JPH03503167A - Site-directed angioplasty device and its usage - Google Patents

Site-directed angioplasty device and its usage

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JPH03503167A
JPH03503167A JP1503123A JP50312389A JPH03503167A JP H03503167 A JPH03503167 A JP H03503167A JP 1503123 A JP1503123 A JP 1503123A JP 50312389 A JP50312389 A JP 50312389A JP H03503167 A JPH03503167 A JP H03503167A
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collagen
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アンダーソン　ダブリュー　フレンチ
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American National Red Cross
US Department of Commerce
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 部位指定血管形成素子とその使用法 （発明の背景） （関連分野） 本発明は新しい血管および人工器官形成を目的とした素子および方法に関する。[Detailed description of the invention] Site-directed angioplasty device and its usage (Background of the invention) (Related fields) The present invention relates to devices and methods aimed at forming new blood vessels and prostheses.

特に本発明は支持体上に吸着した生物学的応答モディファイヤーを用いた血管形 成を目的とした素子および方法に関する。In particular, the present invention provides a method for shaping blood vessels using biological response modifiers adsorbed onto a support. The present invention relates to devices and methods for the purpose of

（関連技術） 血管形成とは本来の場所における血管の形成であり、血管細胞の順序正しい移動 、増殖および分化に関し発育とともに行なわれる。血管形成は成人においては稀 な現象であり、傷害や骨折修復している成人に関する。これに対する例外は発育 における卵胞、小卵化における黄体および妊娠における胎盤でこの過程が起こる 女性の再生システムで見られる。これら血管形成の特定の時期は比較的短かく、 腫瘍増殖や糖尿性網膜症に関する血管形成とは対照的に高度な調節を受けている 。その内皮細胞は血管形成の主要細胞標的であると考えられている。研究は内皮 細胞増殖を制御するポリペプチド因子の同定に集中した。ヘパリン結合成長因子 群のポリペプチドは一般に特に発育における血管形成のイニシェーターと考えら れている。(Related technology) Angiogenesis is the formation of blood vessels in situ and the orderly migration of vascular cells. , proliferation and differentiation occur along with development. Angiogenesis is rare in adults It is a common phenomenon in adults undergoing injury or fracture repair. The exception to this is growth This process occurs in the follicle in the follicle, in the corpus luteum in miniaturization, and in the placenta in pregnancy. Found in the female regenerative system. These specific periods of angiogenesis are relatively short; Highly regulated in contrast to tumor growth and angiogenesis associated with diabetic retinopathy . The endothelial cells are thought to be the main cellular targets for angiogenesis. Research is the endothelium We focused on identifying polypeptide factors that control cell proliferation. heparin-binding growth factor The polypeptides of the group are generally considered to be initiators of angiogenesis, especially in development. It is.

ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）群ポリペプチドを生産する遺伝子群にはＨＢ ＧＦ−１（酸性フィブロブラスト成長因子）、ＨＢＧＦ−２（塩基性フィブロプ ラスト成長因子）およびさらに３個のＨＢＧＦ様構造体、ｈｓｔ／　Ｋ　Ｓ　、 　１ｎｔ−２およびＦＧＦ−５が含まれ、これらはオンコジーンにコードされて いる。原型ＨＢＧＦポリペプチドは内皮細胞移動および、またはインビトロにお ける増殖の強力なインデューサーであり、かつ内皮細胞由来のプロテアーゼの発 現を調節することが知られている。さらに、ＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−２は おそらくグリュサミングリカンヘバリンに対する強力なファイニティーにより細 胞外マトリクスにしっかりと吸着されている。ＨＢＧＦ原型およびヘパリンの会 合はこれらのポリペプチドをたんばく賞分解から守る。細胞外マトリクスはＨＢ ＧＦ−１および）１ＢＧＦ−２の主要な起源でありまたその活性化には生物学的 活性のための結合部位からの加水分解的抽出を必要とすることが示されてきた。The gene group that produces heparin-binding growth factor (HBGF) group polypeptides includes HB GF-1 (acidic fibroblast growth factor), HBGF-2 (basic fibroblast growth factor) last growth factor) and three additional HBGF-like structures, hst/KS, Contains 1nt-2 and FGF-5, which are encoded by oncogenes. There is. The prototypical HBGF polypeptide can be used in endothelial cell migration and/or in vitro. It is a strong inducer of endothelial cell proliferation and the production of endothelial cell-derived proteases. It is known to regulate the current state. Furthermore, HBGF-1 and HBGF-2 probably due to its strong affinity for glycan hebarin. tightly adsorbed to the extracellular matrix. HBGF prototype and heparin association protection of these polypeptides from protein degradation. Extracellular matrix is HB is the main source of GF-1 and )1BGF-2, and its activation is dependent on the biological It has been shown to require hydrolytic extraction from the binding site for activity.

ハイエフ（Ｈａｙｅｋ　）等（１９８７）はラット腎臓におけるフィブロブラス ト成長因子のインビボにおける効果を報告した（　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１４７．８７６−８８０＞。Hayek et al. (1987) reported that fibroblasts in rat kidney reported the in vivo effects of growth factors (Biochem, Biop hys, Res, Commun, 147.876-880>.

内皮細胞増殖の直接的刺激による血管形成の開始はクラスＩヘパリン結合成長因 子（ＨＢＧＦ−Ｉ）およびクラス■ヘパリン結合成長因子（）ＩＢＧＦ−Ｉ［） の結果であると考えられている。これらのポリペプチドは高アフィニティー細胞 表面レセプターを介しインビボにおける生物学的応答を起こす、ＨＢＧＦ−１お よびＨＢＧＦ−ｎは５５パーセントの構造的相同性を共有し、また双方とも見か け上のシグナルペプチド配列を欠いたポリペプチドとして合成される。ＨＢＧＦ −１ｍＲＮＡ転写物を発現するヒト細胞はインビトロでそのポリペプチドを分泌 しない、さらにＨＢＧＦ−■は細胞マトリクスと関係することが示され、またヘ パリンはＨＢＧＦ−Ｉをプラスミンによるたんばく質分解から守る。Initiation of angiogenesis by direct stimulation of endothelial cell proliferation is induced by class I heparin-binding growth factors. child (HBGF-I) and class ■heparin-binding growth factor ()IBGF-I [) It is believed that this is the result of These polypeptides have high affinity for cells HBGF-1 and HBGF-1 induce biological responses in vivo through surface receptors. and HBGF-n share 55% structural homology, and both It is synthesized as a polypeptide lacking a signal peptide sequence. HBGF Human cells expressing the −1 mRNA transcript secrete the polypeptide in vitro. Furthermore, HBGF-■ has been shown to be associated with the cell matrix, and Parin protects HBGF-I from protein degradation by plasmin.

ＰＣＴ５際出順書出順番号ＷＯ３７１０１７２８えフィブロプラスト成長因子を 公開している。これらの成長因子は生物学的応答モディファイヤーの例である。PCT5 outstanding publication order number WO37101728 Fibroplast growth factor It is published. These growth factors are examples of biological response modifiers.

この公開は治療組織における血管系構築のための成長因子の重要性を示摘してい る１本公開の発明はウシおよびヒトの酸性および塩基性ＦＧＦをコードする組換 えＤＮＡ配列およびこれらのＤＮＡ配列を含むベクターである。This publication demonstrates the importance of growth factors for the construction of vasculature in treated tissues. The disclosed invention relates to recombinant bovine and human acidic and basic FGF-encoding proteins. DNA sequences and vectors containing these DNA sequences.

この出版物は部位指定血管形成の素子および方法を公開していない。This publication does not disclose site-directed angioplasty devices and methods.

ファンプラント（Ｕａｎ　Ｂｒｕｎｔ　）等（“成長因子による迅速な傷害治療 ″Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　（１９８Ｂ）　　；　２５−３０）は障害 組織の血管形成における成長因子の有用性を公開している０本記事は動物の傷害 治療に対しスポンジ移植モデルを公開している。このスポンジは不活性なポリビ ニルアルコールからなり、これが動物の皮フの下に移植される。それから成長因 子を直接そのスポンジに注射する。傷害は迅速に治療していき、また傷害部位に 血管の増加が起こる。この発明の血管は成長因子が吸着する支持体による完全で 恒久的血管構造は形成しない、この記事は部位指定血管形成の素子および方法を 公開していない。Uan Brunt, etc. (“Rapid injury treatment using growth factors”) ``Biotechnology 6 (198B); 25-30) is a disorder This article exposes the usefulness of growth factors in tissue angiogenesis. A sponge transplantation model has been published for treatment. This sponge is made of inert polyvinyl vinyl. It consists of alcohol and is implanted under the animal's skin. Then the growth factor Inject the child directly into the sponge. Injuries should be treated quickly and the injured area should be treated quickly. An increase in blood vessels occurs. The blood vessels of this invention are completely made of a support that absorbs growth factors. Permanent vascular structures do not form; this article describes the elements and methods of site-directed angioplasty. Not published.

ランバートン（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ　）等の米国特許番号４，６９９．１４１は 血管形成用の容器および方法を公開している。この発明にはフィブリノーゲンお よびヘパリン溶液に浸したスポンジ体が含まれる。U.S. Patent No. 4,699.141 to Lamberton et al. Discloses vessels and methods for angioplasty. This invention includes fibrinogen and and a sponge body soaked in a heparin solution.

このスポンジ体を非毛細血管のまわり置（、そうすると毛細血管がスポンジ内に 成長していく、この特許は血管の成長が特定の方向または特定の部位間に起こる という素子または方法を公開していない、この発明においてはヘパリンもコラー ゲンも生物学的応答を変化させない、ヘパリンおよびコラーゲンは双方とも生物 学的応答モディファイヤーが作用する基質である。Place this sponge body around non-capillary vessels (then the capillaries will be inside the sponge). Growing, this patent states that blood vessel growth occurs in a specific direction or between specific areas. In this invention, heparin is also used as a colloid. Neither heparin nor collagen changes the biological response; both heparin and collagen It is the substrate on which the chemical response modifier acts.

この発明により開発された毛細血管の成長は異物またはスポンジに対する血管の 炎症的応答の結果である。この発明の血管はそれらの成長がコントロールされて おらず、かつ永久的または長期的構造体も形成しない、これらの血管は成熟する 前にフイプリノ−ゲン支持体がその生体自体により吸収されてしまうことから永 久的なものにはならない。The capillary growth developed by this invention is effective against foreign objects or sponges. It is the result of an inflammatory response. The blood vessels of this invention have controlled growth. These blood vessels mature without forming any permanent or long-term structures. Because the fipurinogen support is absorbed by the body itself before It won't be something permanent.

ランバートン（Ｌａｓ＋ｂｅｒｔｏｎ　）等の発明によって開発された血管は基 本的にスポンジ内の細胞の束または毛細血管である。この発明は“目的細胞”の 容器と見なされる。このような容器は“人工器官”の開発には望ましい、この容 器の開発には約６週間もの時間がかかってしまう、遺伝子的に修正した、もしく は未修正の細胞は望ましい代謝効果を提供する。修正細胞を生成する遺伝子転移 技術の例は次の三つの文献に提供されている；ウオルフ（Ｗｏｌｆｆ）等、“成 熟ラット肝細胞の一次培養におけるレトロウィルスで導入した遺伝子の発現″Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　８４　（１９８７年 ５月）；３３４４−３３４８；レッドリ−（Ｌｅｄｌｅｙ　）等“−次肝細胞へ のレトロウィルス的遺伝子転移；肝臓特異的機能の遺伝的治療″Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　Ｂ互（１９８７）　５３３５−５ ３３９；およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ　）等“成熟肝細胞のレトロウィルス によるトランスダクション”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。The blood vessels developed by Las + Berton et al. They are essentially bundles of cells or capillaries within a sponge. This invention is based on “target cells”. considered a container. Such a container is desirable for the development of “prosthetic organs.” It takes about 6 weeks to develop the device, and it is genetically modified or Unmodified cells provide the desired metabolic effects. Gene transfer to generate corrected cells Examples of techniques are provided in three references: Wolff et al. Expression of retrovirus-introduced genes in primary culture of mature rat hepatocytes roc, Natl, Acad, Set, USA 84 (1987 May); 3344-3348; Ledley et al. Retroviral gene transfer; genetic therapy of liver-specific functions”Proc, N atl, Acad, Sci U S A B Mutual (1987) 5335-5 339; and Wilson et al. “Retroviruses of mature hepatocytes” Transduction by "Proc, Natl, Acad, Sci.

ＵＳＡエエ（１９８８年５月）３０１４−３０１８．この分野は遺伝子的に修正 した、または未修正の細胞を生体中に転移させ、またこれらの細胞をその生体中 に永久に維持してその細胞の代謝は効果から生体が恩恵をこおむるといった手段 を満足に持たない。USAAE (May 1988) 3014-3018. This field is genetically modified translocate modified or unmodified cells into an organism; It is a means for the living body to benefit from the effect of maintaining the cell's metabolism forever. I don't have it satisfactorily.

血管形成の分野は新しい血管または“新車管′成長を選択的に示す素子または方 法がないことで非常に制限されている０部位指定の生理学的血管形成の重要性は 医学において長年認識されてきている。従来技術はこのようなプロセスの可能性 を示してきたが、これを目的とする生理学的態様という形での血管のデザインは 提供していない。The field of angiogenesis is the development of devices or methods that selectively induce new blood vessel or “new vessel” growth. The importance of zero-site physiological angiogenesis, which is extremely limited due to the lack of a method, is It has been recognized in medicine for many years. Conventional technology has limited the possibility of such a process. However, the design of blood vessels in the form of physiological aspects for this purpose is Not provided.

本発明はインビボにおける部位指定血管形成素子である。この素子には支持体が 含まれる。この支持体は吸収可能な支持体でも非吸収可能な支持体でも、その両 方でもよい、またこの素子は血管形成を誘導する生物学的応答モデイファイヤー を含む、この生物学的応答モディファイヤーは支持体に吸着している。The present invention is an in vivo site-directed angioplasty device. This element has a support included. This support can be either an absorbable support or a non-absorbable support. This device may also be used as a biological response modifier to induce angiogenesis. The biological response modifier, including , is adsorbed to the support.

また本発明はインビボで血管形成を行う方法も含む、この方法は、血管形成を誘 導する生物学的応答モディファイヤーの支持体への吸着を必要とする。次に治療 効果量の該生物学的応答モディファイヤーを少なくとも１つの選択した＆ｌｌ織 に接触させるステップを行う。この方法は血管構を得るのに十分な時間の、この 接触した選択組織における血管細胞の増殖または培養を含む。The present invention also includes a method of performing angiogenesis in vivo, which method induces angiogenesis. requires adsorption of the biological response modifier to the support. then treatment an effect amount of at least one selected biological response modifier; Perform the step of bringing it into contact with. This method allows for sufficient time to obtain the vascular structure. Involves the proliferation or culturing of vascular cells in selected tissues that have been contacted.

本発明の方法は人工器官を提供するのに有用である。The methods of the invention are useful for providing prosthetic devices.

本発明の目的は（１）部位指定血管形成を誘導する新しい素子、（２）新しい血 管または血管床のインビボにおける形成法、（３）増殖、クローニング、操作お よび移植のため本発明の移植素子のまわりに集めた哺乳細胞、（４）移植用の血 管床および（５）本発明の詳細な説明から明白であるその他の目的物を提供する ことにある。The objects of the present invention are (1) a new element that induces site-specific blood vessel formation; (3) methods of in vivo formation of tubes or vascular beds; (3) propagation, cloning, manipulation and and mammalian cells collected around the transplant element of the present invention for transplantation, (4) blood for transplantation. providing a tube bed and (5) other objects that will be apparent from the detailed description of the invention. There is a particular thing.

（図面の簡単な説明） 第１図はコラーゲン支持体へのＥＣＧＦの結合を示している。(Brief explanation of the drawing) Figure 1 shows the binding of ECGF to a collagen support.

第２図はコラーゲンスポンジ上に固定化したＥＣＣＦの移植の効果およびその結 果（矢印はスポンジを示す）を示している。Figure 2 shows the effects and results of transplantation of ECCF immobilized on collagen sponge. The fruit (arrow indicates a sponge) is shown.

第３図はスポンジのＨアンドＥ組織学的染色（ラットへのＩＰ）を示している。Figure 3 shows H and E histological staining of sponge (IP on rat).

第４図は肝ｌ１１ｉ（左、Ｌ）および牌ｖａ（右、Ｓ　ｐ　）　間（７）　ＣＦ 　（成長因子）を含む部位指定ゲルフオーム移植を示している。Figure 4 shows the liver l11i (left, L) and the tile va (right, Sp) (7) CF 　Site-directed gelfoam implantation containing (growth factors) is shown.

第５図はＥＣＧＦ吸着コラーゲンスポンジから移植後４〜６週間週間図収された 遺伝子操作したラット肝細胞を示している。Figure 5 shows images taken from an ECGF-adsorbed collagen sponge 4 to 6 weeks after implantation. Genetically engineered rat hepatocytes are shown.

第６図は本発明に従って作られた血管の断面を示している。FIG. 6 shows a cross-section of a blood vessel made according to the invention.

第７図は手術後４週目にＨＢＧＦ−１により誘導された血管形成応答を示してい る。Figure 7 shows the angiogenic response induced by HBGF-1 4 weeks after surgery. Ru.

第８図は一般的に腸ループのまわりの腸間膜組織に結合する血管を含むファイバ ー移植物の後部分を示している。Figure 8 shows fibers containing blood vessels that typically connect to the mesenteric tissue around the intestinal loops. – shows the posterior part of the implant.

