JPH03502697A - 新規のリンフォカイン、該リンフォカインをコードするｄｎａ配列及び該リンフォカインを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規のリンフ才力イン、該リンフ才力インをコードする本発明はヒトリンフ才力 インと、これらのリンフ才力インをコードするＤＮＡ配列と、これらのリンフ才 力インの医薬的及び生物学的使用とに係わる。

周知のように、ヒト免疫系は細胞要素と細胞から分泌される可溶性物質とを含む 、これらの可溶性物質はその由来に応じて、リンフ才力イン（何よりも先ずＴリ ンパ球から分泌される場合）又はモノ力イン（ａ＋ｏｎｏｋｉｎｅ）（何よりも 先ず単球から分泌される場合）と呼ばれる。これらの「サイト力イン（ｃｙｔｏ ｋｉｎｅ）」（より一般的に言えば、細胞によって分泌される可溶性物質）は免 疫系の細胞要素を互いに連絡させる役割を果たす１例えば、これらのサイト力イ ンは成長因子として免疫応答の増幅シグナルを表し得る。最も良く研究されてい るリンフ才力インの１つであるインターロイキン−２はこれに当たる、これらの サイト力インはまた、生体の免疫系と他の生物学的系、例えば造血系との間の連 絡にも関与する。リンフ才力インは多面的（ｐ１６ｉｏｔｒｏｐｉｑｕｅ）と称 する生物学的活性を有することが知られている。実際、これまでに開示されてき たリンフ才力インはいずれも複数の細胞タイプに対して調節効果を示す、また、 これらのサイト力インは、直接的エフェクター機能も有し得る０例えば「腫瘍壊 死因子」は、その名が示す通り、成る程の腫瘍細胞の破壊を惹起することができ る。

サイト力インの発見及び特性づけは遺伝子工学的手法の発達によ１て可能になっ た。遺伝子工学では、様々な実験的手法によってタンパク質をコードする遺伝子 の特性を明らかにすることができ、従って遺伝子のヌクレオチド配列を介してペ プチド配列を知ることができる。同じ実験的原理に基づくこれらの遺伝子工学的 手法を別の用途で用いれば、原核生物又は真核生物の発現系を介して、遺伝子が 発見されているタンパク質を実質的に無限の量で製造することもできる。

ＪｏｎｇｓｔｒａらのＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ　Ｍｅｄｅｃｉｎｅ。

ｖｏｌ、１６５．ｐ、６０１−６１４に記載の論文及びＥＰ　３２０８０６には 、５１９と称するＴリンパ球の遺伝子のクローニングが記述されている。この文 献によれば、前記遺伝子はアミノ酸を１２９個含むタンパク質をコードする。し かしながら、この物質は分泌タンパク質ではなく、従ってリンフ才力インではな い。

本発明者は、まだ開示されたことのないリンフ才力インをコードする新規の遺伝 子の発見を試みた。

本発明者は研究を重ねた結果、ＬＡＧ−２（”Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅと称するＤ ＮＡ配列のクローニング及び特性分析に成功した。

このＬＡに−２ポリペプチドは、シグナル配列の除去後に、活性化ヒトリンパ球 によって成熟タンパク質の形態で分泌される。

そこで本発明は、その目的の１つとして、下記のようなＦｅ１２と称するヌクレ オチド配列を含むＤＮＡ配列に係わる。

ＲＱＱＣ＋ＣＣＣＧＩＣＣｆＯｃＧｆｏＩ３ｆｌａＱ、Ｑ（ｉＱＧＧＩＱＯｆｃ ｃ　Ｔ（ｉｃｃｃＧＴｃｃｃ　ＩＧＧ（ＣＣＲＧｌａｇ　ＧfＧＣＣ（ＣＣＲＧ ２５０　　　’　　　　　２１１Ｇ ＧｒＣ（ＲＧＩＧＩＧＩＧＩＣＴｌａＨＧＩＧＧＩＧｌ（ｉＲｒ　　ＧＧτＧＧ ＧＩＴＲＱＧ　　Ｃ（：ＣＦＩＣＣＣＧｌ（ｄｌ　　ＧＱＲfＴＧｆτ１仁　Ｃ ＲＱＴＧＣτＧＣｌａｇ’１ｃｃｃＧＧＧＴＧｒ　ＧＴＧＩＱＣＧＩＣＣＧＱ　 ＣＧＩＧＧＴ（ｆｌｃＧＧＩ　ＴＱＧＣＧＣｌｄｌＣＣｉ　ＴＣＴｌｌｉＣＲＧ ＧhＲＲＴＴｉＣＲＴＧＧＩＧＧ ＲＧＧＴＲＴＣＱＧＴ　（ＴＧＩＧＱＧＹｒＲｆ　ＣＣＧＩＧ（ｉＧｃｃＴｃ　 ０Ｔ（ｉＧｃｃＧｌｓＡＧ　ＲＱＧＩＣｆＧＣＣＣＲＧＣｌf１ＯＲＴＣｒＧｆ ４６０　　　、、　　　　４ＦＯ ＧＧＩＧ（ｉＲ（ＣＴ（Ｇｌ　６ＧｆＴＧＴＩＳｒＱｆ　ＧＩＣＣＴＴＣＴＧＩ ＣＵ　ＧＧＴＣＣＣＣｆＣｒ　ＧＲＧＣＣＣＴＣＴＣＲ【（sＴ１３ＴＣＣＴ ＧＴＧＧＲＧＩＧＧＩＱＧ　、ＣＧｌＣＧＩＧＧ（ｆ（ＣｆＧＴｃ（ＴＣＧＩＧ Ａ　　ＴＣＣＣＧＧＧＧＩＧＩＬ：　　（ｉＴｃＲＯｃＲＲモメ@　ＩＣＴｕＣ ＣＧＧＣＴ ６４０　　　　　　　藝Ｓｏ　　　　　　　　６６０ＣＣ１ＣＣＣＣＴＣＴ　Ｃ ＲＧＧＧＩＣＧＩＧＩｆＲＲＥＩ（ｉＴＧＴｃＧ１１３Ｇ　ＣＱＧＩＧ翻訳はヌ クレオチド２５で始まりヌクレオチド４５９で終わる。

本発明はＦｅ１２でコードされるポリペプチド、即ち下記の配列率を有するＬＡ に−２ポリペプチドにも係わる。

車国際命名法による符号の意味を別紙に示す。

５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　 　　　　　　　２５　　　　　　　　　３０゜１’ｌＲτＩＩＧＩ　　ＬＬＬＬ ＧＩ　　ＲｌＩＬＬＧ　　ＮＰＧＬＶ４ＳＩＬＬＳ　　ＰＩ：　　マ　マ　０最 初の２２個のアミノ酸は成熟タンパク質からは除外されるシグナル配列を構成す ることになる。

