JPH03502697A - 新規のリンフォカイン、該リンフォカインをコードするdna配列及び該リンフォカインを含む医薬組成物 - Google Patents
新規のリンフォカイン、該リンフォカインをコードするdna配列及び該リンフォカインを含む医薬組成物Info
- Publication number
- JPH03502697A JPH03502697A JP1510496A JP51049689A JPH03502697A JP H03502697 A JPH03502697 A JP H03502697A JP 1510496 A JP1510496 A JP 1510496A JP 51049689 A JP51049689 A JP 51049689A JP H03502697 A JPH03502697 A JP H03502697A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- lymphokine
- lymphokines
- dna
- dna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
新規のリンフ才力イン、該リンフ才力インをコードする本発明はヒトリンフ才力
インと、これらのリンフ才力インをコードするDNA配列と、これらのリンフ才
力インの医薬的及び生物学的使用とに係わる。
周知のように、ヒト免疫系は細胞要素と細胞から分泌される可溶性物質とを含む
、これらの可溶性物質はその由来に応じて、リンフ才力イン(何よりも先ずTリ
ンパ球から分泌される場合)又はモノ力イン(a+onokine)(何よりも
先ず単球から分泌される場合)と呼ばれる。これらの「サイト力イン(cyto
kine)」(より一般的に言えば、細胞によって分泌される可溶性物質)は免
疫系の細胞要素を互いに連絡させる役割を果たす1例えば、これらのサイト力イ
ンは成長因子として免疫応答の増幅シグナルを表し得る。最も良く研究されてい
るリンフ才力インの1つであるインターロイキン−2はこれに当たる、これらの
サイト力インはまた、生体の免疫系と他の生物学的系、例えば造血系との間の連
絡にも関与する。リンフ才力インは多面的(p16iotropique)と称
する生物学的活性を有することが知られている。実際、これまでに開示されてき
たリンフ才力インはいずれも複数の細胞タイプに対して調節効果を示す、また、
これらのサイト力インは、直接的エフェクター機能も有し得る0例えば「腫瘍壊
死因子」は、その名が示す通り、成る程の腫瘍細胞の破壊を惹起することができ
る。
サイト力インの発見及び特性づけは遺伝子工学的手法の発達によ1て可能になっ
た。遺伝子工学では、様々な実験的手法によってタンパク質をコードする遺伝子
の特性を明らかにすることができ、従って遺伝子のヌクレオチド配列を介してペ
プチド配列を知ることができる。同じ実験的原理に基づくこれらの遺伝子工学的
手法を別の用途で用いれば、原核生物又は真核生物の発現系を介して、遺伝子が
発見されているタンパク質を実質的に無限の量で製造することもできる。
JongstraらのThe Journal of Experimenta
l Medecine。
vol、165.p、601−614に記載の論文及びEP 320806には
、519と称するTリンパ球の遺伝子のクローニングが記述されている。この文
献によれば、前記遺伝子はアミノ酸を129個含むタンパク質をコードする。し
かしながら、この物質は分泌タンパク質ではなく、従ってリンフ才力インではな
い。
本発明者は、まだ開示されたことのないリンフ才力インをコードする新規の遺伝
子の発見を試みた。
本発明者は研究を重ねた結果、LAG−2(”Lymphocyteと称するD
NA配列のクローニング及び特性分析に成功した。
このLAに−2ポリペプチドは、シグナル配列の除去後に、活性化ヒトリンパ球
によって成熟タンパク質の形態で分泌される。
そこで本発明は、その目的の1つとして、下記のようなFe12と称するヌクレ
オチド配列を含むDNA配列に係わる。
RQQC+CCCGICCfOcGfoI3flaQ、Q(iQGGIQOfc
c T(icccGTccc IGG(CCRGlag GfGCC(CCRG
250 ’ 211G
GrC(RGIGIGIGICTlaHGIGGIGl(iRr GGτGG
GITRQG C(:CFICCCGl(dl GQRfTGfτ1仁 C
RQTGCτGClag’1cccGGGTGr GTGIQCGICCGQ
CGIGGT(flcGGI TQGCGCldlCCi TCTlliCRG
GhRRTTiCRTGGIGG
RGGTRTCQGT (TGIGQGYrRf CCGIG(iGccTc
0T(iGccGlsAG RQGICfGCCCRGClf1ORTCrGf
460 、、 4FO
GGIG(iR(CT(Gl 6GfTGTISrQf GICCTTCTGI
CU GGTCCCCfCr GRGCCCTCTCR【(sT13TCCT
GTGGRGIGGIQG 、CGlCGIGG(f(CfGTc(TCGIG
A TCCCGGGGIGIL: (iTcROcRRモメ@ ICTuC
CGGCT
640 藝So 660CC1CCCCTCT C
RGGGICGIGIfRREI(iTGTcG113G CQGIG翻訳はヌ
クレオチド25で始まりヌクレオチド459で終わる。
本発明はFe12でコードされるポリペプチド、即ち下記の配列率を有するLA
に−2ポリペプチドにも係わる。
車国際命名法による符号の意味を別紙に示す。
5 20
25 30゜1’lRτIIGI LLLL
GI RlILLG NPGLV4SILLS PI: マ マ 0最
初の22個のアミノ酸は成熟タンパク質からは除外されるシグナル配列を構成す
ることになる。
従って、本発明はより特定的には、下記の配列を有するポリペプチドに係わる。
LARAHLRDEE K!;(、PCI、AQEG i’QGnLLTK
’rQ ELGRn YRTCL TXVQ)CLK)CMVDKPTQ
R5VSN kkTRV CRTGR5RWRDVCRNF FIRRY
Q 5)tVXQ GLVAG4?AQQICEDL RLCXP STG
PL周知のように、真核生物細胞の遺伝子は多望現象(phenoiane d
e polytypie)を示す、この現象が生じると、コードされたタンパク
質のアミノ酸の一部が活性を変えずに置換されることがある0本発明はこの現象
によって生じるポリペプチドも対象とする。
従って、本発明はより特定的には、下記のペプチド配列を有するリンフ才力イン
