JPH03500721A - Encapsulation of biological materials within semipermeable membranes - Google Patents
Encapsulation of biological materials within semipermeable membranesInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 半透膜内に生物学的材料のカプセル化 致■分■ 本発明はカプセル化製品に関する。さらに詳しくは、本発明はゲル形成性ポリマ ーの半透膜内に生活性材料のカプセル化方法に関する。[Detailed description of the invention] Encapsulation of biological materials within semipermeable membranes ■Minute■ The present invention relates to encapsulated products. More specifically, the present invention provides gel-forming polymers. This invention relates to a method for encapsulating bioactive materials in semipermeable membranes.
宜」Ｕ４植 カプセル化方法はバイオテクノロジーの種々の分野において増加する用途を見出 しつつある。そのような方法は、後でバイオリアクター、人工臓器、生分離シス テム、制御された薬物放出システムなどに使用できる酵素、ホルモン、薬物、吸 着剤および細胞のような種々の材料をカプセル化するために使用される。先行技 術プロセスは非水溶液、極端なｐＨ１または高温度の使用のような苛酷な条件を しばしば必要とする。そのような技術は生きている細胞および不安定なタンパク のようなデリケートな生物学的材料のカプセル化には本来不適当である。理想的 には、生物学的材料のためのカプセル化技術は緩和な条件と、カプセル化される 材料に対して不活性で無毒な膜材料を使用すべきである。また、このカプセル化 技術は半透膜を提供し、そして膜厚および膜孔径の調節を許容しなければならな い。好ましくは、膜の電荷は種々の用途に通するように調節可能でなければなら ない。膜はまた攪拌から発生する液体せん断または摩擦効果に耐えるのに十分な ように強くなければならない。"Yi" U4 plant Encapsulation methods are finding increasing use in various fields of biotechnology. It is being done. Such methods could later be used in bioreactors, artificial organs, and bioseparation systems. Enzymes, hormones, drugs, Used to encapsulate various materials such as adhesives and cells. Preceding technique The process may involve harsh conditions such as the use of non-aqueous solutions, extreme pH levels, or high temperatures. often needed. Such techniques can be applied to living cells and unstable proteins. They are inherently unsuitable for the encapsulation of delicate biological materials such as. Ideal Encapsulation techniques for biological materials require mild conditions and are encapsulated Membrane materials should be used that are inert and non-toxic to the material. Also, this encapsulation The technology must provide a semipermeable membrane and allow adjustment of membrane thickness and membrane pore size. stomach. Preferably, the charge of the membrane should be adjustable to accommodate various applications. do not have. The membrane is also sufficiently strong to withstand liquid shear or frictional effects generated from agitation. You have to be as strong as you are.
良く知られた膜カプセル化方法は、高分子電解質膜複合体の形成を含むポリ（Ｌ −リジン）−アルギン酸塩脱法である。この方法においては、生活性材料とアル ギン酸ナトリウムの混合物が液滴形成装置を通って塩化カルシウムを含有する覆 面液中に押出される。Ｃａ”陽イオンが殆ど瞬間的にアルギン酸塩マトリックス を架橋し、ゲルビーズを形成する。ビーズは次に外層中のカルシウムイオンを置 換するためポリーＬ−リジンで処理され、高分子電解質複合体膜を形成する。ビ ーズ内部のアルギン酸カルシウムゲルは、次にカルシウムキレート剤を使用して 液化される。膜カプセル化方法はゲル包接に見られる問題を蒙ることがない。動 物細胞培養物用途においては、細胞が膜カプセル内でおびただしく発育し、組織 類似密度に達することが観察された。しかしながらこの方法は多数の処理ステッ プを含んでいる。この方法はまたその高分子電解質性格のため帯電した膜を提供 する。また、この膜はアルギン酸塩またはポリ （Ｌ−リジン）と一層強く相互 作用するヘパリン、ポリスルホン酸およびポリリン酸のような電解質の存在下で は比較的貧弱な機械的強度および貧弱な化学的安定性を持っている。さらに液化 したアルギン酸塩がカプセル内に残っている。アルギン酸塩は多価イオンまたは 他の帯電したマクロ分子と複合化によって生材料の機能を妨害し得る。A well-known membrane encapsulation method involves the formation of polyelectrolyte membrane complexes. -lysine)-alginate removal method. In this method, living materials and alcohol A mixture of sodium ginate is passed through a droplet former into a coating containing calcium chloride. Extruded into surface liquid. Ca” cations almost instantaneously connect to the alginate matrix. crosslink to form gel beads. The beads then place calcium ions in the outer layer. is treated with poly-L-lysine to convert the polyelectrolyte into a polyelectrolyte composite membrane. B The calcium alginate gel inside the case is then treated with a calcium chelating agent. liquefied. Membrane encapsulation methods do not suffer from the problems seen with gel inclusion. motion In cell culture applications, cells grow profusely within membrane capsules and tissue It was observed that similar densities were reached. However, this method requires many processing steps. Contains This method also provides charged membranes due to its polyelectrolyte nature. do. This membrane also interacts more strongly with alginate or poly(L-lysine). In the presence of electrolytes such as heparin, polysulfonic acid and polyphosphoric acid that act has relatively poor mechanical strength and poor chemical stability. Further liquefaction The alginate remains in the capsule. Alginate is a polyvalent ion or They can interfere with the functionality of raw materials by complexing with other charged macromolecules.