従って、本発明はより特定的には、下記の配列を有するポリペプチドに係わる。

ＬＡＲＡＨＬＲＤＥＥ　　Ｋ！；（、ＰＣＩ、ＡＱＥＧ　　ｉ’ＱＧｎＬＬＴＫ ’ｒＱ　　ＥＬＧＲｎ　　ＹＲＴＣＬ　　ＴＸＶＱ）ＣＬＫ）ＣＭＶＤＫＰＴＱ 　Ｒ５ＶＳＮ　　ｋｋＴＲＶ　　ＣＲＴＧＲ５ＲＷＲＤＶＣＲＮＦ　ＦＩＲＲＹ Ｑ　５）ｔＶＸＱ　ＧＬＶＡＧ４？ＡＱＱＩＣＥＤＬ　　ＲＬＣＸＰ　　ＳＴＧ ＰＬ周知のように、真核生物細胞の遺伝子は多望現象（ｐｈｅｎｏｉａｎｅ　ｄ ｅ　ｐｏｌｙｔｙｐｉｅ）を示す、この現象が生じると、コードされたタンパク 質のアミノ酸の一部が活性を変えずに置換されることがある０本発明はこの現象 によって生じるポリペプチドも対象とする。

従って、本発明はより特定的には、下記のペプチド配列を有するリンフ才力イン に係わる。

Ｘ−ＲＬＳ　　Ｐｌｉ：ＹＹＯＬ入ＲＡＭ　　ｔ、ＲＤＥε　に５ｃｐｃＩ、Ａ ＱＥＧ　　ＰＱＧＤＬ　　ＬＴ）ＣＴＱ　　ＥＬＧＲ，Ｄ　　ＹＲＴＣＬＴＩＶ ＱＫ　　ＬＫＫＭＶ　　ＤＫＰＴＱ　　Ｒ５ＶＳＮ　　ＡＡＴＲＶ前記配列中、 ＸはＨ、メチオニン残基又は下記の配列ＭＡＴＭＡ　　ＬＬＬＬＡ　　ＡＭＬＬ Ｇ　　ＮＰＧＬＶ　　ＦＳ及び前記配列と比べてアミノ酸が１つもしくは複数異 なるが活性は同じである配列から選択される。

本発明者は更に、本発明のリンフ才力インをコードする遺伝子のプロモーター領 域を構成するＤＮＡ配列も発見した。

この配列を下に示す。

１０　　　　　　　　２０　　　　　　　　　コ０　　　　　　　　　４０　　 　　　　　　　５０　　　　　　　　　　ｇ。

ＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴ　　ＣτＴτＧＡＣ１；ＣＴＴ　　ＣλＣτＣ丁Ｔ’ＴＣ ＣＡτＴττＣＣＡＣＧ　　丁Ｃλへｃｘｃｃｃｃ　　ＴＴbτＡにＣＣＴＧ 従って、本発明はこのＤＮＡ配列にも係わる。

本発明はまた、前述のごときＤＮＡのプロモーター配列を含むＤＮＡ配列及び本 発明のリンフ才力インをコードするＤＮＡ配列にも係わる。

本発明の発明者は先ず下記の操作によって相補的ＤＮ＾、Ｆｅ１２を得たニ ー　天然細胞障害性細胞と称するリンパ球の培養、−これらのリンパ球から細胞 内小胞体の膜に結合したメツセンジャーＲＮ＾を単離する操作、−前記メッセン ジャーＲＮＡから一重鎖相補的ＤＮ＾を得、次いで二重鎖相補的ＤＮＡを得る操 作、−バクテリオファージλＣＴｌ０のようなベクターへの挿入、 −該細胞のメツセンジャーＲＮ＾から一重鎖ＤＮＡプローブを形成し、ハイブリ ダイゼーション−サブトラクション法による精製にかけて、リンパ球中に存在し 且つ他の造血細胞には存在しないＲＮＡのコピーを選択する操作、−ベクター中 に挿入した相補的ＤＮＡから前記１０−プと反応するものを選択する操作、 −選択したｃＤＮ＾をプラスミドベクターに移入して増幅し、精製し、且つ配列 を決定する操作。

本発明のリンフ才力インは、一般的なペプチド合成によって、又は本発明のリン フ才力インをコードするＤＮＡ配列をプラスミドのような発現ベクターに挿入し 該発現ベクターで細胞の形質転換を行う操作を含む遺伝子工学の手法を適用する ことによって製造し得る。

そこで本発明は、プラスミドと、本発明のリンフ才力インをコードするＤＮＡ配 列を含む発現ベクターと、このベクターで形質転換した宿主とにも係わる。

本発明は、本発明のリンフ才力インを有効成分として含む医薬組成物にも係わる 。

本発明は、本発明のリンフ才力イン又はこの種のリンフ才力インの免疫原性配列 に対するモノクローナル抗体にも係わる。

本発明はまた、前述のごときモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマにも 係わる。

本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体の使用を含む本発明のリンフ才力イ ンの定量方法にも係わる。

そのためには、Ｒ１ＡタイプもしくはＩＲＭＡタイプ（寒冷抗原と寒冷抗体及び 標識抗体間の競合とを使用するサンドイッチタイプの方法）の放射線免疫法、又 はＥＬＩＳＡタイプもしくはＩＥＭＡタイプ（サンドイッチタイプの手法）の酵 素免疫法を使用し得る。

本発明のモノクローナル抗体は標準的な方法で製造できる。そのためには、必要 であれば、ポリペプチドをグルタルアルデヒド、カルボジイミド又はビス−ジア ゾ−ベンジジンのような結合剤によって破傷風トキソイドのような免疫原性物質 に結合し得る。

以下に、 −ＬＡに−２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ　Ｆｅ１２の製造、 −遺伝子ＬＡＧ−２の製造及び特性づけ、−精製組換え体ＬＡＧ−２タンパク質 の製造及びＮ１１．末端ペプチド配列の製造 を詳述する。

Ｉ−ハ　　　　　に　Ａｔ−ＴａＲＮＡの悴゛ａ胎児クローンＦ５５１１１Ｅ５ （表現型ＣＤ３−　ＣＤ２°）の単離及び特徴はＮｏｗ　ｉ　ｌ　ｌら（１）に よって既に記述されている。

