JPH03502322A - Non-glycosylated analogs of human colony-stimulating factor - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトコロニー形成刺激因子の非グリコジル化略似体発明の背景 本発明は内因性据タンパク質の類似体、特に造血細胞の発生を誘導し得る分泌タ ンパク質の類似体に関する。[Detailed description of the invention] Background of the Invention of Non-Glycosylated Substance Mimics of Human Colony Formation Stimulating Factor The present invention provides analogs of endogenous proteins, particularly secreted proteins capable of inducing the development of hematopoietic cells. Concerning protein analogues.

細胞外環境へ細胞により分泌される数多くのタンパク質は、共有結合された炭水 化物単位（一般には、アスパラギン側鎖にＮ−グリコシド結合によって結合され たオリゴ糖単位の形をとる）を翻訳後に獲得する。特定の分泌タンパク質に結合 されるオリゴ糖単位の構造２よび数は両方とも極めて可変的であり、単一の糖タ ンパク質に属すると考えられる広範囲の見掛は上の分子系合体をもたらす。ヒト ３よびｗＪ物用治療薬剤としての利用可能性を有する多（の調節タンパク質は、 このタイプの分泌タンパク質である。組み換え系に２いてこの糧のタンパク質を 発現させようとする試みは、この可変的炭水化物成分に起因する不均質性により 煩雑なものとなっている。Many proteins secreted by cells into the extracellular environment contain covalently bound carbohydrates. compound unit (generally linked to the asparagine side chain by an N-glycosidic bond) (in the form of oligosaccharide units) are acquired post-translationally. Binds to specific secreted proteins Both the structure 2 and the number of oligosaccharide units produced are highly variable; The wide range of appearances considered to belong to proteins leads to the above molecular system combination. human The regulatory proteins of poly(3) and wJ have potential as therapeutic agents for This type of secreted protein. In a recombinant system, the protein of this food is Attempts to express It has become complicated.

免役調節タンパク質、すなわちリンフ才力イン、は分泌タンパク質の一群であり 、その多くは穏タンパク質である。例えば、造血細胞の増殖２よび分化はコロニ ー形成刺激因子またはＣ’　ＳＦと集合的に呼ばれている多数の糖タンパク質に よつ℃仲介される。ヒトでは、これらのり／バク質に顆粒琢−マクロファージコ ロニー形成刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）が含まれ、この糖タンパク質は正常骨髄か らの顆粒球とマクロファージの生産に必要であり、また分化した成熟顆粒球とマ クロファージの活性を調節すると思われる。他のヒトＣ３Ｆ（ｈｃｓＦ）にはマ クロファージの選択的増殖を誘導するマクロファージＣ３Ｆ（Ａｆ　−ＣＳ　Ｆ 　’！たはＣ３Ｆ−１）、顆粒球の発生を刺激する顆粒球Ｃ３Ｆ（Ｇ−Ｃ５Ｆ） 、および赤血球前駆細胞のヘモグロビン含有細胞への発生を誘導するバースト・ プロモーティング・アクティビティ（ｂｓｒａｔ　ｐデｏｔｎｏｔｉｎｇａｃｔ ｉｖｉｔｙ　；　ＢＰＡ）が含まれる。ＩＬ−３ｆたはマルチＣ５Ｆといろいろ な名称で呼ばれる別のマウスＣ５Ｆは造血系の多数の細胞型の発生を刺激する。Immunoregulatory proteins, or lymphocytes, are a group of secreted proteins. , many of which are mild proteins. For example, hematopoietic cell proliferation 2 and differentiation are – to a number of glycoproteins collectively referred to as formation-stimulating factors or C’SFs. Mediated by Yotsu℃. In humans, these bacteria/bacteria contain granules and macrophages. Contains roniformation-stimulating factor (GM-C5F), which is a glycoprotein found in normal bone marrow. It is necessary for the production of granulocytes and macrophages, and is also necessary for the production of differentiated mature granulocytes and macrophages. It appears to modulate clophage activity. Other human C3F (hcsF) Macrophage C3F (Af-CS F) that induces selective proliferation of clophages '! or C3F-1), granulocyte C3F (G-C5F), which stimulates the development of granulocytes. , and a burst molecule that induces the development of red blood cell progenitors into hemoglobin-containing cells. Promoting activities ivity; BPA). IL-3f or multi C5F and various other things Another mouse C5F, also called C5F, stimulates the development of multiple cell types of the hematopoietic system.

マウスＩＬ−３のヒト類似体が最近報告された。A human analog of mouse IL-3 was recently reported.

Ｇ、Ｍ−Ｃ５Ｆは初めに円香素条件付はマウス肺から得られた調製物中に存在す る２３キロダルトンのタンパク質として同定された。Ｂｓｒｇａａａ　ａｔ　ａ ｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ。G, M-C5F is initially present in preparations obtained from mouse lungs It was identified as a 23 kilodalton protein. Bsrgaaa at a l,,J,Biol,Cham.

２５２：１９９８（１９７７）を６照されたい。ヒトＧＭ−Ｃ’ＳＦはＮ１ｃｏ ｌａａｔａ１．、Ｂｌｏｏｄ５４二６１４（１９７９）によりて胎盤９１ｉ化培 地（ｐｌａａａｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　）から部分精 製された。また、ヒトＧ、Ｍ−Ｃ５ＦはＧａｍｍｏｎ　＃！　ａｌ、、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２６　：１３３９（１９８４）によってヒトＴリンパ芽球細胞株Ｍ、 の培養物に２いて同定され、成熟好中球性顆粒球の活性を調節することが見出さ れた。多様な供給源からの組み換えヒトＧＭ−Ｃ５Ｆのクローニング８よび発現 は（、’ａｎｔｒｇｌｌ　ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、ＩＷａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｅｔ、ＵＳＡ８２　：　６２５０　（１９８５）　；１１”ｏｎｇ　ａｔ　ａｌ 、、５ｃｉｅｎｃｅ２２８二８１０（１９８５）；ｇよびＬｅａ　１ｇ　（１１ ＊ｇＰｒＯ９１三、、工ｔＶａｔ１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　８２：４３ ６０（１９８５）　により報告されている。Ｃ″ａｎｔｒａｌｌらはＩＩＵＴ− １０２８胞株からつくられたｃＤＮＡ　ライブラリーよりヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ配列 を単離した。この単離されたヒト配列は酵母発現系を用いて生理活性ＧＭ−Ｃ５ Ｆの合成へ誘導することが見出された。252:1998 (1977). Human GM-C’SF is N1co laata1. Placenta 91i culture culture by Blood 54 2 614 (1979) Partial essence from the earth (plaaantal conditioned medium) Manufactured. Also, human G and M-C5F are Gammon #! al,,5cie nce 226:1339 (1984), the human T lymphoblastoid cell line M, neutrophilic granulocytes and was found to modulate the activity of mature neutrophilic granulocytes. It was. Cloning and expression of recombinant human GM-C5F from diverse sources8 is (,’antrgll at al,, Proc, IWatl, Acad, S et, USA82: 6250 (1985); 11”ong at al ,,5science2282810(1985);g and Lea1g(11 *gPrO913, tVat1. Acad, sci, UsA 82:43 60 (1985). IIUT- Human GM-C5F sequence from cDNA library created from 1028 cell lines was isolated. This isolated human sequence was used to generate bioactive GM-C5 using a yeast expression system. It was found that the synthesis of F was induced.

酵母によって発現され、グリコジル化され、分泌された組み換えタンパク質は一 般に可変量の結合炭水化物を含有する。従つ℃、ヒトＧＭ−Ｃ５ＦやマウスＧＭ −Ｃ５Ｆのような組み換え据タンパク質の精製混合物はＯ〜５０１量チの炭水化 物を含みうる。Ｍ幻ｔＬｊｉｍａ　ｉｔ　ａｌ、。Recombinant proteins expressed, glycosylated, and secreted by yeast are Generally contains variable amounts of bound carbohydrates. ℃, human GM-C5F or mouse GM - Purified mixtures of recombinant protein proteins such as C5F have a carbohydrate content of O to 501 h. Can include things. M illusion tLjima it al.

Ｅ　ＭＢ　ＯノＯｋｆ％α１５：工１９３（１９８６）はＮ−グリコジル化部位 に突然変異を起こすことによりグリコジル化を妨げて酵母発現Ｍ″ａＪの不均質 性を軽減させた組み俟えマウスＧＭ−Ｃ５Ｆの発現を報告している。E MB O no Okf% α15: Eng 193 (1986) is the N-glycosylation site heterogeneity of yeast-expressed M″aJ by preventing glycosylation by creating mutations in We report the expression of GM-C5F in assembled mice with reduced sex.

分泌された組み侠え据タンパク質中に可変量の結合炭水化物が存在すると、精製 法が複雑になり、これにより収量が減少する。さらに、この糖タンパク質が治療 薬剤として利用される場合、この薬剤の受容者は酵母炭水化物成分に対しアレル ギー反応を起こす可能性があり、その結果治療を中止する必要が生じる。これら の理由のために、炭水化物含量の少ない免役調節糖タンパク質の生物字面に活性 な均質類似体が治療用途のために望まれている。The presence of variable amounts of bound carbohydrates in secreted assembled proteins may lead to The process becomes more complex, which reduces yields. In addition, this glycoprotein When used as a drug, recipients of the drug must be allergic to yeast carbohydrate components. Gly reactions may occur, resulting in the need to discontinue treatment. these Due to the biologically active nature of immunoregulatory glycoproteins with low carbohydrate content Homogeneous analogs are desired for therapeutic use.