アルギン酸塩はまたプラスに帯電した表面上に吸着し、そして汚染を生じ得る。Alginate can also adsorb onto positively charged surfaces and cause contamination.
このように生活性材料の改良したカプセル化方法に対して需要が存在し、そして そのような改良方法を提供することが本発明の目的である。本発明のそれ以上の 理解は以下の説明および請求の範囲から得られるであろう。ここですべての部お よびパーセントは特記しない限り重量による。Thus, there is a need for improved encapsulation methods for bioactive materials, and It is an object of the present invention to provide such an improved method. Further of the present invention Understanding may be gained from the following description and claims. All parts here and percentages are by weight unless otherwise specified.
オ溌１江１し甜１斐 本発明によれば、以下のステップ： （Ａ）カプセル化すべき所望の材料を、該材料と併存でき、そしてＣａ”、Ｋ” 、ポリリン酸塩等のような少量の、効果あるそして拡散可能なゲル化剤を含み、 場合により増結剤を含んでもよい媒体中に懸濁するステップと、 （Ｂ）前記懸濁液を前記材料を包囲する十分な寸法の、そして外側層を有する液 滴に形成するステップと、（Ｃ）前記外側層を、前記ゲル化剤と接触する時ゲル 化するゲル形成性ポリマーの存効量を含むゲル化溶液と接触させることによって 分離したカプセルを形成するように前記液滴をゲル化するステップを含む方法に よって所望の材料が半透膜内にカプセル化される。1 stream 1 stream 1 stream According to the invention, the following steps: (A) the desired material to be encapsulated can co-exist with said material, and Ca", K" Contains small amounts of effective and diffusible gelling agents, such as polyphosphates, etc. suspending in a medium optionally containing a thickener; (B) the suspension is a liquid of sufficient size and having an outer layer to surround the material; (C) forming the outer layer into a gel upon contact with the gelling agent; by contacting with a gelling solution containing an effective amount of a gel-forming polymer that a method comprising gelling said droplets to form discrete capsules; The desired material is thus encapsulated within the semipermeable membrane.
日の ましい貝 を −るための能動」ｌＩ螢隨所本発明によれば、ゲル形成性 ポリマーが種々の材料をカプセル化する半透膜を形成するために使用される。本 発明のプロセスは生物学的材料のカプセル化に特に良く通していることが認めら れるであろう。生物学的材料をカプセル化するための既知方法の多くと異なって 、この方法は生物学的材料の大部分はゲル形成性ポリマーと決して接触しない。According to the present invention, gel-forming properties Polymers are used to form semipermeable membranes that encapsulate various materials. Book It has been found that the inventive process is particularly amenable to the encapsulation of biological materials. It will be. Unlike many of the known methods for encapsulating biological materials , this method ensures that the majority of the biological material never comes into contact with the gel-forming polymer.
生物学的材料は懸濁液中のその元の環境内にとどまる。このため本発明の好まし い具体例の説明は生物学的材料のカプセル化の状況にある。しかしながら本発明 方法は他の材料をカプセル化するためにも使用することができ、そのような他の 使用は本発明の広い範囲にあることが企図される。The biological material remains in its original environment in suspension. For this reason, the present invention is preferable. A specific example illustration is in the context of encapsulation of biological materials. However, the present invention The method can also be used to encapsulate other materials, such as Uses are contemplated within the broad scope of this invention.
カプセル化すべき生物学的材料は、組織、細胞小器官、植物または動物細胞、デ ルタ細胞、ランゲルハンス島、肝細胞、バクテリア、藻類、カビ、ビールス、タ ンパク、医薬化合物等であることができる。材料は本発明の液滴方法によってカ プセル化するのに通するように十分に小さい寸法のものでなければならないが、 しがし直径は１ミクロン以下から数ミリメートルまで広く変化できる。この方法 は生きた細胞を半透膜中にカプセル化し、細胞に生育のため必要な栄養および他 の物質へのアクセスを許容するが、しかし抗体、毒素およびバクテリアのような 選択した寸法以上の分子量を有する物質から細胞を保護する。このため生物学的 材料を長期間生存状態に保つことができる。Biological materials to be encapsulated include tissues, organelles, plant or animal cells, ruta cells, islets of Langerhans, liver cells, bacteria, algae, molds, viruses, It can be a protein, a pharmaceutical compound, etc. The material is coated by the droplet method of the present invention. It must be small enough to fit through packaging, but The diameter of the shield can vary widely from less than 1 micron to several millimeters. this method encapsulates living cells in a semi-permeable membrane, providing the cells with nutrients and other nutrients necessary for growth. substances such as antibodies, toxins and bacteria. Protect cells from substances with molecular weights greater than or equal to selected dimensions. Therefore biological Materials can be kept viable for long periods of time.