ウェルを９６個有するＶ底プレートを用いて、組換え体インターロイキン−２と 、同種の照射され且つ単核化された血液細胞の栄養基層上のリンパ球ならし培地 上清と、ＥＢＶウィルスによって形質転換された細胞系（ＬＡＺ　３８８と称す る）との存在下で大量培養を行った。細胞は０日日にウェル当たり３０００個の 割合で配置した。１２日１に３ｘｌＯ”細胞／ｍｌのプレートを２００枚薬めて 、６ｘｌＯ”個の細胞を採気した。

Ｍａｎｉａｔｉｓ（２）、Ｍｅｃｈｌｅｒ（３）及び＾ｖｉｖ（４）の方法を一 部分変更して用いて、細胞質ＲＮ＾と小胞体の膜に結合したＲＮＡとｍＲＮＡと を調製した。即ち、Ｍｅｃｈｌｅｒ（３）の方法に従って４ｘｌＯ豐個のＦ５５ ｒｌｌＥ５細胞を低張衝撃及び機械的破砕にかけた後で複数の蔗糖勾配上に載置 した。小胞体の膜に結合したリポソームに担持された細胞質ＲＮ＾を蔗糖勾配間 で精製した。このようにすると、その後で、シグナル配列を有するｍＲＮＡ、即 ち粗面小胞体の膜に担持されているか又はその内部に分泌され次いで細胞の外に 分泌されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて操作を行えるようになる。

このＨＢ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ）と称するタイプのＲＮＡ単離方法を 使用すれば、細胞の外側に分泌することができないか又は膜に輸送することがで きない、従って本発明には係わりのない細胞内タンパク質番コードする転写遺伝 子の約９０％を簡単に除去することができる。＾ｖｉｖ（４）、Ｍａｎｉａｔｉ ｓ（２）及びＴｒｉｅｂｅｌ（８）の精製方法を使用すると、ライブラリーの作 製及びプローブの製造に必要な基質として使用されるＭｅ−Ｆ５５１１１Ｅ５＋ ＊ＲＮ八が単離されただけでなく、点Ｖで使用される種々のり胞系毎に約１０９ 個の細胞）の−ＲＮＡも単離された。

これらの方法は下記のステップを含む：Ａ−細胞質ＲＮ＾の製造 ２０〜３０ｘｌＯ’個の細胞が乾燥ペレット状態で入っているバイアルに、１１ の溶解（ｌｙｓｅ）バ”７フ７　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、６２．５ｍＭ 　ＥＤＴＡ、０，４％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，２，５Ｍ　ＬｉＣ１）を加え る。

ペレットを穏やかに溶解した後、ｓｏｕ　＋の１０％ＮＰ４０を入れた低温Ｅｐ ｐｅｎｄｏｒｆ管に前記溶解バッファを移す。

氷上に５分間おいた後、８にで１分間遠心分離する。上清（ＲＮＡ）を採取して 、１１のフェノールと１ｍｌのＣＨＣｌ１と１−１の５ＴＥ２％ＳＯＳ（１５０ ｍＭ　　ＮａＣｌ、　１０ｓ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ、　１ｚＭ　　ＭｇＣｌ２、２％ 　５ＯＳ）とが入っているＦａｌｃｏｎ管に加える。５にで１０分間遠心分離す る。上相を採取し、１−１のフェノールと１１のクロロホルムとを加える。　５ にで５分間遠心分離する。上相を採取する。

１００ｕｌの０．２Ｍ　ＥＤＴＡと、２００μ！の３８　ＮａＡｃと、５論１の エタノールとを加える。これを混合し、−２０℃で一晩放置する。１０にで３０ 分間遠心分離する。ペレットを乾燥する。これを４００ｖ１の低温０．３Ｍ　Ｎ ａＡｃ中にとる。前記Ｆａｌｃｏｎ管に１論１のエタノールを加える。このエタ ノールをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、混合し、−２０℃で１時間放置する。１ ３にで１０分間遠心分離し、アルコールを吸い上げ、ペレットを乾燥する。　３ ０．１の水を加える。この管を遠心分離にかけ、−８０℃で即座に冷凍する。変 性ゲル（加熱滅菌したＴＢＥ（Ｔｒｉｓ、　Ｂａ５ｅ、　ＥＤＴＡ）バッファｐ Ｈ８，５（ＢＥＴ　ＩＩＩｇ／５ｏｌ）中１％のアガロース）上に１１℃置いて 、分解（ｄ６ｇｒａｄａｔｉｏｎ）及び量を制御する。

Ｂ−小胞体の膜に結合したメツセンジャーＲＮ＾の製造　　′予め０．１％のＤ ＥＰＣで処理した氷温度のＲＳＢ低張バッファ（１０ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭ 　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩＣｐＨ７，４））中に、細胞を１０ ’［胞／曽１の割合で取り上げる。氷上に５分間放置する。ｌＯパルスのＤｏｕ ｎｃｅホモジナイザー（タイプＢ）で細胞を機械的に破砕する。　１０００ｇで ２分間遠心分離して核を沈降させる。上清即ち「細胞質抽出物」を遊離リポソー ム／膜抽出物の分離に使用する。　０．７＋ｅｌの細胞質抽出物を３．２ｍｌの ２．５ＭＴＫ蔗糖バッファ　（０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＩ　ｐＨ７，４， ０，１５８にＣ１，０，００５Ｍ　ＭｇＣｌ□）と混合し、この混合物を２１の ２．５Ｍ蔗糖ＴＫ上に載置する０次いで、８＋ａｌの２．０５Ｍ蔗糖ＴＫ及び４ ！１１の１．３Ｍ蔗糖ＴＫを順次加える。　５ｐｉｎｃｏ　５Ｗ２８タイプのス イングローターで、２５．０ＯＯｒ＋ａｐ、４℃で５時間遠心する。　２．０５ Ｍ蔗糖と１．３Ｈ蔗糖との間に含まれたバンドを針で突いて取出す、同量のＴＥ ｔＯ：１（１，０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加える、 フェノール及びフェノール−クロロホルム混合物で順次抽出する。