第９図はファイバー移植物とメセンテリアル血管の間の多重血管結合および移植 物内の血管ターボシティ−を示している。Figure 9 shows multiple vessel connections and grafting between fiber grafts and mesenterial vessels. It shows the vascular turbocity within the body.

第１０図は第９図の多重血管結合のｘＩ＆Ｉ像を示している。FIG. 10 shows an xI&I image of the multiple vessel connection in FIG. 9.

第１１図は血管構造の厚いコラーゲン性および筋肉性壁により囲まれた多重血管 ルミナの存在を明らかにする長さ方向断片の組織学的試験を示している。Figure 11 shows multiple blood vessels surrounded by thick collagenous and muscular walls of the vascular structure. Histological examination of longitudinal sections revealing the presence of lumina is shown.

第１２図は血管構造の豊富なコラーゲン成分および豊富な内皮細胞系毛細血管構 造を明らかにする高倍率での第６図の血管束を示している。Figure 12 shows the abundant collagen components of the vascular structure and the abundant endothelial cell-based capillary structure. Figure 6 shows the vascular bundle of Figure 6 at higher magnification revealing the structure.

第１３図はコラーゲン（■型）上に植種した肝細胞およびＨＢＧＦ−１コート化 ＰＴＦＥフアイバーを移植したガンラットの血清ビリルビンレベルを示している 。Figure 13 shows hepatocytes seeded on collagen (■ type) and coated with HBGF-1. Serum bilirubin levels of gun rats implanted with PTFE fibers are shown. .

第１４図は１力月間ラットの大動脈上に移植した後切り出し、断片化したＨＢＧ Ｆ−１を浸み込ませたコラーゲン■　（ゲルフオーム）スポンジを含むゴルテッ クスシャントチューブを示している。Figure 14 shows HBG cut out and fragmented after being transplanted onto the aorta of a rat for one month. Collagen ■ (gel foam) sponge impregnated with F-1. The shunt tube is shown.

第１４Ｂ図、第１４Ｃ図、第１４Ｄ図はＩ型コラーゲンでコートしかつＨＢＧＦ −１を浸み込ませた一束のゴルテックスエンジェルヘアーファイバーを含むゴル テンクスシャントチューブを示している。Figures 14B, 14C, and 14D are coated with type I collagen and HBGF. Gol containing a bundle of Goltex angel hair fibers impregnated with -1 Tenx shunt tube is shown.

（本発明の詳細な説明） 本発明は構成物または“素子”およびこの素子の使用法を含む。(Detailed description of the invention) The present invention includes compositions or "elements" and methods of using the elements.

この素子は血管形成をインビボで刺激し、遂行するのに使用する。This device is used to stimulate and perform angiogenesis in vivo.

この血管形成は神経を含むその他の細胞組織の成長を伴う、この素子は支持体を 必要とする。この支持体は生物学的応答モデイファイヤーを吸着し得るか、また は生物学的応答モデイファイヤーを吸着し得る構成物に粘着し得なければならな い、生物学的応答モディファイヤーとは血管形成を刺激および誘導する化合物で ある。さらに本発明は人工器官および、または遺伝子操作による組織の開発をも 含み得る。This angiogenesis is accompanied by the growth of other tissue, including nerves, and this element I need. Is this support capable of adsorbing biological response modifiers? must be able to adhere to the composition capable of adsorbing the biological response modifier. Biological response modifiers are compounds that stimulate and induce angiogenesis. be. Furthermore, the present invention also supports the development of prosthetic organs and/or genetically engineered tissues. may be included.

生物学的応答モディファイヤーとは組織または器官に由来する血管細胞の増殖を 刺激し、または可能にする少なくとも１種類の化合物または試薬である。別な言 葉では生物学的応答モデイファイヤーとは成長因子、ホルモンまたはそれらのキ メラ誘導体など転写または翻訳などの細胞事象を直接的または間接的に誘導する 生化学的試薬である。生物学的応答モデイファイヤーは高アフィニティーレセプ タターを介して直接的または間接的にその効果を発揮する。この効果は血管細胞 の増殖を起こす、レセプターを直接刺激する化合物にはホルモンが含まれる。レ セプターの間接的刺激を提供する化合物にはホルモン原型または前駆体およびハ イドロラーゼが含まれる。プラスミノーゲン活性化因子、コラ−ゲナーゼ、また はヘパリナーゼなどのハイドロラーゼは直接的生物学的応答モディファイヤーの 潜伏、保存、またはザイモゲン前駆体を酵素的に活性化または放出することによ り生物学的応答を開始する。Biological response modifiers are biological response modifiers that increase the proliferation of vascular cells originating from tissues or organs. At least one stimulating or enabling compound or reagent. another word In leaves, biological response modifiers are growth factors, hormones, or Directly or indirectly induce cellular events such as transcription or translation, such as mela derivatives It is a biochemical reagent. Biological response modifiers are high affinity receptors It exerts its effect directly or indirectly through Tatar. This effect is caused by vascular cells Compounds that directly stimulate receptors, causing proliferation of cells, include hormones. Re Compounds that provide indirect stimulation of the receptor include hormone prototypes or precursors and hormones. Contains hydrolase. Plasminogen activator, collagenase, and Hydrolases such as heparinases are direct biological response modifiers. by incubation, storage, or enzymatic activation or release of zymogen precursors. triggers a biological response.

血管形成成長因子として望ましい生物学的応答モデイファイヤーにはＨＢＧＦ− １、ＨＢＧＦ−Ｉ［、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、マクロファージ由来成 長因子（ＭＤＧＦ）　、上皮成長因子（ＥＧＦ）、腫瘍血管形成因子（ＴＡＦ） 、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ）　、視 床下部由来の成長因子（ＨＤＣＦ）、レチナ由来成長因子（ＲＤＧＦ）およびこ れらの混合物からなる群の一員を含む０本発明の好ましい態様ではＩＩＢＧＦ− ■を使用している。望ましいバイトラーゼにはヘパリナーゼ、コラ−ゲナーゼ、 プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、ヘバラチナーゼおよび これらの混合物からなる群がら選択される一員を含む。Desirable biological response modifiers as angiogenic growth factors include HBGF- 1. HBGF-I [, platelet-derived growth factor (PDGF), macrophage-derived growth factor growth factor (MDGF), epidermal growth factor (EGF), tumor angiogenic factor (TAF) , endothelial cell growth factor (ECGF), fibroblast growth factor (FGF), visual Subbed-derived growth factor (HDCF), retina-derived growth factor (RDGF) and In a preferred embodiment of the present invention, IIBGF- ■ is used. Preferred baytrases include heparinase, collagenase, Plasmin, plasminogen activator, thrombin, hebaratinase and and a member selected from the group consisting of mixtures thereof.

成長因子のようなホルモンは本発明の生物学的応答モディファイヤーとして使用 するのに特に望ましい、ホルモンは特異的な細胞増殖および分化を起こす、生物 学的応答モディファイヤーとしてのホルモンの使用は迅速な血管形成および完全 な血管構造の形成を起こす、ホルモンによって刺激されて出来た血管は管状の空 隙と細胞間の結合組織を持つ、単なる細胞の塊り以上のものである。ホルモンの 使用でできた血管はそれ自体完全なものであり、切断して別の部分への移植も可 能である。その他の生物学的応答モディファイヤーも同様の結果を産むがホルモ ン、特にＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−Ｉ［ホルモンのような迅速な成長は提供 しない。Hormones such as growth factors are used as biological response modifiers in the present invention Hormones are particularly desirable to induce specific cell proliferation and differentiation in organisms. The use of hormones as biological response modifiers results in rapid angiogenesis and complete The blood vessels that are stimulated by hormones, which cause the formation of vascular structures, are tubular hollow. It is more than just a mass of cells, with spaces and connective tissue between the cells. hormonal The resulting blood vessels are complete in themselves and can be cut and transplanted to another area. It is Noh. Other biological response modifiers produce similar results, but hormone hormones, especially HBGF-1 and HBGF-I [hormones such as do not.

本発明には生物学的応答モディファイヤーが吸着する生適合性支持体が含まれる 。この支持体は吸収性または非吸収性またはその両方の生適合性マトリクスであ る。この支持体は生体への移植が可能でなくてはならず、かつ血管形成が起った 後に移植可能である程度で堅くて強いものが望ましい、この生適合性支持体は血 管形成を支持するのに十分な堅さと強さを備えていなければならない、吸収可能 な支持体の例にはコラーゲン■型（“ゲルフオーム”の商標で市販されている） 、ラミニン、フィブロネクチン、ゼラチン、グリコサミングリカン、糖脂質、プ ロテオグリカン、ムコ多糖類、糖たんばく賞、ポリペプチド、およびこれらの混 合物からなる群から選択される一員が含まれる。非吸収性マトリクスの例には、 ナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、膨張ＰＴＦＥ、架橋コラーゲ ン■型およびこれらの混合物からなる群から選ばれるものが含まれる。選択した 支持体には生物学的応答モディファイヤーを生適合性支持体に吸着しうる細胞外 マトリクスたんばく質を含むことが望ましい。The present invention includes a biocompatible support to which biological response modifiers are adsorbed. . The support can be a biocompatible matrix that can be absorbable or non-absorbable or both. Ru. This support must be capable of being implanted into the living body and must be able to undergo angiogenesis. This biocompatible support is preferably stiff and strong enough to be later implanted. Absorbable, must have sufficient stiffness and strength to support tube formation Examples of suitable supports include collagen type II (sold under the trademark “Gelfoam”). , laminin, fibronectin, gelatin, glycosaminoglycan, glycolipid, protein rotoglycans, mucopolysaccharides, glycoproteins, polypeptides, and their mixtures. A member selected from the group consisting of compounds is included. Examples of non-absorbable matrices include: Nylon, rayon, Dacron, polypropylene, expanded PTFE, crosslinked collagen type selected from the group consisting of type 1 and mixtures thereof. Selected The support includes an extracellular compound capable of adsorbing biological response modifiers to a biocompatible support. It is desirable to include matrix protein.

細胞外マトリクスたんばく質は生適合性支持体を形成している物質であるか、ま たは生物学的応答モディファイヤーを生適合性支持体に吸着させるように生適合 性支持体に添加された成分であり得る。細胞外マトリクスたんばく質成分には純 粋または混合したたんばく質またはポリペプチド組成物を含み得る。このたんば く質およびポリペプチドは天然のものでも合成したものでもよい。Extracellular matrix proteins are substances that form a biocompatible support or or biological response modifiers to a biocompatible support. It can be an ingredient added to the sexual support. Extracellular matrix protein components contain pure may contain pure or mixed protein or polypeptide compositions. This tanka The proteins and polypeptides may be natural or synthetic.

細胞外マトリクスたんばく質成分は細胞外構造分子に由来するのが望ましい、こ れらの細胞外構造分子にはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ゼラチン 、グリコサミングリカン、糖たんばく質、プロテオグリカンおよびこれらの混合 物からなる群から選ばれる一員が含まれる。The extracellular matrix protein components are preferably derived from extracellular structural molecules; These extracellular structural molecules include collagen, laminin, fibronectin, and gelatin. , glycosaminoglycans, glycoproteins, proteoglycans and mixtures thereof Includes a member selected from a group of things.

膨張ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）は本発明の非吸収性支持体に最も 適したものであることが分った。この支持体は次に示す利点を提供する。ＰＴＦ Ｅは手術部分におけるＰＴＦＨの受は入れに基づ（炎症を起こさない、ＰＴＦＥ は生物学的応答モディファイヤーを吸着し得る細胞外マトリクスの種々の成分で 簡単にコートし得る。生物学的に活性なＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−２は従来 法によりコラーゲンコートしたＰＴＦＥに固定化し得る。ＰＴＦＥは必要とされ る構造に適合し得るように種々の仕様でルーチンに作られる。Expanded polytetrafluoroethylene (PTFE) is the most preferred nonabsorbent support of the present invention. It turned out to be suitable. This support offers the following advantages: PTF E is based on the acceptance of PTFH in the surgical area (non-inflammatory, PTFE are various components of the extracellular matrix that can adsorb biological response modifiers. Can be easily coated. Biologically active HBGF-1 and HBGF-2 are It can be immobilized on collagen-coated PTFE by a method. PTFE is required They are routinely manufactured with a variety of specifications to suit different structures.

非吸収ＰＴＦＥの構造は長期移植モデルのより重要な特性である。全ての多細胞 生物は枝分れファイバーネットワークの三次元性を利用し、所定容積で表面積を 増加する問題を解決している。The structure of non-absorbed PTFE is a more important characteristic for long-term implantation models. all multicellular Living organisms utilize the three-dimensional nature of branched fiber networks to increase the surface area of a given volume. Solving a growing number of problems.

移植前のこのようなネットワークへのＨＢＧＦポリペプチドによる接種はマイト ジェンの非常に局所的な濃縮を可能にする。膨張ＰＴＦＥの非織マルチフィラメ ントエンジェル・ヘアーファイバーはＷ、Ｌ、ボア・アンド・アソシェーツ社（ Ｇｏｒｅ　ａｎｄ　Ａｓ５ｏ−ｃｊａｔｅｓ　Ｉｎｃ、＋）　　（アリシナ州、 フラグスタッフ）から市販されている。これらのファイバーは浸透した細胞が宿 主の環境に露出するのに十分に組織化した表面積を実現させる。このことは栄養 物と廃棄物の自由な交換を可能にし血管形成過程を起こさせる。さらに一般的に 細胞骨格と特定のマトリクスへの付着により決定される細胞の形は細胞増殖およ び分化の両方に重要な役割りを果たしていると考えられている。Inoculation of such networks with HBGF polypeptides before transplantation may be Allows highly localized concentration of gen. Non-woven multifilament of expanded PTFE Angel Hair Fiber is manufactured by W, L, Boa & Associates ( Gore and As5o-cjates Inc, +) (Alisina, Commercially available from Flagstaff). These fibers harbor infiltrated cells. Provides a sufficiently organized surface area to be exposed to the host's environment. This is nutrition It allows the free exchange of products and waste and allows the angiogenic process to take place. more generally Cell shape, determined by the cytoskeleton and attachment to specific matrices, is important for cell growth and It is thought that it plays an important role in both differentiation and differentiation.

本発明で使用する支持体は自由な形および大きさのものが提供し得る。血管形成 の基礎を提供するのには１ｍ”はどの小さな支持体が適している。支持体に通し た形は片、スポンジまたはチューブである。支持体は生体内に保持され得ること が望ましい。支持体を保持する適当な手段にはステープル、主通合接着剤、また は組織に支持体を縫いつけるか結びつけるような外科操作が含まれる。The supports used in the present invention can be provided in any shape and size. angiogenesis Any support as small as 1 m” is suitable to provide a foundation for the The shapes are strips, sponges or tubes. The support can be retained in vivo. is desirable. Suitable means of holding the support include staples, threading adhesives, or involves surgical operations such as sewing or tying supports to tissue.

望ましい支持体は膨張ＰＴＦＥのチューブに膨張ＰＴＦＥファイバーまたは“エ ンジェルへ７９を充填することにより得られる。チューブからつくった支持体は 人工器官のポーチを提供する。A preferred support is an expanded PTFE tube with expanded PTFE fibers or It is obtained by filling 79 into a gel. A support made from tubes Providing a prosthetic pouch.

支持体のチューブ形およびチューブ内のファイバーの束は血管形成を行うのに特 に望ましい、このような態様は本発明を人工器官の提供に使用する時、移植細胞 の容器となり得る。The tube shape of the support and the bundle of fibers within the tube are particularly suited for performing angioplasty. Such an embodiment is desirable when the present invention is used to provide a prosthetic organ. It can be used as a container.

生物学的応答モディファイヤーの最も効果的濃度は標的細胞からの成長応答を引 き出すがこれらの細胞に毒性を示さない濃度であればよい、血管形成成長因子の 効果的または治療的濃度は支持体立方ミリメートルル当り約１〜約１０ナノグラ ムの範囲である。The most effective concentration of biological response modifier is the one that elicits a growth response from target cells. angiogenic growth factors, which can be produced at concentrations that are not toxic to these cells. Effective or therapeutic concentrations range from about 1 to about 10 nanograms per cubic millimeter of support. This is the range of

この計算に適する支持体は吸収性および非吸収性支持体の両方を含む。Supports suitable for this calculation include both absorbent and non-absorbent supports.

支持体は望ましい血管の長さおよび巾を確立するのに適した量が提供される。た とえばもし血管が２つの＆ｌｌ織の間に望まれ、かつ２つの組織の間に距離があ るとき、これに相当する長さの支持体を生体内に移植し、望ましい血管のおよそ の長さおよび巾を提供する。ある量の生物学的応答モディファイヤーがこの基本 的構造を形成するのに必要な量の支持体に適用される。Support is provided in a suitable amount to establish the desired vessel length and width. Ta For example, if a blood vessel is desired between two tissues and there is a distance between the two tissues. When the desired blood vessel is approximately Provide length and width. A certain amount of biological response modifiers are fundamental to this applied to the support in the amount necessary to form the desired structure.