今や、ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ２よび他のヒトＣ３Ｆ（通常糖タンパク質とじ℃分泌さ れるもの）の機能的な突然変異類似体が位置特異的変異導入法により炸裂し得る ことが判明した。これらの類似タンパク質は、酵母発現系を用いて、野生型相同 体よりも高い収量で、炭水化物含量の低下した均質形体として生産することがで きる。炭水化物含量の低下したヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ類似体は、適当なコロニー形成 刺激活性検定において、グリコジル化組み換えと）ＧＭ−Ｃ５Ｆの比較可能な精 製混合物に等しい比活性本発明は、少なくとも１つのＮ−グリコジル化部位を有 するｈＣ５Ｆの天然配列に実質上相同な、突然変異アミノ酸配列（Ｎ−グリコジ ル化部位を不活性化するアミノ酸の置換、欠失または挿入を少な（とも１つ含む ）から成るヒトコロニー形成刺激因子（ｈｃｓＦ）類似体を提供する。これに関 連した面に２いて、本発明はｈｃｓｐ類似体をコードするヌクレオチド配列から 成る組み換えＤＮＡセグメント、２よびそのＤＮＡセグメントを含む組み換え体 発現系を提供する。Human GM-C5F2 and other human C3Fs (usually secreted by glycoproteins) are now available. Functional mutant analogs of It has been found. These similar proteins can be synthesized using yeast expression systems to express their wild-type homologs. It can be produced as a homogeneous form with reduced carbohydrate content, with higher yields than the whole body. Wear. Human GM-C5F analogues with reduced carbohydrate content exhibit adequate colony formation. In the stimulatory activity assay, the comparable quality of GM-C5F (with glycosylated recombinant) The present invention has a specific activity equal to that of the prepared mixture. The mutated amino acid sequence (N-glycodiamine) is substantially homologous to the native sequence of hC5F. A small number of amino acid substitutions, deletions, or insertions that inactivate the binding site (including one) ) provides a human colony forming stimulating factor (hcsF) analog consisting of Regarding this In a related aspect, the present invention provides a sequence of nucleotide sequences encoding hcsp analogs. a recombinant DNA segment comprising 2 and a recombinant comprising the DNA segment Provides an expression system.

図面の簡単な説明 第１図はヒト顆粒球−マクロファージコロニー形成刺激因子の炭水化物含量低下 形体のコード配列を含む、ｐαＡＤＥ’ｌＨ％ＧＭＣ５ＦＬａｓ”Ａｓｐ”０１ ％”（Ｌ２０７−５、ＡＴＣＣ６７，２３１）と名づげられた酵母発現ベクター の構築を示す模式図である。Brief description of the drawing Figure 1 shows reduced carbohydrate content of human granulocyte-macrophage colony formation stimulating factor. pαADE'lH%GMC5FLas"Asp"01 containing the coding sequence of the configuration %” (L207-5, ATCC67,231) FIG.

第２図は野生型ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列８よび対応するアミ ノ酸配列を示す。Figure 2 shows the nucleotide sequence 8 of the wild-type human GM-C5F gene and the corresponding amino acid sequence. The amino acid sequence is shown.

第３図はヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ突然変異類似体であるｈＧＭ−Ｃ５ＦＣＬａＳＩ”Ａ ｚｐ２７Ｇｌｓ”　）をコードするＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列８よび 対応するアミノ酸配列を示す。Figure 3 shows hGM-C5FCLaSI”A, a human GM-C5F mutant analogue. Nucleotide sequence 8 of the DNA segment encoding zp27Gls” The corresponding amino acid sequence is shown.

バク質の機能的類似体がＮ−グリコジル化部位を欠いた実質上相同な突然変異ア ミノ酸配列をコードすべく改変されたＤＮＡ配列から翻訳され得るという発見に 基づいている。好適な態檄において、本発明は、ここでｈＧＭ−Ｃ５ＦＣＬａｓ ”Ａｓｐ２７Ｇｌｓ！９）と呼ばれる非グリコクル化ヒ）、　ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ 類似体を提供する。この類似体は冥質的に同一の発現系を用いる比較実験に２い て、その組み侠え天然相同体よりも数倍高いレベルで酵母によシ発現・分泌され る。この類似体は非常に均質な産物として分泌され、その天然相同体に等しい比 活性を示す。A functional analogue of the bacterial protein is a virtually homologous mutant protein lacking the N-glycosylation site. The discovery that amino acid sequences can be translated from modified DNA sequences to encode them Based on. In a preferred embodiment, the invention herein provides hGM-C5FCLas Non-glycosylated protein called “Asp27Gls!9), GM-CS F provide analogs. This analog was tested in two comparative experiments using essentially identical expression systems. It is expressed and secreted by yeast at levels several times higher than its natural homolog. Ru. This analog is secreted as a very homogeneous product, with equal ratios to its natural homologue. Shows activity.

本明細薔全体を通して総称的に用いられる１ヒトコロニー形成刺激因子″マたは ″ｈｃｓＦ″は造血細胞の増殖８工び分化を誘導し得る内因性分泌タンパク質、 例えばＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ５Ｆ、Ｃ３Ｆ−１２よびＢＰＡを意味する。１突然 変異アミノ酸配列”は天然配列と異なるヌクレオチド配列によってコードされる ポリペプチド配列を意味する。伐散配列とアミノ酸配列の両刃に対し℃用いられ る゛実質上相同”とは、特定の対象配列（例えば突然変異配列）が１以上の置換 、欠失または付加により基準配列と異なり、その最終結果が基準配列と対象配列 との間に不利な機能的相違をもたらさないことを意味する。As used generically throughout this specification, ``human colony-stimulating factor'' or "hcsF" is an endogenous secreted protein that can induce proliferation and differentiation of hematopoietic cells. For example GM-C5F, G-C5F, C3F-12 and BPA. 1 suddenly "mutant amino acid sequence" is encoded by a nucleotide sequence that differs from the natural sequence means a polypeptide sequence. ℃ is used for the double edge of cutting sequence and amino acid sequence. "Substantially homologous" means that a particular target sequence (e.g., a mutant sequence) has one or more substitutions. , differs from the reference sequence due to deletions or additions, and the final result is the reference sequence and the target sequence. This means that there is no disadvantageous functional difference between the two.

“天然配列”とは野生型または天然型の遺伝子もしくはタンパク質と同じアミノ 酸配列！たは杉酸配列を意味する。“Ｎ−グリコジル化部僅”は以下で定義され る。本発明の定義に３いて用いられる１不活性化する”とは、オリゴ糖成分の共 有結合を可能にするアミノ酸残基を排除すべく所定のＮ−グリコジル化部位を改 変することを意味する。”組み換えＤＮＡセグメント”は実質的に純粋な形また は不質的に純粋な形で、すなわち標準的な生化学的手法（例えば、クローニング ベクターの使用）によりＤＮＡセグメント２よびその構成ヌクレオチド配列の同 定、操＋′Ｆ＝３よび回収を可能にする童で、少な（とも１回単陥されたＤＮＡ 分子を意味する。６ヌクレオチド配列”はデオキシリボヌクンオチドのヘテロポ リマーを意味する。”組み換え発現系”は適当なりローニングベクターまたは発 現ベクターと適当な宿主微生物との組み合わせを意味する。酵母発現系、特にビ ール酵母菌（ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃａｓ　ｃｇｒａｖｉｓｉａａ）を用いるも の、が好適である。“Native sequence” means the same amino acid sequence as the wild-type or naturally occurring gene or protein. Acid sequence! or cedar acid sequence. “N-glycosylated portion” is defined below. Ru. The term ``inactivate'' used in the definition of the present invention refers to the co-inactivation of oligosaccharide components. Modification of a given N-glycosylation site to eliminate amino acid residues that allow binding It means to change. A “recombinant DNA segment” is defined as a “recombinant DNA segment” in substantially pure form or in an extraneous pure form, i.e. by standard biochemical techniques (e.g. cloning). DNA segment 2 and its constituent nucleotide sequences , operation + 'F = 3, and a child who can be recovered, with a small amount of DNA that has been compromised once. means molecule. 6 nucleotide sequence” is a heteropolyte of deoxyribonuctide. means rimmer. A “recombinant expression system” is a cloned vector or expression system, as appropriate. refers to the combination of the current vector and a suitable host microorganism. Yeast expression systems, especially Also using Saceharomycas cgravisiaa is preferable.

真核生物タンパク質のＮ−グリコジル化部位はアミノ酸トリプレットＡ　ｓ　、 ｎ　−Ａ’　−Ｚ　（ここでＡＩ　　はアミノ酸であり、２はＳ＃ｒまたはＴｈ ｒである）により％徴つけられる。この配列に８（・て、アスパラギンは炭水化 物の共有結合のための側鎖アミノ基を提供する。このような部位はＡａｎ　　ま たは残基Ｚを別のアミノ酸に置き換えるか、ＡａｎまたはＺを欠失させるか、あ るいはＡＩ　とＺの間にＺ以外のアミノ酸を挿入するかもしくはＡａｎとＡ１　 　の間ＫＡａ％Ａａｎアミノ酸を挿入することにより排除することができる。好 １しくは、置換は保存的に行われる；すなわち最適な代替アミノ酸は置換しよう とするアミノ酸の物理化学的特性に類似した性質を有するものである。The N-glycosylation site of eukaryotic proteins is the amino acid triplet A s, n-A'-Z (where AI is an amino acid and 2 is S#r or Th r). This sequence contains 8 (・, asparagine is a carbohydrate Provides a side chain amino group for covalent attachment of compounds. Such parts are Aan or replace residue Z with another amino acid, delete Aan or Z, or Alternatively, insert an amino acid other than Z between AI and Z, or insert Aan and A1. can be eliminated by inserting amino acids KAa%Aan between. good 1, substitutions are made conservatively; i.e., the best alternative amino acid will be substituted. It has properties similar to the physicochemical properties of amino acids.

ＰＪ様に、欠失または挿入法を採用する場合は、欠失または挿入が生物学的活性 に与える影響を考イすべきである。If a deletion or insertion method is used for PJ, the deletion or insertion should be biologically active. Consideration should be given to the impact on

こうして、本発明によるｈｃｓｐ類似体は、少なくとも１つのＮ−グリコジル化 部位を有するｈ　（、’　Ｓ　Ｆの天然配列に実質上相同である突然変異アミノ 酸配列を有するタンパク質から成り、その際天然配列中に存在する少な（とも１ つのＡａｎ−Ａ’−Ｚが変異配列中でＡａ　ｎ　−Ａ”　−ＹｆたはＸ−Ａ２− Ａ’により直ぎ換えられている；但し上記各配列中 Ａ１、Ａ２３よびＡ３は同一であるか又は異なり、いずれのアミノ酸であつ又も よく； ＸはＡｚｎ以外のアミノ酸であり； ＹはＺ以外のアミノ酸であり；そして ＺはＳａｒまたはＴ　ｈ　ｒ　　である。Thus, hcsp analogs according to the invention have at least one N-glycosylation mutated amino acid that is substantially homologous to the natural sequence of It consists of a protein with an acid sequence, in which a small number (both 1 and 1) present in the natural sequence. Aan-A'-Z is Aan-A"-Yf or X-A2- in the mutant sequence Directly replaced by A'; however, in each of the above sequences A1, A23 and A3 are the same or different and can be any amino acid or often; X is an amino acid other than Azn; Y is an amino acid other than Z; and Z is Sar or Thr.

