼおよび５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩ　Ｐ）を包含する。ＢＩＣＰの酵 素的に触媒する加水分解は、ＢＭＱＣＭの表面上に沈澱する不溶性二量体を産生 ずる。加水分解的に切断可能な官能性、例えば、ガラクトース、グルコース、脂 肪酸、脂肪酸エステルおよびアミノ酸で置換したホスフェート部分を有する他の 類似の基質を、それらの相補的酵素とともに使用することができる。

他の酵素／基質系は、ペルオキシダーゼ、例えば、セイヨウワサビペルオキシダ ーゼ（ＨＰ　Ｒ）まＩ；はミエロペルオキシダーゼ、および次ののもの１つ：ベ ンジデン、ペンジデンニ塩酸塩、ジアミノベンジデン、０−トリデン、０−ジア ニシジンおよびテトラメチルベンジデン、カルバゾール、とくに３−アミノ−９ −エチルカルバゾールを包含し、それらのすべてはペルオキシダーゼと反応した とき沈澱を形成することが報告されている。また、オキシダーゼ、例えば、アル ファヒドロキシ酸オキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、グルコースオキシダ ーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼおよびキサンチンオキシダーゼを酸化可能な基 質系、例えば、フェナジンメトサルフェート−ニトリブルーテトラゾリウム混合 物とともに使用することができる。

ここで第２図を参照すると、第１図に示すＢＭＱＣＭの別の実施態様が見られる 。詳しくは、表面１８はそれを層２８でコーティングすることによって変性され ている。層２８は「プライミング」として働くことができ、この層は捕捉因子２ ０の取り付けを増強する。層２８は、また、（１）産生物Ｐおよび層２８の間の 特異的反応、（２）Ｐおよび層２８の間のイオン交換または（３）層２８中のＰ の簡単な吸収により、ＢＭＱＣＭ上の質量の蓄積を増強する働きをすることがで きる。

例示的表面２８はポリマーのフィルムおよびシラン試薬であり、これらは疎水性 の相互作用または共有結合の相互作用により平衡化の間に捕捉因子の結合を増強 する働きをする。ポリマーフィルムの１例はポリスチレンであり、これはそれ自 体普通の方法、例えば、スピンコーティングにより適用することができる。より 大きい捕捉因子の被覆面積のためのより高い表面積のコーティングは、不規則の 三次元に造形された表面により、例えば、ポリマーの小さい滴を付着するエアゾ ールの適用により達成することができる。適当なシランは、アルキルトリクロロ シランの一般クラスを包含し、これらは石英結晶の微量てんびんの金属およびガ ラスの表面に、それぞれ、Ｍ−０−Ｓｉおよび５ｉ−０−３ｉの結合により共有 結合する。アミノシランの一般クラスは、Ｍ−０−５ｉまたは５ｉ−０−Ｓｉを 経てＱＣＭ表面に取り付けるとき、アミノシランの窒素原子および捕捉因子上の 適当な官能基の間の共有結合により捕捉因子を結合するために使用できる。表面 は、また、捕捉因子の結合を増強するだめの疎水性層として働く、反応性フィル ム、例えば、レドックスポリマーフィルム、例えば、ポリビニルフェロセン、Ｐ Ｖ−Ｆｃ、ならびに酵素的反応産生物Ｐと反応して、質量を増加しそして共鳴振 動数を変化させる反応性層で処理することができる。

ＢＭＱＣＭ表面が特異的親和性を有することができる産生物を産生ずる酵素／基 質系の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび過酸化水素／ヨウ化物の混 合物を包含する。この系において、基質は酵素によりＩ　２／　Ｉ　ｓ−に触媒 的に転化され、Ｉ　ｘ／　Ｉ　ｓ−はＢＭＱＣＭの表面上のＰＶ−Ｆｃフィルム を酸化する。酸化後、■３−をフィルム中のＰｖ−Ｆｃ”部位により特異的に結 合される。

ここで第３図を参照すると、ＢＭＱＣＭのなお他の実施態様が見られる。詳しく は、層２８は産生物Ｐと反応して層２８中の化学的変化を誘発して、それが化学 的種、Ａにより全体的に表示する、と特異的に反応するように選択する。化学的 種ＡはＰと異なり、そして反応系中に存在する。