本発明は非吸収性支持体を使用することなしに実施することができる。たとえば ゼラチン、ＨＢＧＦ−１またはＨＢＧＦ−２との複合体はインビボでこの生物学 的活性一致するポリペプチド濃度でインビボにおける血管形成を誘導し得る。こ の血管形成応答はう７）の首および腹腔において４週間まで誘導された部位特異 的血管形成を維持し得る。しかし、支持体を含まない本発明の素子には長期間の 血管の誘導は制限される。これはコラーゲンスポンジの三次元構造が最終的に移 植後３〜４週間以内に開始する再吸収プロセスにより破壊されることによる。特 性が明らかで、かつ細胞外マトリクスの結合成分を含む非吸収性固体高分子支持 体はインビボにおいて長期間安定な血管を誘導した。このような態様の例はコラ ーゲンＩ型および■型の両方に結合し、かつこのコラーゲンに結合したＨＢＧＦ −１およびＨＢＧＦ−２の両方を含む非吸収性支持体である。The invention can be practiced without the use of non-absorbent supports. for example Gelatin, complexed with HBGF-1 or HBGF-2, can be used in vivo to angiogenesis can be induced in vivo at polypeptide concentrations consistent with its activity. child Site-specific angiogenic responses induced for up to 4 weeks in the neck and peritoneal cavity of caries 7) angiogenesis can be maintained. However, the device of the present invention, which does not include a support, has a long-term Vascular guidance is limited. This is because the three-dimensional structure of the collagen sponge is finally transferred. It is destroyed by the resorption process that begins within 3-4 weeks after implantation. Special A non-absorbable solid polymer support that has clear properties and contains binding components of the extracellular matrix. The body induced long-term stable blood vessels in vivo. An example of such an aspect is shown below. HBGF bound to both type I and type II collagen and bound to this collagen. -1 and HBGF-2.

また血管形成装置は宿主への移植の前または後に望ましい細胞に埋めこむことが できる。好ましいＢ様においてはこのような細胞は哺乳細胞であり特別の機能を 行い得るたんばく質を発現する。Angioplasty devices can also be implanted into the desired cells before or after transplantation into the host. can. In the preferred case B, such cells are mammalian cells and have special functions. Express proteins that can be used.

この細胞は異種たんばく質を発現し得る遺伝子操作で作られた細胞であってもよ い、別にこの細胞は肝細胞のような望ましい機能を提供し得る天然の細胞でもよ い。This cell may be a genetically engineered cell capable of expressing a foreign protein. However, these cells can also be natural cells that can provide the desired function, such as liver cells. stomach.

本発明の望ましい態様には少なくとも１つの異種たんばく質を発現するよう遺伝 子操作された血管形成素子に接種した細胞がある。このようなたんぽ（質は治療 薬であることが望ましい。この発現たんばく質は遺伝子操作細胞から分泌されて もよいし、されないこともある。Preferred embodiments of the invention include genes genetically engineered to express at least one heterologous protein. There are cells seeded into the engineered angiogenic element. Danpo like this (quality is healing) Preferably medicine. This expressed protein is secreted from genetically engineered cells. It may or may not be possible.

本発明で使用する遺伝子操作細胞は望ましい異種たんばく質をコードする少なく とも１つの遺伝子でトランスホームされる。この細胞を望ましい遺伝子を含む適 当なベクターまたは発現ベヒクルでトランスホームする。またこのベクターは宿 主での発現に必要なプロモーターも含む、＠乳細胞におけるこの発現プロモータ ーにはＳＶ４０、ＬＴＲ１メタロチオネイン、ＰＧＫ、ＣＭＶ。Genetically engineered cells used in the present invention encode a desired heterologous protein. Both are transformed by a single gene. This cell is then transformed into an appropriate protein containing the desired gene. Transform with a suitable vector or expression vehicle. Also, this vector is This expression promoter in breast cells, including the promoter necessary for expression in the main - SV40, LTR1 metallothionein, PGK, CMV.

ＡＤＡ、ＴＫなどのプロモーターがある。またベクターには治療薬を細胞から分 泌させる適当なシグナル配列が含まれる。適当なプロモーターの選択は当業者の 知識の範囲内で行なわれる。There are promoters such as ADA and TK. The vector also has the ability to separate therapeutic drugs from cells. Contains an appropriate signal sequence for secretion. Selection of an appropriate promoter is within the skill of those skilled in the art. It is done within the scope of knowledge.

ベクターまたは発現ベヒクルはウィルスベクター特にレトロウィルスベクターで あることが望ましい、治療薬遺伝子を含むよう修正し得る適当なウィルスベクタ ーの代表例にはハーバ−ザルコーマウィルス、ＲＯＵＳザルコーマウィルス、Ｍ ＰＳＶ、モロニーマウス白血病ウィルス、アデノウィルスなどのＤＮＡウィルス などが含まれる。別に発現ベヒクルはプラスミドであり得る。The vector or expression vehicle may be a viral vector, particularly a retroviral vector. A suitable viral vector that can be modified to contain a therapeutic gene, preferably Typical examples include Herber's sarcoma virus, ROUS sarcoma virus, and M. DNA viruses such as PSV, Moloney murine leukemia virus, and adenovirus etc. are included. Alternatively, the expression vehicle can be a plasmid.

トランスホーメーシッンはリポソーム融合、リン酸カルシウムまたは硫酸デキス トラントランスフエクシッン、エレクトロボレーシラン、リボフエクション、タ ングステン粒子、その他の方法で行ない得る。トランスホーメーション用の適当 なベヒクルの選択は当業者の知識の範囲で行なわれる。Transforming drugs include liposome fusion, calcium phosphate or dex sulfate. Trantransferexin, electrovolesilane, ribofection, tan ngsten particles, or other methods. Suitable for transformation Selection of a suitable vehicle is within the knowledge of those skilled in the art.

細胞のトランスホーメーシッン用の発現ベヒクルとしてレトロウィルスベクター を用いたとき、ウィルスの複製の機会を除去、および、または減少させるステッ プを行うべきである。基本的にウィルスを複製しないウィルスベクターを作るヘ ルパー細胞を提供する種々の操作が知られている。このような操作の例にはマル コビッッ（Ｍｏｒｋｏｗｉｔｚ　）等、′シーントランスファー用のセーフバッ キングライン；２種のプラスミド上のウィルス遺伝子の分離″Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６２　（４）　　（１９８８年４月）；１１２０−１ １２４；ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ　）等、“アビアンレテキュロエンドセリ オシスウイルスクローニングベクター用のヘルパー細胞の構築”Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ３　（１２）　　（１９８３ 年１２月）；２２４１−２２４９；ダノス（Ｄａｎｏｓ　）等、“アンホトロビ ックおよびエコトロピック宿主範囲をもつ組換えレトロウィルスの安定で効率的 な生成”　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８５（１９８８ 年９月＞６４６０−６４６４；およびボセルマン（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ　）等、 “複製”欠損キメラヘルパープロウィルスおよびコンピテントウィルスの生成に 影響する因子；メタロチオネインプロモーターを介するモロニーマウス白血病ウ ィルス構造遺伝子の発現”、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａ１１ｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　　（５）　　（１９Ｂ？。Retroviral vectors as expression vehicles for cellular transformation steps to eliminate and/or reduce the chance of virus replication when using should be performed. To create virus vectors that basically do not replicate viruses. Various procedures for providing Luper cells are known. Examples of such operations include ``Safeback for scene transfer'' such as Morkowitz King Line; Isolation of viral genes on two types of plasmids" Journal of Virology 62 (4) (April 1988); 1120-1 124; Watanabe et al. Construction of helper cells for Osys virus cloning vector “Mo1ecul” ar and Ce1lular Biology 3 (12) (1983 2241-2249; Danos et al., “Amphotrobi Stable and efficient recombinant retroviruses with ecological and ecotropic host ranges "Generation", Proc, Natl, Acad, Sci, 85 (1988 September >6460-6464; and Bosselman et al. For the generation of “replication”-defective chimeric helper proviruses and competent viruses. Influencing factors; Moloney murine leukemia cow via metallothionein promoter "Expression of Virus Structural Genes", Mo1ular and A11ular B iology (5) (19B?.

年５月）；１７９７−１８０６があり、これらは複製ウィルスを含むウィルス粒 子を生成する機会を最小にするヘルパー細胞を作る操作を公開している。このよ うな操作は遺伝子操作細胞にレトロウィルスベクターを用いるときに採用し得る 。プロモーターおよび治療薬遺伝子に加え、他の物質もこのベクターに含めるこ とができる。これらの物質にはネオマイシン耐性遺伝子などの選択遺伝子、発現 を促進する配列などが含まれる。May 2016); 1797-1806, these are viral particles containing replicating viruses. It discloses operations to create helper cells that minimize the chance of producing offspring. This way Such manipulations can be employed when using retroviral vectors in genetically engineered cells. . In addition to the promoter and therapeutic gene, other materials can also be included in this vector. I can do it. These substances include selection genes such as the neomycin resistance gene, This includes sequences that promote

遺伝子操作哺乳細胞は血管形成素子を用いることにより哺乳類に移植することが できる。これらの遺伝子操作細胞は同種の哺乳類に移植することが望ましい、好 ましい態様においては遺伝子操作哺乳類細胞とは患者に由来し、少なくとも１つ の治療薬の遺伝子を含むよう遺伝子操作し、かつそれらが由来する患者に本発明 に従う血管形成素子を使用して移植される細胞である。これらの独立する遺伝子 操作細胞は、患者を治療する治療薬をインビボで生産することによる“遺伝子治 療”を提供する。Genetically engineered mammalian cells can be transplanted into mammals using angiogenic elements. can. It is desirable to transplant these genetically engineered cells into mammals of the same species. In a preferred embodiment, the genetically engineered mammalian cell is derived from a patient and has at least one genetically engineered to contain genes for therapeutic agents, and the patients from whom they are derived are given the present invention. The cells are transplanted using an angiogenic device according to the method. These independent genes Engineered cells can be used to develop “gene therapy” by producing therapeutic drugs in vivo to treat patients. provide medical treatment.

遺伝子操作細胞は、その治療薬が細胞から分泌しその近傍またはより離れた位置 の細胞および組織にその効果をあげるよう作ることができる。別に、もし遺伝子 操作細胞から治療薬が分泌されない場合それはこの細胞内でその効果を発揮し、 この細胞内に拡散してくる物質の代謝を引き起こし得る。このような治療薬の例 には重度の免疫不全症で蓄積する毒性代謝物質アデノシンを不活性化するように 細胞内で機能するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）またはフェニルケトン尿症 の毒性代謝物であるフェニルアラニンを不活性化するように細胞内で機能するフ ェニルアラニンノ１イドロキシラーゼが含まれる。Genetically engineered cells allow the therapeutic agent to be secreted from the cell, either nearby or at a more distant location. can be tailored to have its effect on cells and tissues. Separately, if the gene If the therapeutic drug is not secreted from the manipulated cell, it will exert its effect within this cell, This can cause the metabolism of substances that diffuse into the cell. Examples of such therapeutic agents to inactivate the toxic metabolite adenosine that accumulates in severe immunodeficiency. Adenosine deaminase (ADA) functioning within cells or phenylketonuria phenylalanine, a toxic metabolite of Contains phenylalanine hydroxylase.

本発明で使用される遺伝子操作細胞を少なくとも１つの異種たんばく賞の遺伝子 でトランスホームする。このたんばく質は治療薬であることが望ましい、“治療 薬”という語句は広い意味で使用され、宿主への望ましい効果を有する試薬また は物質を意味する。治療薬は１種以上のたんばく賞でもよい、望ましいたんぽ（ 質にはＣＤ−４、因子■、因子■、フオノウイレブランド因子、ＴＰＡ、ウロキ ナーゼ、ヒルジン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、Ｇ− Ｃ３Ｆを含む造血成長因子、ＣＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ３、エリスロポイエチン、抗体 、グルコセレブロシダーゼ、ＡＤＡ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ヒト 成長ホルモン、インシェリンなどが含まれる。適当な遺伝子の選択は当業者の知 識の範囲で行なわれる。本発明では遺伝子操作平滑筋細胞、フィブロプラスト、 ダリア細胞、ケラチン細胞などの細胞型の混合物も使用し得る。Genetically engineered cells used in the present invention contain at least one heterologous protein Transform with . It is desirable that this protein is a therapeutic drug, “therapeutic”. The term "drug" is used in a broad sense and refers to any reagent or drug that has a desired effect on the host. means substance. The therapeutic drug may be one or more types of protein drugs, such as a desirable drug ( Quality includes CD-4, factor ■, factor ■, Founouillebrand factor, TPA, and Uroki. Nase, hirudin, interferon, tumor necrosis factor, interleukin, G- Hematopoietic growth factors including C3F, CM-C3F, IL3, erythropoietin, antibodies , glucocerebrosidase, ADA, phenylalanine hydroxylase, human Contains growth hormone and inshelin. Selection of appropriate genes is within the knowledge of those skilled in the art. It is done within the scope of knowledge. In the present invention, genetically engineered smooth muscle cells, fibroplasts, Mixtures of cell types such as dahlia cells, keratinocytes, etc. may also be used.

遺伝子治療に用いる時、遺伝子操作細胞における効果は高生産クローン群の選択 および、または高発現ベクターの使用により制御し得る。このことは患者の治療 のためのインビボでの治療効果量の目的治療薬を提供し得る。移植する細胞数の 決定には治療薬の寿命、血管系の容量、細胞による治療薬の生産速度、および望 ましい投与レベルなどの因子が考えられる。このようなベクターおよび細胞の選 択は治療に依存し、かつ当業者の知識の範囲にある。When used in gene therapy, the effect in genetically engineered cells is determined by the selection of high-producing clones. and/or can be controlled by the use of high expression vectors. This means that patient treatment may provide a therapeutically effective amount of the desired therapeutic agent in vivo. number of cells to be transplanted The decision depends on the longevity of the therapeutic agent, the capacity of the vasculature, the rate at which the cells produce the therapeutic agent, and the desired Factors such as the desired dosage level may be considered. Selection of such vectors and cells The choice depends on the treatment and is within the knowledge of those skilled in the art.

本発明の血管形成素子は宿主にこの素子を移植し、一定期間後この素子上に集合 する細胞を回収するために宿主からこの移植した血管形成素子を取り出すことに より、宿主から細胞を入手するのにも使用し得る。このような細胞は分化し、か つ種々の目的に使用帯る。たとえばこの操作は遺伝子操作用の独立細胞源を提供 し、かつ引きつづいてたんばく質を発現するための遺伝子操作細胞として宿主に 戻し得る。このように収穫した細胞は遺伝子操作を行った後宿主に戻して人工器 官を提供し得る。The angiogenic device of the present invention is implanted into a host and aggregates on the device after a certain period of time. The transplanted angiogenic element was removed from the host in order to recover the cells that It can also be used to obtain cells from a host. These cells differentiate and It is used for various purposes. For example, this procedure provides an independent cell source for genetic manipulation. and into the host as genetically engineered cells to continue expressing proteins. Can be returned. The cells harvested in this way are genetically manipulated and then returned to the host to be used in artificial devices. can provide government services.

血管形成を行うプロセスにはまず上述のような本発明の素子の調製が含まれる。The process of performing angiogenesis first involves preparing the device of the invention as described above.

この素子は血管形成に適した生物学的応答モディファイヤーの支持体への吸着に より調製される。生物学的応答モディファイヤーは細胞増殖を誘導するための治 療効果を有する濃度で支持体上に存在しなければならない、吸着した生物学的応 答モディファイヤーを少なくとも１つの選択した組織に接触させる。一般にこの 素子は血管が必要とされる少なくとも２つの別個の部位に連結する。これらの２ つの部位は同じ＆１１１１１または器官でも異なるものにあっても良い、さらに 本方法には接触した＆ｌｌ織におけるまたはその＆ｌｌ織からの血管形成細胞の 培養が含まれる。接触細胞の培養は血管形成および血管構造の形成に十分な時間 行なわなければならない。This device is suitable for adsorption of biological response modifiers suitable for angiogenesis onto a support. prepared from Biological response modifiers are therapeutic agents for inducing cell proliferation. The adsorbed biological response must be present on the support in a therapeutically effective concentration. contacting the response modifier with at least one selected tissue. Generally this The elements connect to at least two separate sites where blood vessels are needed. These two The two parts can be in the same &11111 or different organs, and The method involves the generation of angiogenic cells in or from the &ll tissue contacted. Includes culture. Culture of contact cells provides sufficient time for angiogenesis and the formation of vascular structures. must be done.

第１図はＥＣＧＦのコラーゲン支持体への結合を示している。Figure 1 shows the binding of ECGF to a collagen support.

このことはコラーゲン■型−セファロースおよびゼラチン−セファロースカラム からのＨＢＧＦ−１（ＥＣＧＦ）の溶出プロフィールにより示される。コラーゲ ン■型−セファロースおよびゼラチン−セファロース（Ｉｍｊりをカラムの中に 詰め、５０ｍＭ）リス・ＨＣ１！　（ｐＨ７，４）中５ＭＮａＣ１溶液５ｍｊ！ で洗った後、５０ｓ＋Ｍ）リス・Ｈ（１１（ｐ）１７．４）　　（１！＆着バッ ファ：　ＡＢ）で十分に洗浄した。ゼラチン−セファロースはファルマシア製で ある。ウシコラーゲン■型−セファロースはシグマケミカル社（ＭＯ。This means that collagen type ■-Sepharose and gelatin-Sepharose columns The elution profile of HBGF-1 (ECGF) from collage type-Sepharose and gelatin-Sepharose (Imj into the column) Packed, 50mM) Squirrel HC1! (pH 7,4) 5M NaCl solution 5mj! After washing with 50s + M) Squirrel H (11 (p) 17.4) (1! Thoroughly washed with F: AB). Gelatin-Sepharose is manufactured by Pharmacia. be. Bovine collagen type ■-Sepharose is from Sigma Chemical Co. (MO).