生物学的材料は最初核材料と生理学的に共存し得る水性媒体中に懸濁される。媒 体は必要な栄養を含め、存毒物質を含まず、そして例えば典型的な緩衝液のよう な適当なｐＨを持っていなければならない。媒体はまた、ゲル化剤の有効量を含 んでいる。ゲル化剤は外部へ拡散し、そして後で詳しく記載するようにそれと接 触したときゲル形成性ポリマーをゲル化するタイプのものであり、そしてそのた めに有効な量にある。場合によって水性媒体はデキストラン、ヒアルウロン酸、 ポリエチレングリコール、デンプン等のような増粘剤を含む。The biological material is initially suspended in an aqueous medium that is physiologically compatible with the nuclear material. medium The body contains necessary nutrients, is free of toxic substances, and is supplied with water such as a typical buffer. It must have a suitable pH. The medium also contains an effective amount of a gelling agent. I'm reading. The gelling agent diffuses out and comes into contact with it as detailed below. It is a type of gel-forming polymer that gels when it comes into contact with it; in an effective amount. In some cases, the aqueous medium is dextran, hyaluronic acid, Contains thickeners such as polyethylene glycol, starch, etc.
カプセル化すべき材料の懸濁液は、例えば懸濁液を細いノズル、毛細管または皮 下注射針を通って落下させることによって材料を包囲するのに十分な寸法の液滴 に形成される。この方法はデリケートな生物学的材料にも適用できる９代わりに 、カプセル化すべき材料は大規模使用のためパンチプレスタイプ装置を使用し、 またはペレットミルを使用してペレット化することができる。液滴またはペレ溶 液を収容した槽中へ落下することによって外側表面層をゲル形成性ポリマーと接 触させることにより、殆ど瞬間的にゲル化した半透膜が形成される。ゲル形成性 ポリマーはゲル化剤と接触し、殆ど瞬間的に液滴をカプセル化する半透膜を形成 する。Suspensions of the material to be encapsulated can be prepared, for example, by passing the suspension through a fine nozzle, capillary tube or skin. A droplet of sufficient size to encircle the material by dropping it through the hypodermic needle is formed. This method can also be applied to delicate biological materials.9 Alternatively, , the material to be encapsulated uses punch press type equipment for large-scale use, Or it can be pelletized using a pellet mill. Droplets or pellets The outer surface layer is brought into contact with the gel-forming polymer by falling into a bath containing a liquid. Upon contact, a gelled semipermeable membrane is formed almost instantaneously. Gel forming property The polymer comes into contact with the gelling agent and forms a semipermeable membrane that almost instantaneously encapsulates the droplets. do.
ゲル形成性ポリマーはゲル化剤と接触するときゲルを形成する任意の無毒性水溶 性ゲル形成性ポリマーでよい。場合によりゲル形成性ポリマーは水溶性多糖類の ようなイオノトロピー性ゲル形成性ポリマーである。適当な多糖類は植物材料か ら典型的に抽出したものであり、そしてアルギン酸ナトリウム、グアーガム、ア ラビヤゴム、カラゲーナン、ペクチン、トラガントガム、キサンタンガム、およ び脱アセチル化キチン（キトサン）を含む。ゲル化剤と接触する時、多糖類分子 は水不溶性形状保持ゲルカプセルを形成する。A gel-forming polymer is any non-toxic water-soluble polymer that forms a gel when it comes into contact with a gelling agent. A gel-forming polymer may be used. In some cases, the gel-forming polymer is a water-soluble polysaccharide. It is an ionotropic gel-forming polymer. Is a suitable polysaccharide plant material? and sodium alginate, guar gum, Rubiya gum, carrageenan, pectin, tragacanth gum, xanthan gum, and Contains deacetylated chitin (chitosan). When in contact with a gelling agent, polysaccharide molecules forms a water-insoluble shape-retaining gel capsule.