に係わる。
X−RLS Pli:YYOL入RAM t、RDEε に5cpcI、A
QEG PQGDL LT)CTQ ELGR,D YRTCLTIV
QK LKKMV DKPTQ R5VSN AATRV前記配列中、
XはH、メチオニン残基又は下記の配列MATMA LLLLA AMLL
G NPGLV FS及び前記配列と比べてアミノ酸が1つもしくは複数異
なるが活性は同じである配列から選択される。
本発明者は更に、本発明のリンフ才力インをコードする遺伝子のプロモーター領
域を構成するDNA配列も発見した。
この配列を下に示す。
10 20 コ0 40
50 g。
GGTACCACCT CτTτGAC1;CTT CλCτC丁T’TC
CAτTττCCACG 丁Cλへcxcccc TTbτAにCCTG
従って、本発明はこのDNA配列にも係わる。
本発明はまた、前述のごときDNAのプロモーター配列を含むDNA配列及び本
発明のリンフ才力インをコードするDNA配列にも係わる。
本発明の発明者は先ず下記の操作によって相補的DN^、Fe12を得たニ
ー 天然細胞障害性細胞と称するリンパ球の培養、−これらのリンパ球から細胞
内小胞体の膜に結合したメツセンジャーRN^を単離する操作、−前記メッセン
ジャーRNAから一重鎖相補的DN^を得、次いで二重鎖相補的DNAを得る操
作、−バクテリオファージλCTl0のようなベクターへの挿入、
−該細胞のメツセンジャーRN^から一重鎖DNAプローブを形成し、ハイブリ
ダイゼーション−サブトラクション法による精製にかけて、リンパ球中に存在し
且つ他の造血細胞には存在しないRNAのコピーを選択する操作、−ベクター中
に挿入した相補的DNAから前記10−プと反応するものを選択する操作、
−選択したcDN^をプラスミドベクターに移入して増幅し、精製し、且つ配列
を決定する操作。
本発明のリンフ才力インは、一般的なペプチド合成によって、又は本発明のリン
フ才力インをコードするDNA配列をプラスミドのような発現ベクターに挿入し
該発現ベクターで細胞の形質転換を行う操作を含む遺伝子工学の手法を適用する
ことによって製造し得る。
そこで本発明は、プラスミドと、本発明のリンフ才力インをコードするDNA配
列を含む発現ベクターと、このベクターで形質転換した宿主とにも係わる。
本発明は、本発明のリンフ才力インを有効成分として含む医薬組成物にも係わる
。
本発明は、本発明のリンフ才力イン又はこの種のリンフ才力インの免疫原性配列
に対するモノクローナル抗体にも係わる。
本発明はまた、前述のごときモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマにも
係わる。
本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体の使用を含む本発明のリンフ才力イ
ンの定量方法にも係わる。
そのためには、R1AタイプもしくはIRMAタイプ(寒冷抗原と寒冷抗体及び
標識抗体間の競合とを使用するサンドイッチタイプの方法)の放射線免疫法、又
はELISAタイプもしくはIEMAタイプ(サンドイッチタイプの手法)の酵
素免疫法を使用し得る。
本発明のモノクローナル抗体は標準的な方法で製造できる。そのためには、必要
であれば、ポリペプチドをグルタルアルデヒド、カルボジイミド又はビス−ジア
ゾ−ベンジジンのような結合剤によって破傷風トキソイドのような免疫原性物質
に結合し得る。
以下に、
−LAに−2ポリペプチドをコードするcDNA Fe12の製造、
−遺伝子LAG−2の製造及び特性づけ、−精製組換え体LAG−2タンパク質
の製造及びN11.末端ペプチド配列の製造
を詳述する。
I−ハ に At−TaRNAの悴゛a胎児クローンF55111E5
(表現型CD3− CD2°)の単離及び特徴はNow i l lら(1)に
よって既に記述されている。
ウェルを96個有するV底プレートを用いて、組換え体インターロイキン−2と
、同種の照射され且つ単核化された血液細胞の栄養基層上のリンパ球ならし培地
上清と、EBVウィルスによって形質転換された細胞系(LAZ 388と称す
る)との存在下で大量培養を行った。細胞は0日日にウェル当たり3000個の
割合で配置した。12日1に3xlO”細胞/mlのプレートを200枚薬めて
、6xlO”個の細胞を採気した。
Maniatis(2)、Mechler(3)及び^viv(4)の方法を一
部分変更して用いて、細胞質RN^と小胞体の膜に結合したRNAとmRNAと
を調製した。即ち、Mechler(3)の方法に従って4xlO豐個のF55
rllE5細胞を低張衝撃及び機械的破砕にかけた後で複数の蔗糖勾配上に載置
した。小胞体の膜に結合したリポソームに担持された細胞質RN^を蔗糖勾配間
で精製した。このようにすると、その後で、シグナル配列を有するmRNA、即
ち粗面小胞体の膜に担持されているか又はその内部に分泌され次いで細胞の外に
分泌されたタンパク質をコードするmRNAを用いて操作を行えるようになる。
このHB(membrane−bound)と称するタイプのRNA単離方法を
使用すれば、細胞の外側に分泌することができないか又は膜に輸送することがで
きない、従って本発明には係わりのない細胞内タンパク質番コードする転写遺伝
子の約90%を簡単に除去することができる。^viv(4)、Maniati
s(2)及びTriebel(8)の精製方法を使用すると、ライブラリーの作
製及びプローブの製造に必要な基質として使用されるMe−F55111E5+
*RN八が単離されただけでなく、点Vで使用される種々のり胞系毎に約109
個の細胞)の−RNAも単離された。
これらの方法は下記のステップを含む:A−細胞質RN^の製造
20〜30xlO’個の細胞が乾燥ペレット状態で入っているバイアルに、11
の溶解(lyse)バ”7フ7 (50mM Tris−HCI、62.5mM
EDTA、0,4%Triton X−100,2,5M LiC1)を加え
る。
ペレットを穏やかに溶解した後、sou +の10%NP40を入れた低温Ep
pendorf管に前記溶解バッファを移す。
氷上に5分間おいた後、8にで1分間遠心分離する。上清(RNA)を採取して
、11のフェノールと1mlのCHCl1と1−1の5TE2%SOS(150
mM NaCl、 10s+M Tris、 1zM MgCl2、2%
5OS)とが入っているFalcon管に加える。5にで10分間遠心分離す
る。上相を採取し、1−1のフェノールと11のクロロホルムとを加える。 5
にで5分間遠心分離する。上相を採取する。