１／１０の３８　ＮａＡｃ及び２．５ｖｏ　ｌ　、エタノールで沈澱させる。

ポリ（＾）’ＲＮへの選択には、１．２ｍｌのゲルを含むオリゴ（ｄＴ）−セル ロースカラムを、ＳＤＳを加えたローディングバッファ（ｔａｍｐｏｎ　ｄｅ　 ｃｈａｒｇｅ）即ち２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、０．５ＨＮａ Ｃ１、ＩＩＩＭＥＤＴ八によって平衡化したものを使用する。　０．１Ｍ　Ｎａ ＯＨと５ｍＭ　ＥＤＴＡとの水溶液で洗浄する。５倍容のローディングバッファ で洗浄する。ＲＮＡを水に溶解し、６５℃で５分間加熱する。同じ量のローディ ングバッファを２回加える。温度が平衡になるまで待つ、流出液（ｅｆｆｌｕｅ ｎｔ）を回収する。これを６５℃に加熱して操作を繰り返す、カラムを５〜１０ 倍容のローディングバッファで洗浄し、次いで４倍容のローディングバッファ０ ．１Ｍ　ＮａＣ１で洗浄する。ポリ（＾）”ＲＮＡを２〜３倍容の１０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＯ５で溶離す る。

３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）を１７１０の割合で加える。　ｐｏｌｙ（＾ ）”ＲＮＡを２．２倍容のエタノールで沈澱させる。

０−　　−イブ−１−の　ｊ Ｆ５５１１１Ｅ５細胞の細胞小胞体の膜に結合したメッセンジャーＲＮＡから一 重鎖相補的ＤＮ＾を製造し、次いで二重鎖相補的ＤＮ＾を製造し、ＥｃｏＲＩリ ンカ−を加え、ベクター＾（：Ｔ１０のＥｃｏ８１部位に連結し、ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏパッケージング（ｅｍｐａｑｕｅｔａｇｅ）を行う操作を、Ｃｕｂｌｅｒら （５）及びＨｕｙｎｈら（６）の方法で、市販のクローニングキット（＾ｍｅｒ ｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、＾ｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＩ＞を用いて実施 した。

そのためには、小胞体の膜に結合させるーＲＮ＾をｌｕｇ使用する。この物質の 約８０％が一重鎖ｃＤＮ＾に変換された。

ＩＩＩ　−！へプローブの　告 「除去すべき」細胞（Ｊｕｒｋａｔ、Ｌａｚ　３８８、Ｕ９３７、Ｋ５６２）の メッセンジャーＲＮＡを過剰に用いるハイブリダイゼーションを２サイクル行い １次いでヒドロキシアパタイトカラムに通してｃＤＮ＾−ｍＲＮ＾二重鎮二重体 複合体する操作を行うサブトラクションによって一重鎖相補的ＤＮＡプローブを 製造する。

ハイブリダイゼーションを２サイクル行い且っカラムに２回通すと、約６〜７％ の放射能が残る。即ち、ＭＢ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ）と称するＦ５５ １１１Ｅ５物質の約７％がＭ瘍細胞Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、υ９３７及びＬａ ｚ３８８中に存在しなくなる。この物質はＭＢ−Ｆ５５１１１Ｅ５ライブラリー 中で対応ｅＤＮ＾を探すのに使用されるプローブである。この方法はＤａｖｉｓ ら（７）のハイブリダイゼーション−サブトラクションの条件を使用する。

消去式プローブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ　ｐｒｏｂｅ）［Ｊｕｒｋａｔ、に５６ ２、Ｌａｚ３８８、Ｕ９３７のＭＢ−ＦＳＳ−１１ＥＳ−ｍＲＮ＾］の製造５ｕ ｇノＭＢ−Ｆ５５１１１Ｅ５　ｍＲＮ＾から、３２Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性：８０ ０Ｃｉ／ｍｍｏｌ−’）で標識した一重鎖ｃＤＮ＾プローブを５０μｌの量で製 造する。

逆転写酵素と共に４２℃で２時間インキュベートした後、５ｕ＋の０．２Ｍ　Ｅ ＤＴＡ及び５０．　ｌの０．２Ｎ　ＮａＯＨを順次加える。６５℃で１時間イン ＃ユヘー）ｔ６．６０ｐｌノＩＮ　ＨＣＩ及び３０Ｉ１１ノ２ＭＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ（ｐ）１８）を加える。　１／１０倍容の３ＭＮａＡｃを加える。前記４つの 腫瘍系のｍＲＮ＾を各７．１加えて１０−ブを沈澱させ、次いで２．５倍容のエ タノールを加える。

−２０℃で１時間放置する。遠心分離にがけ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥 すル、７．５１１１（’）１４２０中に取り上げ、７．５，１ノ０．５Ｍ　Ｎ１ １８２ＰＯ４（ＰＨ７）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％ＳＤＳヲ７１０　ｔ　 ル。

６８℃のインキュベーターで２０時間インキュベートする。

インキュベーター内の物質を１ｍｌの０．１２Ｍ　ＮａＨｚＰＯ＜、０．１％Ｓ ＤＳで希釈する。同じバッファ中で６０℃で平衡化したヒドロキシアパタイトカ ラムにかける。流出液（−重鎖物質）を５ｅｅ−ブタノールで濃縮し、Ｇ−５０ カラムに通してリン酸バッファを除去する。各腫瘍系のｍＲＮ＾を新たに７μｇ ずつ加え、ハイブリダイゼーションとカラムに通す操作とを繰り返す。

このようにしてカラムに２回通すと、出発時の放射能の量の７％が回収される。

ＩＶ　−ｃＤＮ＾　ローンの　　　　　　づ番１０−プとのハイブリダイゼーシ ョン及び選別（ｃｒｉｂ−Ｉａｇｅ）を、Ｈｕｙｎｈ（６）の方法で、組換え体 ファージとナイロンフィルター法とを用いて行った。ハイブリダイゼーションは 、予備ハイブリダイゼーション後に、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）タイプのハイ ブリダイゼーション溶液を用いて且つ一重鎖ＭＢ−Ｆ５５１１１Ｅ５消去式プロ ーブを５ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍｌで加えて、４２℃で行った。

約ｚｏ、ｏｏｏの組換え体ファージを選別した。前記消去式プローブを用いて約 １２０の陽性ファージが得られた。そのうち、約２００塩基対の挿入物を含むフ ァージを１つ選択して、ｐＢＳ中で増殖した。これらのファージの挿入物をＴｒ ｉｅｂｅｌら（８）によって記載されているような３２　ｐ　ｌｌ［識プローブ の製造に使用した。１２０の陽性ファージのうち３８のファージが交差反応で前 記プローブとハイブリダイズした。これら３８のファージの挿入物によってＬＡ （ニー２フアミリーの定義づけが可能になった。この方法は分子生物学で一般的 に使用されているも、のである（２）。

