JPH03503240A - トキソプラズマ・ゴンジの抗p30抗体によって認識される少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸配列および/またはそのフラグメントと、その配列の発現産物と、その産物の製造方法と用途 - Google Patents
トキソプラズマ・ゴンジの抗p30抗体によって認識される少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸配列および/またはそのフラグメントと、その配列の発現産物と、その産物の製造方法と用途Info
- Publication number
- JPH03503240A JPH03503240A JP1507799A JP50779989A JPH03503240A JP H03503240 A JPH03503240 A JP H03503240A JP 1507799 A JP1507799 A JP 1507799A JP 50779989 A JP50779989 A JP 50779989A JP H03503240 A JPH03503240 A JP H03503240A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- formula
- fragment
- protein
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/45—Toxoplasma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
トキソプラズマ・ゴンジの抗P30抗体によって認識される少なくとも1つのタ
ンパク質をコードする核酸配列および/またはそのフラグメントと、その配列の
発現産物と、その産物の製造方法と用途
この発明は、トキソプラズマ・ゴンジ(Toxoplasma gondii。
TG)の抗P30抗体によって認識される少なくとも1つのタンパク質をコード
する核酸配列および/またはそのフラグメントならびに上記配列の発現産物に関
する。またこの発明は、上記発現産物の製造方法、ならびに発現産物のトキソプ
ラズマ病の早期診断、監視および免疫保護への用途に関する。
トキソプラズマ・ゴンジは、コシシア目(Coccidia) 、スポロシア目
(5porozea )に属する原虫類の寄生虫であり、哺乳類の宿主の広範囲
の種類の細胞内で繁殖する細胞内寄生虫である。
成人については、2種類の寄生虫が報告されている。ずなわら急性症状の疾叡の
場合に出会う増殖型のタキシイト(tachyzoiLe)と、神経組織内に披
胞されて生存し、明6らかに再感染に対する永続的な免疫性の維持の原因になっ
ている抵抗性のブラディゾイト(brayzoite)である。
上記の寄生虫は、ヒトのみならず家畜の医学において、重大な病原であるが、非
常に広範囲の地域にひろがっており、全世界でほぼ5億人が感染に対して正の血
清学的反応を示すであろうということが確認できたほどである。
ヒトの場合、トキソプラズマ症は、無症候性の場合が多く、はとんどの期間気付
かれず、症状が現れない。しかし、それでらある場合には、トキソプラズマ症は
、妊娠女性と免疫不全症の四番のようないわゆる危険な患者に対して重篤な症状
を示す場合がある。妊娠女性の場合、トキソプラズマに感染すると、fl) I
Iが治療を早期にうけてかつ治療を絶えず続けなければ、胎児と新生児の恐ろし
い合併症の原因になる。特にトキソプラズマ症は、経胎盤が汚染された新生児の
重篤な生命にかかわる場合らある目や大脳の障害の原因である。また、このよう
な合併症は免疫不全症の患者にも見られる。
この寄生虫の単離は進化した形態または先天的な形態でのみiiJ能である。こ
の単離を行うことはまれであり、通常は、血清学的な診断で充分である。この寄
生虫が存在すると、臨床上の症状は一般に現れにくいが、血清学的診断で特別な
値を与える。
抗原および/または抗体を用いる技術の中の多くのものは、この寄生虫の診断は
困難であり、特にM免疫グロブリン(IgM)の特性決定を行って、最近の進化
した感染を証明することは困難である。
ある試験法は、肢検体内に存在している可能性がある抗体の検出によるものであ
り、他の試験法は抗原自体の検出によるものである。
11ughes(“Current Lopics in o+icrobio
logy and immunology”120巻、 1985年3prin
gerl集、105〜1.39頁)は、利用しうる、次のような種々の血清学的
試験法を概説している。
Sab i nとFe1da+anのカラー試験法(Color test)
:この方法はBeverleyとBeaLtie (1958年)に標準化され
、FeldmanとLamb (1966年) 、 Waldeland−(1
976年)およびBa1rourら(1982年)によって完成された。この方
法には生きた寄生虫、大量の正常なヒトの1f1【清およびその試験法の実施と
結果の解釈についてよく訓練された専門家が必要である。
免疫蛍光法による抗体検出試験法:この方法はReningLon (1968
年)およびKarimとLudlam (1975年)h月gM抗体の検出に利
用したが、この抗体は非特異的反応(偽陽性)を与えることができる。
ヘモグロビン試験法:抗体の検出には時間がかかりずきる。
妊娠女性の場合特におそい。
トキソプラズマ抗体の検出用ELISA法: IgMをその場で試験用マイクロ
プレート上で単離する方法である( NaotとRemington。
1980年)。
可溶性抗原の検出を用いる血清学的試験法については、可溶性抗原は簡単な抽出
法[トキソプラズマ・タキシイトの水による溶解、凍結と解凍または超音波によ
るバースティング(Bursting) 1によって得られる。これらの方法は
、抗原が水もしくは緩衝液に容易に溶解するかまたは最終の遠心分離の段階で小
さな膜の断片が溶液中に墾濁して存続しえる場合に、試験系中に膜状抗原が存在
しているということを証明するだけである。
トキソプラズマ・ゴンジの異なる抗原を適切な抗体で検出することによる試験法
は、特異的なタキシイト抗体の作製が必要であった。
タキシイトの表面に対するモノク【l−ナル抗体の大部分が[(llandma
nら、1980年、 ”DeLecLion and characteri