好ましくは、天然配列中の７８％−Ａ’−Ｚの全部の存在が従って、残基２７の ＡａｎをＡｓｐに、８よび残基３９のＴｈｒをＧｌｕに最も適切に置き換えると 、潜在的Ｎ−グリコジル化部位を欠いた新しい配列が得られる。さらに、残基２ ３２よび２４の多塩基性アミノ酸配列を除（ために、２３位の７２ｇをＬａ％に 置き換えると、分泌前に酵母ＫＥＸ’ｌプロテアーゼにより切断されに（いタン パク質を得ることができる。Preferably, the entire presence of 78%-A'-Z in the native sequence is therefore Most appropriately replacing Aan with Asp and Thr at residues 8 and 39 with Glu , a new sequence lacking potential N-glycosylation sites is obtained. Furthermore, residue 2 32 and 24 polybasic amino acid sequences were removed (in order to remove 72g at position 23 to La%). When replaced, the protein is cleaved by yeast KEX'l protease before secretion. You can get the best quality.

また、２９位のＳｅｔの代わりにｋｈｔを使用し、３７位のＡｓｎの代わりにＧ ｌｎを使用することもできるであろう。Also, use kht instead of Set at position 29, and G instead of Asn at position 37. It would also be possible to use ln.

Ａ−グリコシル化部位を欠くタンパク質を得るために、他の保存釣アミノ酸置換 も行われるであろ５゜以下の表はこれらの位置での置換の浚先順位による代替ア ミノ酸の等級りけを示す： 位置：　　　　　　　　　　２７　　２９　　３７　　３９野生型：　　　　　 　　　　　　Ａａｎ　　５ａ１Ｐ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ最適置換；　　　　　　 　Ａｓｐ　　、’ｄｇｔ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ第２優先順位の置換：　　Ｇｌｕ 　　Ｌａｗ　　Ｇｌｗ　　ＡｓｐＧｉｎ　　Ｉｌａ　　Ａｓｐ　　Ｇｉｎ〆αｌ 　　　　　Ｖａｌ 第３優先順位の置換：　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　ＧｌｙＧｌｙ　　Ｇ ｉｎ　　Ｇｌｙ　　ＡｌａＳｕｒ　　Ｇｌｓ　　５ａｒ Ｔｈｒ　　Ａｓｓ　　Ｔｈｒ 類似の手法を用いて、他のｈｃｓＦの潜在的Ｎ−グリコジル化部位を表すアミノ 酸の適切な置換を確認することができる。こうして、ヒトマクロファーえ特異的 コロニー形成刺激因子（Ｍ−ｃｓＦｔたはＣ３Ｆ−１）のアミノ酸配列は１２２ 位で始まる配列Ａａ　ｎ　−Ｇｌ　％　−ＴＡ　ｒ２よび１４０位で始まる配列 Ａｓ５−Ａａｎ−５ａｔを包含する。Ｋａｓｏａａａｋｉｇｔ　ａｌ、、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３０　：　２９１　（１９８５）を参照されたい。Ａｓｓ残基のい ずれかをＧｉｎ、０１％またはＡｓｐに置き換えるか、あるいはｒｈａ”　また はＳｅｔ””　　の置換のために同様の保存的置換法を用いることによシ、潜在 的Ｎ−グリコジル化部位が排除されるであろ５゜同様に、ヒトパー７トーブロモ ーテイング・アクティビティ（ＥＰＡ４　）（エリトロイド・プロモーティング −アクティビティ：ＥＰＡとも呼ばれる）は成熟タンパク質の３１位で始まる配 列Ａｓｎ−Ｇ１ｎ−５ａｙｓ　Ｅよび７９位で始まる配列Ａｊｆｉ−Ａｒｇ−５ ｕｒ　　を包含する０Ｇａａｓｏｎ　ａｔ　ａＬ、、Ｎａｔｕｒｅ３１５ニア６ ８（１９８５）を参照されたい。Ａ８九残基またはＳａｒ残基の適当な代替アミ ノ酸による置換はＮ−グリコジル化部位乞欠いたタンパク質ｔもたらすであろう 。Other conservative amino acid substitutions to obtain proteins lacking A-glycosylation sites The table below shows the alternative approach according to the order of substitution at these positions. Showing the grade of amino acids: Position: 27 29 37 39 Wild type: Aan 5a1P Asn Thr optimal replacement; Asp,’dgt Gln Glu Second priority replacement: Glu Law Glw AspGin Ila Asp Ginαl Val Third priority replacement: Ala Asp Ala GlyGly G in Gly AlaSur Gls 5ar Thr　Ass　Thr Using a similar approach, amino acids representing other potential N-glycosylation sites of hcsF were Proper substitution of acid can be confirmed. Thus, human macrophyte-specific The amino acid sequence of colony formation stimulating factor (M-csFt or C3F-1) is 122 Sequence starting at position Aa n - Gl % - TA r2 and sequence starting at position 140 Includes As5-Aan-5at. Kasoaaakigt al,, 5ci ence 230:291 (1985). Ass residue Replace either with Gin, 01% or Asp, or rha'' or By using a similar conservative substitution method for the replacement of Set””, the latent The target N-glycosylation site will be eliminated. -Taing Activities (EPA4) (Erythroid Promoting - activity: also called EPA) is a sequence starting at position 31 of the mature protein. Column Asn-G1n-5ays E and sequence Ajfi-Arg-5 starting at position 79 0Gaason at aL, which includes ur, Nature315 Near 6 8 (1985). Suitable alternative amino acid for A89 residue or Sar residue Substitution with a amino acid would result in a protein starved for N-glycosylation sites. .

所定の配列に矢然変異を起こすために、特定オリゴヌクレオチドによる位置特異 的変異導入法が用いられ、これによ、ｂｍ換、欠失または挿入に従つ℃改変され た特定コドンを有する変異遺伝子が得られる。Ｅａｓｍｒ　ａｔ　ａｌｍ。Position specificity using specific oligonucleotides to generate mutations in a given sequence A standard mutagenesis method is used, whereby C.C. A mutant gene having a specific codon is obtained. Easmr at alm.

Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ（ ＰｌｅｎｓｎｎＰｒａｇｓ、１９８１）＋ｇよび米国特許第４５１８５８４号は 適当な投法を開示し”（Ｅｔ）、参照によりここに引用される。この方法によれ ば、改変しようとする遺伝子鎖をＭ１３−重鎖ファージまたは他の適当なベクタ ーにクローニングし、その遺伝子に対応するセンスｌＡマたはアンチセンス鎖か ら成る一本鎖ＤＮＡを適当量生産する。このＤＮＡをＭ１３ファージの７ラグメ ントにアニーリングしてギャップ（一本鎖の部分）を有する二本鎖１）ＮＡを得 、その後これをオリゴヌクレオチドブライマーにノ・イブリダイズさせる。この ブライマーは改変しよ５とするコドンを取り囲ひ配列に相補的であるが、置換が 起こる位置に新しいアミノ酸を規定するコドン（またはこのようなコドンに相補 的なアンチセンスコドン）を含む。Engineering: Pr1nciples and Methods ( PlensnnPrags, 1981)+g and U.S. Pat. No. 4,518,584 ” (Et), which is incorporated herein by reference. For example, the gene chain to be modified can be transferred to M13-heavy chain phage or other suitable vectors. the sense or antisense strand corresponding to the gene. Produce an appropriate amount of single-stranded DNA consisting of: This DNA was converted into 7 lag genes of M13 phage. 1) Obtain a double-stranded NA with a gap (single-stranded part) by annealing to the , which is then hybridized to the oligonucleotide primer. this The primer is complementary to the sequence surrounding the codon to be modified, but the substitution A codon (or complement to such a codon) that specifies a new amino acid at the position where it occurs contains a specific antisense codon).

欠失ン希望する場合、そのブライマーは欠失しようとするアミノ酸を規定する特 定のコドンを含まｌいが、正確なリーディングフレームを保持するであろう。挿 入を希望する場合、そのブライマーは挿入しようとするアミノ酸を規定する新し いコドンをその配列中の適当な位置に含むであろう。好筐しくは、代替コドン、 欠失コド／または挿入コドンはオリゴヌクレオチドの中央もしくはその近傍に配 買される。If a deletion is desired, the primer should contain the characteristics that define the amino acid to be deleted. It will contain constant codons but will retain the correct reading frame. Insert If you wish to insert a new amino acid, the primer will contain a new will contain the desired codon at the appropriate position in its sequence. Preferably, alternative codons, The deletion codon/or insertion codon is placed at or near the center of the oligonucleotide. It is bought.

用いるオリゴヌクレオチド−ブライマーの大きさは変異位置での安定した特異的 ハイブリダイゼーションを最適はギャップを修復するために用いられるＤＮＡポ リメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による変異の修正（ｇｄｉｔｉｎＱ）を避 けるのに十分な長さである。こうして、本発明に８いて用（・られるオリゴヌク レオチドは通常約１５〜２５個の塩基を含むであろう。これより大きい鎖長のオ リゴヌクレオチドは必要でなく、合成するのが比較的困難である。オリゴヌクレ オチドの慣用合成法が適しており、例えばトリエステル合成法は５ｏｏｄ　ａｔ 　ａｌ、、Ｎ５ｃ１．Ａｃ１ｄ匣、±：２５５７Ｃ１９７７）−Ｅよびｆｌ＝ｒ ＠ａａ　ａｔ　ａｔ、。The size of the oligonucleotide-brimer used is determined to be stable and specific at the mutation location. Hybridization is optimized for the DNA polymer used to repair the gap. Avoid modification of mutations by exonuclease activity of limerase (gditinQ) It is long enough for you to walk. Thus, the oligonucleotides that can be used in the present invention Reotide will normally contain about 15-25 bases. Chain lengths larger than this Ligonucleotides are not required and are relatively difficult to synthesize. oligonucle Conventional synthesis methods for otides are suitable; for example, triester synthesis methods include 5ood at al,, N5c1. Ac1d box, ±:2557C1977)-E and fl=r @aaatat,.