第２図および第３図に示す実施態様のために適当な層２８は、酸化のときアニオ ンを組み込むことができる薄い有機フィルム、レドックスポリマーおよび導電性 ポリマーからなることができるであろう。例示的有機レドックスポリマーおよび 薄いフィルムは、ポリビニルフェロシン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリ アセチレンおよび７タロシアニンである。第３図に示す実施態様のために適当な アニオンは、ノルライド、ポリハライド、フェロ／フェリシアニドおよびナイト レートを包含する。

例示的酵素／基質系は、ペルオキシダーゼ／　Ｈ！　Ｏｘ　／　Ｉ−およびペル オキシダーゼ／フェロシアニドである。

ユニで第４図を参照すると、本発明による方法の別の実施態様が見られる。この 実施態様において、捕捉因子２０をＱＣＭ表面１８または層２８と異なる支持体 表面３０に取り付ける。しかしながら、支持体表面３０は層２８と近接していな くてはならない。この実施態様において、分析物２２は捕捉因子２０により結合 される。次いで、結合した分析物は接合体２４と反応する。次いで、接合体２４ は基質Ｓと反応して産生物Ｐを産生じ、この産生物Ｐは層２８に拡散し、ここで それは蓄積して質量の変化および、それゆえ、共鳴振動数の変化を生成する。

第５図は実質的に同一の実施態様を描写し、ただし産生物Ｐを層２８の相互作用 は層２８中で化学的変化を誘発し、それを反応系中に存在する種Ａと反応性とす る。適当な層２８、酵素／基質系および種Ａは第３図と組み合わせて上に説明し た。

第６図は、第４図および第５図に記載されているアッセイを実施するだめの簡単 な装置を描写する。ＱＣＭをチャンバ３２の底に取り付け、こうしてその反応性 層２８をチャンバの内部に暴露する。チャンバの側壁をＯりングにより形成する 。チャンバの上部にナイロン支持体メツシュ３６が存在し、このメツシュは支持 体表面３０を提供する。捕捉因子２０は表面３０上に吸着されている。使用にお いて、ナイロンメツシュ３６を任意の普通の容器（図示せず）内で試料溶液とと もにインキュベーションする。適当なインキュベーション後、メツシュ３６を洗 浄し、そして接合体２４と反応させる。適当なインキュベーション後、メツシュ ３６を洗浄し、そしてチャンバ３２の上部に配置する。次いで、基質Ｓを適当な 入口管３８によりチャンバ３２中に導入する。

第４図、第５図および第６図に記載する実施態様のために、適当な支持体表面は 多孔質および非多孔質の薄いポリマーフィルム、セルロース膜およびニトロセル ロース膜を包含する。反応性フィルム２８は、薄い有機フィルム、ポリマー、レ ドックスポリマーおよび導電性ポリマーを包含することができ、これらは産生物 Ｐを吸着するか、あるいはＰと反応し、次いでＰまたは異なる種Ａを組み込むこ とができる。ポリマーまたは薄い有機フィルムは、ポリビニル７エロシン、ポリ ピロール、ポリチオフェン、ポリアセチレンおよびフタロシアニンを包含するこ とができる。例示的アニオンは、ハライド、ポリハライド、フェロ／フェリシア ニドおよびナイトレートである。例示的酵素／基質系は、ペルオキシダーゼ／Ｈ ２０，／Ｉ−である。この酵素／基質系において、ペルオキシダーゼはＩ−のＩ 　２／　Ｉ　ｓ−への転化を触媒し、次いでＩ　２／　Ｉ　ｓ’−はポリビニル フェロシンフィルムを酸化する。電化のバランスを維持するために■、″を引き 続いて組み込むと、ＱＣＭの質量は増加しそして振動数は測定可能に変化する。

上の第１図〜第５図に関する説明において、試料および因子は順次に添加すると 記載した。しかしながら、因子は同時に添加することができることを理解すべき である。

第７図は本発明の他の実施態様を描写し、ここで分析物２２および分析物および 酵素の接合体２４はＱＣＭの表面上の制限された数の捕捉因子２０の部位につい て競争する。試料は接合体２４の前にあるいは接合体２４と一緒に添加すること ができる。適当なインキュベーション後、結合しない接合体２４を洗浄除去し、 そして基質を添加する。アッセイの残りは前述しｊ；ように実施する。この場合 において、ＢＭＱＣＭ上の質量の蓄積のための応答は分析物の濃度と逆に比例す る。この実施態様は、また、第５図および第５図に示す実施態様に類似して、Ｑ ＣＭの表面と近接して存在する捕捉因子の表面を使用して実施することができる ことを理解すべきである。