100ulの0.2M EDTAと、200μ!の38 NaAcと、5論1の
エタノールとを加える。これを混合し、−20℃で一晩放置する。10にで30
分間遠心分離する。ペレットを乾燥する。これを400v1の低温0.3M N
aAc中にとる。前記Falcon管に1論1のエタノールを加える。このエタ
ノールをEppendorf管に移し、混合し、−20℃で1時間放置する。1
3にで10分間遠心分離し、アルコールを吸い上げ、ペレットを乾燥する。 3
0.1の水を加える。この管を遠心分離にかけ、−80℃で即座に冷凍する。変
性ゲル(加熱滅菌したTBE(Tris、 Ba5e、 EDTA)バッファp
H8,5(BET IIIg/5ol)中1%のアガロース)上に11℃置いて
、分解(d6gradation)及び量を制御する。
B−小胞体の膜に結合したメツセンジャーRN^の製造 ′予め0.1%のD
EPCで処理した氷温度のRSB低張バッファ(10mM KCI、1.5mM
MgC1z、10mM Tris−ICICpH7,4))中に、細胞を10
’[胞/曽1の割合で取り上げる。氷上に5分間放置する。lOパルスのDou
nceホモジナイザー(タイプB)で細胞を機械的に破砕する。 1000gで
2分間遠心分離して核を沈降させる。上清即ち「細胞質抽出物」を遊離リポソー
ム/膜抽出物の分離に使用する。 0.7+elの細胞質抽出物を3.2mlの
2.5MTK蔗糖バッファ (0,05M Tris−FICI pH7,4,
0,158にC1,0,005M MgCl□)と混合し、この混合物を21の
2.5M蔗糖TK上に載置する0次いで、8+alの2.05M蔗糖TK及び4
!11の1.3M蔗糖TKを順次加える。 5pinco 5W28タイプのス
イングローターで、25.0OOr+ap、4℃で5時間遠心する。 2.05
M蔗糖と1.3H蔗糖との間に含まれたバンドを針で突いて取出す、同量のTE
tO:1(1,0+aM Tris−)ICI、1mM EDTA)を加える、
フェノール及びフェノール−クロロホルム混合物で順次抽出する。
1/10の38 NaAc及び2.5vo l 、エタノールで沈澱させる。
ポリ(^)’RNへの選択には、1.2mlのゲルを含むオリゴ(dT)−セル
ロースカラムを、SDSを加えたローディングバッファ(tampon de
charge)即ち20mM Tris−HCI(pH7,6)、0.5HNa
C1、IIIMEDT八によって平衡化したものを使用する。 0.1M Na
OHと5mM EDTAとの水溶液で洗浄する。5倍容のローディングバッファ
で洗浄する。RNAを水に溶解し、65℃で5分間加熱する。同じ量のローディ
ングバッファを2回加える。温度が平衡になるまで待つ、流出液(efflue
nt)を回収する。これを65℃に加熱して操作を繰り返す、カラムを5〜10
倍容のローディングバッファで洗浄し、次いで4倍容のローディングバッファ0
.1M NaC1で洗浄する。ポリ(^)”RNAを2〜3倍容の10mM T
ris−HCI(pH7,5)、1mM EDTA、0.05%SO5で溶離す
る。
3M酢酸ナトリウム(pH5,2)を1710の割合で加える。 poly(^
)”RNAを2.2倍容のエタノールで沈澱させる。
0− −イブ−1−の j
F55111E5細胞の細胞小胞体の膜に結合したメッセンジャーRNAから一
重鎖相補的DN^を製造し、次いで二重鎖相補的DN^を製造し、EcoRIリ
ンカ−を加え、ベクター^(:T10のEco81部位に連結し、in vit
roパッケージング(empaquetage)を行う操作を、Cublerら
(5)及びHuynhら(6)の方法で、市販のクローニングキット(^mer
sham Corp、^rlingtonHeights、II>を用いて実施
した。
そのためには、小胞体の膜に結合させるーRN^をlug使用する。この物質の
約80%が一重鎖cDN^に変換された。
III −!へプローブの 告
「除去すべき」細胞(Jurkat、Laz 388、U937、K562)の
メッセンジャーRNAを過剰に用いるハイブリダイゼーションを2サイクル行い
1次いでヒドロキシアパタイトカラムに通してcDN^−mRN^二重鎮二重体
複合体する操作を行うサブトラクションによって一重鎖相補的DNAプローブを
製造する。
ハイブリダイゼーションを2サイクル行い且っカラムに2回通すと、約6〜7%
の放射能が残る。即ち、MB(membrane−bound)と称するF55
111E5物質の約7%がM瘍細胞Jurkat、K562、υ937及びLa
z388中に存在しなくなる。この物質はMB−F55111E5ライブラリー
中で対応eDN^を探すのに使用されるプローブである。この方法はDavis
ら(7)のハイブリダイゼーション−サブトラクションの条件を使用する。
消去式プローブ(subtracted probe)[Jurkat、に56
2、Laz388、U937のMB−FSS−11ES−mRN^]の製造5u
gノMB−F55111E5 mRN^から、32P−dCTP(比活性:80
0Ci/mmol−’)で標識した一重鎖cDN^プローブを50μlの量で製
造する。
逆転写酵素と共に42℃で2時間インキュベートした後、5u+の0.2M E
DTA及び50. lの0.2N NaOHを順次加える。65℃で1時間イン
#ユヘー)t6.60plノIN HCI及び30I11ノ2MTris−HC
I(p)18)を加える。 1/10倍容の3MNaAcを加える。前記4つの
腫瘍系のmRN^を各7.1加えて10−ブを沈澱させ、次いで2.5倍容のエ
タノールを加える。
−20℃で1時間放置する。遠心分離にがけ、70%エタノールで洗浄し、乾燥
すル、7.5111(’)1420中に取り上げ、7.5,1ノ0.5M N1
182PO4(PH7)、1mM EDTA、0.25%SDSヲ710 t
ル。
68℃のインキュベーターで20時間インキュベートする。
インキュベーター内の物質を1mlの0.12M NaHzPO<、0.1%S
DSで希釈する。同じバッファ中で60℃で平衡化したヒドロキシアパタイトカ
ラムにかける。流出液(−重鎖物質)を5ee−ブタノールで濃縮し、G−50
カラムに通してリン酸バッファを除去する。各腫瘍系のmRN^を新たに7μg
ずつ加え、ハイブリダイゼーションとカラムに通す操作とを繰り返す。
このようにしてカラムに2回通すと、出発時の放射能の量の7%が回収される。
IV −cDN^ ローンの づ番10−プとのハイブリダイゼーシ
ョン及び選別(crib−Iage)を、Huynh(6)の方法で、組換え体