Ｔａｔ、Ｌａｔｔ、２８：２４４９（１９７８）Ｋ記載されている。Tat, Latt, 28:2449 (1978) K.

オリゴヌクレオチドブライマーはその後改変しようとする遺伝子を含む一本鎖鋳 型セグメントを有するギャップ付き二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる。この ブライマーはＤＮＡポリメラーゼ１　（Ｋ１ｍｎｏｗフラグメント）、Ｔ４　１ ）ＮＡ：ｐリメラーゼ、または他の適当なりＮＡポリメラーゼとの反応により鋳 型鎖に沿つ工伸長させる。得られた二本鎖ＤＮＡはその後１）ＮＡ’）ガーゼ（ 例えばＴ４１）ＮＡリガーゼ）で処理して閉環状Ｌ）ＮＡとなし、このヘテロ二 本鎖ＤＮＡを用いて適当な宿主菌株（例えばＥ、ｃｏｔｉ　１Ｍ１０５；ベセス ダ・リサーチΦラボラトリーズ）をトランスフェクションする。宿主によるヘテ ロ二本鎖ＤＮＡの複製は両１）ＮＡ鎖の子孫をもたらす。トランスフェクション された細胞はその後平板培養してプラーク？形成させ、その後変異導入法で用い たオリゴヌクレオチドに対応する標識オリゴヌクレオチドを用いてスクリーニン グする。製鎖の子孫に対してではなく変異ＤＮＡに対して優先的にプライマーが ノ・イブリダイズする粂件を採用する。その後、変異遺伝子を含むＤＮＡを単離 し、スプライシングして適当な発現ベクターに挿入し、このベクターを用いて宿 主菌株を形質転換する。宿主歯株は培養下で増殖させてタンパク質類似体を合成 させる。The oligonucleotide primer then binds the single-stranded template containing the gene to be modified. hybridize to gapped double-stranded DNA with type segments. this Brimer is DNA polymerase 1 (K1mnow fragment), T4 1 ) NA: p primerase, or other suitable NA polymerase. Stretch along the mold chain. The obtained double-stranded DNA was then 1) NA’) gauze ( For example, treatment with T41) NA ligase) to form a closed circular L)NA, and this heterozygous Using double-stranded DNA, a suitable host strain (e.g. E. coti 1M105; transfection (Da Research Φ Laboratories). Hetae by the host 2) Replication of double-stranded DNA results in progeny of both 1) NA strands. transfection The treated cells are then plated to form plaques? formed and then used in mutagenesis methods. Screening using labeled oligonucleotides corresponding to the oligonucleotides Google. Primers preferentially target mutant DNA rather than stranded progeny. Adopt a material that will be hybridized. Then, isolate the DNA containing the mutated gene. This vector is then spliced and inserted into a suitable expression vector. Transform the main strain. Host tooth strains are grown in culture to synthesize protein analogs. let

先に述べたように、組み換えヒトＱＭ−Ｃ５Ｆ類似体の発現には酵母が適してい る。適当な発現ベクターは野生型ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子を保有する。ＹαｆＨ ｓＧＭ（ＡＴＣＣ５３１５７）、８よび当分野で仰られた他のベクターである。As mentioned earlier, yeast is suitable for expressing recombinant human QM-C5F analogs. Ru. A suitable expression vector carries the wild type human GM-C5F gene. YαfH sGM (ATCC 53157), 8 and other vectors mentioned in the art.

形質転換用の適当な酵母菌株の選択は、選択マーカーの性質２よびベクターの他 の特性により決定されるであろう。、Ｙαｆ　Ｍ　ｗ　ＧＭ　Ｅよびこのベクタ ーから誘導された種々の何築物による形質転換に適したＳ、ｅｇｒｅｖｉａｉａ ａ菌株には、カリフォルニア州バークレーのイースト・ジエネテインク・ストッ ク・センター（Ｙ−αａｔ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）から入 手しうるＸ２１８１−１８株（遺伝子型αｔｒｐ１ｇａ１１ａｄａ１ｈｉｓ２　 を有する）〔以下参照〕；Ｊ１７株（ＡＴｃＣ５２６８３；旦と≦旦■ｔｒｐ１ 　ｔｎａｔ１４　　ｗｒａ３）　：ＳよびＩＬ１６６−５Ｅ株（ＡＴＣＣ４６１ ８３：Ｃ１ｈｉｓｌ　　ｔｙｐｌ）が含まれる。Selection of a suitable yeast strain for transformation depends on the nature of the selection marker2 and the vector. will be determined by the characteristics of , Yαf M w GM E and this vector S. egreviaia suitable for transformation with various constructs derived from A strain was obtained from the East Genetein Inc. stock in Berkeley, California. Enter from GeneticStock Center (Y-αat GeneticStock Center) Available strain X2181-18 (genotype αtrp1ga11ada1his2 ) [see below]; J17 strain (ATcC52683; Dan and ≦ Dan ■ trp1 tnat14 wra3): S and IL166-5E strains (ATCC461 83:C1hisl type) is included.

基本的な組み換えＤＮＡ技術、ＧＭ−Ｃ５Ｆ活性についての検足、２よび酵母菌 株の増殖に関するより詳細な説明は係属中の米国特許出願第７６３１３０号（１ ９８５年８月６日付）８よび同第７５０４０１号（１９８５年７月２日付）に記 載されている。Basic recombinant DNA technology, foot examination for GM-C5F activity, 2 and yeast A more detailed description of strain propagation is provided in pending U.S. Patent Application No. 763,130 (1). No. 8 (dated August 6, 1985) and No. 750401 (dated July 2, 1985). It is listed.

以下の実施例は本発明の特定な面についてのより詳細な説明を提供するものであ る。The following examples provide a more detailed description of specific aspects of the invention. Ru.

入 プラスミドｐＢＧ２３に保持されたヒトＧＭ−Ｃ５Ｆをコードする野生型遺伝子 は米国２０８５２メリーランド州ロツクビル、パークローン・ドライブ１２３０ １のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号３ ９９００として寄託されている。酵母発現ベクター、ＹαｆＨｕＧＭ＜ｐＹαｆ ＧＭ−’ｌとも呼ばれる）に挿入された野生型遺伝子は寄託番号５３１５７とし てＡＴＣＣに寄託され１いる。プラスミド、Ｙαｆｌ１％ＧＭはｇ、ｃ＋■」− 中での覆製２よび選択に必要なｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａ、ｒ遺伝子２ よび複製起点）と、酵母ＤＮＡ配列（α因子プロモーター、選択マーカーとして のＴｒｐｌ遺伝子、２よび２μ複裏起点）とを含んでいる。プロモーターに隣接 して、酵母宿主からの異種タンパク質の分泌を可能にするα因子リーダー配列が 存在するように、その３′宋端に第二〇ＫＥＸ２切断部位を含むように修飾して 分泌タンパク質の完全なプロセッシングを可能にする。寄託プラスミドの構築に 関する細部は係属中の米国特許１ｌｔｌ願第７５０４０１号３よび同第７６３１ ３０号に開示されて８り、その内容は参照によりここに引用される。Enter Wild-type gene encoding human GM-C5F carried in plasmid pBG23 1230 Parklawn Drive, Lockeville, MD 20852 Deposit number 3 in the American Type Culture Collection (ATCC) It has been deposited as 9900. Yeast expression vector, YαfHuGM<pYαf The wild-type gene inserted into GM-'l) has been deposited with accession number 53157. It has been deposited with the ATCC. Plasmid, Yαfl1%GM is g, c+■”- pBR322-derived DNA sequence (A, r gene 2) necessary for cloning 2 and selection in and origin of replication) and yeast DNA sequences (α-factor promoter, as a selectable marker). Trpl gene, 2 and 2μ double origin). adjacent to promoter The α-factor leader sequence, which allows secretion of foreign proteins from the yeast host, modified to contain the 20th KEX2 cleavage site at its 3′ Song end, as it exists. Allows complete processing of secreted proteins. For construction of deposited plasmids Related details can be found in pending U.S. Pat. No. 30, the contents of which are hereby incorporated by reference.

野生型ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子のコード領域の大部分および３′隣接領域の一部 を含む４１７塩基対のＡｈａ　ｌ　−出して、成熟タンパク質の最初の２４個の アミノ酸に相当する配列をもたない７ラグメントを単離した。上記遺伝子のこの 部分は、成熟タンバク質の最初の２２個のアミノ酸と一致するアミノ酸配列をコ ードする５′ヌクレ二Ｎｃｏ１部位、コドン１６３よび２１にそれぞれＨｐａ　 Ｉ３よびＨｉ％ｄ１１部位、並びに２３位にロイシン残基をもたらすコドン置換 を含む、合成オリゴヌクレオチドリンカー７ラグメ／トを用いて再＊築した。こ のリンカ−の配列を以下に示す： 係属中の米国特許出願第７６３１３０号に詳述されるように、２３位のアルギニ ンのロイシンへの置換は、酵母ＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位の排除による発現 の増加をもたらす。得られた構築物はＫｐｎ　Ｉ　ｇよびＮｃｏｌで切断したプ ラスミドｐＢｃ１１にクローニングし℃プラスミド、ＢＣ２５を作製し、このプ ラスミドは修飾ＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子を含むある量のＤＮＡを得るために、適当な 宿主菌株を形質転換するのに使用した。このプラスミドは、ＹαｆＨｗＧＭのα 因子プロモーターをグルコース抑制アルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２） ”プロモーターに置き換えたことを除いて１．ＹａｆＢ　ｕ　ＧＭ　　に実質上 類似したＳ、ｅ−デーｖｉｓｉα−発現ベクターである。別の発現プラスミド、 例えば、ＹαｆＨｓＧＭ（ＡＴＣＣ５３１５７）、　も同様に首尾よ（使用され るであろう。Most of the coding region and part of the 3' flanking region of the wild-type human GM-C5F gene 417 base pairs of Aha l - containing the first 24 of the mature protein. Seven fragments with no amino acid equivalent sequences were isolated. This gene of the above The portion contains an amino acid sequence that matches the first 22 amino acids of the mature protein. Hpa at codons 163 and 21 of the 5' nucleotide Nco1 site, respectively. I3 and Hi%d11 sites as well as codon substitutions resulting in a leucine residue at position 23 was reconstituted using a synthetic oligonucleotide linker 7 lugs containing . child The linker sequence for is shown below: As detailed in pending U.S. Patent Application No. 763,130, arginine at position 23 The substitution of leucine with leucine is expressed by eliminating the yeast KEX2 protease cleavage site. resulting in an increase in The resulting construct is a protein cut with KpnIg and Ncol. The plasmid BC25 was created by cloning into plasmid pBc11, and this plasmid The lasmid is prepared using appropriate methods to obtain a certain amount of DNA containing the modified GM-C5F gene. was used to transform the host strain. This plasmid is the α of YαfHwGM. Glucose-repressed alcohol dehydrogenase 2 (ADH2) factor promoter “Except for replacing the promoter, 1. Substantially in YafB u GM A similar S,e-de visiα-expression vector. Another expression plasmid, For example, YαfHsGM (ATCC53157) was also successfully used (used There will be.