zation ormembrane anLigcncs of Toxop
lasmagondii、^ust、J、EsI)、Biol。
Med、Sci、、 59.303) 。
C3eLhiら、1980年、 ”llybridomas secreti
ng monoclonal ant−ibody with 5pecifi
city for Toxoplasma gondii” 、 J、 Par
asiLol、、 6.192) 、 (Johonsonら、1981年
、”llybridomas secre−Ling monoclonal
antibody to Toxoplasma cll Membrone
5ur−face antigens protect m1ce from
toxoplasmosis” 、 J、 r’roLozoo1.、30.3
51) 、 (Kasperら、1983年、 ”Purificatio
nof a majon membrance protein of Tox
oplasma gondii byimmunoabsorpLion wi
th a monoclonal anibody”、 J、 Immuno
l、。
130.2407) 、 (Rodriguczら、1985年、 ’Maj
or 5urface proLa:nor Toxoplasma go
nd目(P2O) contains an immuno−domin
antregion with repetitive epiLopcs−、
Eur、J、 immuno1.、15,747)]アクリルアミドゲル電気泳
動法(5DS−PAGE)で定義された27〜35kDaのタンパク質であって
、P2Oと命名されたタンパク質を認識するということが明らかになってきた(
Kasper、 Rodriguez)。部分的に精製されたP2Oによる疾病
の受動転移(passine transfer) (Johnson)らしく
は活性免疫の実験(Arauj。
ら、1984年、 −ParLially purified antige
n preparations ofToxoplasma gon(Iii
protect against 1ethal 1nrCction inm
ice”、 1nrccL、Immun、、 45,122)は、P2Oがトキ
ソプラズマ症の免疫予防の役割をしていることを示している。
その上にトキソプラズマ症に最近かかったかまたは長期間かかっている信者の血
清中にP2Oの特異的な抗体が存在していることが証明されたC Ilandm
anら、1980年、 ”Detection and character
izaLion of membrane antigens or Toxo
plasma gondii。
J、 Immunol、、 124.2578) 、 (Kasperら
) 、 C3harmaら、1983年、 ”Western blot a
nalyses orthe antigens or Toxoplasma
gondii recognized by human IgM and I
gG antibodies” 。
J、Immunol、、 131,977) 。
抗TG−抗体の検出の例としては、免疫酵素試験法がCe5br。
nらの1986年に発表された論文に記載されているが、これは抗P301gM
の捕獲法に関する論文である。この試験法の原理は血清IgMの捕獲に基づいた
もので、このIgMは、P2Oに対する抗原/モノクローナル抗体の対によって
、2段階で間接的に明らかにされる。この試験法は診断の感度がすてに改善され
、先に述べた試験法よりも明らかに優れており、特に免疫蛍光法もしくは赤血球
凝集法より優れている。
現在利用できる、特異的な抗体によるTG抗原の検出による試験法と、被検体が
産生じた抗TG抗体の検出による試験法とは、同様に、トキソプラズマ症のすべ
ての症例に望ましい信頼性を示さない。
その結果、本願の発明者らは、トキソプラズマ症のタイプと段階にかかわらず信
頼性に優れ、特に進化した( evolutive)トキソプラズマ症検出の特
異性と感度をさらに改善し、偽陰性および偽陽性の反応を回避できる試験法の開
発が不可欠であると考゛えてきたのである。
カくシて本馳発明者らは、特にトキソプラズマ・ゴンジの状態とは無関係に、す
でに提案された方法の欠点をもたないトキソプラズマ症の診断に採用できる診断
剤を提供することを目的とするしのである。
この発明の目的は、ヌクレオチド塩基の下記配列(+)・1
1a !・ !0 40
s6人入GGGGAGACCGGτGGACGGTCCA
GGTCτ丁CGTGGA入τ0CTCG’!’C”l’TGCGCGCACC
GGC&a 711 16
Ill 10@ 111P
CG入入入丁ττCCGGτ丁Cτ入CGACCCGGCGAAAGTGAAG
AGCCTCGTGGTCACGG入CττC入G12111 1
3@ 140 110 A暴・T
CGC(JC入TG(:TCCGCAAGGCCCTGGAGAAGAAAGA
AGCCCτC入入G (I)。
を6し、抗P30抗体が認識するタンパク質をフードすることを特徴とする核酸
配列を提供することである。
本願の発明者らはこの配列をり〔I−ンP−30,8と命名した。また、この発
明の目的は、上記式(1)の配列の少なくとも1つのフラグメントと、下記式(
11)
のヌクレオチド塩基の配列とを何することを特徴とする核酸配列を提案すること
である。
本願の発明者らは上記の発明をクローンGPP5と命名したが、この配列は、本
朝発明者がG42と命名した1、600塩基対の挿入断片のフラグメントに相当
し、かつトキソプラズマ・ゴンジのゲノムDNへのフラグメントに相当する。
本願発明において、核酸配列とは、二重鎖DNAの配列、−重鎖ON^の配列お
よびいわゆるDNA配列の転写産物の各々を意味する。
またこの発明の目的は、この発明によるヌクレオチド配列のフラグメントで溝成
されていることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提案するにある。
これらのフラグメントとしては、特に以下のものがあげられる。
下記式([!+ )・
5’ CAGCTGCGATAにAAGCGTCにCAGTG CXエ
エ)の配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド(この配列は、特に式