セントルイス）から購入し、また（”’Ｉ）−ＨＢＧＦ−１は以前に報告されて いるように調製した。吸着バッファ中約０．１曽ｌの（”り−ＨＢＧＦ−１　　 （およソ５×１ｏｓｃｐＩＩ）ヲカラムニ添加し、そのカラムを吸着バッファで 洗浄した。カラム会合（”’Ｉ）−ＨＢＧＦ−１の溶出は吸着バッファ中１．５ 　Ｍ　ＮａＣ１溶液または吸着バッファ中５０ユニットのヘパリン（アンプジョ ン製、Ｍｌ、カラマズー）溶液で行った。ＮａＣ１ｔ′！Ｊ出したカラムは吸着 バッファ洗浄で再生し、一方ヘバリン溶出したカラムは吸着バッファ中１．５　 Ｍ　ＮａＣｌ溶液での連続的洗浄および吸着バッファでの洗浄で再生した。マト リクスアフィニティー操作は室温（約２２℃〜２５℃）で行った。St. Louis) and (”’I)-HBGF-1 was previously reported. It was prepared as follows. Approximately 0.1 l of HBGF-1 in the adsorption buffer (approximately 5 Washed. The elution of column-associated (”’I)-HBGF-1 was at 1.5 in the adsorption buffer. M　50 units of heparin (ampjool) in NaCl solution or adsorption buffer The test was carried out using a solution manufactured by M.I. NaC1t'! The column taken out of J is adsorbed. The column was regenerated by buffer washing, while hevarin was eluted at 1.5 in adsorption buffer. Regenerated with successive washes with M NaCl solution and washes with adsorption buffer. Mato Lix affinity operations were performed at room temperature (approximately 22°C to 25°C).

第２図はコラーゲン支持体へのＥＣＧＦの結合を示している。Figure 2 shows the binding of ECGF to a collagen support.

吸着した因子を種々の解剖部位に移植し、目的領域における血管形成および血管 床の成長を刺激するための成長因子吸着移植体の実際の使用を示している。コラ ーゲンスポンジ上に固定化したＥＣＧＦの移植効果とその結果（矢印はスポンジ ）が示されている。The adsorbed factors are transplanted to various anatomical sites to induce angiogenesis and blood vessels in the target area. Demonstrates the practical use of growth factor-adsorbing implants to stimulate bed growth. Cola The transplantation effect and results of ECGF immobilized on the Gengen sponge (arrows indicate the sponge )It is shown.

Ａ０首、　２週間、ＥＣＧＦなし、 ８０首、　２週間、ＥＣＧＦあり、 Ｃ，ＩＰ、２週間、ＥＣＧＦなし、 Ｄ、ＩＰ、２週間、ＥＣＧＦあり、 Ｅ、ＩＰ、２週間、部位指定ＥＣＧＦ、Ｆ、ＩＰ、２週間、網内のＥＣＣ；Ｆ移 植。A0 neck, 2 weeks, no ECGF, 80 necks, 2 weeks, with ECGF, C, IP, 2 weeks, no ECGF; D, IP, 2 weeks, with ECGF, E, IP, 2 weeks, site-specific ECGF, F, IP, 2 weeks, ECC within the network; F transfer Plant.

第３図は本発明の素子が自然に有意な血管形成を誘導することを示している。こ れらの移植物を組織学の一般的方法により実験の種々の時期に取り出しこれらの 動力学の顕微鏡的性質を測定した。以下の略号を使用する２８ｇは“スポンジ（ Ｃ−１）　”を表わしているｉｓｐは“肺臓”を表わしている：Ｌは１肝臓”を 表わしている；およびＢＶは“血管（大動脈）″を表わしている。FIG. 3 shows that the device of the invention spontaneously induces significant angiogenesis. child These implants were removed at different times of the experiment by standard methods of histology and these The microscopic properties of the dynamics were measured. 28g using the following abbreviations is “sponge ( C-1) isp stands for “lung”; L stands for “1 liver”. and BV stands for "blood vessel (aorta)".

スポンジのＨアンドＥ組織学的染色（ラット中のＩＰ）が示されている。H and E histological staining of sponge (IP in rat) is shown.

Ａ、　スポンジ−−２週間、Ｉ　ＰＳＥＣＧＦなし、Ｂ、　スポンジ−−１週間 、ＩＦＳＥＣＧＦあり、Ｃ，スポンジ−−２週間、Ｉ　ＰＳＥＣＧＦあり、Ｄ、 肺臓に接着したスポンジ、２週間、ＥＣＧＦあり；Ｅ、＊＊＊に接着したスポン ジ、２週間、ＥＣＧＦあり；および Ｆ、大動脈を包んだスポンジ、２週間、ＥＣＧＦあり。A. Sponge--2 weeks, I. No PSECGF, B. Sponge--1 week. , with IFSECGF, C, sponge--2 weeks, I with PSECGF, D, Sponge glued to lung, 2 weeks, with ECGF; E, Sponge glued to *** di, 2 weeks with ECGF; and F, sponge wrapped around the aorta, 2 weeks, with ECGF.

第４図はＥＣＧＦが第２図および第３図に示されている適当な細胞型の採用によ りそのままの状態で有意で安定な血管形成応答を誘導する。移植物は多種の器官 、血管、組織間の部位指定架橋を作るよう設定された。肝ＩＩ（左、Ｌ）および 膵臓（右、ｓｐ）間の成長因子（ＣＦ）を含む部位指定ゲルフオーム移植物（Ｓ ｇ）が示されている。Figure 4 shows that ECGF can be detected by employing the appropriate cell types shown in Figures 2 and 3. In situ induces a significant and stable angiogenic response. Transplants include many types of organs , were set up to create site-directed bridges between blood vessels and tissues. Liver II (left, L) and Site-directed gelfoam implant (S) containing growth factor (CF) between the pancreas (right, sp) g) is shown.

第５図は本発明の素子が本来の移植部位とは無関係に血管を形成していることを 示している。この素子は一般に哺乳類細胞に対する採用ベヒクルとして、または 移植細胞の生存および生理学的環境を維持するためのベヒクルとしての役割を果 す能力を有している。移植から４〜６週間後ＥＣＧＦを吸着したコラーゲンスポ ンジから回収した遺伝子操作ラット肝細胞を示すや肝細胞を取り出しそれらの生 存力を測定した。Figure 5 shows that the device of the present invention forms blood vessels regardless of the original implantation site. It shows. This device is commonly used as a recruitment vehicle for mammalian cells or Serves as a vehicle to maintain the survival and physiological environment of transplanted cells. have the ability to 4-6 weeks after transplantation Collagen sponge adsorbed with ECGF Genetically engineered rat hepatocytes recovered from a mouse. I measured my stamina.

第５Ａ図は成長因子なしでの結果を示している。第５Ａ図ではほとんどの細胞が 不健康に見え、かつ生残細胞の増殖もないことに注意すべきである。第５Ｂ図は 成長因子を使用した結果を示している。第５Ｂ図では健康な生存細胞が有意な増 殖を伴っていることに注意すべきである。Figure 5A shows the results without growth factors. In Figure 5A, most of the cells It should be noted that it looks unhealthy and there is no proliferation of viable cells. Figure 5B is Results using growth factors are shown. Figure 5B shows a significant increase in healthy viable cells. It should be noted that this is accompanied by reproduction.

本発明の素子および方法は単一または別の組織上の１つ以上の部位からの血管形 成を提供し得る。動脈など１つの組織の単一部位からの血管の発達は移植し得る 、または人工器官として使用し得る血管を提供する。同じまたは異なる組織に存 在する２つ以上の部位間の血管の発達はその部位間の循環を改善する。Devices and methods of the invention can be used to generate blood vessel shapes from one or more sites on a single or separate tissue. can provide Development of blood vessels from a single site in one tissue, such as an artery, can be transplanted , or to provide a blood vessel that can be used as a prosthesis. in the same or different organizations The development of blood vessels between two or more existing sites improves circulation between those sites.

第６図は本発明の素子および方法で発達した血管構造の断面図を示している。こ の図は本発明によって発達した血管が単に無差別な方向に成長する血管の束では ないことを示している。血管ｌは内皮細胞２、壁細胞３、ペリサイト４、平滑筋 細胞５、フィブロブラスト６および神経様細胞７を含んでいる。血管１の断面は 毛細血管様構造８、動脈９、および静脈様構造１０の形成を示している。この完 全な血管構造の発達は生体中に永久に保持され、かつこの生体内に移植可能な堅 固とした血管を提供する。FIG. 6 shows a cross-sectional view of a vascular structure developed with the devices and methods of the present invention. child The figure shows that the blood vessels developed by the present invention are not simply bundles of blood vessels that grow in random directions. It shows that there is no. Blood vessel l has 2 endothelial cells, 3 parietal cells, 4 pericytes, and smooth muscle. It contains 5 cells, 6 fibroblasts, and 7 neuron-like cells. The cross section of blood vessel 1 is The formation of capillary-like structures 8, arteries 9, and vein-like structures 10 is shown. This completion The development of the entire vascular structure is maintained permanently in the body, and this implantable rigidity Provides solid blood vessels.

本発明の方法はまず組織からの血管の成長と、発達を行うことにより人工器官を 提供する。それから発達した血管に選択した組織または器官に由来する細胞を注 入または接種する。血管に接種される前、注入された細胞は遺伝子的に修正し得 る。接種した細胞は望ましい代謝効果を提供し得る。これらの代謝効果にはビリ ルビン代謝などの肝機能およびインシュリン生産などの肺臓機能が含まれる。そ の他の代謝機能は１つ以上のホルモン生産遺伝子を含む細胞により提供され得る 。本発明により発達した人工器官は生体の免疫系に応答することなく望ましい機 能を提供し得る。The method of the present invention first grows and develops blood vessels from tissue to create a prosthesis. provide. Cells derived from the selected tissue or organ are then injected into the developed blood vessels. or inoculate. Before being inoculated into blood vessels, the injected cells can be genetically modified. Ru. The inoculated cells can provide the desired metabolic effect. These metabolic effects are surprising. These include liver functions such as rubin metabolism and lung functions such as insulin production. So Other metabolic functions may be provided by cells containing one or more hormone-producing genes. . The prosthetic device developed according to the present invention does not respond to the body's immune system and provides desired functionality. ability.

実施例１ 実施例１は本発明の素子または組成物の種々の！Ｓ様および該素子の生成法につ いて示している。この実施例では放射性ヨウ素マーカーを含むＨＢＧＦ−１を使 用している。治療的用途には放射能マーカーは使用しない。実施例１を以下に示 す。Example 1 Example 1 shows various examples of elements or compositions of the present invention. Mr. S and the production method of this element It shows. In this example, HBGF-1 containing a radioactive iodine marker was used. I am using it. Radioactive markers are not used for therapeutic use. Example 1 is shown below. vinegar.

ゼラチン−セファロースおよびコラーゲン■型−セファロースの（”’Ｉ）−Ｈ ＢＧＦ−１吸着能を試験した。第１ｃ図および第１Ｇ図は（”５Ｉ）−ＨＢＧＦ −１（７）大部分または約８０パーセントが固定化したゼラチンおよびコラーゲ ン■型に結合し、また１、　５　Ｍ　ＮａＣｊで溶出し得ることを示している。Gelatin-Sepharose and Collagen type ■-Sepharose (''I)-H BGF-1 adsorption capacity was tested. Figures 1c and 1G are ("5I)-HBGF -1(7) Mostly or about 80 percent immobilized gelatin and collagen It is shown that the compound binds in the form of 1, and can be eluted with 1,5 M NaCj.

また吸着した（”’Ｉ）　−ＨＢＧＦ−１は０．５　Ｍ　ＮａＣｊでも溶出し得 る（データ示さず）、９０℃１分間での（”’Ｉ）−ＨＢＧＦ−１（７）変性は ＨＢＧＦ−１ポリペプチド構造内の結合ドメインの不活性化により固定化したゼ ラチンおよびコラーゲン■型へのポリペプチドの結合能を有意に減少させる。Adsorbed (''I)-HBGF-1 could also be eluted with 0.5 M NaCj. (data not shown), denaturation of (''I)-HBGF-1(7) at 90°C for 1 min was Immobilized enzymes by inactivation of the binding domain within the HBGF-1 polypeptide structure Significantly reduces the binding ability of the polypeptide to latin and collagen type II.

固定化したゼラチンおよびコラーゲン■型に吸着した（Ｉｔｓ　Ｉ　）−ＨＢＧ Ｆ−１は第１Ａ図および第１Ｅ図に示されているようにヘパリンでも溶出し得る 。ヘパリン溶出後結合したまま残存しているおよそ２０％の成長因子は１．５Ｍ ＮａＣｊ！で溶出し得る。(Its I)-HBG adsorbed on immobilized gelatin and collagen type II F-1 can also be eluted with heparin as shown in Figures 1A and 1E. . Approximately 20% of the growth factor remaining bound after heparin elution is 1.5 M NaCj! It can be eluted with

ゼラチンおよびコラーゲン■型マトリクスの５０ユニツトのヘパリンによる前処 理は第１Ｂ図および第１Ｆ図で示されているように（”’Ｉ）−ＨＢＧＦ−１を 吸着する各マトリクスの能力を有意に減少する。各マトリクスの１．５ＭＮａＣ ｊ！洗浄による再生で（＋、ｚｓ■）−ＨＢＧＦ　　１の吸着が可能となる。Pretreatment of gelatin and collagen type matrix with 50 units of heparin The principle is as shown in Figures 1B and 1F, (''I)-HBGF-1. Significantly reduces the ability of each matrix to adsorb. 1.5M NaC for each matrix j! Regeneration by washing makes it possible to adsorb (+, zs■)-HBGF 1.

第１Ｄ図および第１Ｈ図に示されているようにミリリフドル当り１園ｇのウシ血 清アルブミンおよびミリリフドル当りＩＩｍｇのヒトフィブロネクチンは各マト リクスに吸着した（”り−ＨＢＧＦ−１を有意に溶出しない。1 g of bovine blood per milliliter as shown in Figures 1D and 1H. Clear albumin and II mg of human fibronectin per milliliter were added to each tomato. It does not significantly elute HBGF-1 adsorbed to the liquid.

実施例２ 実施例２は本発明の素子の移植法および血管形成の誘導法を示している。ＨＢＧ Ｆ−１を含む固定化ゼラチンの使用は本方法の好ましい態様を示している。実施 例２を以下に示す。Example 2 Example 2 shows a method for implanting the device of the invention and inducing angiogenesis. HBG The use of immobilized gelatin containing F-1 represents a preferred embodiment of the method. implementation Example 2 is shown below.

実施例２はＨＢＧＦ−Ｉが固定化したゼラチンおよびコラーゲン■型の両方に結 合することを示している。ゼラチンスポンジに吸着したＨＢＧＦ−Ｉはインビト ロでの内皮細胞マイトジェンとしての成長因子活性と一致する成長因子濃度でう ７）における血管形成を促進する。この濃度は当分野でインビトロで使用される 濃度より約１０−”倍と低い。Example 2 shows that HBGF-I binds to both immobilized gelatin and type II collagen. It shows that it matches. HBGF-I adsorbed on gelatin sponge is in vitro. Growth factor concentrations consistent with growth factor activity as an endothelial cell mitogen in 7) Promote blood vessel formation. This concentration is used in vitro in the art. The concentration is approximately 10-” lower than the concentration.

２５０グラムの麻酔化雄ラットの腹部を２０パーセント（Ｖ／Ｗ）エタノールで 洗浄し、ついでその腹腔壁を切り開いて腹腔を露出させた。アフブジョン製（カ ラマズー、ミシガン）のゲルフオームを約５　ｘ　２０ｃ■の片に切った。この スポンジを腹部大動脈の末梢領域にｎ−ブチルシアノアクリレートで固定した。The abdomen of a 250 g anesthetized male rat was injected with 20% (V/W) ethanol. The peritoneal cavity was washed and then the abdominal wall was cut open to expose the peritoneal cavity. Manufactured by Afbujohn (ka (Lamazoo, Michigan) gel foam was cut into approximately 5 x 20 cm pieces. this The sponge was fixed in the distal region of the abdominal aorta with n-butyl cyanoacrylate.

フリーの端を別の組織に固定すると橋が出来る。これらの実施例を提供するため に行った実験において、以下の組織が実験にこの素子により接触させられた。こ れらの組織は肝臓、腎臓、および＊ｍを含む器官、腹腔および大小の血管である 。外科切開はステラプレから１週間後に開らかれた。このコラーゲンスポンジを 外科的の摘出し、血管形成について調べるとともに組織学的試験のための準備を 行った。Fixing the free end to another tissue creates a bridge. To provide examples of these In experiments conducted in 1995, the following tissues were brought into contact with this device in experiments: child These tissues are the liver, kidneys, and other organs including the abdominal cavity and large and small blood vessels. . A surgical incision was opened 1 week after Stelapre. This collagen sponge Surgical extraction, examination of angiogenesis and preparation for histological examination went.