第８図は、ＢＭＱＣＭの共鳴振動数の測定に使用できる回路を描写する。このよ うな回路は普通のものであり、そしてこの分野においてよく知られている。

一般に、捕捉因子２０の取り付けは、捕捉因子および石英結晶の微量てんびん上 の表面のタイプに依存して、５０〜１００μｇ／ｍＱの範囲の濃度で、捕捉因子 のリン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中でＱＣＭをインキュベーションすることによ って達成される。他の適当な方法は、例えば、グルタルアルデヒドとの、化学的 架橋による捕捉因子の固定化を包含する。平衡化後、ＢＭＱＣＭをＰＢＳ緩衝液 で洗浄して、所望の表面に強く取り付けられない過剰の捕捉因子を除去する。

ＢＭＱＣＭアセンブリーの形成後、ＢＭＱＣＭを分析物２２の溶液に室温におい て、研究する捕捉因子／分析物系のために最適であると決定された時間の間暴露 する。この暴露後、表面をトリス試験緩衝液で洗浄して非特異的に吸着されｔ； 物質を除去する。次いで、接合体２４をトリス試験緩衝液中の０．０５〜２０μ ｇ／ｍＱの範囲の濃度で、ＢＭＱＣＭ／分析物のアセンブリーに室温において添 加する。接合体は、例えば、イマガワ［Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、９２％　１４ １３　（１９８２）］およびアブラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）ｅｔ　　ａｔ、 ［５ｃａｎｄ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏ　１．　、Ｖｏ　１．８．５ｕｐｐ１．７．７−２３　（１９７８ ）］の方法に従い調製し、そして４℃において原溶液として維持することができ る。酵素および合成ポリ核酸の接合体は、ルス（Ｒｕｔｈ）ａｔａ！、　　［Ｄ ＮＡ、４．９３　（１９８５）］の方法に従い調製することができる。次いで、 これをトリス試験緩衝液で洗浄して、非特異的に吸着されｔ；接合体２４を除去 する。接合体２４の合計量は、特異的に吸着される分析物２２の量を越える濃度 で添加すべきである。あるいは、分析物および接合体は同時に添加することがで きる。

いわゆる競争的モードにおいて、分析物および分析物／酵素の接合体をＢＭＱＣ Ｍと反応することができる。分析物および接合体を順次にまたは同時に添加する ことができる。

石英結晶の微量てんびんの振動数を５ミリモルのトリス洗浄緩衝液中で測定１１ 、次いで基質の標準溶液を直接に添加する。振動数の変化の速度、ならびに最適 な測定間隔であると考えられる時間後の合計の振動数の変化を溶液中で測定しそ して、分析物を表面に結合するときにのみ接合体は存在するので、これらはＢＭ ＱＣＭに暴露の分析物の量を指示する。測定されるシグナルは、分析物の濃度を 大きく越える産生物の濃度を生成する酵素反応の大きい回転回数により増幅する 。

本発明は、所望の捕捉因子および任意の変性層２８でも理した結晶、および石英 結晶の微量てんびんの共鳴振動数の直接の表示器をもつ共振器回路からなる診断 キットにおいて具体化することができる。典型的な使用において、分析物の溶液 、例えば、患者の血清をＢＭＱＣＭを含有する隔室に添加し、次いで緩衝液で洗 浄し、次いで適当な酵素／抗分析物因子の接合体を添加し、次いで洗浄する。次 いで、基質を添加し、そして振動数の変化を直接測定する。操作の好ましいモー ドは参照結晶の使用を包含し、この結晶を同一溶液に暴露するが、変性されてい ないでその表面上にまたはそれと近接して捕捉因子を有する。このようにして、 試料および参照結晶の間の振動数の差を測定し、そして粘度、温度および非特異 的結合のための誤差は最小とすることができる。しかしながら、試料の結晶を使 用する操業は、また、可能である。なぜなら、（１）基質の間および測定の間の 粘度および温度の変化は大きくなく、（２）非特異的吸着からの妨害は洗浄工程 により最小となり、そして（３）　１ｍ定工程はＰにより誘発されるもの以外の プロセスからの質量変化の危険を与えないからである。