(11)の配列の32〜56の塩基の配列に相当する):下記式(■)。
5’ GGGGAGACCGGTGGACGGTCCAGGTC(KV)の配列
を何することを特徴とするオリゴヌクレオチド(この配列は、特に式(II)の
配列の155〜+80の塩基または式(1)の配列の3〜28の塩基の配列に相
当する):および下記式(V)
5’ GCAGGTC:GACCCAGCGACCTCAGC(V)の配列を何
することを特徴とするオリゴヌクレオチド(この配列は、特に式(IJ )の配
列の275〜298の塩基の配列に相当する)である。
この発明の有利な態様によって、前記のオリゴヌクレオチドは合成によって得る
ことができる。
またこの発明の目的は、各ブライマーが上記定義と同じ配列らしくはヌクレオチ
ド配列のフラグメントからなることを特徴と4゛るトキソプラズマ・ゴンノの核
酸の合成に用いるブライマーの対を提供することである。
かようなブライマーは、トキソプラズマ・ゴンノのDNAもしくはRNAの特異
的合成を行うことができる。
この発明によれば、1iii記ブライマーは、適切な手段[バイオヂニレーショ
ン(13ioLinylation) ]によって標識をつけるのがfi利であ
る。
上記のブライマーの対の有利な態様によれば、このブライマ一対は、式(V)の
オリゴヌクレオチドと対になった式(III)のオリゴヌクレオチドで構成され
、前記核酸の合成に用いられる。
またこの発明の目的は、放射性同位元素、適切な酵素、蛍光色素のような適切な
標識、または他の化学的修飾もしくは抗体によって標識を付けることができる上
記定義のヌクレオチド配列らしくはそのフラグメントを育することを特徴とする
ヌクL/オチドブローブを提供することである。
この発明の有利な態様によれば、MiJ記のプローブは上記式(■)のオリゴヌ
クレオチドである。
またこの発明の目的は、抗P30抗体によって認識され、そのアミノ酸配列(V
T)が上記式(1)の配列由来の配列であり、下記配列:
であることを特徴とする特許
またはそのフラグメントを提供ずることである。
またこの発明の目的は、アミノ酸の下記配列(■):を¥fし、抗P30抗体よ
って認識され、上記式(Vl)のタンパク質のC末端フラクンコンに相当するこ
とを特徴とするベブヂドを提供することである。
式(■)のペブヂドのベブヂドを修飾すれば、そのN末端アミノ酸はアセヂルノ
ステインになり、fIij記ベプヂドは、アミノ酸の下記配列(■):
AcetylCys−Asp− Phe−Ser−Arg−Leu−Met−L
eu−Arg− Ly+s−Ali− Leu−Glu−LYs−Lys−Gl
u−Ala−Leu−Arg. +VIH Iを
fイ4−る。
またこの発明の目的は、式(■)のペブヂドもしくは式(■)のべブチドで構成
され、輸送タンパク質と共有結合されていることを特徴とする抗原性を有する結
合体を提供することである。
この態様の有利な特徴によれば、nfI記輸送タンパク質はランアルブミンで構
成されている。
さらにこの発明の目的は、抗P30抗体によって認識され、そのアミノ酸配列(
IX)が上記配列(II)由来の配列であり、下記配列。
であることを特徴とする抗原性を有するタンパク質および/またはそのフラグメ
ン}・を提供ずることである。
またこの発明の目的は、式(1)のDNA配列を挿入された組換え体発現ベクタ
ーで発現され、120kDaの分子量を有することを特徴とずる式(Vl)のタ
ンパク質の発現産物を提供することである。
この態様の有利な特徴によれば、i+Q記発現産物は、トキソプラズマ・ゴンノ
の抗原タンパク質のタンパク質に相当する6 kDaのベプヂドフラグメントを
有し、上記式(V[)のタンパク質と同一であり、かっ抗P30抗体によって認
識される少なくとも1つの抗原決定基(エピトープ)を有する。
この発明の、タフバク質および/またはベプヂドおよび/または接合体の製造は
、メリフィールド( MERRIFIELD)法の固相での合成による公知の方
法で行われる。
またこの発明の目的は、」二組式(+)のDNA挿入断片を有する組換え体プラ
スミドを提供することである。
上記の組換え体プラスミドは、アンスティチュ パスツール(INSTITUT
PASTEUR)に所属するラ コレクシオン ナソオナル ド キュリチュ
ール ド ミクローオーガニスム(laCollection NaLiona
le da Cultures de Micro−organismes)に
、1988年6月24日付けで寄託番号1−773号として寄託された。
また、この発明の目的は、上記式(■)のDNAフラグメントを含aずるDNA
挿入断片を有する組換え体プラスミドを提供することである。
このDNA挿入断片は、本願発明音らが042と命名したトキソプラズマ・ゴン
ジのゲノムDNAの1,600の塩基対のフラグメントである。
E組紐換え体プラスミドは、アノスティチュ パスツールに所属するラ コレク
ツオン ナンオナル ド キュリチュールド ミクローオルガニスムに、198
9年6月22日付で寄託番号l−876号で寄託された。
またこの発明は、活性成分として、抗P30抗体によって認識されるこの発明の
、式(Vl)のタンパク質および/または式(IX)のタンパク質および/また
は式(■)もしくは(■)のペプチドおよび/または接合体を含有することを特
徴とするトキソプラズマ症用の診断剤に関する。
またこの発明の目的は、活性成分として、この発明の核酸配列および/またはそ
のフラグメントを含有することを特徴とするトキソプラズマ症用診断剤を提供す
ることである。
またこの発明は、活性成分としてこの発明のタンパク質および/またはペプチド
および/または接合体と、任意に少なくとし1つ適切な医薬賦形剤とを含有する
ことを特徴とする、トキソプラズマ症に対して有意な防護を行うのに適切なワク
チンに関する。
またこの発明の目的は、この発明の少なくとも1つ診断剤を用いることを特徴と
する、トキソプラズマ症の特に急性トキソプラズマ症と先天的なトキソプラズマ
症の検出および/また監視する方法を提供することである。
1つの態様によれば、上記定義の抗原活性を有し、以後抗原画分と呼ぶ、タンパ
ク質および/またはペプチドおよび/または接合体で表わされる診断剤を生物学
的被検試料と接触させ、抗P30抗体が被検体が生物学的試料内に存在する場合
には、前記抗原画分が抗P30抗体と結合するのを測定し、次いで、前記複合体
が適切に展開される。