ファージとナイロンフィルター法とを用いて行った。ハイブリダイゼーションは
、予備ハイブリダイゼーション後に、サザン(Southern)タイプのハイ
ブリダイゼーション溶液を用いて且つ一重鎖MB−F55111E5消去式プロ
ーブを5x 10’cpm/mlで加えて、42℃で行った。
約zo、oooの組換え体ファージを選別した。前記消去式プローブを用いて約
120の陽性ファージが得られた。そのうち、約200塩基対の挿入物を含むフ
ァージを1つ選択して、pBS中で増殖した。これらのファージの挿入物をTr
iebelら(8)によって記載されているような32 p ll[識プローブ
の製造に使用した。120の陽性ファージのうち38のファージが交差反応で前
記プローブとハイブリダイズした。これら38のファージの挿入物によってLA
(ニー2フアミリーの定義づけが可能になった。この方法は分子生物学で一般的
に使用されているも、のである(2)。
陽性ファージの培養、対応DNAの精製、切り出しによるフラグメント形態の相
補的DN^の低ゲル化点アガロースゲル上での電気泳動による精製をMania
tis(2)及びHuynh(6)の方法で実施した。
■−いcDNAの i ローニン
エンドヌクレアーゼEcoRIによって消化し且つ子牛の腸のアルカリ性ホスフ
ァターゼによって処理したプラスミドベクターpBS中にLAG−2フアミリー
の最も長い相補的DN^を連結させる操作と、コンピテント細菌JH109の形
質変換と、二重選別システム(アンピシリン+X−gal/IP丁G)による組
換え体の選別とを一般的な遺伝子工学の手法によって行った。
pBS中でクローン化した組換え体相補的DNAの精製及び大j1製造を、Na
n1atis(2)によって記述されている塩化セシウム勾配による精製方法を
用いて実施した。
テストすべき相補的ON^に対して特異的なRN^プローブを組換え体プラスミ
ドの純粋調製物から製造した。
最も長いcDNAはeDNA Fe12であり、その配列は本発明の対象の1つ
である。
これらの各ファミリーに対応する種々の転写体くメツセンジャーRN^)の大き
さ及び細胞分布の分析と、細胞Jurkat、Laz388、υ93フ、K56
2のメツセンジャーRN^とのハイブリダイゼーションの分析によるハイブリダ
イゼーション−サブトラクション法の全体的評価と、減少した転写分布での興味
深いファミリーの決定とは、Triebelら(8)によって操作条件が記述さ
れているrノーザンプロット」法によって実施することができた。
Vl −cDNA Fe12の ゛
相補的DNA Fe12の配列決定を、Sangerの方法に従いジデオキシヌ
クレオチドによるヌクレオチド鎖終結反応で「ポリメラーゼDNAの大フラグメ
ント」(Klenow酵素)を使用して、精製組換え体プラスミドから直接に(
二重鎖DNA配列)、又はファージ813中でクローニングした後で間接的に(
−重鎮DN^配列)行った。ここで留意すべきことして、これらのcDNAは2
つの鎖について配列決定されたものであり、この配列は、二重gDNAで構成さ
れた配列の解釈を容易にすべくこれらのcDNAのフラグメント(EcoRI−
Pst及びEcoRI−Xba)をプラスミドpBS中で再クローン化した後で
も決定された。
VII−LAに−2ノ/ −7プロ・・1細胞質内総RN^の抽出をTrieb
elら(8)の方法で行った。
このRNAをグリオキサルの存在下でアガロースゲル上で分離し、やはりTri
ebelら(8)に従いナイロン膜にトランスファーした。このナイロン膜のハ
イブリダイゼーションを、Triebelら
(8)の方法によりcDNA Fe12をaspで標識して形成したプローブF
C24を用いて、50%のホルムアミドの存在下で42℃で実施した。
ハイブリダイゼーション−サブトラクトジョンに使用した細胞系、例えばJur
kat、Laz388、K562及びU927では遺伝子LAG−2は発現しな
い、遺伝子LAG−2の発現は、造血組織以外(extra−hamipof#
t 1que)の組繊、例えば脳又は肝癌細胞系では見られなかった。遺伝子L
AG−2の発現は、1 ) NK型もしくはT型に属するIL−2依存性クロー
ン系もしくはポリクローン系中に、又は2)フィトヘマグルチニンによって刺激
した後の末梢血液リンパ球中に4日目もしくは5日目から、約0.8kbのメツ
センジャーの形態で見られるだけである。
従って、遺伝子LAG−2の発現はTリンパ球又はNKリリン球の抗原又はマイ
トジェン刺激によって惹起する。この遺伝子の発現は活性化後かなりの時間がた
ってから(4日目〜5日目)生じる。この発現は、リンパ球細胞系をインターロ
イキン−2と共に培養した場合には、長期間(数箇月)にわたって維持される。
Vlll −LAflニー2ノ:yフo−細胞系に562、Laz388及びJ
urkatのゲノムDN^を制限酵素で消化した。消化したDNAをTrieb
elら(8)の方法に従って0.7%アガロースゲル上で移動させ、ナイロン膜
にトランスファーした1次いでこのフィルターをTriebelら(8)の方法
でプローブFC24とハイブリダイズした。10−プFC24とハイブリダイズ
する同じ制限フラグメントが、EcoRI、Bt+aHI又はHindlllで
の消化後にも発見された。これは、DNA全体が抽出されたことを意味する。E
coRIについては、約2kb、3.3kb及び5.2kbの3つの特徴的バン
ドが見られる。
クローニング後に遺伝子LAG−2の分子構造を確定す8〆に使用されるのはこ
れら3つのバンドである(下記の説明参照)0種々の制限フラグメントを分析し
た結果、遺伝子LAG−2は非反復性である(unique)確率が極めて高く
、半数体ゲノム当たり1つのコピーの割合で存在することが利明した。
IX −LH玉PC−2の゛ びプロモーター −の 1Dariavach
ら(10)の方法に従って、EBVで形質転換したヒトB細胞の細胞系のDNA
から得たバンクLY67からゲノムDNAクローンを単離し、Hbolで部分的
に消化し、更にファージλ2001に挿入した。 Feinb6rg(11)の
方法、即ちランダムヘキサマーを用いるプライマー法によって制限フラグメント
FC24を標識し、これを使用して2x 105プラークのヒトゲノムDNAラ
イブラリーを選別する。このようにして6つのクローンC01〜GC6を単離し
5、プローブFC24を用いて制限マツプによりファージDN^を特性づける。
これらのクローンからは、ハイブリダイゼーション後に、同一の制限マツプが得