次の非限定的実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例１ 非変性石英結晶上のアルカリ性ホスファターゼ１５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を使用するアデノシン−５′−ホスホサル フェート（ＡＰＳ）リダクターゼのアッセイこの手順は、第１図に示すモードに 従い、捕捉因子２０として抗ＡＰＳリダクターゼ抗体、分析物２２としてＡＰＳ リダクターゼ、接合体２４として抗ＡＰＳリダクターゼ抗体およびアルカリ性ホ スファターゼ酵素、および基質Ｓとして５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルホスフェート（’ＢＣＩＰ）を使用して実施した。第」工程は石英結晶の金／ 石英表面上の吸着であった。これは、金／石英結晶をＰＢＳ緩衝液中の２ｍ（ｌ の１００μｇ／ｍＱの抗ＡＰＳリダクターゼ抗体で２時間平衡化することによっ て実施した。次いで、結晶を０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有す る緩衝液で１回、次いでＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して、過剰の抗ＡＰＳリダクタ ーゼを除去し、そして非特異的結合部位を遮断した。次いで、結晶を１．５ｍｕ のトリス試験緩衝液中のθ〜４００ｎｇの範囲の変化する濃度のＡＰＳリダクタ ーゼに２０分間暴露した：投与の濃度を変化させて装置の応答特性決定した。ト リス試験緩衝液で洗浄して非特異的に吸着されたＡＰＳリダクターゼを除去し、 ３０ｍ４の抗ＡＰＳリダクターゼ抗体およびアルカリ性ホスファターゼ酵素から なる接合体を含有する１、５ｍ１２のトリス試験緩衝液に２０分間結晶を暴露し た。次いで、結晶を試験緩衝液で２回洗浄し、そして５０ミリモルのトリス洗浄 溶液で１回洗浄した。

検出工程は細胞ホルダー中で０−５ｍ１２のトリス洗浄緩衝液中に結晶を浸漬シ 、次イテ０．５ｍｆｆ　（７）ＢＣＩ　Ｐ試薬溶液（Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ）　（７） 標準溶液を添加することによって実施した。抗原に対する陽性の応答を、ＢＣＩ Ｐ、インジゴ色素の類似体の酸化されｔ；二量体の沈澱に相当する、振動数の減 少により測定した。沈澱はＢＣＩＰのホスフェート官能性の酵素的に触媒された 加水分解から生じ、この加水分解はアルカリ性ホスファターゼ接合体が存在する 場合にのみ起こり、この接合体の存在はＡＰＳリダクターゼが存在ときにのみ可 能である。表１はＡＰＳインジゴの異なる投与レベルに対するＢＭＱＣＭの振動 数の応答を示す。振動数の変化および変化の速度は、期待するように、より大き い投与割合とともに増加することは明らかである。相対的応答は、石英結晶の微 量てんびんの表面１８上に析出したブルーのＢＣＩＰインジゴニ量体の分光光度 測定の光学密度により決定されたものと一致する。特に、これらの応答はＡＰＳ リダクターゼのレベルについて観測され、ここでＡＰＳリダクターゼの直接結合 を観測することができなかった。すなわち、ＢＭＱＣＭへのＡＰＳリダクターゼ の添加から生ずる振動数の変化は検出することができなかった。

表１ ２００　　　　　　　　０．２４　　　　　４０６７５　　　　　　　　　０． １７　　　　　２５０２５　　　　　　　　　０．１０　　　　　１７０７．５ 　　　　　　　０−００２　　　　　　６．３ポリビニル７工ロセン変性層を有 する石英結晶上にアルカリ性ボス７アターゼ１５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルポス７エートを使用するＡＰＳのアッセイ この手順は、第２図に示すモードに従い、石英結晶上にポリビニル７エロセン（ ＰＶ−Ｆｃ）層２８、捕捉因子２ｏとして抗ＡＰＳリダクターゼ抗体、分析物２ ２としてＡＰＳリダクターゼ、接合体２４として抗ＡＰＳリダクターゼ抗体およ びアルカリ性ホスファターゼ酵素、および基質Ｓとして５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルポス７エート（ＢＣＩ　Ｐ）を使用して実施した。ＰＶ−Ｆｃ 層は疎水性層として働き、抗ＡＰＳリダクターゼ抗体の吸着を増強する。