他の態様によれば、この発明のプローブによって表される診断剤を、適切に処理
された生物学的種と接触させて、核酸がプローブに近づくことができて、さがし
ているトキソプラズマが存在している場合は、有効に雑種形成がなされ、雑種形
成がなされなかったプローブを除去して、雑種形成よって残ったDNAプローブ
が適切に検出される。
この態様なイイ利な特徴によれば、雑種形成の前に、検出すべき核酸とこの発明
のプライマ一対とを適切な条件下で接触させ、[i1j記核酸の少なくともひと
つのフラグメントを増幅させる。
実施される増幅法は、詳しくは、次のよなう遺伝子の増幅技術である。すなわち
、いわゆるQββダブリカーゼ法 LizzardiP、M、ら、Biotec
hol、、 1938年6月)、またはいわゆる連鎖重合反応法(P、C,R)
(GETUS Co、が出願したヨーロッパ特許願第200.363号、同
第201,184号および同229,701号に記載されている)がある。
」−記の診断試験法には生物学的試料もしくは組織の稚内のトキソプラズマ・ゴ
ンジのゲノムDNAの特異的検出ができるという利点がある。
先天的トキソプラズマ症の場合は、胎盤コード血液もしくは胎盤組織の問題であ
り、免疫不全のt者については、気管支肺胞の洗浄液と、脳を髄液もしくは脳を
髄血液の問題である。
またこの発明の目的は、この発明のタンパク質、および/またはペプチドおよび
/または接合体の適切な量、必要に応じて陽性の対照(Lemoin) 、陰性
の対称および他の適切な試薬を含有することを特徴とする、生物学的試料中のト
キソプラズマ・ゴンジを検出するためのキットもし、<は器具をIn (J4
するものである。
1つの改変例のキットは、発明のプローブの適切な量と、必要に応じて、少なく
とも1つの適切なブライマーの対の適切な重を組合イ〕せ、および必要に応じて
、トキソプラズマ・ゴンジの核酸の対照製剤およびその他の適切な試薬を含有し
ている。
1−記の特徴の外に、この発明は、以下に述べるように、P2Oをコード−4る
遺伝子をクローン化する実施例と、ワクチンとしてP2Oの用途による別の特徴
を有するしかしこれらの実施例は、この発明を例証するだけのものであり、この
発明を限定するものではない。
害Fmffjll−−−匹服犯蔗俸−←−火二ユニー櫂J東盗−ハる表面U男系
11ka)タキシイトの膜抗原の抽出法:
トキソプラズマ・ゴンノのビルレント菌株R1−(は、スイスマウスに1週間に
2回継代させて保持されている。寄生虫はすでに3日間感染させたマウスの腹膜
から採取する。それを3#11(Nucleporc)のポリカーボネートフィ
ルタで濾過し、PBS (リン酸ナトリウム緩衝液10mM pH7,2,Na
C115h+M)で3回洗浄する。最終ベレットを0.5%のNon1deL
NP40 (Sigma)と100単位/j+12のアプロチニン(Sig+
l1a)を含有するPBSで再懸濁さUる。1時間91℃で保温した後、4℃で
20分間、io、ooogで遠心シ〕離する。次いで上澄み液を抗P30抗体で
認識される抗原の原料として用いる。
b)抗P30抗体によって認識される抗原のIIPLcによる精製;タキシイト
の全抽出物(500μQ)を、300人の多孔度で54I11のマイクロビーズ
からなるVydac C+。(4,6X 250ix)カラムに注入する。溶離
は、CIIaCN/ l1to/ CFaCOOH!合物(5/9510.05
/体積)を用いて12分間行い、次いで直線勾配法で180分間、80%CII
、CNまで行う。なお最終の80%CI1.CNは5分間保持する。抗P30抗
体で認識される抗原を含有するピークは、90分後、34.4%濃度のCIl、
CNで溶離される。
C)抗P30抗体で認識される抗原の免疫親和性クロマトグラフィーによる精製
。
抗P30抗体によって認識される抗原を。5anLoroらの報告(1985年
)どおりにして精製した。モノクローナル抗体(+*Ab)を、メーカーの推薦
によってグルタルアルデヒドで活性化した親和性支持体に固定する。(Boeh
ringer、 Mannkei+m、 R,F、A、) o手早く、親和性吸
着剤口1)をmAbを20u/zQ含有するNaC10,9%(5x+り中に再
懸濁させる。撹拌しながら室温で4時間保温した後、ゲルをデカニットしてクロ
マトグラフィのカラムに入れ、溶出液の光学濃度(0,D、)が0.005以下
になるまでNaCl1.5%で洗浄する。残留遊離アルデヒド基を、エタノール
アミン−11CI。
0.03M (pi−17,5) ’T: 1時間飽和サセル。0.9%NaC
1を50xQ、 0.5Mグリノンp1(3,75の501および0.9%Na
C11003112で順に洗浄した後、得られた免疫吸着剤を4℃で保管する。
P2Oの精製は、トキソプラズマ・ゴンジ(20019)のタキシイトの全抽出
物(loIf2)を、閉回路の免疫吸着剤のカラムを2x(1/hourの流速
で循環させることにより、−夜4℃で行う。次いでクロマトグラフ系を開いて、
カラムを0.9%NaC1で洗浄する。
免疫吸着剤に特異的に結合した抗原をトリエチルアミン0.1M(pi(Il、
、5)によって溶離し、迅速にIMHcIで中和する。PBSp87.2にたい
して透析した後、得られた純品のP2Oを一70℃で保管する。
a)全RN^の抽出。
AurrrayとRougeonの方法(Eur、J、Biochem、 1
980年、 107.303)を用いた。3MLiC1、ヘパリン200μg/
xQ、酢酸ナトリウム10mMI)T−15、SDS O,1%の溶液を添加し
てタキシイトを溶解した。
ボブター(Potter)のホモジナイゼーンヨンを行い、−夜保存してRNA
を沈澱させた後、ライゼートを4℃で40分間、16.3009で遠心分離する
。得られたベレットを2回洗浄し、4 M LiC1,8M尿素の溶液中に再@
濁させ、次いで再度、4℃で40分間、16.3009で遠心分離する。次にベ
レットを水で溶解し、溶液を、pH5の酢酸ナトリウム中で0.1Mにし、次い
でSDS中でo、tmとして、次いで水で飽和させた同体積のフェノールと同体
積のフェノール−クロロホルムで順に抽出する。最後に水相を、酢酸ナトリウム
pH5中で0.2Mとし、次いで2.5倍の体積のエタノールを用いて、RNA
を一20℃で一夜沈澱させた。
b)メツセンジャーRN^の精製:
Arnemonnらの方法(Nucl、Ac1ds Res、、 1977年1