られる。クローンGCIからは、プローブFC24とハイブリダイズする3つの
EcoRIフラグメントが単離される。これらのフラグメントは2kb、3.4
kb及び5.2kbである。これらのフラグメントをプラスミドpBSのEco
R1部位中に部位−ン化する。
次いで、これらのサブクローンの詳細な制限マ・ノブを作成し、得られた結果を
前述のFC24配列の制限マツプと比較する。ゲル化点の低いアガロースゲル上
に多数のフラグメントが得られる。これらのフラグメントをバクテリオファージ
M13+ap18、M13wp19中にサブクローン化する。これらのフラグメ
ントの配列を、Sangerら(9)のジデオキシ鎖終結法によって一重鎖DN
Aから得る。
このようにして、最初の3つのエクソンに係わるエクソン−イントロン区域とプ
ロモーター領域の配列とを決定することができた。エクソン1は前記FC24配
列のヌクレオチド2〜76を含み、エクソン2はヌクレオチド77〜179を含
み、エクソン3はヌクレオチド180〜278を含む、尚、FC24配列の+1
位のヌクレオチドはゲノムのレベルでは見られず、このヌクレオチド(FC24
配列中のC)はcDN^バンク中でのクローニングに使用されたEeoRIリン
カ−に属する可能性がある。ゲノム配列中の対応する位置(5ページ及び6ベー
ジ(日本語明細書7ページ)に示した配列の680位)にはAが存在する。エク
ソンの配列は前記FC24クローンの配列と同じであり、従って、FC24クロ
ーンの由来源であるcDN^DNAラリー及びゲノムライブラリーLY67が2
つの別個の個体がら得た細胞物質に由来するという事実がら、異種の個体間には
遺伝子多望現象が殆ど存在しないことになる。
第1図に示したプロモーター配列は705のヌクレオチドからなり、最後の3つ
のヌクレオチドはヌクレオチドA、T及びG(翻訳開始コドン)に対応する。こ
の配列は、遺伝子LA(ニー2レベルで、Fe12 cDNへの分析によって決
定された翻訳開始部位(^TG)の5°位に存在する702のヌクレオチドに対
応する。プロモーターが結合し得る部位(下線部分)は、17386位のTAT
八ボへクス、2/291位のCC^^丁ボックス、3/183位(配列G^^に
TACCAC)のGM−CSFタイプ(コンセンサス配列C^^^TTCAC)
のデカヌクレオチドである!初の2つの部位(TAT^及びCCAAT)は真核
生物遺伝子のプロモーター中に混存する。最後の部位(GM−CSFタイプのデ
カヌクレオチド)はGM−CSFをコードする遺伝子及びヒトのIL−4をコー
ドする遺伝子の5′部分に見られるサイト力インの比較的特異的な配列であると
記述されている(12)、 4/また、配列TGACTC^のタンパク質^P−
1の結合部位は367位〜373位(14及び15)に翻訳すべきFC24クロ
ーンの転写によって誘導されるmRN^のコード領域及び翻訳能を決定するため
に、T3もしくはT7ボリメラーゼを使用し且つ基質としてベクターpBS中の
FC24クローンを用いて、Fe12 cDN^の2つの鎖を転写した。
次いで、メチオニンコSSの存在下でウサギ網状赤血球抽出物を使用して、2つ
のRNA調製物をin vitroで翻訳した。3゛側にポリ−八尾部を含むセ
ンスRNA(^RNsens)は、5DS−PA(:Eタイプのゲル上での移動
後にオートラジオグラフィーで検出できる分子量約16,000ダルトンのタン
パク質に翻訳された。この分子量測定値は、完全なシグナルペプチドを有する切
断されていないLAに−2ポリペプチドの145のアミノ酸に対応する16,3
80という分子I計算値に極めて近い、ウサギ網状赤血球抽出物との反応でアン
チセンスRNAを基質として使用すると、翻訳産物は1つも検出できなかった。
Xl−−LAG−2ンB9 (:Qユ列トl兄−「バクロウィルス」タイ
プのベクターを用いるシステムを使用した。このシステムは、外来遺伝子を含む
運搬ベクターとウィルスのゲノムとの間のin vivo組換えを使用して、昆
虫細胞、例えばSF9細胞(寄託^TCCCRRL 1711)中で外来タンパ
ク質を産生することができる0組換え体プラスミド及びウィルスゲノムのトラン
スフェクションの後で、組換え体タンパク質を大量に産生せしめるSF9細胞を
連続的精製(組換え体の選別)によって運択する。前記タンパク質は通常は切断
されており(細胞内部から疎水性シグナルペプチドが除去されている)、且つグ
リコジル化されている(少なくとも部分的に)。
組換え体タンパク質の検出:
Fe12 ON^クローンの翻訳によって誘導されるNO2末端配列に対応する
24のアミノ酸を含む合成ペプチドを合成した。
次いでこのペプチドをキャリヤータンパク質KLH(“Keyholet、y論
pet Hemocyanin”)に結合した。ウサギを繰返し免疫すると、E
LISΔタイプのテストで1/10000でこの合成ペプチドと反応する血清が
得られた。これらのウサギ血清のイムノグロブリンフラクションをプロティンA
−セファロースカラムで精製した。
FC24フラグメントを含むウィルス組換え体クローンによって怒染させたSF
9細胞の上清を培養3日目に得、前述の抗FC24抗ペプチド精製抗体を用いて
「ウェスタンプロット」法でテストした。その結果、ペルオキシダーゼで標識し
たヤギの抗ウサギ抗体での順環化(revelation)の後で約14kdの
タンパク質に対応する明確なシグナルが得られた。
X1l−“ LAに−2ンパ の
1)tt′ え タンパク のアフイニテイ力ラム びL迷」[た新−
LAG−2cDN^のNH2末端ペプチドに対するウサギ抗体をプロティンA−
セファロースに通して精製した。この精製抗体を、ゲル1ml当たり5ugの抗
体の割合で、活性CI−セファロースに結合した。イムノアフイニテイ力ラムに
使用した希釈バッファは下記の通りであるニ
ー 20mM TRl5.10%エチレングリコール、0.1%N−オクチル
グルコピラノシド、pH7,5のバッファ(ローディングバッファ)、
一20mM TRl5.10%エチレングリコール、0.1%N−オクチルグル
コピラノシド、0.258 NaCl、pl’17.5のバッファ(洗浄バッフ
ァ)、
50mMグリシン、pH2,5のバッファ(溶離バッファ)、−50−Hトリエ
チルアミン、pHllのバッファ(再生バッファ)、
一20d TRl5塩基、2,5%マンニトール(自発的p)l約9)のバッフ
ァ、
−20mM TRl5.10%エチレングリコール、0.1%トオクチルグルコ
ピラノシド、0,01%アジ化ナトリウム、pH7,5のバッファ(免疫吸着剤
保存用バッファ)。
2)11え