第１工程はＰＶ−Ｆｃ層上に抗ＡＰＳリダクターゼ抗体上の吸着であり、このＰ Ｖ−Ｆｃ層は１０％の０−クロロトルエン溶液から石英結晶の金／石英表面１８ 上へのスピンコーティングにより適用した。これは、ＰＶ−Ｆｃ変変性金石石英 結晶ＰＢＳ緩衝液中の１．５ｍ４の１００μｇ／ｍＱの抗ＡＰＳリダクターゼ抗 体で２時間平衡化することによって実施した。次いで、結晶をＰＢＳ緩衝液で３ 回洗浄して、過剰の抗ＡＰＳリダクターゼを除去した。次いで、結晶を２ｒ１２ のトリス試験緩衝液中のＯ〜８ｍＱのＡＰＳリダクターゼ（０，５ｍｇ／ｍ１２ ）に３０分間暴露した：投与の速度を変化させて装置の応答特性決定した。トリ ス試験緩衝液で洗浄して非特異的に吸着されたＡＰＳリダクターゼを除去し、３ ０ｍ１２の抗ＡＰＳリダクターゼ抗体およびアルカリ性ホスファターゼ酵素から なる接合体を含有する１、５ｍ＋２のトリス試験緩衝液に３０分間結晶を暴露し た。次いで、結晶を実施例１に記載するようにトリス試験緩衝液およびトリス洗 浄溶液で再び洗浄した。

検出工程は細胞ホルダー中で０．５ｍ４のトリス洗浄緩衝液中に結晶を浸漬し、 次いで０．５ｍｌ１の５０ミリモルのトリス緩衝液（Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ）中のＢＣ ＩＰ基質試薬（ＳＩＧＭＡ）の５０％の希釈物を含有するの標準検出溶液を添加 することによって実施した。抗原に対する陽性の応答を、ＢＣＩＰ、インジゴ色 素の類似体の酸化された二量体の沈澱に相当する、振動数の減少により測定した 。沈澱はＢＣＩＰのホスフェート官能性の酵素的に触媒された加水分解から生じ 、この加水分解はアルカリ性ホスファターゼ接合体が存在する場合にのみ起こり 、この接合体の存在はＡＰＳリダクターゼが存在ときにのみ可能である。表２は ＡＰＳインジゴの異なる投与レベルに対するＢＭＱＣＭの振動数の応答を示す。

振動数の変化および変化の速度は、期待するように、より大きい投与割合ととも に増加することは明らかである。相対的応答は、石英結晶の微量てんびんの表面 １８上に析出したブルーのＢＣＩＦインジゴニ量体の分光光度測定の光学密度に より決定されたものと一致する。

表２ ２００　　　　　　　０．２２　　　　２７８７５　　　　　　　　０．０９　 　　　　８Ｑ２５　　　　　　　　０．０５　　　　　６９７．５　　　　　　 ０．０２５　　　　２２ポリビニルフ工ロセン変性層で変性した石英結晶に対し て反対に位置するナイロン膜上のセイヨウワサビペルオキシダーゼ／過酸化水素 −ヨウ化物ヒト慢性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のアッセイこの手順は、第４図お よび第６図に示すモードに従い、その表面３０が捕捉因子で変性されている、ナ イロン膜３６に対して反対側に位置する石英結晶上にポリビニル７エロセン（Ｐ Ｖ−Ｆｃ）層２８を使用して実施した。隔室の間隔はほぼ１ｍｍである。この実 施例において、抗ｈＣＧ抗体は捕捉因子２０であり、ｈＣＧは分析物２２であり 、抗ｈＣＧ抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素は接合体 ２４であり、そして過酸化水素−ヨウ化物は基質Ｓであった。ナイロン膜は抗ｈ ＣＧ抗体を吸着する疎水性層として働き、そして酵素反応産生物をＰＶ−Ｆｃフ ィルムに提供した。接合体が存在するとき起こるヨウ素／トリヨウ化物の酵素が 触媒する形成は、ＰＶ−Ｆｃフィルムを酸化し、次いでトリヨウ化物をフィルム 中に組み込んで電子中和性を維持した。