4巻、4023〜4026頁)を用いた。この方法は、ポリ^”RNAを、全R
N^からオリゴ(αT)セルロースの2つの連続クロマトグラフィで分離する方
法で構成されている。
実施例3:発現産物のクローン化
a)タキシイトのmRNAからのcDN^DNAラリーの製造:cDNAの合成
を、GublerとIlo[Tmanの方法(Gene、 1983年、25巻
、263頁)で実施する。第1の相捕的DNAのストランドを、^MY逆転酵素
の作用で合成する。RN アーゼHとポリメラーゼIの共同作用によって2重鎖
にされたDNAは、次いでT 、DNAポリメラーゼで処理して平滑断片を得る
。酵素のEcoRIメチラーゼでメチル化した後、EcoRl “リンカ−”を
、T 4 DNAリガーゼの作用で叶^の末端に付加する。次に得られたcDN
AGRcoRl酵素で消化し、Ac^34とUltrogel (0,2X 3
0cll)のクロマトグラフィを用い、WatsonとJaeksonの方法(
C1over D、M、編、 ”DNAcloning” Vol、1.^、
practical approach : 0xford、 Washing
tonIRL Press、 49頁、 1985年)で精製する。得られたc
DNA (500〜7,000塩基対)を次に、λgL+ファージのEcoR1
部位に挿入する(Iluynhら、 t9g5年、 Glover D、M、編
:“DNA cloning″Vol。
1、^、 practical approach : 0xford、 Wa
shington IRL Press。
49年)。連結した後、組換え体ファージのライブラリーが構築される。
1) )ライブラリーのスクリーニングと“P30″候補の選択=λg【、1の
誘導体は、cDNAと、イー・コリ(E、Co11)のβ−ガラクトノダーゼの
遺伝子が融合した後、Lacプロモーターの制御下で異種遺伝子を発現すること
ができる( YoungとDavis、 1983年)。
λgL++のライブラリーの試料を、イー・コリY 1.090の菌株に90c
−直径の皿当り10’フアージの希釈度で接種する。Lacプロモーターの制御
下でのタンパク質の発現の誘発がイソプロビルヂオーβ−ガラクトンド(IPT
G)の存在下、42℃でトリガーされる。合成されたタンパク質をニトロセルロ
ースに吸着させ、実施例1に従ってラビット抗P30抗体の存在下で培養する。
固定された抗体をペルオキシダーゼで標識をつけた2番目のラビット抗1gG抗
体で検出し、次に複合体を、Ht Otの存在下4−クロロ−1−ナフトールで
染色することによって展開される。組換え体ファージのcDNAの挿入断片が、
抗P30抗体によって認識される抗原決定基を有するタンパク質もしくはタンパ
ク質フラグメントの合成を命令する場合、上記の検出法によってそのファージを
同定することができる。
P2O−8クローンを精製した後、ファージを大量に製造し、精製し、DNAを
標準法(1+BIiatisら、 1982年)で抽出する。次にDNAをEc
oRl酵素で加水分解し、挿入断片を2%アガロースゲル上の電気泳動法で分離
し、次いでエレクトロエリュージュン(electroeluLion)で回収
する。挿入断片を、T 4 DNAリガーゼの作用によってpuciaプラスミ
ド(Pharmacia)のRcoR1部位にサブクローン化し、次いで得られ
た組換え体プラスミドを、この発明によって、イー・コリ JM109菌株を形
質転換するのに用いる。組換え体プラスミドは、BirnboinとDolyの
方法(1979年)で大量に製造され、挿入断片を上記のようにしてRcoRI
によって加水分解した後、再製造する。ファジク(phagique)ベクター
MIamplO内のサブクローニングを、メーカー(A+mersha*)の指
示にしたがって行い、−重鎖ファージDNAが、Sangerらの方法によって
配列の決定をするのに用いられる。
実施例5 ペプチド類の合成
りローンのC末端配列に対応するペプチドを固相で合成しくMerririel
d、 1963年)、活性基を保護する。HFで開裂させた後、ペプチドを、H
e1pH2の存在下、Fractogel TSK−HIIUO−8(Merc
k)を用いるゲル濾過法で精製し、次いで凍結乾燥する。
ペプチドの純度を薄層クロマトグラフィと逆相HPLCでチェックする。ペプチ
ドの同一性は、酸加水分解した後アミノ酸を分析することによりチェックする。
得られたペプチドを、グルグルアルデヒドを用いてウシアルブミンに接合(co
njugate)させる。すなわちペプチド(1,5μ識ol)を、担体タンパ
ク質(211!9)とともにリン酸ナトリウム緩衝液pH7に溶解し、次ぎにp
Hを重炭酸ナトリウムで8に調節する。2.5%グルタルアルデヒド溶液(20
μQ)を、常に撹拌しながら、3日間毎日添加する。4日後、混合物を0.15
M NaC1に対して透析する。
実施例6−: P30抗原の予防接種特性免疫吸着法もしくはHPLC法で精製
された、抗P30抗体で認識される抗原15hfを用い、Yaitukatis
らの方法(1971年)によってラビットの免疫化を行う。1ケ月後に、追加免
疫の筋肉注射この発明によるプライマーlと2をPCR法に用い、下記の3段階
で各々定義される増幅サイクルを30回実施する。
*DN^を94℃で1分間保持して変性させる;*プライマーを、55℃で2分
間、−重鎖DNAと雑種形成させる。
*新しいストランドを72℃で合成する。
この反応は、2Nのプライマー(0,5μM)のデスオキンクレオチド類(dC
TP、 dGTP、 dATr’、 dTTP、各々最終的に200μM)、1
μ9のDNAおよび2.5単位のTagポリメラーゼ(GETUS)の混合物の
存在下で行う。これらの段階の自動化をPerkin E1a+er CeLu
++“cycler”によって確実に行った。
2%アガロースゲルでの分析で大きさが250bpと測定された一重鎖の増幅が
、上記の条件下で達成されたが、予想どおりのものである。式(IV)で定義さ
れるこの発明のオリゴヌクレオチドプローブの用途は、同じバンドをサザン雑種
形成させて、この発明の特異性を証明することによって開発することができる。
ヒトDNAのタキシイトDNAの希釈実験によって、10のタキシイトと当量の
この技術の検出しきい値を決定することができる。
上記の反応は、ヒト、ミュレイン(murine)もしくはニシンのDNAが増