ＨＢＧＦ−１は固定化したゼラチンおよびコラーゲン■型に結合し、それゆえＨ ＢＧＦ−１が吸着した商標“ゲルフオーム”で市販されているゼラチンスポンジ を本来の場所に血管を形成する方法として使用し得るという可能性が評価された ことが知られている。ラットに外科手術を行ないＨＢＧＦ−１で処理したゼラチ ンスポンジを移植した。　ＨＢＧＦ−１１１着ゲルフオームをラットの首および 腹腔に独立して置いた。−ａｔ当りＨＢＧＦ−１１Ｅｇを用いた外科手術から１ 週間後有意な血管形成応答が観察された（第２図）、移植の組織部位から移動し た血管がゼラチンスポンジ内に観察された。ＨＢＧＦ−１を含まないコントロー ルスポンジおよび）ＩＢＣＦ−１およびヘパリンを吸着させたスポンジはインビ ボで１週間後血管形成は誘導しなかった。後者は固定化したゼラチンおよびコラ ーゲン■型へのＨＢＧＦ−１吸着を妨げるヘパリン能と一致する０種々の濃度の ＨＢＧＦ−１を用いた滴定曲線をこの操作を用いて作った。また第１図と同じ結 果がスポンジが１３当り１〜１０ｎｇのＨＢＧＦ−１の範囲で観測された（デー タ示さず）、１週間後取り出したスポンジの組織学的試験（第３図）はスポンジ 内の新しい血管形成を明らかにした。HBGF-1 binds to immobilized gelatin and collagen type II, and therefore H Gelatin sponge sold under the trademark “Gelfoam” with BGF-1 adsorbed The possibility of using this method as a method to form blood vessels in situ was evaluated. It is known. Gelatin treated with HBGF-1 after surgery on rats transplanted sponge. HBGF-111 gel foam was applied to the rat neck and It was placed independently in the abdominal cavity. -1 from surgery using HBGF-11Eg per at After a week, a significant angiogenic response was observed (Figure 2), which caused the tissue to migrate away from the site of implantation. Blood vessels were observed within the gelatin sponge. Control without HBGF-1 sponge and) sponge adsorbed with IBCF-1 and heparin were used in vitro. No angiogenesis was induced after 1 week in mice. The latter consists of immobilized gelatin and collagen. 0 various concentrations consistent with the ability of heparin to prevent HBGF-1 adsorption to A titration curve with HBGF-1 was generated using this procedure. Also, the same result as in Figure 1 HBGF-1 was observed in the range of 1 to 10 ng per 13 sponges (data The histological examination of the sponge removed after one week (Fig. 3) shows that the sponge revealed new blood vessel formation within.

ＨＢＧＦ−１吸着ゲルフオーム単独でもセローサ（ｓｅｒｏｓａ）からの血管形 成の有効なインジューサーであるので固定化ＨＢＧＦ−１吸着移植体の腹腔内皿 管形成プロセスの誘導および維持能力を評価した。別個の外科移植体をゲルフオ ーム片としてラットの腹部大動脈に固定し、他端を腎臓、膵臓、肝臓または腹部 壁に結合して橋を作った（第４図）、インビボで２週間後、この移植物の血管形 成の程度を調べた。肝臓および大動脈からＨＢＧＦ−１吸着ゼラチンスポンジを 沿って両方向に新しい血管が形成しているのが観察された。同様の両方向の結果 は大動脈から各腎臓、膵臓または腹腔壁にかけて固定した移植物についても観察 された（データ示さず）これらの移植体の組織学的試験は第３図で観察されたも のと同一の結果となった。Even with HBGF-1-adsorbed gel foam alone, blood vessel formation from serosa Intraperitoneal dishes of immobilized HBGF-1 adsorbed implants are effective inducers of The ability to induce and maintain the tube formation process was evaluated. Separate surgical implants The other end is attached to the abdominal aorta of the rat as a piece of tissue, and the other end is attached to the kidney, pancreas, liver or abdomen. After 2 weeks in vivo, the vascular shape of this implant was attached to the wall to create a bridge (Figure 4). The degree of development was investigated. Remove HBGF-1 adsorbed gelatin sponge from liver and aorta. New blood vessels were observed to form in both directions along the line. Similar results in both directions Also observed for grafts fixed from the aorta to each kidney, pancreas, or abdominal wall. Histological examination of these grafts (data not shown) was similar to that observed in Figure 3. The result was the same as that of

また腹腔内に誘導された血管形成はＨＢ　Ｇ　Ｆ　−、１吸着ゲルフオームと同 時に移植された遺伝子操作ラット肝細胞株の増殖能を維持させることが示された （第５図）、肝細胞をゲルフオームスポンジ上高密度（１０６個）に増殖した。In addition, the angiogenesis induced in the peritoneal cavity is the same as that of HBGF-,1-adsorbed gel foam. was shown to maintain the proliferative ability of a transplanted genetically engineered rat liver cell line. (Fig. 5), hepatocytes were grown to a high density (10 6 cells) on a gel foam sponge.

外科的移植の前、スポンジｓｕｉ”当り１０ｎｇのＨＢＧＦ−１を添加した。コ ントロールスポンジはＨＢＧＦ−１を吸着させていない、別個の外科的移植体を 肝臓と肺臓の間の橋のように固定し、その状態のまま４〜６週間保持した。この 時点で移植体を取り出し、トリプシンまたはコラーゲネースで消化して組織培養 物中に維持されていた移植細胞を回収した。ＨＢＧＦ−１吸着ゲルフオームスポ ンジから回収した細胞は遺伝的素因を反映する淘汰圧下インビトロで増殖可能で あった（第５Ｂ図）、一方コントロールゲルスポンジから回収された細胞は増殖 能の損失を示した（第５Ａ図）、細胞を含むスポンジの組織学的試験はＨＢＧＦ −１も第３図および第４図と同じ応答を誘導することを明らかにした。Before surgical implantation, 10 ng of HBGF-1 per sponge was added. The Control Sponge is a separate surgical implant that does not have HBGF-1 adsorbed. It was fixed like a bridge between the liver and lungs and kept in that position for 4-6 weeks. this At time points, explants were removed, digested with trypsin or collagenase, and cultured in tissue. The transplanted cells maintained in the cells were collected. HBGF-1 adsorption gel foam Cells harvested from plants can be grown in vitro under selection pressure that reflects genetic predisposition. (Figure 5B), whereas cells recovered from the control gel sponge did not proliferate. Histological examination of sponges containing cells showed a loss of HBGF activity (Figure 5A). -1 was also found to induce the same response as in Figures 3 and 4.

本発明の素子および方法に従い、第２図〜第５図に示されているように種々の組 織で血管形成が行われた。同様に以下に示す部位間でも血管形成を行った（デー タ示さず）；肝臓と肺臓、肝臓と腎臓、肺臓と腎臓、肝臓と大動脈、肝臓と静脈 、肺臓と綱腎臓と大動脈、腎臓と静脈、腎臓と網、網と大動脈および網と静脈。In accordance with the devices and methods of the present invention, various combinations as shown in FIGS. Angioplasty was performed in the tissue. Similarly, angiogenesis was performed between the following sites (data (not shown); liver and lungs, liver and kidneys, lungs and kidneys, liver and aorta, liver and veins , lung and cord kidney and aorta, kidney and vein, kidney and omentum, omentum and aorta and omentum and vein.

実施例３および比較実施例Ａ 実施例３は非吸収性支持体を存する本発明の素子を示している。Example 3 and Comparative Example A Example 3 shows a device of the invention with a non-absorbent support.

本実施例を導くために行った実験はＩ型または■型のコラーゲンを使用し、ラッ トの肝臓または１１１ｐＩｉ１ｉへの移植で示されている。The experiments conducted to derive this example used type I or type II collagen, and Transplantation into human liver or 111pIi1i.

比較実施例ＡはＨＢＧＦＬｌを含まない実施例３の同物質および操作の使用は血 管形成を誘導しないことを示している。Comparative Example A uses the same material and procedure of Example 3 without HBGFLl. This shows that it does not induce tube formation.

ＨＢＧＦ−１吸着コラーゲンコート化（Ｉ型または■型）膨張ＰＴＦＥファイバ ーを外科的にラットの腹腔（肝臓または肺臓上）に移植した。ＨＢＧＦ−１によ り有意な血管形成応答が誘導され、術後４週目の結果を第７図に示す。移植の組 織部位から移動した血管が移植ファイバー内およびその回りに観察された。肝臓 に結合するファイバー移植物の先には肝臓からその移植物の内部への実質的血管 成長が示された（第７図）、さらに試験によりファイバー移植物の後部（特定の 器官に結合している）またはその移植物に隣接する領域は一般に腸ループのまわ りの隔膜組織に結合する血管“ストリングを含んでいた（第８図）、また別個の ＨＢＧＦ−１処理フアイバーを各器官に移植することにより肝臓および肺臓間の 長寿命両方向血管形成を誘導および維持し得る。HBGF-1 adsorbed collagen coated (type I or type ■) expanded PTFE fiber was surgically implanted into the abdominal cavity (over the liver or lungs) of rats. By HBGF-1 A significant angiogenic response was induced, and the results 4 weeks after the surgery are shown in FIG. transplant group Blood vessels migrating from the tissue site were observed within and around the grafted fibers. liver At the end of the fiber graft, which connects to Growth was demonstrated (Figure 7), and further examination revealed that the posterior part of the fiber implant (particular The area adjacent to the organ (attached to the organ) or its implant is generally around the intestinal loop. It contained a string of blood vessels attached to the septum tissue (Figure 8), and also contained a separate string of blood vessels. By implanting HBGF-1-treated fibers into each organ, the Long-lived bidirectional angiogenesis can be induced and maintained.

ＨＢＧＦ−１吸着移植物の腹膜内皿管構造維持能力はこれらの高度な血管架橋に より証明された。比較実施例Ａのコントロールフアイバーは外科移植から６力月 後でさえ血管形成は誘導されなかった。種々の濃度のＨＢ　Ｇ　Ｆ　−１による 滴定はこの操作を用いて行った。ファイバー表面積１８当り１〜１００ｎＨの濃 度のＩＩＢＧＦ−１について同じ結果が得られた。ファイバー移植モデルにおい て血管形成応答を誘導するのに必要なＨＢＧＦ−１の濃度はゲルフオーム移植モ デルとインビトロでのポリペプチドのマイトジェン活性を用いて得られた結果と 一致する。The ability of HBGF-1-adsorbed implants to maintain intraperitoneal dish structure may be due to these advanced vascular bridges. more proven. The control fiber of Comparative Example A was 6 months old after surgical implantation. Even after that no angiogenesis was induced. With various concentrations of HB G F-1 Titration was performed using this procedure. Concentration of 1 to 100 nH per 18 fiber surface areas The same results were obtained for degree IIBGF-1. Fiber implantation model odor The concentration of HBGF-1 required to induce an angiogenic response is determined by the gelform implantation model. Results obtained using the mitogenic activity of polypeptides in vitro with Match.

実施例４ 実施例４は実施例３で生成した血管が血管形成ネットワークを含む大規模にｍｍ 化された固体マトリクスを形成していることを示している。Example 4 Example 4 shows that the blood vessels generated in Example 3 are large-scale mm containing an angiogenic network. This indicates that a solid matrix is formed.

ラットの肺臓へのＨＢＧＦ−１処理移植体の外科移植から２力月後、より低い膨 大動脈に置いたカテーテルを用いて腹部器官にホルマリンを散布し固定した。つ づいて、この腹部器官に商標ミクロフィルで市販されている放射能不透過性シリ コンラバーを散布し、つづいてソフトＸ線解析にかけたく強度２７ＫＶ）、ファ イバー移植物および腸間膜血管の間の多重血管結合が新しい血管形成に典型的な 移植体内の血管ターボシティ−とともに観察された（第９図）、この移植体自体 の組織学的試験は種々の細胞型に分校された血管形成のネットワークを含む大規 模に組織化された固体マトリクスを示してた。このことは以来に得られた短期間 のＨＢＣ；Ｆ−１処理ゲルフオ一ム移植体モデルの結果と一致している。第１０ 図に示されている長期ファイバー移植体のＸ線分析はファイバーネットワーク内 の血管形成が主に豊富な血管組織の橋（゛ストリング）を介して宿主の血管樹と 統合していることを確認した（第７図および第８図）、典型的な血管結合の長さ 方向断面の組織学的試験は血管構造の厚いコラーゲン性および筋肉性特表平３− ５０３１６７　（９） の壁に囲まれている多重血管ルミナの存在を明らかにした（第１１図）、さらに これらの血管結合の断面分析は豊富な内皮細胞により囲まれている中央部分の大 きな血管ルミナを囲む上皮性中杯葉細胞の単層および多重層の平滑筋細胞の存在 を関係づけ熟し高度に分化した動脈を示した。静脈ルミナは見に＜＜、部分的に つぶれたスリットとして存在する。末梢には多くの毛細血管があり、全血管の束 は連続する繊維細胞カプセルで囲まれている（第６図）、さらにより高い倍率の 試験は血管構造のより豊富なコラーゲン成分と豊富な内皮細胞系毛細管構造を明 らかにした（第１２図）。アステリスクでマークした２つの明瞭で突き出ている が丸い構造の存在も観測できる。これらの構造は神経様構造の組織学的特性を示 している。集約するとこれらの構造はＩ（ＢＧＦ−１はセローサの鱗状上皮性中 杯葉細胞およびチュニカアベンチタ（ｔｕｎｉｃａ　ａｄｖｅｎｔｉｔａ）の中 心部細胞にシグナルを与え血管形成を開始し得る。中杯葉および神経外杯葉由来 の細胞の出現はＨＢＧＦ−１が上皮細胞、フィブロプラスト、平滑筋細胞、中杯 葉細胞、内皮細胞、星状細胞および乏技神経膠に対するインビトロでのマイトジ ェンとして作用し得ることと一致している。また神経様構造の存在はニューライ ト伸張およびインビトロにおけるＰＣ１２細胞の生存を誘導する神経成長因子（ Ｎ　ＣＦ）様生物学的活性とも一致している。Two months after surgical implantation of HBGF-1-treated grafts into the lungs of rats, lower inflation was observed. The abdominal organs were sprayed with formalin and fixed using a catheter placed in the aorta. One This abdominal organ was then treated with a radiopaque silicone commercially available under the trademark Microfil. Spray Conrubber and then apply it to soft X-ray analysis (intensity 27KV). Multiple vessel connections between liver grafts and mesenteric vessels are typical of new vessel formation. The graft itself was observed with vascular turbocity within the graft (Figure 9). Histological examination of large scale cells containing angiogenic networks divided into various cell types It showed a solid matrix with a pattern of organization. This has been achieved for a short period of time since HBC; F-1 treated gel film graft model. 10th X-ray analysis of the long-term fiber implant shown in the fiber network Angiogenesis mainly connects to the host vascular tree through bridges (strings) of rich vascular tissue. Typical length of vascular connections confirmed to be integrated (Figures 7 and 8) Histological examination of directional cross-sections reveals the thick collagenous and muscular characteristics of the vascular structure. 503167 (9) We revealed the existence of multiple blood vessel lumina surrounded by a wall (Fig. 11). Cross-sectional analysis of these vascular connections reveals a large central portion surrounded by abundant endothelial cells. Presence of single and multilayered smooth muscle cells of epithelial middle goblet cells surrounding large vascular lumina The associated arteries showed mature and highly differentiated arteries. Vein lumina is visible <<, partially It exists as a crushed slit. There are many capillaries in the periphery, and a bundle of all blood vessels is surrounded by a continuous fibrous cell capsule (Fig. 6), and at higher magnification The test reveals a more abundant collagen component of the vascular structure and an abundant endothelial cell-based capillary structure. (Figure 12). Two distinct and prominent marks marked with asterisks The presence of a round structure can also be observed. These structures exhibit histological properties of nerve-like structures. are doing. Collectively, these structures are I (BGF-1 is found in the squamous epithelium of Serosa Inside goblet cells and tunica adventita It can signal cardiac cells to initiate angiogenesis. Derived from middle and outer calyx lobes The appearance of HBGF-1 on epithelial cells, fibroplasts, smooth muscle cells, and middle goblet cells In vitro mitosis on leaf cells, endothelial cells, astrocytes and gliomas. This is consistent with the fact that it can act as an agent. In addition, the presence of nerve-like structures indicates that neural Nerve growth factor ( It is also consistent with NCF)-like biological activity.

実施例５および比較実施例Ｂ 実施例５は実施例４の成熟筋肉血管形成ネ７）ワークを含み、かつ宿主の血管樹 と接触する大規模に組織化した固体マトリクスの存在が選択的細胞増殖を可能に していることを示している。Example 5 and Comparative Example B Example 5 includes the mature muscle angiogenic network of Example 4 and the host vascular tree. The presence of a massively organized solid matrix in contact with allows selective cell proliferation It shows that you are doing it.

比較実施例ＢはＨＢＧＦ−１を含まない実施例５の同物質および操作の使用が選 択的細胞移植を維持できないことを示した。Comparative Example B was selected to use the same materials and procedures of Example 5 without HBGF-1. showed that selective cell transplantation could not be maintained.

ホモ接合ガンラットはビリルビンに対するＵＤＰ−グルカロノシルトランスフエ ラーゼを欠き効果的にビリルビンを分泌し得ない、この理由でガンラットは長寿 命非溶血性非結合遇ビリルビン血症を示す０本システムの遺伝治療能を試すため 、有性生殖性ウィスター（ＲＨＡ）ラットのコラーゲネース散布により肝細胞を 収穫した。ウィスターラフトは正常なビリルビン結合部位を含むこと以外はガン ラフ）と遺伝的に等しい。Homozygous gun rats undergo UDP-glucaronosyl transfer to bilirubin. Gun rats lack bilirubin and cannot effectively secrete bilirubin, which is why they have a long lifespan. To test the gene therapy ability of this system for non-hemolytic non-binding bilirubinemia. , hepatocytes were stimulated by collagenase spraying in sexually reproductive Wistar (RHA) rats. Harvested. Wistarrafts are cancerous cells except that they contain normal bilirubin binding sites. genetically equivalent to Rough).