これはＰＶ−Ｆｃフィルムの質量を増加し、したがってＢＭＱＣＭ装置の共鳴振 動数を大きく変化させた。

第１工程は膜３６のナイロン表面３０への抗ｈＣＧ抗体の吸着であった。これは 、ナイロン膜３０をＰＢＳ緩衝液中の２ｍｆｆの１００μｇ／ｍＱの抗ｈＣＧ抗 体で２時間平衡化することによって実施した。次いで、膜を０．１％のＢＳＡを 含有するＰＢＳ緩衝液で１回、次いでＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して、過剰の抗ｈ ＣＧを除去し、そして非特異的結合部位を遮断した。次いで、膜を０．１％のＢ ＳＡ緩衝液溶液を含有するＰＢＳ緩衝液中の異なる濃度のｈＣＧに３０分間暴露 した。ＰＢＳ緩衝液で洗浄して非特異的に吸着されたｈＣＧを除去し、３０ｍ（ ２の抗ｈＣＧ抗体およびＨＰＲ酵素から構成された２０ｍ（＋の原接合体を含有 する２ｍＱのトリス試験緩衝液に２０分間結晶を暴露した。次いで、膜をＰＢＳ ｌｏ、１％のＢＳＡ緩衝液で再び洗浄した。

検出工程は、ＰＶ−Ｆｃフィルムで変性した石英結晶に対して反対に膜を配置し 、２つの表面の間に直径１ｍｍのセパレーター配置して反応隔室を形成すること によって実施した。隔室にｐＨ＝５．０のクエン酸塩／リン酸塩／ヨウ化物の検 出緩衝液で充填した。振動数が安定化した後、ｌｏｍＱの０．０１％の過酸化水 素の標準溶液を添加した。酵素が触媒する反応の産生物ヨウ素／トリヨウ化物Ｐ は、隔室を横切ってＰＶ−Ｆｅ２（ルムヘ拡散し、Ｐの当量の１／２だけＰＶ− Ｆｃフィルムを酸化する。次いで、１当量のトリヨウ化物は酸化されたＰ　Ｖ　 −Ｆ　ｃ　７　イルム中に組み込まれ、フィルムの質量を増加し、そして石英結 晶の微量てんびんの共鳴振動数は対応して減少する。トリヨウ化物の組み込みは ヨウ素／トリヨウ化物へのヨウ化物の酵素を触媒とする転化から生じ、この転化 はＨＲＰ接合体が存在ときにのみ可能であり、この存在はｈｃＧ抗原が存在する ときにのみ可能である。

表３ ０＜０．００５＜３ ６００　　　　　　　　０．０１　　　　　４８本発明は次の請求の範囲により 規定されるが、当業者は理解するように、種々の変更はその精神を逸脱しないで 可能である。

ＦＪＧ、２ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　３ Ｆ　　ｆ　　Ｇ、４ ＦＩＧ　　５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ　　７ Ｓ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年１０月５日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００４０２ ２、発明の名称 酵素的に増幅された圧電特異的結合アッセイ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国プラウエア用１９８９８ウイルミントン・マーケットス トリート１００７名　称　イー・アイ・デュポン・デ・ニモアス・アンド・カン パニー ４、代理人　〒１０７ ７、補正の説明 補正音翻訳文の第１頁は明細書翻訳文の第１頁２１行〜第２頁第１９行の差し替 えであります。

補正音翻訳文の第２頁〜第４頁は請求の範囲第１項〜第２６項の差し替えであり ます。なお、請求の範囲第２７項〜第２８項に補正はありません。

第６図も差し替えられました。

置の共鳴振動数の変化は質量の変化に関係づけることができる；石英結晶の微量 てんびんおよびそれに取り付けられた層が硬質の挙動に従う場合、質量の変化は サラエルプレイ（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ）の関係により振動数の変化から決定する ことができる：ここで△ｆは測定した振動数偏移であり、ｆｏは石英結晶の親振 動数に示す、６ｍは質量の変化であり、Ａは圧電的に活性な面積であり、Ｐ、は 石英の密度（２，６４８ｇｃｍ−〇であり、そしてμ、は剪断弾性係数（ＡＴ切 断石英について２．９４７Ｘ１０’ニュートンａｍ一つである。

ションズ（Ｓｈｏｎｓ）らは、溶液中の抗体活性の決定のために変更しｔ；、圧 電石英結晶の微量てんびんを記載している。抗原を予備コーティングした石英結 晶を、変化する濃度および特異性の抗血清に暴露する。