陽性ファージの培養、対応ＤＮＡの精製、切り出しによるフラグメント形態の相 補的ＤＮ＾の低ゲル化点アガロースゲル上での電気泳動による精製をＭａｎｉａ ｔｉｓ（２）及びＨｕｙｎｈ（６）の方法で実施した。

■−いｃＤＮＡの　ｉ　　　ローニン エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによって消化し且つ子牛の腸のアルカリ性ホスフ ァターゼによって処理したプラスミドベクターｐＢＳ中にＬＡＧ−２フアミリー の最も長い相補的ＤＮ＾を連結させる操作と、コンピテント細菌ＪＨ１０９の形 質変換と、二重選別システム（アンピシリン＋Ｘ−ｇａｌ／ＩＰ丁Ｇ）による組 換え体の選別とを一般的な遺伝子工学の手法によって行った。

ｐＢＳ中でクローン化した組換え体相補的ＤＮＡの精製及び大ｊ１製造を、Ｎａ ｎ１ａｔｉｓ（２）によって記述されている塩化セシウム勾配による精製方法を 用いて実施した。

テストすべき相補的ＯＮ＾に対して特異的なＲＮ＾プローブを組換え体プラスミ ドの純粋調製物から製造した。

最も長いｃＤＮＡはｅＤＮＡ　Ｆｅ１２であり、その配列は本発明の対象の１つ である。

これらの各ファミリーに対応する種々の転写体くメツセンジャーＲＮ＾）の大き さ及び細胞分布の分析と、細胞Ｊｕｒｋａｔ、Ｌａｚ３８８、υ９３フ、Ｋ５６ ２のメツセンジャーＲＮ＾とのハイブリダイゼーションの分析によるハイブリダ イゼーション−サブトラクション法の全体的評価と、減少した転写分布での興味 深いファミリーの決定とは、Ｔｒｉｅｂｅｌら（８）によって操作条件が記述さ れているｒノーザンプロット」法によって実施することができた。

Ｖｌ　−ｃＤＮＡ　Ｆｅ１２の　　゛ 相補的ＤＮＡ　Ｆｅ１２の配列決定を、Ｓａｎｇｅｒの方法に従いジデオキシヌ クレオチドによるヌクレオチド鎖終結反応で「ポリメラーゼＤＮＡの大フラグメ ント」（Ｋｌｅｎｏｗ酵素）を使用して、精製組換え体プラスミドから直接に（ 二重鎖ＤＮＡ配列）、又はファージ８１３中でクローニングした後で間接的に（ −重鎮ＤＮ＾配列）行った。ここで留意すべきことして、これらのｃＤＮＡは２ つの鎖について配列決定されたものであり、この配列は、二重ｇＤＮＡで構成さ れた配列の解釈を容易にすべくこれらのｃＤＮＡのフラグメント（ＥｃｏＲＩ− Ｐｓｔ及びＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ）をプラスミドｐＢＳ中で再クローン化した後で も決定された。

ＶＩＩ−ＬＡに−２ノ／　−７プロ・・１細胞質内総ＲＮ＾の抽出をＴｒｉｅｂ ｅｌら（８）の方法で行った。

このＲＮＡをグリオキサルの存在下でアガロースゲル上で分離し、やはりＴｒｉ ｅｂｅｌら（８）に従いナイロン膜にトランスファーした。このナイロン膜のハ イブリダイゼーションを、Ｔｒｉｅｂｅｌら （８）の方法によりｃＤＮＡ　Ｆｅ１２をａｓｐで標識して形成したプローブＦ Ｃ２４を用いて、５０％のホルムアミドの存在下で４２℃で実施した。

ハイブリダイゼーション−サブトラクトジョンに使用した細胞系、例えばＪｕｒ ｋａｔ、Ｌａｚ３８８、Ｋ５６２及びＵ９２７では遺伝子ＬＡＧ−２は発現しな い、遺伝子ＬＡＧ−２の発現は、造血組織以外（ｅｘｔｒａ−ｈａｍｉｐｏｆ＃ ｔ　１ｑｕｅ）の組繊、例えば脳又は肝癌細胞系では見られなかった。遺伝子Ｌ ＡＧ−２の発現は、１　）　ＮＫ型もしくはＴ型に属するＩＬ−２依存性クロー ン系もしくはポリクローン系中に、又は２）フィトヘマグルチニンによって刺激 した後の末梢血液リンパ球中に４日目もしくは５日目から、約０．８ｋｂのメツ センジャーの形態で見られるだけである。

従って、遺伝子ＬＡＧ−２の発現はＴリンパ球又はＮＫリリン球の抗原又はマイ トジェン刺激によって惹起する。この遺伝子の発現は活性化後かなりの時間がた ってから（４日目〜５日目）生じる。この発現は、リンパ球細胞系をインターロ イキン−２と共に培養した場合には、長期間（数箇月）にわたって維持される。

Ｖｌｌｌ　−ＬＡｆｌニー２ノ：ｙフｏ−細胞系に５６２、Ｌａｚ３８８及びＪ ｕｒｋａｔのゲノムＤＮ＾を制限酵素で消化した。消化したＤＮＡをＴｒｉｅｂ ｅｌら（８）の方法に従って０．７％アガロースゲル上で移動させ、ナイロン膜 にトランスファーした１次いでこのフィルターをＴｒｉｅｂｅｌら（８）の方法 でプローブＦＣ２４とハイブリダイズした。１０−プＦＣ２４とハイブリダイズ する同じ制限フラグメントが、ＥｃｏＲＩ、Ｂｔ＋ａＨＩ又はＨｉｎｄｌｌｌで の消化後にも発見された。これは、ＤＮＡ全体が抽出されたことを意味する。Ｅ ｃｏＲＩについては、約２ｋｂ、３．３ｋｂ及び５．２ｋｂの３つの特徴的バン ドが見られる。

クローニング後に遺伝子ＬＡＧ−２の分子構造を確定す８〆に使用されるのはこ れら３つのバンドである（下記の説明参照）０種々の制限フラグメントを分析し た結果、遺伝子ＬＡＧ−２は非反復性である（ｕｎｉｑｕｅ）確率が極めて高く 、半数体ゲノム当たり１つのコピーの割合で存在することが利明した。