幅産物を与えないことから、トキソプラズマ・ゴンノのDNAに対して特異的で
ある。
実施例8:挿入断片GPI’ 5のクローン化:cDN^クローンp −30,
8の挿入断片は、λgrloベクター中のゲノムDNAのライブラリーのスクリ
ーニングに役立つ。トキソプラズマ・ゴンジのゲノムDN^のフラグメントに相
当するもので本願発明者らがG42と命名した、1,600塩基の挿入断片を有
するクローンを単離した。
フラグメントpsL I −pst Iのサブクローニングによって、クローン
GPP 5の特定決定と配列の決定がなされる。
上記のことから分かるように、この発明は、より明確に述べた製法と用途につい
ての実施例に限定するものではなく、また、当業者は、この発明の範囲から逸脱
することなく改変することができる。
国際調査報告
一肯一−1−−−−waK+r/FR89100322
Claims (33)
- 1.ヌクレオチド塩基の下記式(I):【配列があります】(I) を有し、抗P30抗体によって認識されるタンパク質をコードすることを特徴と する核酸配列。
- 2.上記式(I)の配列の少なくとも1つのフラグメントを有し、および下記式 (II): 【配列があります】(II) のヌクレオチド塩基の配列を有することを特徴とする核酸配列。
- 3.請求項1もしくは2のヌクレオチド配列のフラグメントで構成されているこ とを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 4.下記式(III): 【配列があります】(III) の配列を有することを特徴とする請求項3のヌクレオチド。
- 5.下記式(IV): 【配列があります】(IV) の配列を有することを特徴とする請求項3のヌクレオチド。
- 6.下記式(V): 【配列があります】(V) の配列を有することを特徴とする請求項3のヌクレオチド。
- 7.合成によって得られることを特徴とする請求項3〜6のいずれか1つに記載 のオリゴヌクレオチド。
- 8.各プライマーが請求項1〜6のいずれか1つのヌクレオチド配列もしくはそ のフラグメントを有することを特徴とするトキソプラズマ・ゴンジの核酸合成用 のプライマーの対。
- 9.適切ないずれかの手段で有利に標識をつけることができることを特徴とする 請求項8のプライマーの対。
- 10.前記核酸の合成用に、請求項6の式(V)のオリゴヌクレオチドと対にな っている請求項4の式(III)のオリゴヌクレオチドで構成されていることを 特徴とする請求項8もしくは9のプライマーの対。
- 11.放射性同位元素、適切な酵素、蛍光色素のような標識またはその外の化学 的修飾もしくは抗体によって標識をつけることができる請求項1〜6のいずれか 1つのヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを有することを特徴とするヌ クレオチドプローブ。
- 12.請求項5の式(IV)のオリゴヌクレオチドによって構成されていること を特徴とする請求項11のプローブ。
- 13.抗P30抗体によって認識され、そのアミノ酸の配列(VI)が、請求項 1の配列(I)由来のもので下記式:【配列があります】(VI) で表されることを特徴とする抗原性を有するタンパク質および/またはそのフラ グメント。
- 14.アミノ酸の下記配列(VII):【配列があります】(VII) を有し、抗P30抗体によって認識され、請求項13の式(VI)のタンパク質 のC末端画分に相当することを特徴とするペプチド。
- 15.N末端アミノ酸がアセチルシステインで、前記ペプチドがアミノ酸の下記 配列(VIII):【配列があります】(VIII) を有することを特徴とする請求項14のペプチド。
- 16.請求項14もしくは15のペプチドで構成され、輸送タンパク質に共有結 合していることを特徴とする抗原性を有する接合体。
- 17.輸送タンパク質がウシのアルブミンで構成されていることを特徴とする請 求項16の接合体。
- 18.抗P80抗体によって認識され、そのアミノ酸配列(IX)が請求項2の 配列(II)由来のもので下記式:【配列があります】(IX) で表されることを特徴とする抗原性を有するタンパク質および/またはそのフラ グメント。
- 19.式(I)のDNA配列を挿入された組換え体発現ベクターによって発現さ れ、分子量が120kDaであることを特徴とする請求項13のタンパク質の発 現産物。
- 20.トキソプラズマ・ゴンジの抗原タンパク質のタンパク質に相当する6kD aのペプチドフラグメントを有し、請求項13の式(IV)のタンパク質と同一 で、抗P30抗体で認識される少なくともひとつの抗原決定基を有することを特 徴とする請求項19の発現産物。
- 21.請求項1の式(I)のDNA挿入断片を有することを特徴とする組換え体 プラスミド。
- 22.アンスティテコパスツール所属のラコレクシオンナシオナルドキュリチュ ールドミクローオルガニスムに1988年6月24日付けで寄託番号1−773 号で寄託されたことを特徴とする請求項21の組換え体プラスミド。
- 23.請求項2の式(II)のDNAフラグメントを含むDNA挿入断片を有す ることを特徴とする組換え体プラスミド。
- 24.アンスティテコパスツール所属のラ・コレクシオンナシオナルドキュリチ ュールドミクローオルガニスムに1989年6月22日付けで寄託番号1−87 6号で寄託されたことを特徴とする請求項23の組換え体プラスミド。
- 25.活性成分、請求項13の式(VI)のタンパク質および/または請求項1 8の式(IX)のタンパク質および/または請求項14の式(VII)のペプチ ドもしくは請求項15の式(VII)のペプチドおよび/または抗P30抗体に よって認識される請求項16ちしくは17のいずれか1つの接合体を含有するこ とを特徴とするトキソプラズマ症の診断剤。
- 26.活性成分、請求項1〜6のいずれか1つの核酸配列および/またはそのフ ラグメントを含有することを特徴とする診断剤。
- 27.活性成分、請求項13〜18のいずれか1つの、タンパク質および/また はペプチドおよび/または接合体および任意に少なくとも1つの適切な医薬品賦 形剤を組合せることを特徴とするトキソプラズマ症に対して有意な防護を行うよ う構成されたワクチン。
- 28.請求項25もしくは26のいずれか1つの少なくとも1つの診断剤を用い ることを特徴とする、トキソプラズマ症の特に急性トキソプラズマ症と先天性ト キソプラズマ症を検出しおよび/または監視する方法。