抗原のコーティングに対して特異的な抗血清は、結晶上の追加のタンパク質層を 形成するであろう。乾燥しｔ；結晶の振動数偏移により測定した、抗体層の厚さ は、溶液中の特異的抗体の濃度に比例する。［Ｊ、Ｂｉ。

ｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ、Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、６、Ｉ）Ｉ）、　５６５−５７０　（ １９７２）］。

米国特許第４．２３５，９８３号（Ｒ４ｃｅ、１９８０年１２月２日発行）は、 抗体の特定のサブクラスの決定の方法を開示している。この方法は、決定すべき 抗体に対して特異的な抗原を、その表面に結合して有する圧電共振器を利用する 。抗体をコーティングした抗原を、未知の請求の範囲 １１液状試料を、その表面に結合した分析物捕捉因子を有する石英結晶の微量て んびん（ＱＣＭ）と反応させ、これにより分析物をＱＣＭに分析物捕捉因子によ り結合させることからなる、液状試料中に存在することが疑われる分析物を検出 する方法において、結合した分析物を（１）酵素および抗分析物因子または分析 物からなる接合体、および（２）前記酵素により触媒されて、ＱＣＭ表面上に蓄 積するか、あるいはそれと反応することができる産生物を形成して質量の変化を 誘発することができる基質と反応させ、これによりＱＣＭの共鳴振動数の変化に 導くことからなる改良。

２、前記接合体は酵素および抗分析物因子からなる、上記第１項記載の方法。

３、分析物捕捉因子は、抗体、？シラン、キレート剤、結合性タンパク質、ポリ 核酸プローブ、または細胞受容体である、上記第１項記載の方法。

４、分析物捕捉因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第３項記載の方 法。

５、分析物捕捉因子は抗体である、上記第４項記載の方法。

６、杭分析物因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ポリ核 酸プローブ、または細胞受容体である、上記第１項記載の方法。

７、抗分析物因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第３項記載の方法 。

８、杭分析物因子は抗体である、上記第４項記載の方法。

９、酵素はアルカリ性ホスファターゼであり、そして基質は５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリルホスフェートである、上記第」項記載の方法。

１０、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、上記第１項記載の方法。

１１、　前記表面はシラン、ポリマーまたは薄い有機フィルムでコーティングさ れている、上記第１項記載の方法。

１２、ポリマーは、ポリビニルフェロセン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポ リアセチレンまたはフタロシアニンである、上記第１１項記載の方法。

１３、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼであり、そして基質は過酸化水素 ／ヨウ化物、尿素ペルオキシド／ヨウ化物または７エロシアニドである、上記第 １２項記載の方法。

１４、基質は過酸化水素／ヨウ化物である、上記第１３項記載の方法。

１５、液状試料を、その上に結合した分析物捕捉因子を有する支持体表面と反応 させ、前記支持体表面は石英結晶の微量てんびんの表面と近接しており、そして 前記支持体表面を（１）酵素および抗分析物因子または分析物からなる接合体お よび（２）前記酵素により触媒されて、ＱＣＭ表面上に蓄積するか、あるいはそ れと反応することができる産生物を形成して質量の変化を誘発することができる 基質と反応させ、これによりＱＣＭの共鳴振動数の変化に導くことからなる、液 状試料中に存在することが疑われる分析物を検出する方法。

１６、前記接合体は酵素および杭分析物因子からなる、上記第１５項記載の方法 。

１７、分析物捕捉因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ポ リ核酸グローブ、または細胞受容体である、上記第１５項記載の方法。

１８、分析物捕捉因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第１６項記載 の方法。

１９、分析物捕捉因子は抗体である、上記第１７項記載の方法・２０、抗分析物 因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ポリ核酸プローブ、 まＩ；は細胞受容体である、上記第１５項記載の方法。

２１、杭分析物因子は抗体またはポリ核酸グローブである、上記第１７項記載の 方法。

２２、抗分析物因子は抗体である、上記第１８項記載の方法。

２３、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、上記＠１５項記載の方法 。

２４、前記石英結晶の微量てんびんの表面は、シラン、ポリマーまたは薄い有機 フィルムでコーティングされている、上記第１５項記載の方法。

２５、ポリマーは、ポリビニルフェロセン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポ リアセチレンまたはフタロシアニンである、上記第２４項記載の方法。