Fe12 cDN八(クローン5−01−八6)を組込んだバクロウイルファで
172に希釈し、0.7+al/amの流速(#線速度=9.5c+m/h)で
室温で51の免疫吸着剤上に導入する。
−次いで、280での光学密度が安定する(約0.080All)までゲルをロ
ーディングバッファで洗浄する。
−(1,[1,が約Oになるまでゲルを洗浄バッファ(0,25M NaC1)
で洗浄する。
−結合したタンパク質を低温溶離バッファで溶離する:溶出液(eluat)は
、20+sM TRl5.25B/mlマンニトールを含む同量のバッファ中に
回収する。
−カラムを再生バッファ(ゲルの約10倍容)で洗浄し、次いでローディングバ
ッファで再平衡化する。これを保存バッファ中4℃で貯蔵する。
3 ) 5DS−PAGE・の゛ の背当たり200. lの溶出液を10I
IlのIN TRl5塩基で中和してから濃縮乾固する。これらの試料を20v
1の電気泳動試料バッファ中に取り上げ、この試料1μmをゲル上に載置する0
次いで、SOSゲルをクーマシーブルーで染色する。しへG−2タンパク質(1
4kclのバンド)の量の測定値は溶出液11当たり約500ng〜tugであ
る。
4 ) 5DS−PAII:Eにか(つ にトーンスフ − t・ のN1正l
−
a ) 5OS−PAにE
タンパク質の電気泳動を、 Shagger及びVO(l Jago@の方法(
^nal 、Biochem、 、166:368−379.1987)で行う
。
b) −ンスフ − び 4
P、NATSUD^IR^の方法(JBC,vol、262.21:10035
−10038.1987)を使用する。 5DS−PAにE又はPVDF膜への
トランスファー及び用いて、自動EDNAN分解法により最初の20のアミノ酸
の配列を分析する。結果は下記の通りである:サイクル アミノ酸
l Arg Tyr Ser Pro Met Val^lx C
ly Glu5 Clu
6 Tyr
8 ^sp C1y
尚、使用した方法では通常、最初のアミノ酸が不確定である。
U:
この配列は、前記したFC24クローンの翻訳によって推定されるLAに−2タ
ンパク質の配列に確かに対応し、シグナルペプチドが21位と22位との間で切
断されていることを示す。
従って、アルギニンは成熟LA[ニー2タンパク質のNH2末端アミノ酸である
。
X1ll −J%LAG−2ンハノ’
F55111E5細胞(Fe12 cDN^クローンの由来源)を内部標識し、
対照としてEBVで形質転換されたB細胞及びLiz388を用いて免疫沈降を
行った。該細胞のタンパク質(3xlO’細胞)をメチオニンコ’5(200u
Ci/ml)により10’細胞/■lの濃度で4時間標識した。標識後、遠心分
離によって細胞の上清を得、1%のTriton X−100と0.1%のデオ
キシコール酸ナトリウムとを含む0.01Mリン酸バッファ(pi(7,2)で
5倍に希釈した。免疫沈降は、Moingeonら(13)の方法に従い、セフ
ァロ−スープロチインAビーズに結合したウサギ異種抗体を用いて行った。免疫
沈降したLAG−2タンパク質をSOSローディングバッファ(3%5OS)中
でインキュベー) (100℃で3分間)することによってセファロース4Bビ
ーズから離脱させ、還元条件(5%のβ−メルカプトエタノール)及び非還元条
件でSOSポリアクリルアミドゲル(15%アクリルアミド)にかけた、還元条
件でも非還元条件でも、オートラジオグラフィーの後で約15kdのバンドが得
られる。このバンドはF55IIIE541胞の上清中に見られるが、Laz3
88細胞の対照上清中には見られない、従って、これらの実験は、LAG−2タ
ンパク質が確かにヒト活性化細胞から自然に分泌されることを立証する。また、
見出された分子量はバクロウィルスシステムと称するシステムで産生される組換
え体タンノ<り質の分子量に類似している。
下記の文献は明細書中に引用されたものである。
gamma genes、 Eur、 J、工mmuno1.17:1209゜
、 Sanger、 F、、 S、 N1cklen anci A、R
,Coulson、 1977、 DNAaヒ1. Acad、 Sci
、 USA 75:5461
@ ^
ern、’CニーLx=bda chain ILn’l Clambd
a4 and CLa北da5 are D’ukuyama、
R,、Maekawa、 M、、 Kudoh、 J、、 Shimiz
u、 N、、 1:or human XL−4and it
s axpression、Ti1e Journal of l
’、 Triebel、 M、Graziani、F、For@5tier
、D、Be1let、C,)l?eS with natuz
al killer−Lik@ activity、 Na
ture、@ q
325ニア21
14、 Angal、 P、、工magawa、 M、、 Chiu、 R,、
5teiri、 B、 Imbra、 Rt、 Rhamsdorf、
H,J、 Jonat、 C,1(errlich、 P、 &にarin、
M、 5(198〕) Ce1l 49. 729−739゜15
、 Lee、 W、、 M支tchell、 p、 & Tji
an、 R1(19137) Ce1l 49.@ T
阿
特表千3−502697 (11)
1ユ!勺1凶j」L
^sp アスパラギン酸
Glu グルタミン酸
Phe フェニルアラニン
G!y グリシン
His ヒ入チジン
11e イソロイシン
^sn アスパラギン
Pro プロリン
Gln グルタミン
^rg アルギニン
Trp )リプトファン
Tyr チロシン
浄書(内容に変更なし)
手続ネm正書(方式)
%式%
明の名称 新規のリンフ才力イン、該リンフ才力インをコードするDNA配列
及び該リンフ才力インを含む医薬組成物
正をする者
件との関係 特許出願人
名 称 ルーセル・ユクラフ
正命令の日付 平成3年3月12日
王の対象 図 面
国際調査報告
−開−嚇i神−−1昧 PCT/FR89100491mAlum−・0rT7
1D只Q/l’1f14QI国際調査報告 FRB900491
Claims (14)
- 1.下記のペプチド配列 【配列があります】 並びに該配列と比べて1つ又は複数のアミノ酸は異なるが活性は同じである配列 からなる又はこれらの配列を含むリンフォカイン。
- 2.下記のペプチド配列 【配列があります】 [式中、XはH、メチオニン残基又は下記の配列【配列があります】 から選択される] 並びに該配列と比べて1つ又は複数のアミノ酸は異なるがが活性は同じである配 列からなる請求項1に記載のリンフォカイン。