- 29.以下に抗原画分と呼ぶ請求項25の診断剤を、検査すべき生物学的試料と 接触させ、抗P30抗体が試験すべき生物学的試料内に存在している場合、前記 抗原画分と抗P30抗体との結合を測定し、前記複合体を適切に展開することを 特徴とする請求項28の検出方法。
- 30.請求項11のプローブで表される診断剤を、適切に処理された生物学的試 料と接触させ、その核酸がプローブに近付くことができ、さがしているトキソプ ラズマが存在している場合に有効な雑種形成を行えるようにし、雑種形成されて いないプローブを除去し、DNAプローブの適切な検出が雑種形成で維持される ことを特徴とする請求項28の検出法。
- 31.雑種形成の前に、適切な条件下で、検出すべき核酸を、請求項8〜10の いずれか1つの少なくともひとつのブライマーの対と接触させ、前記核酸の少な くとも1つのフラグメントを増幅させることを特徴とする請求項30の検出法。
- 32.請求項13〜18のいずれか1つのタンパク質および/またはペプチドお よび/または接合体の適切な量および必要に応じて陽性のの対照、陰性の対照お よび他の適切な試薬を含有することを特徴とする生物学的試料中のトキソプラズ マ・ゴンジの検出に用いるキットもしくは器具。
- 33.請求項11のプローブの適切な量と、任意に請求項8〜10のいずれかひ とつの少なくとも1つの適切なプライマーの対の適切な量と、必要に応じてトキ ソプラズマ・ゴンジの核酸の対照製剤と他の適切な試薬を含有することを特徴と する生物的試料中のトキソプラズマ・ゴンジ検出用のキットもしくは器具。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8808535A FR2633309B1 (fr) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | Sequence d'adn codant pour la proteine p30 de toxoplasma gondii, produits d'expression de cette sequence, leurs procedes d'obtention et leurs applications |
FR88/08535 | 1988-06-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03503240A true JPH03503240A (ja) | 1991-07-25 |
Family
ID=9367703
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1507799A Pending JPH03503240A (ja) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | トキソプラズマ・ゴンジの抗p30抗体によって認識される少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸配列および/またはそのフラグメントと、その配列の発現産物と、その産物の製造方法と用途 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0353111A1 (ja) |
JP (1) | JPH03503240A (ja) |
DK (1) | DK48890A (ja) |
FR (1) | FR2633309B1 (ja) |
PT (1) | PT90963B (ja) |
WO (1) | WO1989012683A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG48953A1 (en) * | 1988-03-09 | 1998-05-18 | Univ Leland Stanford Junior | Diagnostic genes for toxoplasmosis |
FR2664290B1 (fr) * | 1990-07-05 | 1993-01-29 | Centre Nat Rech Scient | Sondes genetiques specifiques de toxoplasma gondii, et leur utilisation pour la detection in vitro de toxoplasma gondii et pour le typage des souches toxoplasmiques. |
AU6172194A (en) * | 1993-02-08 | 1994-08-29 | Paravax, Inc. | Defective sindbis virus vectors that express (toxoplasma gondii) p30 antigens |
FR2722508B1 (fr) * | 1994-07-13 | 1996-10-04 | Transgene Sa | Cassette d'expression d'une proteine p30 de toxoplasma gondii |
FR2729960A1 (fr) * | 1995-01-30 | 1996-08-02 | Bio Merieux | Polypeptides mimotopes de toxoplasma gondii et applications |
CN101137674A (zh) | 2005-03-08 | 2008-03-05 | 肯顿有限公司 | 刚地弓形虫的嵌合重组抗原 |
FR2900407B1 (fr) * | 2006-04-27 | 2008-07-25 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux polypeptides induisant des cellules dendritiques ainsi que les medicaments et compositions pharmaceutiques contenant de tels polypeptides |
-
1988
- 1988-06-24 FR FR8808535A patent/FR2633309B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-23 EP EP89401783A patent/EP0353111A1/fr not_active Withdrawn