プラスミドＤＮＡは慣用手法により単離し、Ａ’ｃｏｌで消化してアミノ限コド ン１２から１２７まで伸長し且つその３′末端に追加の１１１非コード塩基対を 含む５０３塩基対の７ラグメントを得た。Plasmid DNA was isolated by conventional techniques and digested with A'col to obtain the amino-limited code. 12 to 127 and an additional 111 non-coding base pairs at its 3' end. Seven fragments of 503 base pairs were obtained.

このフラグメントはＴ４　　ＤＮＭポリメラーゼで平滑末端となし、その後ｐＢ Ｃ２５フラグメントの内部旦Ω＞ｄｆ１１部位がＭ　１３　ｍ　ｐ　１０ベクタ ーのＨｉｎｄｍ部位に接近するように、Ｓｍａ　（で切断した＃１３ｍｐｌＯ（ 米国イリノイ州アーリントンハイツ、アマージャム社）に連結した。得られたベ クターを用いて適当なＥ、ｅ６１工株（例えばＪＭｌ　０３　）ヲ）ランスフエ クシヨンし、一本鎖ＤＮＡ　な活発に分泌する細菌を得、その珊養上溝から慣用 手段で一本鎖ＤＮＡを単離した。This fragment was made blunt ended with T4 DNM polymerase and then pB The internal Ω>df11 site of the C25 fragment is the M13 mp10 vector. #13mplO( cut with Sma() so as to approach the Hindm site of - Amerjam Inc., Arlington Heights, Illinois, USA). The obtained base Transfect a suitable E, e61 plant (e.g. JMl 03) using a vector. Obtain bacteria that actively secrete single-stranded DNA, and then use the cultured grooves to obtain bacteria that secrete single-stranded DNA. Single-stranded DNA was isolated by means of

その後、一本鎖ＤＮＡはＭ　１３　ｒＩＬｐ　１８　ＤＮＡ　Ｅよび３９位のト レオニン（Ｔｈデ）の代わりにグルタミン酸（Ｇｌｕ　）を挿入し５るコドン置 換を与える次の変異誘発性オリゴヌクレオチド： ５’−ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＴＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＡＧＡ　ＡＧＴＣ−３’にア ニーリングした。After that, the single-stranded DNA is M13 rILp 18 DNA E and the top at position 39. Insert glutamic acid (Glu) in place of leonine (Thde) The following mutagenic oligonucleotides that confer transformations: 5'-GAT GAA TGA AGA AGT AGA AGTC-3' Kneeling.

首尾よ（突然変異を誘発された遺伝子（ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ（ＬｇＪ”ＧＬｓ”　］ と呼ぶ）を検出Ｓよび分離した後、この遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡはＥｅｏＲＩ ＳよびＸｂａＩで切断し、そしてＥｃｏＲ（およびΔ土主■で消化しｆＭ　１３ ｍｐ　Ｉ　Ｑに再連結した。一本鎖ＤＮＡは前述のように作製し、２７位のアス パラギン（７ｇ％）をアスパラギン散（Ａｓｐ　）に置換すべくコード配列を改 変する次の変異誘発性オリゴヌクレオチド： ５’−Ｃ’ＧＴ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＧＴ　Ａ−３’を用いる突然 変異誘発反応に３いて使用した。Success (mutated gene (hGM-C5F (LgJ"GLs") After detection and separation of the gene (called EeoRI), the double-stranded DNA containing this gene is Cut with S and XbaI, and digest with EcoR (and Reconnected to mpIQ. Single-stranded DNA was prepared as described above, and the asymmetry at position 27 was The code sequence was modified to replace paragine (7g%) with asparagine powder (Asp). The following mutagenic oligonucleotides change: Suddenly using 5'-C'GT CTCCTG GACCTG AGT A-3' Three samples were used in the mutagenesis reaction.

突然変異を誘発された鎖（今やｈＧＭ−Ｃ５ＦＣＬｇＪ”Ａ、　、２７６　（％ ３９〕と呼ぶ）を検出および分離した後、この遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡを作製 し、Ｎｃｏｉで切断し、そしてこの５０３塩基対フラグメントをＮｃｏｌ切断ｐ ＥＣ２５に再連結した。ｐ（ＩＡＤＨ２Ｈ＠ＧＭＣ５ＦＬｇＪ”Ａａｐ”７Ｇｌ ｕ”（Ｌ２０７　５）と名づけられたこのプラスミドは寄託番号６７２３１とし てアメリカン・タイプ・カルチャー〇コレクションに（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲ１株 中に）寄託された。The mutagenized chain (now hGM-C5FCLgJ”A, 276 (% After detecting and isolating the gene (called 39), double-stranded DNA containing this gene is produced. and cut with Ncoi, and this 503 base pair fragment was cut with Ncoi and cut with Ncoi. Religated to EC25. p(IADH2H@GMC5FLgJ”Aap”7Gl This plasmid, named ``u'' (L2075), has deposit number 67231. In the American Type Culture Collection (E. coli RR1 strain) ) was deposited.

プラスミドｐαＡＤＢ２１１ｕＧ、ＭＣ５ＦＬｇＪ３Ａｓｐ”フＧＬＪ９を用い て酵母Ｘ１２１８１株を形質転換した。Ｘｉ”２１８１株は２１類の半数体株、 すなわち米国９４７０２カリフオルニア州バークレー、カリフォルニア大学、生 物物理２よび医療物理部、イースト・ジエネテイツク・ストック・センターから 入手しうるＸ２１８１−１８株；８よび米国ワシントン州シアトル、ワシントン 大学、遺伝学部から入手しうるＸＶ６１７−１−３Ｂ株、を接合することにより り（られた二倍体株である。用いた形質転換プロトコルはＨ４ｎｓｇｎ、ａｔ　 ａｌ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｃｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７５　：　１９２９（ １９７８）に記載されるものと実質的に類似して３り、０．６７％酵母窒紫塩基 、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｆ　／　ｍｌアデニン２よび２ ０μｆｌ／Ｍｌ　ウラシルから成る選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体について選 択した。Using plasmid pαADB211uG, MC5FLgJ3Asp” GLJ9 Yeast strain X12181 was transformed using the method. Xi”2181 strain is a type 21 haploid strain, University of California, Berkeley, California 94702, USA. Physical Physics 2 and Medical Physics Department, from East Genetics Stock Center Available strain X2181-18; 8 and Seattle, WA, USA. By conjugating the XV617-1-3B strain available from the University, Department of Genetics. The transformation protocol used was H4nsgn, at al,, Proe, Nacl, Acad, Sci, USA75: 1929 ( 1978), with 0.67% yeast nitrogen purple base. , 0.5% Casamino Acids, 2% Glucose, 10μf/ml Adenine 2 and 2 Select for Trp+ transformants in selection medium consisting of 0 μfl/Ml uracil. I chose.

形質転換された酵母菌株は濃厚培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１％グル コース、８０μｍ／酊アデニン２よび８０μり／ｒＩＬｔウラシル）２５〜５０ ゴ中３０℃で増殖させた。遠心により酵母菌を除いた後、得られた馴化培地は０ ．４５μ酢醒セルロースフイルターを通して濾過することによりアッセイのため に調製した。大規模発酵は１０リットル発酵槽中で実施し、細胞はその発酵槽か ら濾過装置により除去した。The transformed yeast strain was grown in a concentrated medium (1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose). Course, 80 μm/Adenine 2 and 80 μm/rILt uracil) 25-50 The cells were grown at 30°C in water. After removing the yeast by centrifugation, the resulting conditioned medium was 0. ．． For assay by filtration through a 45μ vinegar-tempered cellulose filter. It was prepared as follows. Large-scale fermentation was carried out in a 10 liter fermenter, and the cells were was removed using a filtration device.

振と５フラスコ実験からの酵母菌の上清はαｋｌ　ｕ　ＧＭ−Ｃ５ＦＣＬｇＪ” 　　：］仇体を用いる“イムノ−ドツトプロット”アッセイにより、実質的にＵ ｒｄａｌ　ａｔ　ａｌ、、！’ぴＬ２て記載されるよ５に、しかし次のように変 更して検定を行った。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の連続希釈酵母上清のｌμｌ アリコートを、精製した組み換えＧＭ−Ｃ５Ｆの均質胸裏物の連続希釈物と並べ てニトロセルロースフィルター上、てスポットした。このフィルターを自然乾燥 させ、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から成る“ブロッキング緩 衝液中に１時間８ぎ、その後実質的にＢｓｒｎａｔｔａ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｇｍ、　１１２　：　１９５（１９８１）に記載される方法に従ってマウス仇ヒ トにＭ−Ｃ５Ｆ仇体、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ仇マウス１ 、ＧＳＥよび４−クロロ−１−ナフトール発色溶液（後者の試薬は米国カリフォ ルニア州すッチモンド、バイオランド・ラボラトリーズから入手可能である）に 順次さらした。The yeast supernatant from the shaking and 5 flask experiments was αkl u GM-C5FCLgJ” :] An "immuno-dot plot" assay using a host virtually rdal　at　al,,! 'piL2' is written in 5, but changed as follows. Further testing was performed. lμl of serially diluted yeast supernatant in phosphate buffered saline (PBS) Aliquots were aligned with serial dilutions of purified recombinant GM-C5F homogeneous breast lining. and spotted on a nitrocellulose filter. Dry this filter naturally and a “blocking slow” consisting of 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS. Bsrnatta, Anal, Bioch Mice were killed according to the method described in G.M., 112:195 (1981). M-C5F antibody was conjugated to horseradish peroxidase in goat mice 1. , GSE and 4-chloro-1-naphthol coloring solution (the latter reagent is available from California, USA). Available from Bioland Laboratories, Suchmond, Lunia) I exposed them one by one.