本発明の一利益は、ゲル形成性ポリマーがゲル化前液滴の外側表面部分のみと接 触することである。このためカプセル化された材料に対してもしあってもポリマ ーの影響は少ししかない。本発明の他の利益は、この方法はカプセル形成のため 最初ゲル包接ステップの必要性を回避することである。もし最初ゲル化を使用し て形成される膜タイプが特定の生処理用途のために適切であるならば、カプセル はゲル化溶液から回収され、そして所望の媒体で平衡化されることができる。し かしながらカプセル膜の機械的および化学的強度は種々の生処理および生体医学 用途に適すようにさらに変質することができる。One advantage of the present invention is that the gel-forming polymer is in contact only with the outer surface portion of the pre-gel droplet. It is about touching. For this reason, the polymer, if any, - has only a small influence. Another benefit of the present invention is that this method is suitable for capsule formation. The first is to avoid the need for a gel inclusion step. If you use gelation first If the membrane type formed is suitable for a particular bioprocessing application, can be recovered from the gelling solution and equilibrated with the desired medium. death However, the mechanical and chemical strength of the capsule membrane is important for various bioprocessing and biomedical applications. It can be further modified to suit the application.
膜を変質するため、膜へ機械的強度、化学的安定性、孔径および／または表面電 荷のような変った性質を与えるように第２のゲル形成性ポリマーを使用すること ができる。第２のポリマーは第１のポリマーと反対の電荷を持った他の高分子電 解質とすることができる。Mechanical strength, chemical stability, pore size and/or surface electrical potential are Using a second gel-forming polymer to impart unusual properties such as loading Can be done. The second polymer is made of another polymer with an opposite charge to the first polymer. It can be a solute.
この場合第２のポリマーは最初のゲル膜と複合するようにカプセルの外側表面上 に被覆することができる。性成する高分子電解質複合体はカプセルへ大きな化学 的安定性を与える。例えば、アルギン酸ナトリウムカプセルは、複合膜を有する カプセルを形成するようにポリ（Ｌ−リジン）、ポリエチレンイミン、キトサン またはアクリレート／メタクリレート共重合体（ｊイドラジットＲＬ−１００゜ ***タルムシュタット、ローム、ゲーエムベーハー）のよウナポリカチオンで被 覆することができる。膜のどちらの側にも所望の電荷特性を持つカプセルを得る ことが可能である。In this case the second polymer is placed on the outer surface of the capsule so as to be composited with the first gel membrane. can be coated with The polyelectrolyte complex that forms is a large chemical component in the capsule. provides stability. For example, sodium alginate capsules have a composite membrane Poly(L-lysine), polyethyleneimine, chitosan to form capsules or acrylate/methacrylate copolymer (j Idragit RL-100゜ (West German Talmstadt, Rohm, GmbH) It can be reversed. Obtain capsules with desired charge characteristics on either side of the membrane Is possible.
代わりに、ゲル形成性溶液は、第１のポリマーに加え、可溶化した第２のゲル形 成性ポリマーを含む。最初の膜を形成するように第１のゲル形成性ポリマーの殆 ど瞬間的なゲル化は膜内に第２のゲル形成性ポリマーを包接する。また高粘度の ため、ある種のポリマー溶液はカプセル表面の外側へそれがゲル化溶液から除去 される時付着し得る′。カプセルは油性媒体中か、または第１および／または第 ２のポリマーに対するゲル化剤を含んでいる緩衝液中に置くことができる。これ らのアプローチの両方ともカプセルをカバーする薄い液体ポリマー溶液の損失を 減らす。当業者にはカプセルの物理化学的条件は第２のポリマーのゲル化を誘発 する多種類の方法で変えることができることが自明°であろう。Alternatively, the gel-forming solution contains a first polymer plus a solubilized second gel form. Contains synthetic polymers. most of the first gel-forming polymer to form the first film. Instantaneous gelation encapsulates the second gel-forming polymer within the membrane. Also, high viscosity Because some polymer solutions are removed from the gelling solution to the outside of the capsule surface, It can be attached when it is done. Capsules are placed in an oily medium or in a first and/or second 2 can be placed in a buffer containing a gelling agent for the polymer. this Both approaches involve the loss of a thin liquid polymer solution covering the capsule. reduce. It is understood by those skilled in the art that the physicochemical conditions of the capsule induce gelation of the second polymer. It will be obvious that this can be varied in many different ways.
場合により、第２のゲル形成性ポリマーは熱ゲル形成性ポリマーであることがで きる。熱ゲル形成性ポリマーはそれらの温度がそれらのゲル化温度以下に下降す る時ゲル化し、そして一般にイオノトロピー性ゲルにまさる化学的および機械的 性質を持っている。ゲル包接には広く使用されているが、熱ゲルを使用する膜カ プセル化方法は現在存在しない。本発明においては、例えばアガロースおよびカ ッパーカラゲーナンを含む多種類の熱ゲル形成性ポリマーを使用することができ る。Optionally, the second gel-forming polymer can be a thermal gel-forming polymer. Wear. Thermogel-forming polymers are used when their temperature is lowered below their gelling temperature. gels when gelled, and generally has better chemical and mechanical have characteristics. Although widely used for gel inclusion, membrane coatings using thermal gels No packaging method currently exists. In the present invention, for example, agarose and carbon A wide variety of thermogel-forming polymers can be used, including carrageenan. Ru.