- 1989-06-23 JP JP1507799A patent/JPH03503240A/ja active Pending
- 1989-06-23 PT PT90963A patent/PT90963B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 WO PCT/FR1989/000322 patent/WO1989012683A1/fr unknown
-
1990
- 1990-02-23 DK DK048890A patent/DK48890A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT90963A (pt) | 1989-12-29 |
DK48890D0 (da) | 1990-02-23 |
DK48890A (da) | 1990-04-24 |
PT90963B (pt) | 1995-01-31 |
WO1989012683A1 (fr) | 1989-12-28 |
EP0353111A1 (fr) | 1990-01-31 |
FR2633309A1 (fr) | 1989-12-29 |
FR2633309B1 (fr) | 1992-04-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI231299B (en) | Antibody for the detection of microorganism | |
JP5053497B2 (ja) | 乳癌の治療および診断のための組成物および方法 | |
CN115381934A (zh) | Zika病毒疫苗 | |
JP2729070B2 (ja) | 肝細胞内で亜三日熱マラリヤ原虫により生成されたタンパク質の特微的なエピトープを単数又は複数有する少なくとも1つのペプチド配列を含む分子、及びこれらの分子を含む化合物 | |
KR20010012813A (ko) | 결핵 확인용 화합물 및 이의 사용 방법 | |
Beghetto et al. | Molecular dissection of the human B-cell response against Toxoplasma gondii infection by lambda display of cDNA libraries | |
EP0455620B1 (en) | Immunogenic protein and cDNA clone | |
RU2202613C2 (ru) | Иммуногенные пептиды вируса ящура | |
AU674311B2 (en) | Delivery and expression of a hybrid surface protein on the surface of gram positive bacteria | |
JPH03503240A (ja) | トキソプラズマ・ゴンジの抗p30抗体によって認識される少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸配列および/またはそのフラグメントと、その配列の発現産物と、その産物の製造方法と用途 | |
JPH04504119A (ja) | ブタクサからのアレルゲン蛋白質およびそれらの使用 | |
SA110310855B1 (ar) | استخدام مصدر l3 و/ أو l5 كلقاح أو كوسيلة تشخيصية لمرض طفيلي | |
JPS63501615A (ja) | 生物学的流体中のコキシエラ・ブルネティ−の検出及び識別 | |
EP0656063B1 (en) | Nucleotide sequences coding for cryptosporidium proteins, polypeptides coded by said sequences and kits for the use thereof | |
US6100067A (en) | Molecules containing at least one peptide sequence carrying one or several epitopes characteristic of a protein produced by P. falciparum at the sporozoite stage and in the hepatocytes | |
KR101080071B1 (ko) | 재조합 n 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법 | |
RO114347B1 (ro) | Secventa nucleotidica | |
US5429922A (en) | Composition and method for distinguishing virulent and non-virulent toxoplasma infections | |
CN110759975B (zh) | 一种多肽以及具有强adcc效应的抗体和应用 | |
EP1307537B1 (en) | Neospora caninum isolate | |
JPH06505865A (ja) | トキソプラズマ・ゴンディの蛋白抗原のクローニング及び発現 | |
US20020012668A1 (en) | DNA sequence encoding the specific and antigenic outer membrane protein of salmonella typhi | |
US6514697B1 (en) | Methods for detection of Crytosporidium species and isolates and for diagnosis of Cryptosporidium infections | |
AU645482B2 (en) | A malaria antigen | |
EP2247952B1 (en) | Diagnosis of and vaccination against aspergillus fumigatus |