ＩＸ　−ＬＨ玉ＰＣ−２の゛　　びプロモーター　−の　１Ｄａｒｉａｖａｃｈ ら（１０）の方法に従って、ＥＢＶで形質転換したヒトＢ細胞の細胞系のＤＮＡ から得たバンクＬＹ６７からゲノムＤＮＡクローンを単離し、Ｈｂｏｌで部分的 に消化し、更にファージλ２００１に挿入した。　Ｆｅｉｎｂ６ｒｇ（１１）の 方法、即ちランダムヘキサマーを用いるプライマー法によって制限フラグメント ＦＣ２４を標識し、これを使用して２ｘ　１０５プラークのヒトゲノムＤＮＡラ イブラリーを選別する。このようにして６つのクローンＣ０１〜ＧＣ６を単離し ５、プローブＦＣ２４を用いて制限マツプによりファージＤＮ＾を特性づける。

これらのクローンからは、ハイブリダイゼーション後に、同一の制限マツプが得 られる。クローンＧＣＩからは、プローブＦＣ２４とハイブリダイズする３つの ＥｃｏＲＩフラグメントが単離される。これらのフラグメントは２ｋｂ、３．４ ｋｂ及び５．２ｋｂである。これらのフラグメントをプラスミドｐＢＳのＥｃｏ Ｒ１部位中に部位−ン化する。

次いで、これらのサブクローンの詳細な制限マ・ノブを作成し、得られた結果を 前述のＦＣ２４配列の制限マツプと比較する。ゲル化点の低いアガロースゲル上 に多数のフラグメントが得られる。これらのフラグメントをバクテリオファージ Ｍ１３＋ａｐ１８、Ｍ１３ｗｐ１９中にサブクローン化する。これらのフラグメ ントの配列を、Ｓａｎｇｅｒら（９）のジデオキシ鎖終結法によって一重鎖ＤＮ Ａから得る。

このようにして、最初の３つのエクソンに係わるエクソン−イントロン区域とプ ロモーター領域の配列とを決定することができた。エクソン１は前記ＦＣ２４配 列のヌクレオチド２〜７６を含み、エクソン２はヌクレオチド７７〜１７９を含 み、エクソン３はヌクレオチド１８０〜２７８を含む、尚、ＦＣ２４配列の＋１ 位のヌクレオチドはゲノムのレベルでは見られず、このヌクレオチド（ＦＣ２４ 配列中のＣ）はｃＤＮ＾バンク中でのクローニングに使用されたＥｅｏＲＩリン カ−に属する可能性がある。ゲノム配列中の対応する位置（５ページ及び６ベー ジ（日本語明細書７ページ）に示した配列の６８０位）にはＡが存在する。エク ソンの配列は前記ＦＣ２４クローンの配列と同じであり、従って、ＦＣ２４クロ ーンの由来源であるｃＤＮ＾ＤＮＡラリー及びゲノムライブラリーＬＹ６７が２ つの別個の個体がら得た細胞物質に由来するという事実がら、異種の個体間には 遺伝子多望現象が殆ど存在しないことになる。

第１図に示したプロモーター配列は７０５のヌクレオチドからなり、最後の３つ のヌクレオチドはヌクレオチドＡ、Ｔ及びＧ（翻訳開始コドン）に対応する。こ の配列は、遺伝子ＬＡ（ニー２レベルで、Ｆｅ１２　ｃＤＮへの分析によって決 定された翻訳開始部位（＾ＴＧ）の５°位に存在する７０２のヌクレオチドに対 応する。プロモーターが結合し得る部位（下線部分）は、１７３８６位のＴＡＴ 八ボへクス、２／２９１位のＣＣ＾＾丁ボックス、３／１８３位（配列Ｇ＾＾に ＴＡＣＣＡＣ）のＧＭ−ＣＳＦタイプ（コンセンサス配列Ｃ＾＾＾ＴＴＣＡＣ） のデカヌクレオチドである！初の２つの部位（ＴＡＴ＾及びＣＣＡＡＴ）は真核 生物遺伝子のプロモーター中に混存する。最後の部位（ＧＭ−ＣＳＦタイプのデ カヌクレオチド）はＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子及びヒトのＩＬ−４をコー ドする遺伝子の５′部分に見られるサイト力インの比較的特異的な配列であると 記述されている（１２）、　４／また、配列ＴＧＡＣＴＣ＾のタンパク質＾Ｐ− １の結合部位は３６７位〜３７３位（１４及び１５）に翻訳すべきＦＣ２４クロ ーンの転写によって誘導されるｍＲＮ＾のコード領域及び翻訳能を決定するため に、Ｔ３もしくはＴ７ボリメラーゼを使用し且つ基質としてベクターｐＢＳ中の ＦＣ２４クローンを用いて、Ｆｅ１２　ｃＤＮ＾の２つの鎖を転写した。

次いで、メチオニンコＳＳの存在下でウサギ網状赤血球抽出物を使用して、２つ のＲＮＡ調製物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳した。３゛側にポリ−八尾部を含むセ ンスＲＮＡ（＾ＲＮｓｅｎｓ）は、５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅタイプのゲル上での移動 後にオートラジオグラフィーで検出できる分子量約１６，０００ダルトンのタン パク質に翻訳された。この分子量測定値は、完全なシグナルペプチドを有する切 断されていないＬＡに−２ポリペプチドの１４５のアミノ酸に対応する１６，３ ８０という分子Ｉ計算値に極めて近い、ウサギ網状赤血球抽出物との反応でアン チセンスＲＮＡを基質として使用すると、翻訳産物は１つも検出できなかった。

Ｘｌ−−ＬＡＧ−２ンＢ９　　　　（：Ｑユ列トｌ兄−「バクロウィルス」タイ プのベクターを用いるシステムを使用した。このシステムは、外来遺伝子を含む 運搬ベクターとウィルスのゲノムとの間のｉｎ　ｖｉｖｏ組換えを使用して、昆 虫細胞、例えばＳＦ９細胞（寄託＾ＴＣＣＣＲＲＬ　１７１１）中で外来タンパ ク質を産生することができる０組換え体プラスミド及びウィルスゲノムのトラン スフェクションの後で、組換え体タンパク質を大量に産生せしめるＳＦ９細胞を 連続的精製（組換え体の選別）によって運択する。前記タンパク質は通常は切断 されており（細胞内部から疎水性シグナルペプチドが除去されている）、且つグ リコジル化されている（少なくとも部分的に）。

組換え体タンパク質の検出： Ｆｅ１２　ＯＮ＾クローンの翻訳によって誘導されるＮＯ２末端配列に対応する ２４のアミノ酸を含む合成ペプチドを合成した。

次いでこのペプチドをキャリヤータンパク質ＫＬＨ（“Ｋｅｙｈｏｌｅｔ、ｙ論 ｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ”）に結合した。ウサギを繰返し免疫すると、Ｅ ＬＩＳΔタイプのテストで１／１００００でこの合成ペプチドと反応する血清が 得られた。これらのウサギ血清のイムノグロブリンフラクションをプロティンＡ −セファロースカラムで精製した。