実施例５においてはＨＢ　Ｇ　Ｆ　−１吸着コラーゲン（■型）コート化ＰＴＦ Ｅファイバーを肝臓の隣りに移植し、１０〜１４日後その腹腔の外科的切開によ り肝臓から突き出ていてファイバーの束の中に張り出している血管形成（第７図 ）および腸ループを多くの血管架橋を結合する血管形成が明らかになった。有性 生殖ウィスター（ＲＨＡ）ラットから収穫した一次肝細胞を血管形成したファイ バーのファイバーネットワーク中に注入した。直ちに血清ビリルビンレベルは減 少し始め、肝細胞注入から１０日後、血清ビリルビンレベルが５０％減少した。In Example 5, HB G F-1 adsorbed collagen (■ type) coated PTF The E-fiber is implanted next to the liver and removed 10-14 days later through a surgical incision in the abdominal cavity. Angioplasties protrude from the liver and protrude into bundles of fibers (Figure 7). ) and angiogenesis connecting intestinal loops with many vascular bridges was revealed. sexual Primary hepatocytes harvested from reproductive Wistar (RHA) rats were vascularized with fibers. injected into the fiber network of the bar. Serum bilirubin levels immediately decrease. Initially, 10 days after hepatocyte injection, serum bilirubin levels decreased by 50%.

６０パ一セント以上までの段階的減少が第１３Ａ図に示されているように実験期 間（６０日間）に渡って観察された。実験により血清ビリルビンの減少したレベ ルは少なくとも１８１日間維持されていることを示し、またこれらの長期移植物 の組織的試験で生肝細胞が含まれていることが示された。これらのデータはイン ビボにおいてＨＢＧＦ−１フアイバー移植モデルは分化した生理学的機能を発現 し得る細胞の部位指定導入を可能にする容器として機能することを示している。A gradual decrease of 60% or more occurred during the experimental period as shown in Figure 13A. It was observed over a period of 60 days. Experiments showed decreased levels of serum bilirubin. showed that these long-term implants were maintained for at least 181 days. Histological examination showed that it contained live hepatocytes. These data are HBGF-1 fiber implantation model expresses differentiated physiological functions in vivo It has been shown that the cell functions as a container that allows for the site-directed introduction of cells.

比較実施例Ｂにおいては、肝細胞をコラーゲン（■型）コート化ＰＴＦＥファイ バーに接種した。このファイバーには吸着した）ＩＢＧＦ−１は含まれず、右肝 葉に外科的に移植された。血清ビリルビンレベルはおよそ５０パーセント減少し た。これにつづいて元のビリルビンレベルへの急激な復帰があった。第１３Ｂ図 は実験期間（６０日間）中血清ビリルビンレベルが一定に維持されていたことを 示している。２０日後の組織学的な本移植物の試験はファイバー移植物内の毒性 様酸の蓄積レベルが移植肝細胞の最終的死滅に導くことを示した。In Comparative Example B, hepatocytes were coated with collagen (type ■) PTFE fiber. The bar was inoculated. This fiber does not contain IBGF-1 (adsorbed), and the right liver The leaves were surgically transplanted. Serum bilirubin levels are reduced by approximately 50% Ta. This was followed by a rapid return to the original bilirubin level. Figure 13B showed that the serum bilirubin level remained constant during the experimental period (60 days). It shows. Examination of the implant histologically after 20 days indicates toxicity within the fiber implant. showed that accumulated levels of similar acids lead to eventual death of transplanted hepatocytes.

実施例５の長期ＨＢＧＦ−１ファイバー移植モデルはう、トにうまく移植したと き顕著な向血管性および向神経性の応答を誘導する。実施例５は非常に洗練され たかつ多様な哺乳類細胞型をインビボで誘導し、かつ維持するＨＢＧＦ−１の能 力を示している。The long-term HBGF-1 fiber transplantation model of Example 5 was successfully transplanted. induces significant vasculotropic and neurotropic responses. Example 5 is very sophisticated Ability of HBGF-1 to induce and maintain strong and diverse mammalian cell types in vivo It shows power.

細胞外マトリクス成分および分化特異的遺伝子調節の間の関係は遺伝子工学的治 療にとって重要な情報を提供し得る０本発明はまた成人における神経および血管 形成の発達の際の成長および分化シグナルの時間的および空間的発現を理解する 能力を有する部位特異的でトランスジェニフクな代替物として有用であることが 分った。The relationship between extracellular matrix components and differentiation-specific gene regulation has The present invention also provides important information for the treatment of nerves and blood vessels in adults. Understanding the temporal and spatial expression of growth and differentiation signals during formation development may be useful as a site-specific, transgenic alternative with I understand.

実施例６ 実施例６は遺伝子工学細胞を本発明の素子に接種した場合の該血管形成素子を示 している。実施例６は以下のように行った。Example 6 Example 6 shows the angiogenic element of the present invention when genetically engineered cells are inoculated into the element. are doing. Example 6 was carried out as follows.

Ａ、う７）成長ホルモンを作るために内皮細胞を遺伝子工学的に作るのに用いら れたｐＧ２Ｎレトロウィルスベクターの構築はＳＶ４０プロモーターによるネオ マイシン耐性遺伝子およびラット成長ホルモンのｃＤＮＡを用いて行った。A.7) Used to genetically engineer endothelial cells to produce growth hormone. The construction of the pG2N retroviral vector was carried out using the SV40 promoter. This was performed using the mycin resistance gene and rat growth hormone cDNA.

これらをＮＩＨの分子血液学研究室から提供されるｐＢ２レトロウィルスベクタ ーに入れた。成長ホルモンｃＤＮＡはＮａｔｕｒｅ２７０　　（１９７７）：４ ９４に従うプラスミドＲＧＨ−１をベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ社 から市販されている制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌおよびＭ　ａ　ｌ　ＩＩで 消化することにより入手した。このラット成長ホルモンＣＤＮＡをアガロースゲ ルから電気泳動的に単離し、ついで商標（ゼネクリーン、バイオ社、１０１、ラ ジッラカリホルニア）で市販されているガラスピーズに対する結合／溶出で精製 した。この成長ホルモンｃＤＮＡをニューイングランドバイオラボ社から市販さ れているＤＮＡポリメラーゼクレノーラージフラグメントおよびヌクレオチド三 リン酸を業者の推薦する方法で平滑化した。さらにこのフラグメントをゼネクリ ーン製品で精製した。These are the pB2 retrovirus vectors provided by the NIH Molecular Hematology Laboratory. - I put it in. Growth hormone cDNA Nature 270 (1977): 4 Plasmid RGH-1 according to 94 was purchased from Boehringer Mannheim Biochemicals. with the restriction endonucleases Xhol and Mal II commercially available from Obtained by digestion. This rat growth hormone CDNA was converted into agarose gel. electrophoretically isolated from the sample (Geneclean, Bio Inc., 101, Purification by binding/elution on commercially available glass beads did. This growth hormone cDNA is commercially available from New England Biolabs. DNA polymerase Klenolarge fragment and nucleotide trinucleotides The phosphoric acid was smoothed using the method recommended by the manufacturer. Additionally, generalize this fragment. Purified with a commercially available product.

Ｍ、　Ａ、エグリチス（Ｅｇｌｉｔｉｓ）等（Ｓｃｉｅｎｃｅ　、　　２３０　 （１９８５）１３９５）およびり、アルメンタノ　（Ａｒａ＋ｅｎｔａｎｏ）等 （Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。M. A. Eglitis et al. (Science, 230) (1985) 1395) Andori, Armentano (Ara+entano) et al. (J, Virol.

立上（１９８７）１６４７）に示されているＮ２中のＮｅｏ”遺伝子を多重クロ ーニング部位で置換えるためＢ２ベクターを構築した。まずＮ２をＥｃｏＲＩで 消化し隣接するＭ　ｏ　Ｍ　Ｌ　Ｖ配列をもつ５′側および３′側ＬＴＲを放出 させた。３′側ＬＴＲフラグメントをプロメガバイオチク社のプラスミドＧＥＭ ４のＥｃｏＲＩ部位にライゲーションした。隣接するｇａｇ配列を含む５′側Ｌ ＴＲフラグメントをＣ１ａ　Ｉで消化し、Ｈｉｎｄ　ｍリンカ−を付加した後こ のフラグメントをｐＧＥＭ４のＨｉｎｄ　Ｄ１部位に挿入した。The “Neo” gene in N2 was multiple cloned as shown in Ritakagi (1987) 1647). A B2 vector was constructed to replace this site. First, N2 with EcoRI Digest and release 5′ and 3′ LTRs with adjacent M　M　V　V sequences I let it happen. The 3′ LTR fragment was converted into plasmid GEM from Promega Biotic. It was ligated into the EcoRI site of 4. 5′ side L containing adjacent gag sequences After digesting the TR fragment with C1aI and adding a Hindm linker, this The fragment was inserted into the HindD1 site of pGEM4.

ｐＢ２ベクターをニューイングランドバイオラプス社の制限エンドヌクレアーゼ Ｈｉｎｄ　Ｉ［［で消化し、ついでベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ社 のウシアルカリホスファターゼを用いてリン酸化した。ｐＢ２プラスミドをゼネ クリーン製品で精製した。ついでｐＢ２プラスミドおよびラット成長ホルモンｃ ＤＮＡをニューイングランドバイオラプス社のＴ４リガーゼを用いてライゲーシ ョンした後、ｐＧ２をニューイングランドバイオラプス社のＢａｍＨＩで消化し 、ゼネクリーンバイ第１０１製品で精製してからクレノーフラグメントで平滑末 端化した。The pB2 vector was digested with New England Biolapse restriction endonuclease. Digested with Hind I [[, then Boehringer Mannheim Biochemicals phosphorylated using bovine alkaline phosphatase. Generate pB2 plasmid Purified with clean products. Then pB2 plasmid and rat growth hormone c The DNA was ligated using T4 ligase from New England Biolapse. After digestion, pG2 was digested with BamHI from New England Biolapse. , purified with Geneclean Bai No. 101 product and smoothed with Klenow fragment. It became trivial.

３４０塩基対のＳＶ４０プロモーター・ネオマイシン耐性遺伝子フラグメントを ニューイングランドバイオラプス社のＰｖｕＩ［およびＨｉｎｄｌ［Ｉによる消 化によりｐＳＶ２ＣＡＴプラスミド（ＡＴＣＣ受理番号３７１５５）がら単離し た。このフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した後ゼネクリーン 製品で精製した。５Ｖ４０−ネオマイシン耐性フラグメントをニューイングラン ドバイオラプス社のＴ４リガーゼを用いｐＧ２とライゲーションした後業者の説 明に従がい（ＶＲＬ）Ｄ）（５ニング後、そのプラスミド構築物をｐ０２Ｎと命 名した。ＳＡＸベクターはＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｔ、　 ＵＳＡ８３　（１９８Ｂ　）６５６３に報告されている方法で得た。The 340 base pair SV40 promoter neomycin resistance gene fragment Determination by PvuI [and Hindl[I] from New England Biolapse The pSV2CAT plasmid (ATCC accession number 37155) was isolated by Ta. This fragment was isolated by agarose gel electrophoresis followed by Geneclean The product was purified. New 5V40-neomycin resistance fragment The manufacturer's theory is that after ligation with pG2 using T4 ligase from Dubai Oraps (VRL) D) (After 5 nins, designate the plasmid construct as p02N. I named it. SAX vectors are Proc, Natl, Acad, Sct, It was obtained by the method reported in USA 83 (198B) 6563.

本実施例で使用する組換えベクターＮ２．ＳＡＸ、Ｇ２Ｎを各々別々にアンホト ロビックパッキング系列Ｐ　Ａ　３１７　　（Ｍｏｌ。Recombinant vector N2 used in this example. Unhot SAX and G2N separately Robic packing series P A 317 (Mol.

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　６　（１９８６）　２８９５）およびエコトロピック 系列Ｐｓｉ２　（Ｃｅ１１　３３　（１９８３）　　１５３）を含む現在入手可 能なレトロウィルスベクターバッキング細胞にトランスフェクトした。これらの 細胞系列を増殖してヘルパーウィルスを含まないレトロウィルスベクター粒子を 生産した。Ce11. Biol, 6 (1986) 2895) and Ecotropic Currently available including series Psi2 (Ce11 33 (1983) 153) A competent retroviral vector was transfected into backing cells. these Retroviral vector particles that do not contain helper virus by propagating cell lineage produced.

Ｂ、コロンビア大学医学教室にニューヨーク、ニューヨーク）のリチャードアク セル（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａｘｅｓ）の提供によるＣＤ４含有プラスミドｐ４Ｂを ニューイングランドバイオラプス（マサチウーセソッ、バーバリー）社の制限エ ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化でＣＤ４遺伝子を放出 し、これをアガロースゲル電気泳動で単離した後、業者の推薦する方法に従がい ゼネクリーン製品、（バイオ１０１、ラジッラ、カルホルニア）を用いたガラス ピーズへの結合と溶出により精製した。Richard Ack, Department of Medicine, Columbia University, New York, NY) The CD4-containing plasmid p4B was provided by Cell (Richard Axes). Limited edition by New England Biolapse Digestion with endonucleases EcoRI and BamHI releases the CD4 gene This is then isolated by agarose gel electrophoresis, followed by the manufacturer's recommendations. Glass using Zeneclean products (Bio 101, Radilla, California) Purification was achieved by binding and elution to beads.

このｃＤ４フラグメントを業者の推薦する方法でＴ４リガーゼを用いてストラタ ジーン社（ラジョラ、カルホルニア）のブルースクリプトクロー、ニングベクタ ーのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断物にライゲーションした。このライゲーシ ョン物はベセスダリサーチラブス社（ゲイサースバーグ、メリーランド）由来の コンピテントＤＨ５アルアアバクテリアにトランスホームし、白いコロニーを単 離して正しい挿入物に間してスクリーニングしてプラスミドｐｃｐｗを作った。This cD4 fragment was ligated to strata using T4 ligase as recommended by the manufacturer. Blue Script Claw and Ning Vector from Gene Inc. (La Jolla, California) was ligated to the EcoRI and BamHI cut product of . This ligase The materials are from Bethesda Research Labs, Gaithersburg, Maryland. Transform into competent DH5 alua bacteria and isolate white colonies. Plasmid pcpw was created by separating and screening for the correct insert.

適当なプラスミドを基本としたＣＤ４遺伝子に対する発現ベクターを作るためア メリカンカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド）から入手したプ ラスミドＳ　Ｖ　２　ｎｅｏをＨｉｎｄ　ｍとＨｐａＩで消化した。In order to create an appropriate plasmid-based expression vector for the CD4 gene, Print obtained from the American Culture Collection (Rockville, MD). Lasmid SV2 neo was digested with Hindm and HpaI.

ファルマシア社（ビスカタウェイ、ニューシャーシー）から市販されているＪ） ＵＣ−１３ベクター由来の合成ポリリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いＰＳＶ ２ｎｅｏのＮｅｏ”遺伝子と置き換えた。このライゲーション物をベセスダリサ ーチラプス社製のＤＨ５バクテリアにトランスホームし、ポリリンカーにユニー クな制限酵素部位の存在でコロニーをスクリーニングすることによりベクターｐ ｓＶＰＬを得た。さらにｐｓｖｐｔ、発現ベクターをニューイングランドバイオ ラプス社の指示する条件および試薬を用いＸｈｏｒリンカ−をＳＶ４０初期領域 プロモーターの５′側のＰｖｕ１１部位に挿入することにより修正を行ないｐｓ ｖｐｔ、ｘを得た。J) commercially available from Pharmacia (Viscotaway, New Chassis) Synthetic polylinker derived from UC-13 vector was converted into PSV using T4 DNA ligase. 2neo” gene. This ligation product was transferred to Bethesda Lisa. -Transformed into DH5 bacteria manufactured by Chilaps, and added a unique polylinker. vector p by screening colonies for the presence of specific restriction enzyme sites. sVPL was obtained. In addition, psvpt, expression vector was Xhor linker was added to the SV40 initial region using the conditions and reagents specified by Lapus. ps was modified by inserting it into the Pvu11 site on the 5' side of the promoter. vpt, x was obtained.

ｐＣＤＷおよびｐｓｖｐｔ、ｘプラスミドをニューイングランドバイオラプス社 製の酵素Ｈ５ｎｄ　Ｕｌと）（ｂａ　Ｉで消化し、それらのＤＮＡをゼネクリー ン製品とアガロースゲル電気泳動により単離した。ｃＤ４フラグメントのｐ３ｖ ｐｔ、ｘベクターへのライゲーションを行ない、コロニーのスクリーニングによ りｐＳＶＣＤＷを得た。このｐＳｖＣＤＷではＳＶ４０ウイ）Ｌｔス初期領域プ ロモーターは完全なｃＤ４遺伝子産物の発現に使用されている。次のステップは 細胞外産物として細胞から分泌されるようなｃＤ４遺伝子の形を作ることである 。pCDW and psvpt, x plasmids were purchased from New England Biolapse. The DNA was digested with enzymes H5nd Ul and (baI) from isolated by agarose gel electrophoresis. cD4 fragment p3v pt, x vector and colony screening. pSVCDW was obtained. In this pSvCDW, the SV40 Wi) Lt initial region The promoter is used for expression of the complete cD4 gene product. The next step is The goal is to create a form of the cD4 gene that is secreted from the cell as an extracellular product. .