イムノ−ドツトプロットアッセイの結果は、新しいＧＭ−Ｃ５Ｆ形体が酵母上溝 中に約２０〜４０μ２／混の濃度で存在することを示した。Immuno-dot plot assay results show that the new GM-C5F form It was shown that it was present at a concentration of about 20 to 40 μ2/mixture.

この結果は、未成熟骨髄細胞の顆粒法、マクロファージ、または混合コロニーへ の分化２よび増殖を誘導する試料の能力について測定するヒト骨髄増殖検定によ り確かめだ。増殖検定の結果は、炭水化物含量の低下したＧＭ−Ｃ５Ｆ形体を発 現する培養物の上溝中に５０Ｘ１０’Ｕ／ν以上のＧＭ−Ｃ５Ｆ活性が存在する ことを示した。This result indicates that immature myeloid cells are granular, macrophages, or mixed colonies. The human bone marrow proliferation assay measures the ability of a sample to induce differentiation and proliferation. Make sure. The results of the proliferation assay indicate that the GM-C5F form with reduced carbohydrate content was produced. GM-C5F activity of 50×10’U/ν or more is present in the superior groove of the culture expressing It was shown that

比較すると、ＬｇＪ３形体（修飾されたＮ−グリコジル化部位を含１１ｘい）を 発現する培養物はドツトプロットアッセイで１５〜３０μ２／ゴ、セし℃増殖検 定で約５〜１０　ｘ　１０’Ｕ／ｍをモタラシタ。By comparison, the LgJ3 form (containing 11x modified N-glycosylation sites) Expressing cultures were tested at 15-30μ2/g by dot-plot assay at 10°C. At a constant rate of about 5 to 10 x 10'U/m.

２回目の発現実験はより大きい規模で実施された。A second expression experiment was performed on a larger scale.

ｐαＡＤＥ　２ＨｓＧＭｃ　Ｓ　Ｆ　Ｌ　＃　ｓ”　Ａ　ｓ　ｐ２丁Ｑ　ｔｓ３ ９　発現プラスミドを保有する屏母薗のｌＯリットル発酵槽培養物は、Ｌｍ−ゝ 類似体に関係した一連の基準発酵と実質的に同様に実流した。イムノ−ドツトプ ロット３よび増殖検定は非グリコジル化類似体につい７５０〜１００μｆ／ｒａ ｔｒＧ、Ｍ−Ｃ３Ｆの収量を示し、これに対し℃基準実験では干Ｐ：ｊ１５μ７ ／成の収量を示した。pαADE　2HsGMc　S　F　L　#　s”　A　p2choQ　ts3 9. A 1O liter fermentor culture of Pingmuzon carrying the expression plasmid is Lm-ゝ A series of reference fermentations involving analogues were run in substantially the same manner. Immuno-dot top Lot 3 and proliferation assays are 750-100 μf/ra for non-glycosylated analogs. The yield of trG, M-C3F is shown, whereas in the °C standard experiment, dry P:j15μ7 The yield of 20% was shown.

大規模発酵から得られた物質はＵｒｄａｌ　ａｔ　ａｌ、、Ｊ。The material obtained from large-scale fermentation was published by Urdal at al., J.

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、２９６：１７１（１９８４）に記載されるような、ｒ、ｃ 、デ８調襄用ＥＰＬＣカラムによる２つの連続した逆相ＨＰＬＣ工程により精製 した。r, c, as described in Chromatog, 296:171 (1984). , purified by two consecutive reversed-phase HPLC steps on a DE8-prepared EPLC column. did.

簡単に説明すると、ｒ　Ｇ　Ｍ　−Ｃ５Ｆを含む酵母培地は０４５μフイルター を通してＦ通し、１５〜２０μ　Ｃ−４逆相−／ＩＪ力（Ｖｙｄａｔ　ｒセパレ ーションズブループ、米幽カリフォルニア州へスペリア）を充填した５　ｃｍ　 Ｘ３０ｃｍカラムに１００ｆｆｌｔ／分の流速でポンプ装填した。Briefly, the yeast medium containing rGM-C5F was filtered through a 045μ filter. through F, 15-20μ C-4 reverse phase-/IJ force (Vydat r separate 5cm filled with tions bloop, Hesperia, California) A X30 cm column was pump loaded at a flow rate of 100 fflt/min.

口酢酸水溶液（溶剤Ａ）で平衡化し、カラムに培地を装填した後流出液の吸光度 が基底恒に近づ（までこの溶剤で促っだ。この時点で、アセトニトリル（溶剤Ｂ ）中の０．１％）リフルオロ酢酸の勾配を確立し、１分画たり２チの変化率２よ び１００ｍＪ／分の流速で０チから１００チ溶剤Ｂへ至らせた。勾配を開始して ２０分後、１分ごとの画分を果め、これらの画分のアリコートをポリアクリルア ミドゲル電気泳動２よびフルオレサミンタンパク質測定によりタンパク質含量に つい℃分析した。この実験からのＧ　Ｊ（−ＣＳ　Ｆ含有画分をプールし、２倍 容量の０．９Ｍ酢葭、０．２ＭピリジンＣｐＨ４，０＞で希釈した。After equilibration with aqueous acetic acid solution (solvent A) and loading the column with the medium, absorbance of the effluent was promoted with this solvent until the Establish a gradient of 0.1%) lifluoroacetic acid in The flow rate was from 0 to 100 times Solvent B at a flow rate of 100 mJ/min. start the slope After 20 minutes, collect fractions every minute and aliquots of these fractions into polyacrylic resin. Protein content determined by midgel electrophoresis 2 and fluorescamine protein measurement I just analyzed the temperature. GJ(-CSF-containing fractions from this experiment were pooled and 2x Diluted with a volume of 0.9 M Vinegar, 0.2 M Pyridine C pH 4.0>.

その後、この希釈プールは７５％溶剤Ａ２（０，９Ｍ酢酸、０．２Ｍピリジン１ ．Ｈ４，ｏ）Ｅよび２５チ溶剤Ｅ２（０，９Ｍ酢酸、０．２Ｍピリジン中の６０ ％外−プロパノール１、Ｂ、４．５）で平衡化して３いた１５〜２０μシリカ（ ｙｙｔｔａｃ　）　充填５ｚＸ３０儂カラムにポンプ装填した。This diluted pool was then mixed in 75% solvent A2 (0.9M acetic acid, 0.2M pyridine 1 ．． H4,o) E and 25% 60% in solvent E2 (0.9M acetic acid, 0.2M pyridine) 15-20μ silica (3%) equilibrated with propanol (1, B, 4.5%) yyttac) Pump loaded into a packed 5zX30 column.

物質の装填恢、カラムを追加の平衡化溶剤で洗い、その後２５％から１００％溶 ＭＢ２へ至る勾配を１分子当たＪ）１％の溶剤Ｂ２の変化率に２い℃確立して、 カラムからτＧＭ−Ｃ５Ｆ類似体を溶出した。After loading the material, the column is washed with additional equilibration solvent, then the 25% to 100% A gradient leading to MB2 is established at a rate of change of J) 1% of solvent B2 per molecule at 2°C. The τGM-C5F analog was eluted from the column.

ｒ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ含有画分のフルオレサミンタンパク質分析は、８．７４ １ｆ）試料から６１０■の収量、すなわち約６９．８μ２７μを示した。そのピ ーク中の回々の画分は、１μｍ７就の濃度に希釈して増殖検定で調べたとぎ、同 じタンパク質濃度のＺ　＃　ｍ２３類似体の活性に等しい活性を示した。これは 新しい類似体が野生型の生物活性レベルを保持していたことを示す。約５倍の発 現増加を示した初期の観測は生産レベル（約７０μり／ｍｌ）により確認された 。Fluorescamine protein analysis of the fraction containing rGM-CSF was 8.74 1f) The sample showed a yield of 610μ, ie approximately 69.8μ27μ. That pin Each fraction in the tank was diluted to a concentration of 1 μm in 7 and examined in a proliferation assay. showed activity equivalent to that of the Z#m23 analog at the same protein concentration. this is Showing that the new analog retained the level of bioactivity of the wild type. Approximately 5 times more radiation Initial observations of current increases were confirmed by production levels (approximately 70 μl/ml). .

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＣＡＡ　ＧＣＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＴＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＡＣ Ａ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　ＡＡＣＴＣＡ　　４５０ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＴＣＡ 　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＧＡＣＣＡＡ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＣＣＡＣＡＧ ＣＣＡＴ　ＧＧＴ　　４９５ｈＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ２３Ａｓ　２７Ｇ１ｕ３９ ］ｎ６！列ＡＣＣＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＣＡ　ＡＣＣＣＡ Ｇ　ＡＴＴ　ＱＴＣｐ、、ｃｃ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　　３１５Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　工１ｅ　工 １ｅ　Ｔｈ’ｒ　’Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　　P０５ ＴＧＣＴＧＧ　ＡＪｌ、Ｇ　ＣＣＡ　ＧＴＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＴＧＡ　ＧＡＣＣ ＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＣ４０５Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ 　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｅｎｄ　　　　　　　　　　　　　　　　 　　１２７ＣＡＡ　　ＧＣＣＧＧＧ　　ＧＡＧ　　ＣＴＧ　　ＣＴＣＴＣＴ　　 ＣＡＴ　　ＧＡＡ　　ＡＣＡ　　ＡＧＡ　　ＧＣＴ　　ＡＧＡ　　ＭＣsＣＡ　 　　４５０ ＧＧＡ　ＴＧＣＴＣＡ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＧＡｃＣＭ　ＧＧＧ　ＧＴＧ 　ＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＴ　　４９５ＦＩＧ、３ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）− 平成　元年　４月ｌＬ１．日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２７９９ ２、発明の名称 ヒトコロニー形成刺激因子の非グリフシル化類似体３、特許出願人 住　所　　アメリカ合衆国ワシントン用９８１０１．　　シアトル。FIG.1 FIG.2 CAA GCCGGG GAG CTG CTCTCT CAT GAA AC A AGA GCT AGA AACTCA 450GGA TGG TCA TCT TGG AGG GACCAA GGG GTG GGCCACAG CCAT GGT 495hGM-CSF [Leu23As 27G1u39 ]n6! Column ACCCCG GAA ACT TCCTGT GCA ACCCA G ATT QTCp, cc TTT GAA AGT 315Thr P ro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gin Engineering 1e Engineering 1e　Th’r　’Phe　Glu　Ser　P05 TGCTGG AJl, G CCA GTCCAG GAG TGA GACC GG CCA GAT GAG GCT GGC405Cys Trp Lys Pro Val Gin Glu End 127CAA GCCGGG GAG CTG CTCTCT CAT GAA ACA AGA GCT AGA MCsCA 　450 GGA TGCTCA TCT TGG AGG GAcCM GGG GTG GGCCACAGCCAT GGT 495FIG, 3 Submission of translation of written amendment (Patent Law Article 184-8) April 1st year of Heisei lL1. Day Yoshi Yoshi, Commissioner of the Patent Office 1) Takeshi Moon 1. Display of patent application PCT/US87102799 2. Name of the invention Non-glyphsylated analogue of human colony-stimulating factor 3, Patent Applicant Address: Washington, USA 98101. Seattle.