ＦＣ２４フラグメントを含むウィルス組換え体クローンによって怒染させたＳＦ ９細胞の上清を培養３日目に得、前述の抗ＦＣ２４抗ペプチド精製抗体を用いて 「ウェスタンプロット」法でテストした。その結果、ペルオキシダーゼで標識し たヤギの抗ウサギ抗体での順環化（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）の後で約１４ｋｄの タンパク質に対応する明確なシグナルが得られた。

Ｘ１ｌ−“　ＬＡに−２ンパ　　の １）ｔｔ′　　　え　タンパク　のアフイニテイ力ラム　　　びＬ迷」［た新− ＬＡＧ−２ｃＤＮ＾のＮＨ２末端ペプチドに対するウサギ抗体をプロティンＡ− セファロースに通して精製した。この精製抗体を、ゲル１ｍｌ当たり５ｕｇの抗 体の割合で、活性ＣＩ−セファロースに結合した。イムノアフイニテイ力ラムに 使用した希釈バッファは下記の通りであるニ ー　　２０ｍＭ　ＴＲｌ５．１０％エチレングリコール、０．１％Ｎ−オクチル グルコピラノシド、ｐＨ７，５のバッファ（ローディングバッファ）、 一２０ｍＭ　ＴＲｌ５．１０％エチレングリコール、０．１％Ｎ−オクチルグル コピラノシド、０．２５８　ＮａＣｌ、ｐｌ’１７．５のバッファ（洗浄バッフ ァ）、 ５０ｍＭグリシン、ｐＨ２，５のバッファ（溶離バッファ）、−５０−Ｈトリエ チルアミン、ｐＨｌｌのバッファ（再生バッファ）、 一２０ｄ　ＴＲｌ５塩基、２，５％マンニトール（自発的ｐ）ｌ約９）のバッフ ァ、 −２０ｍＭ　ＴＲｌ５．１０％エチレングリコール、０．１％トオクチルグルコ ピラノシド、０，０１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７，５のバッファ（免疫吸着剤 保存用バッファ）。

２）１１え Ｆｅ１２　ｃＤＮ八（クローン５−０１−八６）を組込んだバクロウイルファで １７２に希釈し、０．７＋ａｌ／ａｍの流速（＃線速度＝９．５ｃ＋ｍ／ｈ）で 室温で５１の免疫吸着剤上に導入する。

−次いで、２８０での光学密度が安定する（約０．０８０Ａｌｌ）までゲルをロ ーディングバッファで洗浄する。

−（１，［１，が約Ｏになるまでゲルを洗浄バッファ（０，２５Ｍ　ＮａＣ１） で洗浄する。

−結合したタンパク質を低温溶離バッファで溶離する：溶出液（ｅｌｕａｔ）は 、２０＋ｓＭ　ＴＲｌ５．２５Ｂ／ｍｌマンニトールを含む同量のバッファ中に 回収する。

−カラムを再生バッファ（ゲルの約１０倍容）で洗浄し、次いでローディングバ ッファで再平衡化する。これを保存バッファ中４℃で貯蔵する。

３　）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ・の゛　　の背当たり２００．　ｌの溶出液を１０Ｉ ＩｌのＩＮ　ＴＲｌ５塩基で中和してから濃縮乾固する。これらの試料を２０ｖ １の電気泳動試料バッファ中に取り上げ、この試料１μｍをゲル上に載置する０ 次いで、ＳＯＳゲルをクーマシーブルーで染色する。しへＧ−２タンパク質（１ ４ｋｃｌのバンド）の量の測定値は溶出液１１当たり約５００ｎｇ〜ｔｕｇであ る。

４　）　５ＤＳ−ＰＡＩＩ：Ｅにか（つ　にトーンスフ　−　ｔ・　のＮ１正ｌ − ａ　）　５ＯＳ−ＰＡにＥ タンパク質の電気泳動を、　Ｓｈａｇｇｅｒ及びＶＯ（ｌ　Ｊａｇｏ＠の方法（ ＾ｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、１６６：３６８−３７９．１９８７）で行う 。

ｂ）　−ンスフ　−　び　４ Ｐ、ＮＡＴＳＵＤ＾ＩＲ＾の方法（ＪＢＣ，ｖｏｌ、２６２．２１：１００３５ −１００３８．１９８７）を使用する。　５ＤＳ−ＰＡにＥ又はＰＶＤＦ膜への トランスファー及び用いて、自動ＥＤＮＡＮ分解法により最初の２０のアミノ酸 の配列を分析する。結果は下記の通りである：サイクル　　アミノ酸 ｌ　　　　　　　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ＾ｌｘ　Ｃ ｌｙ　Ｇｌｕ５　　　　　　　Ｃｌｕ ６　　　　　　　　　Ｔｙｒ ８　　　　　　　　＾ｓｐ　　Ｃ１ｙ 尚、使用した方法では通常、最初のアミノ酸が不確定である。

Ｕ： この配列は、前記したＦＣ２４クローンの翻訳によって推定されるＬＡに−２タ ンパク質の配列に確かに対応し、シグナルペプチドが２１位と２２位との間で切 断されていることを示す。

従って、アルギニンは成熟ＬＡ［ニー２タンパク質のＮＨ２末端アミノ酸である 。

Ｘ１ｌｌ　−Ｊ％ＬＡＧ−２ンハノ’ Ｆ５５１１１Ｅ５細胞（Ｆｅ１２　ｃＤＮ＾クローンの由来源）を内部標識し、 対照としてＥＢＶで形質転換されたＢ細胞及びＬｉｚ３８８を用いて免疫沈降を 行った。該細胞のタンパク質（３ｘｌＯ’細胞）をメチオニンコ’５（２００ｕ Ｃｉ／ｍｌ）により１０’細胞／■ｌの濃度で４時間標識した。標識後、遠心分 離によって細胞の上清を得、１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と０．１％のデオ キシコール酸ナトリウムとを含む０．０１Ｍリン酸バッファ（ｐｉ（７，２）で ５倍に希釈した。免疫沈降は、Ｍｏｉｎｇｅｏｎら（１３）の方法に従い、セフ ァロ−スープロチインＡビーズに結合したウサギ異種抗体を用いて行った。免疫 沈降したＬＡＧ−２タンパク質をＳＯＳローディングバッファ（３％５ＯＳ）中 でインキュベー）　（１００℃で３分間）することによってセファロース４Ｂビ ーズから離脱させ、還元条件（５％のβ−メルカプトエタノール）及び非還元条 件でＳＯＳポリアクリルアミドゲル（１５％アクリルアミド）にかけた、還元条 件でも非還元条件でも、オートラジオグラフィーの後で約１５ｋｄのバンドが得 られる。このバンドはＦ５５ＩＩＩＥ５４１胞の上清中に見られるが、Ｌａｚ３ ８８細胞の対照上清中には見られない、従って、これらの実験は、ＬＡＧ−２タ ンパク質が確かにヒト活性化細胞から自然に分泌されることを立証する。また、 見出された分子量はバクロウィルスシステムと称するシステムで産生される組換 え体タンノ＜り質の分子量に類似している。