もし望むならば、複合膜の第１のポリマー成分はこの分野で良く知られた手段に よって除去することができる。例えば、もし第１のポリマーがイオノトロピー性 ゲル形成ポリマー・−であるならば、その溶解は第２のポリマーのゲル化が完了 した後カプセルをキレート剤と接触させることによって達成できる。If desired, the first polymeric component of the composite membrane can be modified by means well known in the art. Therefore, it can be removed. For example, if the first polymer is ionotropic If the gel-forming polymer is -, its dissolution indicates that the gelation of the second polymer is complete. This can be achieved by subsequently contacting the capsule with a chelating agent.
この方法は融通性があり、そして実質的な変更を加え得ることが認められるであ ろう。膜は多種類の利用し得るゲル形成性ポリマーを使用して形成することがで きる。異なる特性の膜はポリマーのタイプおよび濃度を変えることによって得る ことができる。アガロース、カッパー力ラゲーナン、またはゼラチンのような水 性熱ゲルは、生きている細胞および不安定タンパクのようなデリケートな材料を カプセル化するために使用し得る。もしカプセル化する材料が有機溶媒、反応性 架橋剤および短時間の極端なＴ）Ｈの存在下で安定であるならば、ここで使用可 能なポリマーのリストは沈澱ゲル（例えばセルロースアセテート）、重縮合ゲル （例えばエポキシおよびポリウレタン）および共重合ゲル（例えばポリアクリル アミド）を含むように拡張し得る。これらのポリマーを使用して形成したカプセ ルはより大きい構造剛直性および化学的不活性の膜内に吸着剤、薬物および安定 な酵素をカプセル化するために使用し得る。It will be appreciated that this method is flexible and can be subject to substantial modification. Dew. Membranes can be formed using a wide variety of available gel-forming polymers. Wear. Membranes with different properties are obtained by varying the polymer type and concentration. be able to. water like agarose, kappa power lagenan, or gelatin Thermal gels are suitable for handling delicate materials such as living cells and unstable proteins. Can be used for encapsulation. If the encapsulating material is an organic solvent or reactive Can be used here if it is stable in the presence of cross-linkers and extreme T)H for short periods of time. A list of possible polymers includes precipitated gels (e.g. cellulose acetate), polycondensed gels. (e.g. epoxies and polyurethanes) and copolymer gels (e.g. polyacrylics) amide). Capsules formed using these polymers The membrane has greater structural rigidity and chemical inertness to absorb adsorbents, drugs and stabilize can be used to encapsulate various enzymes.
実施例１ この実施例はカプセル化すべき材料を含有するアルギン酸カルシラムカプセルの 形成を例証する。０．８％アルギン酸ナトリウム（シグマＡ ７１２８．タイプ ■）を含有する溶液を調製し、室温においてマグネチックスクーラーを使用して 攪拌し続ける。カプセル化すべき材料を含む水性懸濁液を０．１ Ｍ Ｃａ Ｃ Ｉ ｔおよび２０％デキストラン（シグマＤ’４１３３）を添加した０、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ Ｈ７）中に調製する。懸濁液は高速攪拌アルギン酸溶液 中へ落下する液滴を形成するように皮下注射針を通して落下させる。Example 1 This example describes the calculation of calcium alginate capsules containing the material to be encapsulated. Illustrating formation. 0.8% sodium alginate (Sigma A 7128. type ■) Prepare a solution containing Continue stirring. An aqueous suspension containing the material to be encapsulated was mixed with 0.1 M CaC. 0, 1M with addition of IT and 20% dextran (Sigma D'4133) Prepare in HEPES buffer (pH7). Suspension is a high speed stirring alginate solution Drop through the hypodermic needle to form a droplet that falls into the hypodermic needle.
界面のアルギン酸分子のＣａ ”陽イオンによる架橋のため懸濁液滴のまわりに カプセル膜が殆ど瞬間的に生成する。カプセルを除去する前に、ポリマー溶液は 必要量の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を加えることによって５倍に希 釈される。このステップはカプセル外側のアルギン酸塩溶液を希釈し、そしてカ プセルがそれらの外側表面上のアルギン酸塩溶液のゲル化により、それらが密着 した時相互に合体する可能性を減らす、カプセルは溶液から回収され、そして過 剰の溶液は適当寸法の網を使用して排液される。カプセルは０．１ Ｍ Ｃａ Ｃ１ｔを含有する０、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）へ移され、そして外表 面を安定化するため１分間インキュベートする。最後にカプセルは所望の媒体で 平衡化される。around the suspension droplets due to crosslinking by Ca cations of alginate molecules at the interface. A capsule membrane forms almost instantaneously. Before removing the capsule, the polymer solution is Dilute 5 times by adding the required amount of 0.1M HEPES buffer (pH 7). be interpreted. This step dilutes the alginate solution on the outside of the capsule and The cells stick together due to the gelation of the alginate solution on their outer surface. When the capsules are removed from the solution and superfluous, reducing the possibility of coalescence with each other, Excess solution is drained using a suitably sized screen. Capsule is 0.1M Ca Transferred to 0.1 M HEPES buffer (pH 7) containing C1t and Incubate for 1 minute to stabilize the surface. Finally the capsule is in the desired medium Equilibrated.