ユニバーシティ・ストリート　５１．イミュネックス・ビルディング 名　称　　イミュネックス・コーポレーション４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁ｇ２番１号新大手町ビル　２０６区 電話（２７０）　６６４１〜６６４６ 昭和６３年１０月３１日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　　　　　　　１通浄書（内容に変更なし） 発明の概要 本発明は、少なくとも１つのＮ−グリコジル化部位を有するｈＣ５Ｆの天然配列 に実質上相同な、突然変異アミノ酸配列（Ｎ−グリコジル化部位を不活性化する アミノ酸の置換、欠失ヱたは挿入を少なくとも１つ含む）から成るヒトコロニー 形成刺激因子（ｈｃｓＦ）類似体を提供する。これに関連した面に２いて、不発 明はｈｃｓＦ類似体をコードするヌクレオチド配列から成る組み換えＤＮＡセグ メント、２よびそのＩ）ＮＡ上セグメント含む組み換え体発現系を提供する。University Street 51. Immunex Building Name: Immunex Corporation 4, Agent Address: Shin-Otemachi Building, 206-ku, 2-g2-1 Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo Phone (270) 6641-6646 October 31, 1986 6. List of attached documents (1) Translation of the written amendment 1 letter of entitlement (no change in content) Summary of the invention The present invention provides that the native sequence of hC5F has at least one N-glycosylation site. a mutated amino acid sequence substantially homologous to (inactivating the N-glycosylation site) human colony containing at least one amino acid substitution, deletion, or insertion) Formation stimulating factor (hcsF) analogs are provided. 2 related aspects and misfires Recombinant DNA segment consisting of nucleotide sequence encoding hcsF analogue ment, 2 and its I) recombinant expression systems comprising the NA supra-segment.

図面の簡単な説明 第１図はヒト顆収球−マクロファージコロニー形成刺激因子の炭水化物含量低下 形体のコード配列を含む、ｐαＡＤＢ２ＨｓＧＭｃｓＦＬａｓヱ”　Ａｇ　ｐ” 丁Ｇｌｓ”（Ｌ２０７　　５、ＡＴＣＣ６７，２３１）と名づけられた酵母発現 ベクターの構築を示す模式図である。Brief description of the drawing Figure 1 shows reduced carbohydrate content of human condyle-macrophage colony formation stimulating factor. pαADB2HsGMcsFLasヱ”　Ag　p” containing the coding sequence of the configuration. Yeast expression named “Ding Gls” (L207 5, ATCC67,231) FIG. 2 is a schematic diagram showing the construction of a vector.

第２図は野生型ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列２よび対応するアミ ノ酸配列を示す。Figure 2 shows the nucleotide sequence 2 of the wild-type human GM-C5F gene and the corresponding amino acid sequence. The amino acid sequence is shown.

発明の詳細な説明 本発明は、通富Ｎ−グリコジル化された免疫ｖＩ４酌タンパク質の偵能的類似体 がＮ−グリコジル化部位を欠いた実質上相同な突然変異アミノ酸配列をコードす べく改変されたＩ）ＩＪＡ配列から翻訳され得るという発見に基ついている。好 適なり碌に２いて、本発明は、ここで五ＧＭ−Ｃ５ＦＣＬａｔｂ”Ａｓｐ２γＧ ｌｓ”〕と呼ばれる非グリコジル化ヒ）　に　、Ｍ　−Ｃ５Ｆ類似体を提供する 。この類似体は実質的に同一の発現系を用いろ比ｔ１！笑験に８いて、その組み 侯え天然相同体よりも数倍高いレベルで酵母により発現・請求の範囲 １、天然ｈＧＭ−ＣｓＦに実質上相同であるアミノ酸配列を有し、酵母宿主内で Ｎ−結合グリコシル化されることなく発現により生産される、ヒト顆粒球−マク ロファージコロニー形成刺激因子類似体ｈＧＭ−Ｃ５ＦＣＬｍ譬！！　、４　、 ．２１Ｇｌｓ”〕 ２、　　＆のアミノ酸配列： 隣　　＼　　Ｏ（◇　　ζ　　４　　大神　　　ト　　　ト　　　−　　　Ｉ＠ ｏ　　　　謔　　　暢へ　　１１ｍ１＞　　　−−１。Detailed description of the invention The present invention provides novel analogues of the N-glycosylated immune vI4 protein. encodes a substantially homologous mutant amino acid sequence lacking the N-glycosylation site. It is based on the discovery that it can be translated from I) IJA sequences that have been modified to suit the needs of the patient. good As appropriate, the present invention provides five GM-C5FCLatb"Asp2γG M-C5F analogues are provided to the non-glycosylated human protein called "ls"]. . This analog was produced using a virtually identical expression system. There were 8 in the comedy show, and that group Claimed to be expressed by yeast at levels several times higher than the natural homologue 1. It has an amino acid sequence that is substantially homologous to natural hGM-CsF and is Human granulocyte-macros produced by expression without N-linked glycosylation Lophage colony formation stimulating factor analogue hGM-C5FCLm! ! , 4, ．． 21Gls"] 2. Amino acid sequence of &: Next door ＼ O(◇ ζ 4 Okami To To To − I＠ o To Nobuo 11m1＞　　　--1.

試　　　−ａｌｌ！ｋｓ！　　　　暢　　鴫−−＼　　−−−Ｎ　　− ４＼０ｂηにφｑ ｋ　Ｃ５Ｉ！ｏ　ｅｈ　ｋ　ｅＡへ− ７）大大−大４＼大Φ ｋｌｌｌ　　　　−−為　　　軸　　　トー−を有する、請求項１記載のヒト顆 粒球−マクロファージコロニー形成刺激因子類似体。Trial -all! Ks!　　　　　　　　　　--＼　---N　- φq to 4\0bη k　C5I! o　eh　k　to eA- 7) Large - Large 4\ Large Φ The human condyle according to claim 1, having an axis of Granulocyte-macrophage colony formation stimulating factor analog.

３、請求項１記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオチド 配列を、酵母宿主内で該ヌクレオチド配列の発現を可能にするプロモーターＳよ びリーダー配列と共に含む、組み換え体発現ベクター。3. A nucleotide encoding the human colony formation stimulating factor analog according to claim 1. The sequence is linked to a promoter S that allows expression of the nucleotide sequence in the yeast host. A recombinant expression vector comprising a recombinant expression vector and a leader sequence.

４、　　ＡＤＨ’ｊ：　プロモーター２よびα因子リーダー配列を含む、請求項 ３記載の組み換え発現ベクター。4. ADH'j: Claim comprising promoter 2 and alpha factor leader sequence 3. The recombinant expression vector described in 3.

５、請求項２記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオチド 配列を、酵母宿主内で該ヌクレオチド配列の発現を可能にするプロモーターおよ びリーダー配列と共に含む、組み換え体発現ベクター。5. A nucleotide encoding the human colony formation stimulating factor analog according to claim 2. The sequence is linked to a promoter and a promoter that enable expression of the nucleotide sequence in the yeast host. A recombinant expression vector comprising a recombinant expression vector and a leader sequence.

６、ＡＤＨ２プロモーターＳよびα因子リーダー配列を含む、請求項５記載の組 み換え体発現ベクター。6. The set according to claim 5, comprising ADH2 promoter S and α-factor leader sequence. Recombinant expression vector.

７、　　ＡＴＣＣ６７，２３１として寄託されたベクターの本質的特徴を有する 、請求項６記載の組み換え体発現ベクター。7. Has the essential characteristics of the vector deposited as ATCC 67,231 , the recombinant expression vector according to claim 6.

８、請求項３記載のベクターにより形質転換された酵母宿主。8. A yeast host transformed with the vector according to claim 3.

９、請求項４記載のベクターにより形質転換された酵母宿主。9. A yeast host transformed with the vector according to claim 4.

１０、請求項４記載のベクターにより形質転換された酵母宿主。10. A yeast host transformed with the vector according to claim 4.