下記の文献は明細書中に引用されたものである。

ｇａｍｍａ　ｇｅｎｅｓ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１７：１２０９゜ 、　　Ｓａｎｇｅｒ、　　Ｆ、、　　Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ　ａｎｃｉ　Ａ、Ｒ ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　　１９７７、　ＤＮＡａヒ１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ 、　　ＵＳＡ　　７５：５４６１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　@　　　＾ ｅｒｎ、’ＣニーＬｘ＝ｂｄａ　　ｃｈａｉｎ　　ＩＬｎ’ｌ　　Ｃｌａｍｂｄ ａ４　　ａｎｄ　ＣＬａ北ｄａ５　ａｒｅ　　　　　　Ｄ’ｕｋｕｙａｍａ、　 　Ｒ，、Ｍａｅｋａｗａ、　　Ｍ、、　　Ｋｕｄｏｈ、　Ｊ、、　Ｓｈｉｍｉｚ ｕ、　Ｎ、、　　　　　　１：ｏｒ　　ｈｕｍａｎ　　ＸＬ−４ａｎｄ　　ｉｔ ｓ　　ａｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｔｉ１ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　　　　　　ｌ ’、　　Ｔｒｉｅｂｅｌ、　　Ｍ、Ｇｒａｚｉａｎｉ、Ｆ、Ｆｏｒ＠５ｔｉｅｒ 、Ｄ、Ｂｅ１ｌｅｔ、Ｃ，）ｌ？ｅＳ　　　　　ｗｉｔｈ　　　　　ｎａｔｕｚ ａｌ　　　　　ｋｉｌｌｅｒ−Ｌｉｋ＠　　　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　　　　Ｎａ ｔｕｒｅ、@　　　　　　　　　　　ｑ ３２５ニア２１ １４、　Ａｎｇａｌ、　Ｐ、、工ｍａｇａｗａ、　Ｍ、、　Ｃｈｉｕ、　Ｒ，、 ５ｔｅｉｒｉ、　Ｂ、　Ｉｍｂｒａ、　　　　Ｒｔ、　　Ｒｈａｍｓｄｏｒｆ、 　Ｈ，Ｊ、　Ｊｏｎａｔ、　Ｃ，１（ｅｒｒｌｉｃｈ、　Ｐ、　＆にａｒｉｎ、 　Ｍ、　　　　５（１９８〕）　　Ｃｅ１ｌ　　４９．　７２９−７３９゜１５ 、　　　Ｌｅｅ、　　Ｗ、、　　Ｍ支ｔｃｈｅｌｌ、　　ｐ、　　＆　　Ｔｊｉ ａｎ、　　Ｒ１（１９１３７）　　Ｃｅ１ｌ　　４９．@　　　　　　　　Ｔ 阿 特表千３−５０２６９７　（１１） １ユ！勺１凶ｊ」Ｌ ＾ｓｐ　　　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 Ｐｈｅ　　　フェニルアラニン Ｇ！ｙ　　　グリシン Ｈｉｓ　　　ヒ入チジン １１ｅ　　　イソロイシン ＾ｓｎ　　　アスパラギン Ｐｒｏ　　　プロリン Ｇｌｎ　　　グルタミン ＾ｒｇ　　　アルギニン Ｔｒｐ　　　）リプトファン Ｔｙｒ　　　チロシン 浄書（内容に変更なし） 手続ネｍ正書（方式） ％式％ 明の名称　　新規のリンフ才力イン、該リンフ才力インをコードするＤＮＡ配列 及び該リンフ才力インを含む医薬組成物 正をする者 件との関係　特許出願人 名　称　　　ルーセル・ユクラフ 正命令の日付　平成３年３月１２日 王の対象　　図　面 国際調査報告 −開−嚇ｉ神−−１昧　ＰＣＴ／ＦＲ８９１００４９１ｍＡｌｕｍ−・０ｒＴ７ １Ｄ只Ｑ／ｌ’１ｆ１４ＱＩ国際調査報告　　　ＦＲＢ９００４９１

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．下記のペプチド配列 【配列があります】 並びに該配列と比べて１つ又は複数のアミノ酸は異なるが活性は同じである配列 からなる又はこれらの配列を含むリンフォカイン。
2. ２．下記のペプチド配列 【配列があります】 ［式中、ＸはＨ、メチオニン残基又は下記の配列【配列があります】 から選択される］ 並びに該配列と比べて１つ又は複数のアミノ酸は異なるがが活性は同じである配 列からなる請求項１に記載のリンフォカイン。
3. ３．請求項１又は２に記載のリンフォカインをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮ Ａ配列。
4. ４．請求項１又は２に記載のリンフォカインをコードするＤＮＡ配列。
5. ５．本質的に下記の配列 【配列があります】 を含む請求項４に記載のＤＮＡ配列。
6. ６．請求項１又は２に記載のリンフォカインを活性成分として含む医薬組成物。
7. ７．請求項１又は２に記載のリンフォカイン又はこの種のリンフォカインの免疫 原性配列に対するモノクローナル抗体。
8. ８．請求項７に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
9. ９．請求項１又は２に記載のリンフォカインをコードするＤＮＡ配列を含むプラ スミド。
10. １０．請求項１又２に記載のリンフォカインをコードするＤＨＡ配列を含む発現 ベクター。
11. １１．請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主。
12. １２．プロモーター配列として本質的に下記の配列【配列があります】 の全体又は一部分を含むＤＮＡ配列。
13. １３．請求項１２に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
14. １４．請求項１２に記載のプロモーターＤＮＡ配列と請求項１又は２に記載のリ ンフォカインをコードするＤＮＡ配列とを含み、前記リンフォカインを前記プロ モーター配列の制御下で発現させる発現ベクターによって形質転換された宿主。