- 3.請求項1又は2に記載のリンフォカインをコードするDNA配列を含むDN A配列。
- 4.請求項1又は2に記載のリンフォカインをコードするDNA配列。
- 5.本質的に下記の配列 【配列があります】 を含む請求項4に記載のDNA配列。
- 6.請求項1又は2に記載のリンフォカインを活性成分として含む医薬組成物。
- 7.請求項1又は2に記載のリンフォカイン又はこの種のリンフォカインの免疫 原性配列に対するモノクローナル抗体。
- 8.請求項7に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 9.請求項1又は2に記載のリンフォカインをコードするDNA配列を含むプラ スミド。
- 10.請求項1又2に記載のリンフォカインをコードするDHA配列を含む発現 ベクター。
- 11.請求項10に記載のベクターで形質転換された宿主。
- 12.プロモーター配列として本質的に下記の配列【配列があります】 の全体又は一部分を含むDNA配列。
- 13.請求項12に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- 14.請求項12に記載のプロモーターDNA配列と請求項1又は2に記載のリ ンフォカインをコードするDNA配列とを含み、前記リンフォカインを前記プロ モーター配列の制御下で発現させる発現ベクターによって形質転換された宿主。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR88/12538 | 1988-09-26 | ||
FR8812538A FR2636953B1 (fr) | 1988-09-26 | 1988-09-26 | Nouveaux polypeptides produits par des lymphocytes humains, genes codant pour ces polypeptides et applications pharmaceutiques et biologiques |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03502697A true JPH03502697A (ja) | 1991-06-20 |
JP2960453B2 JP2960453B2 (ja) | 1999-10-06 |
Family
ID=9370380
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1510496A Expired - Lifetime JP2960453B2 (ja) | 1988-09-26 | 1989-09-26 | 新規のリンフォカイン、該リンフォカインをコードするdna配列及び該リンフォカインを含む医薬組成物 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0367641B1 (ja) |
JP (1) | JP2960453B2 (ja) |
AT (1) | ATE111920T1 (ja) |
DE (1) | DE68918399T2 (ja) |
DK (1) | DK130290D0 (ja) |
ES (1) | ES2059801T3 (ja) |
FR (1) | FR2636953B1 (ja) |
WO (1) | WO1990003394A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992006195A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-16 | University Of Minnesota | Dna and amino acid sequence specific for natural killer cells and t cells |
CA2278118A1 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Polynucleotides and polypeptides encoding receptors |
JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
AU2015229103C9 (en) | 2014-03-14 | 2020-11-26 | Immutep S.A.S | Antibody molecules to LAG-3 and uses thereof |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE260880T1 (de) * | 1986-09-11 | 1988-11-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc., Boston, Mass. | Verfahren zur ausloesung der zytotoxizitaet. |
US4994369A (en) * | 1987-12-15 | 1991-02-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. | T-cell activation related gene |
-
1988
- 1988-09-26 FR FR8812538A patent/FR2636953B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-09-26 ES ES89402632T patent/ES2059801T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-26 DE DE68918399T patent/DE68918399T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-26 JP JP1510496A patent/JP2960453B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-26 EP EP89402632A patent/EP0367641B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-26 WO PCT/FR1989/000491 patent/WO1990003394A2/fr unknown