実施例２ この実施例は所望の材料を含有するアガロースカプセルの形成を例証する。０． ５％アガロース（シグマＡ ４０１８．タイプ■）と０．２５％アルギン酸ナト リウム（シグマＡ ７１２８．タイプ■）とを含む溶液を調製し、暖めそしてマ グネチックスクーラーを使用して４０°Ｃで攪拌し続ける。生物学的材料を含有 する水性緩衝化懸濁液を０．１ Ｍ Ｃａ Ｃｌ ｔで調製する。この懸濁液の 粘度を２０％デキストラン（シグマＤ ４１００）を加えることによって増加さ せる。懸濁液をアルギン酸塩／アガロース溶液中へ落下する液滴を形成するよう に皮下注射針を通して落下させる。界面のアルギン酸塩のＣａ・２陽イオンによ る架橋のため懸濁液滴のまわりにカプセル膜が殆ど瞬間的に生成する。生成した カプセルを分離し、油性媒体中３５°Ｃで激しく振とうし、その時液滴を囲む膜 中およびまわりのアガロースは固化し、ゲルー油界面における界面張力は平滑な そして均一な外表面をもたらす。カプセルは次にＣａ ”のキレート剤である０ 、０５Ｍ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で平衡化し、これはゲル膜のアルギン酸カル シウム成分を液化除去する。最後にカプセルを洗い、所望の媒体中に置く。Example 2 This example illustrates the formation of agarose capsules containing the desired materials. 0. 5% agarose (Sigma A 4018. type ■) and 0.25% sodium alginate Prepare a solution containing aluminum (Sigma A 7128. type ■), warm it up and Continue stirring at 40°C using a magnetic cooler. Contains biological material An aqueous buffered suspension is prepared with 0.1 M CaClt. of this suspension The viscosity was increased by adding 20% dextran (Sigma D 4100). let Allow the suspension to form droplets that fall into the alginate/agarose solution. drop it through the hypodermic needle. Due to Ca 2 cations of alginate at the interface. Due to the crosslinking, a capsule membrane forms almost instantaneously around the suspension droplets. generated Separate the capsules and shake vigorously at 35 °C in an oily medium, when the membrane surrounding the droplets The agarose in and around it solidifies, and the interfacial tension at the gel-oil interface becomes smooth. and provides a uniform outer surface. The capsule is then filled with 0, which is a chelating agent for Ca. , equilibrated in a buffer containing 05M EDTA, which Liquefy and remove the lithium component. Finally, wash the capsules and place them in the desired medium.
存在のためかなり強いことがわかった。このカプセルはまたＮａＣ１゜ＥＤＴＡ 、リン酸塩等の高濃度を含有する溶液中で安定であることがわかった。It turned out to be quite strong due to its existence. This capsule also contains NaC1°EDTA , was found to be stable in solutions containing high concentrations of phosphates, etc.
実施例３ この実施例は所望の材料を含有するキトサンカプセルの形成を例証する。０．５ ％キトサン（シグマＣ３，６４６）を０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸を含む水中に溶解 する。カプセル化すべき材料は４０％デキストラン（シグマＤ ４１３３）を含 む１．５％トリポリリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）と混合する。この懸濁 液は粘い懸濁液の小さい液滴（０，５〜１．０ユ直径）形成のため空気ジェット へ接続した皮下注射針を通して押出す。液滴は液体を包囲するポリリン酸キトサ ン塩膜を瞬間的に形成する。カプセルを溶液から除去し、そしてさらに１．５％ トリポリリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８，５）中で半時間処理する。最後にカプ セルは所望の緩衝液中で平衡化される。Example 3 This example illustrates the formation of chitosan capsules containing the desired materials. 0.5 % chitosan (Sigma C3,646) dissolved in water containing 0.5% (V/V) acetic acid. do. The material to be encapsulated contains 40% dextran (Sigma D 4133). Mix with 1.5% sodium tripolyphosphate solution (pH 5.5). This suspension The liquid is air jetted for the formation of small droplets (0.5-1.0 U diameter) of a viscous suspension. extrude through a hypodermic needle connected to the Droplets are made of polyphosphate chitosa surrounding the liquid. Instantly forms a salt film. Remove the capsules from the solution and add another 1.5% Treat for half an hour in sodium tripolyphosphate solution (pH 8,5). finally cup The cell is equilibrated in the desired buffer.