手続補正書坊幻 特許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿１、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２７９９ ２、発明の名称 ヒトコロニー形成刺激因子の非グリコジル化類似体３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　イミュネックス・コーポレーション４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話３２７０−６６４１〜６６４６ ５、補正命令の日付　　平成　２年　１月２２日　溌送日）国際調査報告Procedural amendment book phantom Director General of the Patent Office Toshi Ueki 1, Display of the case PCT/US89102799 2. Name of the invention Non-glycosylated analogue of human colony-stimulating factor 3, corrector Relationship to the case Patent applicant address Name: Immunex Corporation 4, Agent Address: Shin-Otemachi Building, 206-ku, 2-2-1 Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo Phone 3270-6641~6646 5. Date of amendment order: January 22, 1990 Transmission date) International search report

Claims (37)

【特許請求の範囲】[Claims] １．少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するｈＣＳＦの天然配列に実質 上相同である突然変異アミノ酸配列から成り、該突然変翼配列がＮ−グリコシル 化部位を不活性化する少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入を含むヒ トコロニー形成刺激因子（ｈＣＳＦ）類似体。1. Substantial to the native sequence of hCSF with at least one N-glycosylation site consisting of a mutant amino acid sequence that is super homologous and that the mutant sequence is N-glycosyl. a human protein containing at least one amino acid substitution, deletion or insertion that inactivates the activating site. human colonization stimulating factor (hCSF) analog. ２．天然配列中に存在する少なくとも１つのＡｓｎ−Ａ１−Ｚが突然変異配列中 でＡｓｎ−Ａ２−ＹまたはＸ−Ａ２−Ａ３（ここでＡ１、Ａ２およびＡ３は同一 であるか又は異なり、いずれのアミノ酸であつてもよく：ＸはＡｓｎ以外のアミ ノ酸であり；ＹはＺ以外のアミノ酸であり；そしてＺはＳｅｒまたはＴｈｒであ る）により置換されている、請求項１記載のｈＣＳＦ類似体。2. At least one Asn-A1-Z present in the native sequence is present in the mutant sequence Asn-A2-Y or X-A2-A3 (where A1, A2 and A3 are the same) or different, and may be any amino acid: X is an amino acid other than Asn. Y is an amino acid other than Z; and Z is Ser or Thr. 2. The hCSF analog of claim 1, wherein the hCSF analog is substituted with ３．天然配列中に存在する全てのＡｓｎ−Ａ１−Ｚが突然変異配列中でＡｓｎ− Ａ２−ＹまたはＸ−Ａ２−Ａ３により置換されている、請求項２記載のｈＳＣＦ 類似体。3. All Asn-A1-Z present in the native sequence are replaced by Asn-A1-Z in the mutant sequence. hSCF according to claim 2, substituted by A2-Y or X-A2-A3. Analogs. ４．存在するＡｓｎ−Ａ１−Ｚの１つがＸ−Ａ２−Ａ３で置換され、ここでＸが Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｍ、Ａｌａ、Ｇｌｖ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである、請求 項３記載のｈＣＳＦ類似体。4. One of the Asn-A1-Z present is replaced with X-A2-A3, where X is Claims that are Asp, Gln, Glm, Ala, Glv, Ser, or Thr hCSF analog according to item 3. ５．ＸがＡｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｍである、請求項４記載のｈＣＳＦ類似体。5. 5. The hCSF analog of claim 4, wherein X is Asp, Gln or Glm. ６．存在するＡｓｎ−Ａ１−Ｚの１つにおいて、ＺがＳｅｒであり、Ａｓｎ−Ａ １−ＺがＡｓｎ−Ａ２−Ｙで置換され、そしてＹがＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖ ａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｎである、請求項３記載のｈＣＳＦ 類似体。6. In one of the Asn-A1-Z present, Z is Ser and Asn-A 1-Z is substituted with Asn-A2-Y, and Y is Met, Leu, He, V hCSF according to claim 3, which is al, Asp, Gln, Glu, or Asn. Analogs. ７．ＹがＭｅｔ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌである、請求項６記載のｈＣＳＦ 類似体。7. hCSF according to claim 6, wherein Y is Met, Leu, He or Val. Analogs. ８．存在するＡｓｎ−Ａ１−Ｚの１つにおいて、ＺがＴｈｒであり、Ａｓｎ−Ａ １−ＺがＡｓｎ−Ａ２−Ｙで置換され、そしてＹがＧｌｕ、ＡｓｐＧｌｎ、Ｖａ ｌ、ＧｌｙまたはＡｌａである、請求項３記載のｈＣＳＦ類似体。8. In one of the Asn-A1-Z present, Z is Thr and Asn-A 1-Z is substituted with Asn-A2-Y, and Y is Glu, AspGln, Va 4. The hCSF analog of claim 3, which is 1, Gly or Ala. ９．ＹがＧｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎである、請求項８記載のｈＣＳＦ類似体。9. 9. The hCSF analog according to claim 8, wherein Y is Glu, Asp or Gln. １０．天然ｈＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３またはＢＰＡである 、請求項３記載のｈＣＳＦ類似体。10. the native hCSF is GM-CSF, CSF-1, IL-3 or BPA , hCSF analogue according to claim 3. １１．ｈＣＳＦがＣＳＦ−１である、請求項１０記載のｈＣＳＦ類似体。11. 11. The hCSF analog of claim 10, wherein hCSF is CSF-1. １２．ｈＣＳＦがＢＰＡである、請求項１０記載のｈＣＳＦ類似体。12. 11. The hCSF analog of claim 10, wherein hCSF is BPA. １３．ｈＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦである、請求項１０記載のｈＣＳＦ類似体。13. 11. The hCSF analog according to claim 10, wherein hCSF is GM-CSF. １４．天然配列中のＡｓｎ２７ＬｅｕＳｅｒがＸ−Ａ２−Ａ３またはＡｓｎ−Ａ ２−Ｙで置換され、そしてＡｓｎ３７ＧｌｕＴｈｒがｘ−Ａ２−Ａ３またはＡｓ ｎ−Ａ２−Ｙ１で置換され、ここでＸがＡｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｙ がＭｅｔ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌであり、そしてＹ１がＧｌｕ、Ａｓｐま たはＧｌｎである、請求項１０記載のＧＭ−ＣＳＦ類似体。14. Asn27LeuSer in the natural sequence is X-A2-A3 or Asn-A 2-Y and Asn37GluThr is replaced by x-A2-A3 or As n-A2-Y1, where X is Asp, Glu or Gln, and Y is Met, Leu, He or Val, and Y1 is Glu, Asp or 11. The GM-CSF analog according to claim 10, which is Gln or Gln. １５．天然配列中のＡｓｎ２７ＬｅｕＳｅｒがＡｓｐＬｅｕＳｅｒまたはＡｓｎ ＬｅｕＭｅｔで置換され、そしてＡｓｎ３７ＧｌｕＴｈｒがＧｌｎＧｌｕＴｈｒ またはＡｓｎＧｌｕＧｌｕで置換される、請求項１４記載のＧＭ−ＣＳＦ類似体 。15. Asn27LeuSer in the natural sequence is AspLeuSer or Asn LeuMet was substituted and Asn37GluThr was replaced with GlnGluThr or AsnGluGlu. . １６．ｈＧＭ−ＣＳＦ〔Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９〕である、請求項１５ 記載のＧＭ−ＣＳＦ類似体。16. Claim 15, which is hGM-CSF [Leu23Asp27Glu39]. GM-CSF analogs as described. １７．Ａｌａ１で始まる、第３図に示したアミノ酸配列から成るヒトＧＭ−ＣＳ Ｆ類似体。17. Human GM-CS consisting of the amino acid sequence shown in Figure 3 starting with Ala1 F analog. １８．請求項１記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオチ ド配列から成る組み換えＤＮＡセグメント。18. A nucleotide encoding a human colony-stimulating factor analog according to claim 1. A recombinant DNA segment consisting of a code sequence. １９．請求項２記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオチ ド配列から成る組み換えＤＮＡセグメノト。19. A nucleotide encoding a human colony formation stimulating factor analog according to claim 2. A recombinant DNA segment consisting of a code sequence. ２０．請求項３記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオチ ド配列から成る組み換えＤＮＡセグメント。20. A nucleotide encoding a human colony-stimulating factor analog according to claim 3. A recombinant DNA segment consisting of a code sequence. ２１．請求項１０記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオ チド配列から成る組み換えＤＮＡセグメント。21. A nucleo encoding a human colony-stimulating factor analog according to claim 10. A recombinant DNA segment consisting of a sequence. ２２．請求項１３記載のヒトコロニー形成刺激因子類似体をコードするヌクレオ チド配列から成る組み換えＤＮＡセグメント。22. A nucleo encoding a human colony-stimulating factor analog according to claim 13. A recombinant DNA segment consisting of a sequence. ２３．請求項１４記載のヒトＧＭ−ＣＳＦ類似体をコードするヌクレオチド配列 から成る組み換えＤＮＡセグメント。23. Nucleotide sequence encoding a human GM-CSF analog according to claim 14 A recombinant DNA segment consisting of. ２４．請求項１５記載のヒトＧＭ−ＣＳＦ類似体をコードするヌクレオチド配列 から成る組み換えＤＮＡセグメント。24. A nucleotide sequence encoding a human GM-CSF analog according to claim 15. A recombinant DNA segment consisting of. ２５．請求項１６記載のヒトＧＭ−ＣＳＦ類似体をコードするヌクレオチド配列 から成る組み換えＤＮＡセグメント。25. Nucleotide sequence encoding a human GM-CSF analog according to claim 16 A recombinant DNA segment consisting of. ２６．コドンＧＣＴ（Ａｌａ１）で始まり、コドンＧＡＧ（Ｇｌｕ１２７）で終 わる第３図に示したヌクレオチド配列から成る、請求項２５記載の組み換えＤＮ Ａセグメント。26. Starts with codon GCT (Ala1) and ends with codon GAG (Glu127) 26. The recombinant DN according to claim 25, consisting of the nucleotide sequence shown in FIG. A segment. ２７．請求項１８記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。27. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 18. ２８．請求項１９記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。28. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 19. ２９．請求項２０記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。29. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 20. ３０．請求項２１記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。30. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 21. ３１．請求項２２記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。31. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 22. ３２．請求項２３記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。32. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 23. ３３．請求項２４記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。33. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 24. ３４．請求項３５記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。34. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 35. ３５．請求項２６記載のＤＮＡセグメントを含む組み換え体発現系。35. A recombinant expression system comprising a DNA segment according to claim 26. ３６．適当な酵母菌株中に存在するプラスミドｐＡＤＨ２ＨｕＧＭＣＳＦ〔Ｌｅ ｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９〕（ＡＴＣＣ６７２３１）から成る酵母組み換え体 発現系。36. Plasmid pADH2HuGMCSF [Le u23Asp27Glu39] (ATCC67231) Expression system. ３７．プラスミドｐＡＤＨ２ＨｕＧＭＣＳＦ〔Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９ 〕ＡＴＣＣ６７，２３１〕。37. Plasmid pADH2HuGMCSF [Leu23Asp27Glu39 [ATCC67, 231].