Ｃ，可溶型ｃＤ４の生産はｃＤ４遺伝子の変異型を作るための特別に設計したオ リゴヌクレオチドアダプターを使用することにより行なわれた。このアダプター はｃＤ４遺伝子のＮｈｅ１部位に挿入されたとき、ｃＤ４たんばく質アミノ酸配 列の精密で未成熟な停止を起こし、一方、新しく）（ｐａＩ部位を生成し、かつ ＮｈｅＩ部位を再生するというユニークな性質を有している。ミドランドサチフ ァイドリエージェント社で合成されたこのオリゴヌクレオチドアダプターは２つ のリン酸化オリゴヌクレオチド（１１５’　ＣＴＡＧＣＩＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴ 　３　’および（２１ＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧをアニールすることにより生成 された。この生成物をＰＳＶＣ［＋！１の部位にライゲーションした。このライ ゲーション反応物をＨｐａｌで切断した後Ｘｈｏｌリンカ−を付加した。このリ ンカ−反応を６５℃、１５分間の加熱で停止した後ニューイングランドバイオラ プス社のＸｈｏ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。さらにこの反応 物をアガロースゲル電気泳動にかけ、５Ｖ４０−ｃＤ４アダプターを含むフラグ メントをゼネクリーン製品を用いて単離した。レトロウィルスベクターＮ２をＸ ｈｏｌによる消化、およびベーリンガーマンハイム社（インディアナポリス、イ ンディアナ州）のウシ腸ホスファターゼによる処理で５Ｖ４０−ｃＤ４−アダプ ターフラグメントを受は入れ準備をした。C. Production of soluble cD4 is achieved by specially designed options for creating mutant forms of the cD4 gene. This was done by using oligonucleotide adapters. this adapter When inserted into the Nhe1 site of the cD4 gene, the cD4 protein amino acid sequence cause a precise premature arrest of the sequence, while generating a new (paI) site and It has the unique property of regenerating the NheI site. midland satif There are two oligonucleotide adapters synthesized by Adriagent. Phosphorylated oligonucleotide (115' CTAGCITGAGTGAGTT 3’ and (produced by annealing 21AACTCACTCAAG It was done. This product was converted into PSVC [+! 1 site. This lie After the ligation reaction was cleaved with Hpal, an Xhol linker was added. This resource After stopping the linker reaction by heating at 65°C for 15 minutes, the New England viola Digestion was performed using Xho I restriction endonuclease from Puss. Furthermore, this reaction The material was subjected to agarose gel electrophoresis and the flag containing the 5V40-cD4 adapter ment was isolated using Geneclean products. Retroviral vector N2 hol digestion and Boehringer Mannheim (Indianapolis, Inc.) 5V40-cD4-adapter by treatment with bovine intestinal phosphatase (Indiana). I received the tarpaulin and prepared it.

ｃＤ４発現力セントのライゲージジンは挿入物／ベクター比５対１で行った後ベ セスダリサーチラブス社のＤＨ５コンピテントバクテリアにトランスホームした 。この構築物を制限酵素消化でその挿入物の方向を調べた後大規模に増殖した。cD4 expression center Ligage Gin was performed at an insert/vector ratio of 5:1 and then Transformed into DH5 competent bacteria from Sesda Research Labs. . This construct was expanded to large scale after checking the orientation of the insert by restriction enzyme digestion.

ＳＶ４０ウィルスプロモーターがウィルスＬＴＲプロモーターと同じ向きである 構築物はＳＳＣとして知られており、一方送方向の構築物は５ｃｓｘと呼ばれる 。SV40 viral promoter is in the same orientation as the viral LTR promoter The construct is known as SSC, while the forward construct is called 5csx. .

ＳＳＣベクターをミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）等（上述）によって報告されている方 法によりＰＡ３１７細胞系列中にバッキングし可溶性ｃＤ４たんばく質を生産し 得るＰＡ３１７細胞を得た。このＳＳＣベクターをバフキングしたＰＡ３１７細 胞を上述のようなウサギの内皮細胞の形質導入に使用した。形質導入した内皮細 胞は可溶性ｃＤ４を発現した。The SSC vector reported by Miller et al. (mentioned above) backing into the PA317 cell line to produce soluble cD4 protein. PA317 cells were obtained. PA317 fibers buffed with this SSC vector The cells were used to transduce rabbit endothelial cells as described above. Transduced endothelial cells The cells expressed soluble cD4.

Ｄ、先に述べたタイプの吸着ＨＢＧＦ−１を含むコラーゲンスポンジをラットの 肝臓付近の腹腔内に外科的に移植した。移植後７〜１０日目にスポンジを外科的 に取り出し、５パーセントＣＯｔの組織培養器中１−ｇ／曽ｉ＠度のコラーゲネ ースリン酸緩衝液溶液を用い２７℃で３０〜６０分間消化した。放出された細胞 を２０℃における１１０００ＲＰ、１０分間の遠心で集めた。この細胞をリン酸 緩衝液（ＰＢＳ）で１度洗った後遠心でペレット化した。細胞をＭ１９９メディ ア（ギブコ）、ＥＣＧＦ　（粗脳抽出物）７．２ｍｇ；ヘパリン（アップジョン ）７５０ユニット；およびウシ大動脈またはヒトヘソ静脈内皮細胞の４８時間後 の集密化ディツシュに由来する上清のように集めた２０パーセントならし細胞培 地を含む培地３０−１を２回用いて再懸濁した。別の培地は、１０パ一セントウ シ胎児血清（ハイクローン）；３０００ユニ７トペニシランＧ（バイオフルラド ）；および３０００ユニツト硫酸ストレプトマイシン（バイオフルラド）を含み 、細胞は１μｇ／ｃｗａ”のフィブロネクチン（ヒト）でコートした１００ｍｍ Ｍ１Ｉａ培養皿上に１６時間維持した。ブレーティングした細胞をＰＢＳで３回 洗浄し、ついで先に述べた培地１５−ｌを与えた。培地は操作期間中２日毎に交 換した。D. Collagen sponge containing adsorbed HBGF-1 of the type described above was applied to rats. It was surgically implanted into the abdominal cavity near the liver. The sponge was surgically removed 7-10 days after implantation. Collagen was removed at 1-g/so i@degree in a 5% COt tissue culture vessel. Digestion was performed at 27° C. for 30 to 60 minutes using a phosphate buffer solution. released cells were collected by centrifugation at 11,000 RP for 10 minutes at 20°C. Phosphate this cell After washing once with a buffer solution (PBS), the cells were pelleted by centrifugation. cells with M199 medicine A (Gibco), ECGF (crude brain extract) 7.2 mg; heparin (Upjohn ) 750 units; and after 48 hours of bovine aorta or human umbilical vein endothelial cells. 20% conditioned cell culture collected as supernatant from confluent dishes of The cells were resuspended twice using medium 30-1 containing soil. Another medium is 10% Fetal serum (Hyclone); 3000 Uni7 Topeniciran G (Bioflurad ); and 3000 units of streptomycin sulfate (Bioflurad). , cells were coated with 1 μg/cwa” fibronectin (human) in a 100 mm It was maintained on M1Ia culture dishes for 16 hours. Blated cells 3 times with PBS Washed and then fed with 15-l of the medium described above. The medium was changed every 2 days during the operation period. I changed it.

以下の操作を用い、選択したラット内皮細胞にＮ−７，ＳＡＸ。N-7, SAX to selected rat endothelial cells using the following procedure.

０２ＮおよびＳＳＣベクターで形質導入した。02N and SSC vectors.

１．２Ｘ１０″マイクロ内皮細胞（単層、８０パーセント集密化）２、　２Ｘ１ ０ｈ　ｃｆｕ／ｍ１　（ウィルス上清）３、ポリブレン（８μｇ／＋ｓｊり −３７℃で２〜３時間、５１Ｉｊ２容積中で１．２．３を合せてインキュページ 茸ン（５パーセントＣ０ｔ）。1.2X10″ micro endothelial cells (monolayer, 80% confluence) 2, 2X1 0h cfu/ml (virus supernatant) 3, polybrene (8 μg/+sj Incubate 1.2.3 together in 2 volumes of 51Ij for 2-3 hours at -37°C. Mushrooms (5% C0t).

＝　３７℃で１６時間組織培養培地２０−ｌを加えてインキュベーション（５パ ーセントＣ０１）。= Incubation with 20-l of tissue culture medium at 37°C for 16 hours (5 cycles) -St.C01).

−培地の吸引（ウィルスを含む）後新鮮な培養培地の添加。- Addition of fresh culture medium after aspiration of medium (containing virus).

＝　４８〜９６時間後、Ｇ４１８　（８００μｇ／ｍｊ２）および培養培地の添 加。= After 48-96 hours, addition of G418 (800 μg/mj2) and culture medium. Add.

−２日毎の培地の交換を行ないながら１〜２週間にわたる選択。- Selection over 1-2 weeks with medium changes every 2 days.

次にスポンジに上述の形質導入内皮細胞を接種する操作を示す。Next, we will show the procedure for inoculating the above-mentioned transduced endothelial cells onto a sponge.

Ａ、内皮細胞を直接ＨＢＧＦ−１吸着コラーゲンコート化ＰＴＦＥファイバース ポンジ上に接種し、ついでそのスポンジを内皮細胞源として用いたものと同じ動 物に移植する。移植部位は皮下、腹腔内またはその内皮細胞に形質導入された遺 伝子によってコードされる新しい産物を正常に生産する器官の部位またはその付 近である。スポンジ移植体は先の実施例で述べたように５〜１０日間でそれ自身 に血管形成を起こす０作った内皮細胞をその移植体上に維持することで新しい遺 伝子産物が細胞からの分泌後循環系に配給される。遺伝子産物の生産はその血清 レベルの直接的測定、その試薬の生化学的または生理学的効果またはその両方に よりモニターされる。A, Collagen-coated PTFE fibers that directly adsorb HBGF-1 to endothelial cells. The same procedure was used to inoculate onto a sponge and then use the sponge as the source of endothelial cells. transplant to something. The transplant site may be subcutaneous, intraperitoneal, or the endothelial cells transduced. The part of an organ or its attachment that normally produces the new product encoded by the gene. It's close. The sponge implant grows on its own within 5-10 days as described in the previous example. By maintaining the generated endothelial cells on the graft, which cause blood vessel formation, new genes can be generated. After secretion from the cell, the gene product is distributed to the circulatory system. The production of gene products takes place in the serum Direct measurement of levels, biochemical and/or physiological effects of the reagent more monitored.

Ｂ、ＨＢＧＦ−１吸着コラーゲンコート化ＴＰＦＥファイバースポンジを先に述 べたように目的とする部位に、また血管形成が確立するその移植部位を自由に選 択されるように決定された時点で予備移植する。トランスホームした細胞は直接 すでに血管形成したファイバースポンジに注入する。この方法の利点は作製した 細胞はその移植体中でより迅速かつ効率的に定着するかまたは元の器官（たとえ ば肝ＩＩ）に戻ることである。生産物は上述の方法人よりもより速やかに循環系 に入り始める。新しい遺伝子産物の生産は方法Ａで述べたように測定される。こ の操作はサンプリングされ、インビボで遺伝子工学的に作製され、かつファイバ ースポンジ移植体を介して再挿入され得る多くの種類の細胞型に適用し得る。こ のような細胞にはフィブロブラスト、肝細胞、平滑筋細胞、骨髄細胞などが含ま れる。ＷＩ環系に配給される産物は細胞に挿入された遺伝子でその産物が配給さ れることが望ましい遺伝子によりコードされるペプチドまたはたんばく質である 。B. HBGF-1-adsorbed collagen-coated TPFE fiber sponge was previously described. Freely select the desired site as described above and the site where angiogenesis is established. Pre-implant at the time it is determined to be selected. Transformed cells are directly Inject into the already vascularized fiber sponge. The advantage of this method is that the fabricated The cells may colonize more quickly and efficiently in the transplant or in the original organ (e.g. The point is to return to liver II). Products enter the circulatory system more quickly than the methods described above begins to enter. Production of new gene product is measured as described in Method A. child operations are sampled, genetically engineered in vivo, and fiber -Applicable to many types of cells that can be reinserted via sponge implants. child Such cells include fibroblasts, hepatocytes, smooth muscle cells, and bone marrow cells. It will be done. The products delivered to the WI ring system are the genes inserted into the cell that deliver the products. A peptide or protein encoded by a gene that is desired to be .

実施例７ ゴルテソクスシヤントチユーブを大動脈に各末端を接してループを作るようにラ ットの腹腔に外科的に移植した。このチューブはＨＢＧＦ−１（ｌｎｇ／閣りを 浸み込ませたゲルフオーム（コラーゲン■）もしくはコラーゲンＩでコートし、 かつ　ＨＢＧＦ−１（Ｉｎｓ／ｍｊりを浸み込ませた“エンジェルへアー”ゴル テックスファイバーの束を含んでいる。このチェープを１力月間動物体内に放置 しておいた後外科的に抽出して血管形成を調べてから、このスポンジを組織学的 試験用に調製した。第１４Ａ図に示したように、ゲルフオームスポンジを含むチ ューブは新しい血管を含んでおらず、かつスポンジは完全に溶解した。一方、エ ンジェルーヘアゴルテフクスファイバーの束は有意に血管形成を起こしており（ 第１４Ｂ図）、より高い倍率では毛細血管構造を示している（第１４Ｃ図、第１ ４Ｄ図）。Example 7 Lay the Goltesox tube into the aorta, making a loop with each end touching the aorta. surgically implanted into the peritoneal cavity of a cat. This tube is HBGF-1 (lng/kakuriwo) Coat with impregnated gel foam (collagen ■) or collagen I, Katsu HBGF-1 (“Angel to Ah” Gol imbued with Ins/mjri) Contains bundles of Tex fiber. Leave this chain inside the animal's body for one month. The sponge was then surgically extracted and examined for angiogenesis, and then the sponge was examined histologically. Prepared for testing. As shown in FIG. 14A, the chip containing the gel foam sponge The tube contained no new blood vessels and the sponge was completely dissolved. On the other hand, Bundles of Angelou hair Gortefuchs fibers are significantly vascularized ( Figure 14B), higher magnification shows capillary structures (Figure 14C, Figure 1). 4D figure).

この実験は２つの成分素子を用いて特定の部位に血管を形成させる例を提供して いる。第１の成分、チェーブまたはポーチは遺伝子工学的に作製した、または通 常の移植細胞を接種し得る容器を提供し得る。このような部位は免疫学的に特権 が与えられ、別の個体または別の種由来の細胞が生存し、かつ目的とする産物を 生産し得る可能性がある。This experiment provides an example of forming blood vessels in a specific region using two component elements. There is. The first component, the chaves or pouches, may be genetically engineered or A container can be provided that can be seeded with conventional transplant cells. Such sites are immunologically privileged cells from another individual or species can survive and produce the desired product. There is a possibility that it can be produced.

φ−コラーゲン■型　　　　　　　　　　　　　　φ−ゼラチ。φ-Collagen type ■ φ-Gelati.

フラクション番号 ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ 全血清ビリルビン　ｆｍｇ／ｄｌｌ 全血清ビリルビン　１ｍｇ／ｄｌ１ 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称　　　部位指定血管形成素子とその使用法３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　アメリカン　ナショナル　レッド　クロス５、補正命令の日付　　自 　　　発 国際調査報告 −−ｂｕｅ＋、、＋ｂｓ１．ａｔ　Ａｅａｌｌｃｍｌｌｅ、ｌｉｏ、　　ＰＣＴ ／ＵＳ８９１００７４２　　−ＰＣ？／υＳ８９１０ｔ）７４２fraction number FIG.3 FIG. 4 Total serum bilirubin fmg/dll Total serum bilirubin 1mg/dl1 Procedural amendment (formality) %formula% 2. Name of the invention Site-specific angioplasty device and its use 3. Person making corrections Relationship to the case: Applicant Name: American National Red Cross 5, date of amendment order: Departure international search report --bue+,,+bs1. at Aealcmlle, lio, PCT /US89100742-PC? /υS8910t)742