実施例４ この実施例は哺乳類細胞のアルギン酸塩／ポリ−（Ｌ−リジン）カプセル中への カプセル化を例証する。ＫＢ細胞を１０％デキストランおよび１．３％Ｃａ Ｃ １ｇよりなり、１３ｍＭ ＨＥＰＥＳで緩衝化した溶液（ｐＨ７）中へ１０ｓ細 胞／戚の濃度で懸濁する。溶液を高速攪拌等張ＮａＣｌ溶液中０５２５％アルギ ン酸ナトリウム溶液（ＫＥＬＣＯ，ＬＶ）中ヘアトマイザーを通って押出す、こ のように形成したＫＢ細胞含有カプセルは溶液を等張ＮａＣ１溶液を使用して５ 倍希釈した後除去する。カプセルはその後カプセルを強化するため０．０５％ポ リ（Ｌ−リジン）溶液へ５分間露出される。最後にカプセルを除去し、所望の媒 体で平衡する前に過剰のポリ（Ｌ−リ、ジ゛ン）を除去するため洗浄される。こ の方法を用いてカプセル化したＫＢ紺胞は生き続け、正常の生育を示す。Example 4 This example demonstrates the introduction of mammalian cells into alginate/poly-(L-lysine) capsules. Demonstrate encapsulation. KB cells were treated with 10% dextran and 1.3% CaC. 1 g for 10 s into a solution buffered with 13 mM HEPES (pH 7). Suspend at a concentration of cells/relatives. Stir the solution at high speed.0525% Algium in isotonic NaCl solution This product is extruded through a hair tomizer in a sodium chloride solution (KELCO, LV). KB cell-containing capsules formed as in Remove after dilution. The capsule is then treated with 0.05% point to strengthen the capsule. lysine (L-lysine) solution for 5 minutes. Finally remove the capsule and add the desired medium. It is washed to remove excess poly(L-dione) before equilibration in the body. child KB azure cells encapsulated using this method remain alive and exhibit normal growth.
産呈上勿且里註 このカプセル化方法は多種類の分野、特にバイオテクノロジーにおいて増加する 用途を見出す、そのような方法は酵素、ホルモン、薬物、吸着剤および細胞をカ プセル化するために使用され、それらはバイオリアクター、人工臓器、生分離シ ステム、制御された薬物放出システム等に使用できる。Notes on production This encapsulation method is increasing in many different fields, especially in biotechnology. Finding applications, such methods can be used to bind enzymes, hormones, drugs, adsorbents and cells. They are used in bioreactors, artificial organs, and bioseparation systems. It can be used for stems, controlled drug release systems, etc.
補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２ｊ １３ ２、発明の名称 半透膜中に生物学的材料のカプセル化 ３、特許出願人 住 所 アメリカ合衆国４８１０９−１０９２ミシガン、アナ−バー、ウエスト エンジニャリングビルディンク２２５住 所 大阪市中央区淡路町２丁目１番１ ３号 弘栄ビル電話（０６） ２２２−０５４７ １９８９年１１月２７日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文 １通 請求の範囲 １．材料をカプセル膜内にそして実質上膜形成ポリマーを含まないカプセルコア 内にカプセル化する方法であって、（Ａ）材料をイオノトロピー性ゲルのための ゲル化剤の存効量を含む媒体中に懸濁するステップ、 （Ｂ）前記懸濁液を前記材料を含みそして外側表面部分を存する液滴に形成する ステップ、 （Ｃ）イオノトロピー性ゲル形成性ポリマーおよび第２のゲル形成性ポリマーの 選択した濃度を含み、前記第２のゲル形成性ポリマーは熱ゲル形成性ポリマー、 沈澱ゲル形成性ポリマーまたは共有結合架橋ゲル形成性ポリマーよりなる群から 選ばれ、前記イオノトロピー性ゲル形成性ポリマーは前記ゲル化剤と接触すると き選択された所望厚みの半透膜マトリックスを形成するようにゲル化し、そして 前記第２のゲル形成性ポリマーを前記膜マトリックス中に包接するものであるゲ ル化溶液と選択した時間接触させることによって分離したカプセルを形成するス テップ、および（Ｄ）前記第２のゲル形成性ポリマーを複合ゲルマトリックス膜 を形成するようにゲル化するステップ、を含んでいることを特徴とする前記方法 。Submission of translation of written amendment (Article 184-8 of the Patent Act) 1. Display of patent application PCT/US88102j 13 2. Name of the invention Encapsulation of biological materials in semipermeable membranes 3. Patent applicant Address: West Annbor, Michigan 48109-1092, United States Engineering Building Dink 225 Address: 2-1-1 Awajicho, Chuo-ku, Osaka City No. 3 Koei Building Telephone (06) 222-0547 November 27, 1989 6. List of attached documents (1) One translation of the written amendment The scope of the claims 1. a capsule core containing materials within the capsule membrane and substantially free of membrane-forming polymers; 1. A method of encapsulating (A) a material in an ionotropic gel. suspending in a medium containing an effective amount of a gelling agent; (B) forming said suspension into droplets containing said material and having an outer surface portion; step, (C) an ionotropic gel-forming polymer and a second gel-forming polymer; the second gel-forming polymer comprises a thermogel-forming polymer; From the group consisting of precipitated gel-forming polymers or covalently crosslinked gel-forming polymers selected, said ionotropic gel-forming polymer upon contact with said gelling agent. gel to form a semipermeable membrane matrix of the selected desired thickness, and a gel that includes the second gel-forming polymer in the membrane matrix; Forms separated capsules by contacting with a silting solution for a selected time. and (D) the second gel-forming polymer into a composite gel matrix membrane. gelling to form a .