- 1989-09-26 AT AT89402632T patent/ATE111920T1/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-05-25 DK DK130290A patent/DK130290D0/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0367641A3 (en) | 1990-08-29 |
DE68918399D1 (de) | 1994-10-27 |
WO1990003394A3 (fr) | 1990-07-12 |
FR2636953A1 (fr) | 1990-03-30 |
ES2059801T3 (es) | 1994-11-16 |
FR2636953B1 (fr) | 1990-12-14 |
AU4405689A (en) | 1990-04-18 |
JP2960453B2 (ja) | 1999-10-06 |
DK130290A (da) | 1990-05-25 |
WO1990003394A2 (fr) | 1990-04-05 |
ATE111920T1 (de) | 1994-10-15 |
DK130290D0 (da) | 1990-05-25 |
DE68918399T2 (de) | 1995-03-16 |
EP0367641B1 (fr) | 1994-09-21 |
EP0367641A2 (fr) | 1990-05-09 |
AU638682B2 (en) | 1993-07-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tjoelker et al. | Human, mouse, and rat calnexin cDNA cloning: identification of potential calcium binding motifs and gene localization to human chromosome 5 | |
JPH06502176A (ja) | 新しいオンコフェータル遺伝子、そのための遺伝子生成物およびその利用法 | |
JP2002504818A (ja) | リガンドファミリーのntn−2メンバー | |
US7384750B2 (en) | Nucleic acid sequences having characteristics of enhanced expression in human neuroblastoma with favorable prognosis based on comparison between human neuroblastoma with favorable prognosis and human neuroblastoma with unfavorable prognosis | |
JPS6091995A (ja) | サツカロミセス属酵母によるインターロイキン‐2の製造方法 | |
Degols et al. | Antiviral activity and possible mechanisms of action of oligonucleotides-poly (L-lysine) conjugates targeted to vesicular stomatitis virus mRNA and genomic RNA | |
JPH10508206A (ja) | 組換えヤドリギレクチン(rML) | |
JPH11514859A (ja) | 肝腫瘍性疾患に関連する遺伝子 | |
WO1992000757A1 (en) | Diagnosis of metastatic cancer by the mts-1 gene | |
JPH03502697A (ja) | 新規のリンフォカイン、該リンフォカインをコードするdna配列及び該リンフォカインを含む医薬組成物 | |
JPH06509227A (ja) | リンパ球仲介細胞障害の活性を持つタンパク質をコードするdna | |
Sutcliffe et al. | Brain specific gene expression | |
JPH10500311A (ja) | 核タンパク質と相互作用する因子 | |
CN112111496A (zh) | 稀有鮈鲫载脂蛋白ApoE基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用 | |
JP2005538930A (ja) | ヒトfoxc2タンパク質およびfoxc−2相互作用タンパク質の複合体 | |
US20050064411A1 (en) | Novel gene nedl-1 | |
JP2001501802A (ja) | ハンチンチン(huntingtin)結合蛋白質 | |
Dreesen et al. | A peptide-reactive antibody to a Balbiani ring gene product: immunological evidence that a 6.5-kb RNA in Chironomus tentans salivary glands is mRNA for a 180-kDa nonfibrous component of larval secretion | |
EP1939292B1 (en) | Nucleic acids isolated from neuroblastomas | |
US5196526A (en) | CDNA clone for T-cell suppressor inducer factor | |
AU2003204659C1 (en) | Extended cDNAs for secreted proteins | |
CN1418223A (zh) | 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列 | |
Kang et al. | A new autoantigen reactive with prediabetic nonobese diabetic mice sera | |
JP3755040B2 (ja) | ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び解糖系酵素の製造方法 | |
JP2000512133A (ja) | 多発性骨髄腫で変化した遺伝子の同定 |