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．生適合性支持体および血管形成を誘導する生物学的応答モディファイヤーを 含む血管形成素子であって、該生物学的応答モディファイヤーが該生化学的支持 体に吸着されている素子。 ２．前記生適合性支持体が吸収可能な支持体である請求の範囲１記載の血管形成 素子。 ３．請求の範囲２記載の血管形成素子でさらに非吸収性支持体を含む素子。 ４．前記生適合性支持体が非吸収性支持体である請求の範囲１記載の血管形成素 子。 ５．前記吸収可能支持体がコラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン、ゼラチン 、グリコサミノグリカン、糖たんぱく質、プロテオグリカンおよびこれらの混合 物からなる群から選択される１員である請求の範囲２記載の血管形成素子。 ６．前記生物学的応答モディファイヤーがホルモン、ホルモン原型、ハイドラー ゼおよびこれらの混合物からなる群から選択される１員である請求の範囲１記載 の血管形成素子。 ７．前記ホルモンがＨＢＧＦ−Ｉ、ＨＢＧＦ−ＩＩ、ＨＢＧＦ−Ｉ原型、ＨＢＧ Ｆ−ＩＩ原型およびこれらの混合物からなる群から選ばれる１員である血管形成 性で、かつ向神経性の成長因子である請求の範囲６記載の血管形成素子。 ８．前記ハイドロラーゼがヘパリナーゼ、コラゲナーゼ、プラスミン、プラスミ ノーゲン活性化因子、トロンビンヘパラチナーゼおよびこれらの混合物である請 求の範囲６記載の血管形成素子。 ９．前記生物学的応答モディファイヤーが血管形成性成長因子であり、該血管形 成性成長因子が前記支持体ｍｍ３当り約１〜約１０ナノグラムの濃度である請求 の範囲１記載の血管形成素子１０．前記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、 ダクロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲ ンＩＶ、ケラチンおよび糖脂質からなる群から選択される１員である請求の範囲 ３記載の血管形成素子。 １１．前記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、 ポリエチレン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ケラチンおよび糖脂 質からなる群から選択される１員である請求の範囲４記載の血管形成素子。 １２．前記吸収可能支持体がゼラチンである請求の範囲２記載の血管形成素子。 １３．吸収可能な支持体、該吸収可能な支持体を吸着した非吸収性支持体、およ びインビボで部位指定血管形成を誘導するのに十分な濃度で該吸収可能な支持体 に吸着された生物学的応答モディファイヤーを含む血管形成素子。 １４．前記吸着可能な支持体がコラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン、ゼラ チン、グルコサミノグリカン、糖たんばく質、プロテオグリカンおよびこれらの 混合物からなる群から選択される１員である請求の範囲１３記載の血管形成素子 。 １５．前記生物学的応答モディファイヤーがホルモン、ホルモン原型、ハイドロ ラーゼおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる１員である請求の範囲１３ 記載の血管形成素子。 １６．前記ホルモンがＨＢＧＦ−Ｉ、ＨＢＧＦ−ＩＩ、ＨＢＧＦ−Ｉ原型、ＨＢ ＧＦ−ＩＩ原型およびこれらの混合物からなる群から選択される１員である血管 形成性で、かつ向神経性成長因子である請求の範囲１５記載の血管形成素子。 １７．前記ハイドロラーゼがヘパリナーゼ、コラーゲナーゼ、プラスミン、プラ スミノーゲン活性化因子、トロンビン、ヘパラチナーゼおよびこれらの混合物で ある請求の範囲１５記載の血管形成素子。 １８．前記生物学的応答モディファイヤーが血管形成成長因子であり、該血管形 成成長因子が両前記吸収可能な支持体および非吸収性支持体ｍｍ３当り約１〜約 １０ナノグラムの濃度である請求の範囲１３記載の血管形成素子。 １９．前記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、 ポリエチレン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ケラチンおよび糖脂 質からなる群から選択される１員である請求の範囲１３記載の血管形成素子。 ２０．生適合性支持体、およびインビボにおける部位指定血管形成を誘導する生 物学的応答モディファイヤーを含む血管形成素子であって、該生物学的応答モデ ィファイヤーが（１）該生適合性支持体ｍｍ３当り約１〜約１０ナノグラムの濃 度であり、かつ（２）ホルモン、ホルモン原型、ハイドロラーゼ、およびこれら の混合物からなる群の１員である素子。 ２１．前記生適合性支持体が吸収可能な支持体である請求の範囲２０記載の血管 形成素子。 ２２．請求の範囲２０記載の血管形成素子であって、さらに非吸収性支持体を含 む素子。 ２３．前記生適合性支持体が非吸収性支持体である請求の範囲２０記載の血管形 成素子。 ２４．前記吸収可能な支持体がコラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン、ゼラ チン、グルコサミノグリカン、糖たんばく質、プロテオグリカンおよびこれらの 混合物からなる群から選択される１員である請求の範囲２１記載の血管形成素子 。 ２５．前記ホルモンがＨＢＧＦ−Ｉ、ＨＢＧＦ−ＩＩ、ＨＢＧＦ−Ｉ原型、ＨＢ ＧＦ−ＩＩ原型およびこれらの混合物からなる群から選択された１員である血管 形成性で、かつ向神経性の成長因子である請求の範囲２０記載の血管形成素子。 ２６．前記ハイドロラーゼがヘパリナーゼ、コラゲナーゼ、プラスミン、プラス ミノーゲン活性化因子、トロンビン、ヘパラチナーゼおよびこれらの混合物であ る請求の範囲２０記載の血管形成素子。 ２７．前記支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、ポリエチ レン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ケラチンおよび糖脂質からな る群から選択される１員である請求の範囲２２記載の血管形成素子。 ２８．記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、ポ リエチレン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ケラチンおよび糖脂質 からなる群から選択される１員である請求の範囲２３記載の血管形成素子。 ２９．血管形成の方法であって、 （イ）生適合性支持体上に血管形成を誘導する生物学的応答モディファイヤーを 吸着させる工程、 （ロ）治療効果量の前記吸着生物学的応答モディファイヤーを生物内の少なくと も１つの選択した組織に接触させる工程、（ｎ）血管構造を得るのに十分な時間 、前記接触した選択組織において血管形成細胞をインビボで増殖させる工程を含 む方法。 ３０．前記血管形成細胞が遺伝子挿入物を含む請求の範囲２９記載の血管形成方 法。 ３１．前記遺伝子挿入物が血管形成細胞に生物学的産物を分泌される請求の範囲 ３０記載の血管形成方法。 ３２．前記生物学産物が生物学的応答モディファイヤーである請求の範囲３１記 載の血管形成方法。 ３３．前記生物学的応答モディファイヤーがホルモン、ホルモン前駆体およびハ イドロラーゼからなる群から選択される１員である請求の範囲３２記載の血管形 成方法。 ３４．請求の範囲２９記載の血管形成方法で、さらに前記血管構造に非血管細胞 を接種することを含む方法。 ３５．前記接種細胞が望ましい生物学的産物を分泌する請求の範囲３４記載の血 管形成法。 ３６．前記接種細胞が望ましい代謝機能を果たす請求の範囲３４記載の血管形成 法。 ３７．前記生適合性支持体が吸収可能な支持体である請求の範囲２９記載の血管 形成法。 ３８．請求の範囲３７記載の血管形成素子で、さらに非吸収性支持体を含むもの 。 ３９．前記生適合性支持体が非吸収性支持体である請求の範囲２９記載の血管形 成素子。 ４０．前記吸収可能な支持体がコラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン、ゼラ チン、グルコサミノグリカン、糖たんぱく質、プロテオグリカンおよびそれらの 混合物からなる群から選択される１員である請求の範囲３７記載の血管形成素子 。 ４１．前記生物学的応答モディファイヤーがホルモン、ホルモン原型、ハイドラ ーゼおよびこれらの混合物からなる群から選択される１員である請求の範囲２９ 記載の血管形成素子。 ４２．前記ホルモンがＨＢＧＦ−Ｉ、ＨＢＧＦ−ＩＩ、ＨＢＧＦ−Ｉ原型、ＨＢ ＧＦ−ＩＩ原型およびこれらの混合物からなる群から選択される１員である血管 形成性で、かつ向神経性成長因子である請求の範囲４１記載の血管形成素子。 ４３．前記ハイドロラーゼがヘパリナーゼ、コラゲナーゼ、プラスミン、プラス ミノーゲン活性化因子、トロンビン、ヘパラチナーゼおよびこれらの混合物であ る請求の範囲４１記載の血管形成素子。 ４４．前記生物学的応答モディファイヤーが血管形成成長因子であり、かつその 濃度が前記支持体ｍｍ３当り約１〜約１０ナノグラムである請求の範囲２９記載 の血管形成素子。 ４５．前記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、 ポリエチレン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ケラチンおよび糖脂 質からなる群から選択される１員である請求の範囲３８記載の血管形成素子。 ４６．前記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、 ポリエチレン、ＰＴＦＥ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ケラチンおよび糖脂 質からなる群から選択される１員である請求の範囲３９記載の血管形成素子。 ４７．細胞外マトリクスたんぱく質および生物学的応答モディファイヤーを含有 する支持体を含む血管形成促進用産物。 ４８．支持体が代謝物を発現し得る細胞を含み、該産物が器官の血管形成を誘導 し得る請求の範囲４７記載の産物。 ４９．細胞が異種たんぱく質を発現するように遺伝子工学的に作製されたもので ある請求の範囲４８記載の産物。 ５０．支持体が非吸収性支持体である請求の範囲４９記載の産物。 ５１．生物学的応答モディファイヤーが非吸収性支持体中に含まれる細胞外マト リクスたんぱく質に吸収される請求の範囲５０記載の産物。 ５２．前記生物学的応答モディファイヤーがホルモン、ホルモン原型、ハイドロ ラーゼおよびこれらの混合物からなる群から選択される１員である請求の範囲５ １記載の産物。 ５３．生物学的応答モディファイヤーがヘパリナーゼ、コラゲナーゼ、プラスミ ン、プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、およびヘパラチナーゼからなる 群から選択される少なくとも１員である請求の範囲５２記載の産物。 ５４．生物学的応答モディファイヤーがＨＢＧＦ−Ｉ、ＨＢＧＦ−ＩＩ、および ＨＢＧＦ−Ｉ原型、およびＨＢＧＦ−ＩＩ原型からなる群から選択される少なく とも１員である請求の範囲５２記載の産物。 ５５．前記生物学的応答モディファイヤーが血管形成成長因子であり、その濃度 が前記支持体ｍｍ３当り約１〜約１０ナノグラムである請求の範囲５１記載の産 物。 ５６．前記非吸収性支持体がナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、 ポリエチレン、ＰＴＦＥおよび架橋コラーゲンＩＶからなる群から選択される１ 員である請求の範囲５１記載の産物。 ５７．細胞外マトリクスたんぱく質がコラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン 、ゼラチン、グルコサミノグリカン、糖たんぱく質およびプロテオグリカンから なる群から選択される少なくとも１員である請求の範囲５１記載の産物。[Claims] 1. Biocompatible supports and biological response modifiers that induce angiogenesis an angiogenic element comprising: wherein the biological response modifier is associated with the biochemical support modifier; Elements that are adsorbed to the body. 2. Angioplasty according to claim 1, wherein the biocompatible support is an absorbable support. element. 3. The angioplasty device according to claim 2, further comprising a non-absorbable support. 4. The angiogen according to claim 1, wherein the biocompatible support is a non-absorbable support. Child. 5. The absorbable support is collagen, laminin, fipronectin, gelatin. , glycosaminoglycans, glycoproteins, proteoglycans and mixtures thereof The angioplasty element according to claim 2, which is a member selected from the group consisting of: 6. The biological response modifier is a hormone, a hormone prototype, a hydran and a mixture thereof. angiogenic element. 7. The hormone is HBGF-I, HBGF-II, HBGF-I prototype, HBG Angiogenesis that is a member selected from the group consisting of F-II prototype and mixtures thereof 7. The angiogenic element according to claim 6, which is a neurotropic growth factor. 8. The hydrolases include heparinase, collagenase, plasmin, and plasminase. Nogen activator, thrombin heparatinase and mixtures thereof. The angiogenic device according to claim 6. 9. the biological response modifier is an angiogenic growth factor; 2. The adult growth factor is at a concentration of about 1 to about 10 nanograms per mm3 of said support. Angioplasty element 10 according to scope 1. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, polyethylene, PTFE, collagen I, collagen A member selected from the group consisting of keratin and glycolipids 3. The angiogenic element according to 3. 11. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, Polyethylene, PTFE, collagen I, collagen IV, keratin and sugar fat 5. The angioplasty element according to claim 4, which is a member selected from the group consisting of: 12. 3. The angiogenic device of claim 2, wherein the absorbable support is gelatin. 13. an absorbable support, a non-absorbent support adsorbing the absorbable support, and and at a concentration sufficient to induce site-directed angiogenesis in vivo. an angiogenic element containing a biological response modifier adsorbed to the angiogenic element. 14. The adsorbable support is collagen, laminin, fipronectin, gelatin, etc. Chin, glucosaminoglycans, glycoproteins, proteoglycans and their The angiogenic device according to claim 13, which is a member selected from the group consisting of mixtures. . 15. The biological response modifier may be a hormone, a hormone prototype, a hydro Claim 13 is a member selected from the group consisting of: The angiogenic element described. 16. The hormone is HBGF-I, HBGF-II, HBGF-I prototype, HBGF-I A blood vessel that is a member selected from the group consisting of GF-II prototype and mixtures thereof. The angiogenic element according to claim 15, which is a plasticizing and neurotropic growth factor. 17. The hydrolases include heparinase, collagenase, plasmin, and plasma. with sminogen activator, thrombin, heparatinase and mixtures thereof. An angioplasty device according to claim 15. 18. the biological response modifier is an angiogenic growth factor; The growth factor is about 1 to about 1 per mm3 of both the absorbable support and the non-absorbable support. 14. The angiogenic device of claim 13, having a concentration of 10 nanograms. 19. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, Polyethylene, PTFE, collagen I, collagen IV, keratin and sugar fat 14. The angioplasty element according to claim 13, which is a member selected from the group consisting of: 20. Biocompatible supports and biological agents that induce site-directed angiogenesis in vivo. An angiogenic device comprising a physical response modifier, the biological response modifier comprising: (1) a concentration of about 1 to about 10 nanograms per mm3 of the biocompatible support; and (2) hormones, hormone prototypes, hydrolases, and An element that is a member of the group consisting of a mixture of 21. 21. The blood vessel of claim 20, wherein the biocompatible support is an absorbable support. Forming element. 22. 21. The angioplasty device according to claim 20, further comprising a non-absorbable support. Motoko. 23. 21. The vascular shape of claim 20, wherein the biocompatible support is a non-absorbable support. Seiko. 24. The absorbable support may be collagen, laminin, fipronectin, gelatin, etc. Chin, glucosaminoglycans, glycoproteins, proteoglycans and their The angiogenic device according to claim 21, which is a member selected from the group consisting of mixtures. . 25. The hormone is HBGF-I, HBGF-II, HBGF-I prototype, HBGF-I A blood vessel that is a member selected from the group consisting of GF-II prototype and mixtures thereof. The angiogenic element according to claim 20, which is a plasticizing and neurotropic growth factor. 26. The hydrolases include heparinase, collagenase, plasmin, and plasmin. minogen activator, thrombin, heparatinase and mixtures thereof. 21. The angioplasty device according to claim 20. 27. The support is made of nylon, rayon, Dacron, polypropylene, polyethylene. PTFE, collagen I, collagen IV, keratin and glycolipids. 23. The angioplasty element according to claim 22, which is a member selected from the group consisting of: 28. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, polypropylene, etc. Liethylene, PTFE, collagen I, collagen IV, keratin and glycolipids 24. The angioplasty element according to claim 23, which is a member selected from the group consisting of: 29. A method of angiogenesis, the method comprising: (b) Biological response modifiers that induce angiogenesis on biocompatible supports adsorption process, (b) A therapeutically effective amount of said adsorbed biological response modifier is (n) for a period of time sufficient to obtain vascular structures; , the step of growing angiogenic cells in vivo in the contacted selected tissue. How to do it. 30. 30. The method of angiogenesis according to claim 29, wherein the angiogenic cells contain a gene insert. Law. 31. Claims wherein said genetic insert is secreted into angiogenic cells to secrete a biological product. The angiogenesis method according to 30. 32. Claim 31, wherein said biological product is a biological response modifier. Angioplasty method described above. 33. The biological response modifier may include hormones, hormone precursors, and hormones. The vascular shape according to claim 32, which is a member selected from the group consisting of hydrolase. How to create. 34. 30. The angiogenesis method according to claim 29, further comprising non-vascular cells in the vascular structure. A method comprising inoculating. 35. 35. The blood of claim 34, wherein the inoculated cells secrete a desired biological product. Tube formation method. 36. 35. The angiogenesis of claim 34, wherein the inoculated cells perform a desired metabolic function. Law. 37. 30. The blood vessel of claim 29, wherein the biocompatible support is an absorbable support. Formation method. 38. The angioplasty device according to claim 37, further comprising a non-absorbable support. . 39. 30. The vascular shape of claim 29, wherein the biocompatible support is a non-absorbable support. Seiko. 40. The absorbable support may be collagen, laminin, fipronectin, gelatin, etc. Chin, glucosaminoglycans, glycoproteins, proteoglycans and their 38. The angiogenic device according to claim 37, which is a member selected from the group consisting of mixtures. . 41. The biological response modifier may be a hormone, a hormone prototype, a hydra Claim 29 is a member selected from the group consisting of The angiogenic element described. 42. The hormone is HBGF-I, HBGF-II, HBGF-I prototype, HBGF-I A blood vessel that is a member selected from the group consisting of GF-II prototype and mixtures thereof. 42. The angiogenic element according to claim 41, which is a plasticizing and neurotropic growth factor. 43. The hydrolases include heparinase, collagenase, plasmin, and plasmin. minogen activator, thrombin, heparatinase and mixtures thereof. 42. The angioplasty element according to claim 41. 44. said biological response modifier is an angiogenic growth factor; 30. The concentration is from about 1 to about 10 nanograms per mm3 of said support. angiogenic element. 45. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, Polyethylene, PTFE, collagen I, collagen IV, keratin and sugar fat 39. The angioplasty element according to claim 38, wherein the angioplasty element is a member selected from the group consisting of: 46. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, Polyethylene, PTFE, collagen I, collagen IV, keratin and sugar fat 40. The angioplasty element according to claim 39, which is a member selected from the group consisting of: 47. Contains extracellular matrix proteins and biological response modifiers A product for promoting angiogenesis, comprising a support for supporting angiogenesis. 48. the support comprises cells capable of expressing the metabolite, the product inducing angiogenesis in the organ; 48. The product of claim 47. 49. Cells are genetically engineered to express foreign proteins. 49. The product of claim 48. 50. 50. The product of claim 49, wherein the support is a non-absorbent support. 51. Extracellular matrices containing biological response modifiers in a non-absorbable support 51. The product of claim 50, which is absorbed by Rix protein. 52. The biological response modifier may be a hormone, a hormone prototype, a hydro Claim 5 is a member selected from the group consisting of: Product according to 1. 53. Biological response modifiers include heparinase, collagenase, and plasmid. plasminogen activator, thrombin, and heparatinase 53. The product of claim 52, wherein the product is at least one member selected from the group. 54. Biological response modifiers include HBGF-I, HBGF-II, and HBGF-I prototype, and HBGF-II prototype. 53. The product of claim 52, wherein both are members. 55. the biological response modifier is an angiogenic growth factor, and the concentration from about 1 to about 10 nanograms per mm3 of said support. thing. 56. The non-absorbent support is nylon, rayon, Dacron, polypropylene, 1 selected from the group consisting of polyethylene, PTFE and crosslinked collagen IV 52. The product of claim 51, wherein the product is a member. 57. Extracellular matrix proteins include collagen, laminin, and fipronectin. , gelatin, glycosaminoglycans, glycoproteins and proteoglycans 52. The product of claim 51, wherein the product is at least one member selected from the group consisting of:
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