２６、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼであり、そして基質は過酸化水素 ／ヨウ化物、原素ペルオキシド／ヨウ化物またはフェロシアニドである、上記第 ２５項記載の方法。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液状試料を、その表面に結合した分析物捕捉因子を有する石英結晶の微量て んびん（ＱＣＭ）と反応させ、これにより分析物をＱＣＭに分析物捕捉因子によ り結合させることからなる、液状試料中に存在することが臭われる分析物を検出 する方法において、結合した分析物を（１）酵素および抗分析物因子または分析 物からなる接合体、および（２）前記酵素により触媒されて、ＱＣＭ表面上に蓄 積するか、あるいはそれと反応することができる産生物を形成して質量の変化を 誘発することができる基質と反応させ、これによりＱＣＭの共鳴振動数の変化に 導くことからなる改良。 ２、前記接合体け酵素および抗分析物因子からなる、上記第１項記載の方法。 ３、分析物捕捉因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ポリ 核酸プローブ、または細胞受容体である、上記第１項記載の方法。 ４、分析物捕捉因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第３項記載の方 法。 ５、分析物捕捉因子は抗体である、上記第４項記載の方法。 ６、抗分析物因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ポリ核 酸プローブ、または細胞受容体である、上記第１項記載の方法。 ７、分析物捕捉因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第３項記載の方 法。 ８、分析物捕捉因子は抗体である、上記第４項記載の方法。 ９、酸素はアルカリ性ホスファターゼであり、そして基質は５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリルホスフェートである、上記第１項記載の方法。 １０、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、上記第１項記載の方法。 ｌｌ、前記表面はシラン、ポリマーまたは薄い有機フィルムでコーティングされ ている、上記第１項記載の方法。 １２、ポリマーは、ポリビニルフェロセン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポ リアセチレンまたはアクロシアニンである、上記第１１項記載の方法。 １３、酵素はセイヨウワサビベルオキシダーゼであり、そして基質は過酸化水素 ／ヨウ化物、尿素ペルオキシド／ヨウ化物またはフェロシアニドである、上記第 １２項記載の方法。 １４、基質は過酸化水素／ヨウ化物である、上記第１３項記載の方法。 １５、液状試料を、その上に結合した分析物捕捉因子を有する支持体表面と反応 させ、前記支持体表面は石英結晶の微量てんびんの表面と近接しており、そして 前記支持体表面を（１）酵素および抗分析物因子または分析物からなる接合体お よび（２）前記酵素により触媒されて、ＱＣＭ表面上に蓄積するか、あるいはそ れと反応することができる産生物を形成して質量の変化を誘発することができる 基質と反応させ、これによりＱＣＭの共鳴振動数の変化に導くことからなる、液 状試料中に存在することが疑われる分析物を検出する方法。 １６、前記接合体は酵素および抗分析物因子からなる、上記第１５項記載の方法 。 １７、分析物捕捉因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク賃、ポ リ核酸プローブ、または細胞受容体である、上記第１５項記載の方法。 １８、分析物捕捉因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第１６項記載 の方法。 １９、分析物捕捉因子は抗体である、上記第１７項記載の方法。 ２０、抗分析物因子は、抗体、レクチン、キレート剤、結合性タンパク質、ポリ 核酸プローブ、または細胞受容体である、上記第１５項記載の方法。 ２１、分析物捕捉因子は抗体またはポリ核酸プローブである、上記第１７項記載 の方法。 ２２、分析物捕捉因子は抗体である、上記第１８項記載の方法。 ２３、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、上記第１５項記載の方法 。 ２４、前記石英結晶の微量てんびんの表面は、シラン、ポリマーまたは薄い有機 フィルムでコーティングされている、上記第１５項記載の方法。 ２５、ポリマーは、ポリビニルフエロセン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポ リアセチレンまたはフタロシアニンである、上記第２４項記載の方法。 ２６、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼであり、そして基質は過酸化水素 ／ヨウ化物、尿素ペルオキシド／ヨウ化物またはフェロシアニドである、上記第 ２５項記載の方法。 ２７、基質はセイヨウワサビペルオキシダーゼ／ヨウ化物である、上記第２６項 記載の方法。 ２８、支持体表面はナイロンまたはニトロセルロースである、上記第１５項記載 の方法。