２、前記材料は生物学的材料であり、そして前記媒体はそれと生理−学的に共存 し得る水性媒体である第１項の方法。2. The material is a biological material and the medium is physiologically compatible with it. The method of item 1, wherein the aqueous medium is
３、前記熱ゲル形成性ポリマーはアガロースである第１項の方法。3. The method of item 1, wherein the thermogel-forming polymer is agarose.
４、前記熱ゲル形成性ポリマーは寒天である第１項の方法。4. The method of item 1, wherein the thermogel-forming polymer is agar.
５、前記熱ゲル形成性ポリマーはゼラチンである第１項の方法。5. The method of item 1, wherein the thermogel-forming polymer is gelatin.
６、前記熱ゲル形成性ポリマーはカンバーカラギーナンである第１項の方法。6. The method of item 1, wherein the thermogel-forming polymer is camber carrageenan.
７、前記沈澱ゲル形成性ポリマーはコラーゲンである第１項の方法。7. The method of item 1, wherein the precipitated gel-forming polymer is collagen.
８、前記生物学的材料は組織、細胞小器官、植物細胞、動物細胞、デルタ細胞、 ランゲルハンス島、肝細胞、バクテリア、藻類、カビ、ビールス、タンパクおよ び医薬化合物からなる群から選ばれる第２項の方法。8. The biological materials include tissues, organelles, plant cells, animal cells, delta cells, Islets of Langerhans, liver cells, bacteria, algae, molds, viruses, proteins and and a pharmaceutical compound.
９、前記イオノトロピー性ゲル形成性ポリマーは多糖類ガムである第１項の方法 。9. The method of item 1, wherein the ionotropic gel-forming polymer is a polysaccharide gum. .
１０、前記ゲル化剤は多価イオンである第１項の方法。10. The method of item 1, wherein the gelling agent is a multivalent ion.
１１、前記多糖類ガムはアルギン酸ナトリウムである第９項の方法。11. The method of item 9, wherein the polysaccharide gum is sodium alginate.
１２、前記多糖類ガムはキトサンである第９項の方法。12. The method of item 9, wherein the polysaccharide gum is chitosan.
１３、前記複合ゲルマトリックス膜はそれからイオノトロピー性ゲル形成性ポリ マーを可溶化しそして除去するステップによって後で処理される第１項の方法。13. The composite gel matrix membrane is then coated with an ionotropic gel-forming polyester. The method of claim 1, which is subsequently processed by a step of solubilizing and removing the mer.
１４、前記媒体は増粘剤を含んでいる第１項の方法。14. The method of paragraph 1, wherein the medium includes a thickener.
１５、第１項の方法の生産物。15. Product of the method of paragraph 1.
１６、アルギン酸塩およびアガロースよりなる複合ゲルマトリックス膜を持って いる第１項の方法の生産物。16. It has a composite gel matrix membrane consisting of alginate and agarose. The product of the method of paragraph 1.
１７、アルギン酸塩および寒天よりなる複合ゲルマトリックス膜を持っている第 １項の方法の生産物。17. No. 1 with a composite gel matrix membrane consisting of alginate and agar Product of the method of paragraph 1.
１８、アルギン酸塩およびゼラチンよりなる複合ゲルマトリックス膜を持ってい る第１項の方法の生産物。18. It has a composite gel matrix membrane consisting of alginate and gelatin. The product of the process of paragraph 1.
１９、アルギン酸塩およびコラーゲンよりなる複合ゲルマトリックス膜を持って いる第１項の方法の生産物。19. It has a composite gel matrix membrane consisting of alginate and collagen. The product of the method of paragraph 1.
２０、アルギン酸塩およびカラギーナンよりなる複合ゲルマトリックス膜を持っ ている第１項の方法の生産物。20, has a composite gel matrix membrane consisting of alginate and carrageenan. The product of the process of paragraph 1.
２１、アガロースよりなる膜を持っている第１項の方法の生産物。21. The product of the method of item 1 having a membrane made of agarose.
国際調査報告 Ｉ酎−−１−−一−＾６寥１１□ζ虐畷−”１１６ＰＣＴ／ＬＩＳ８８１０２４ １３２国際調査報告 。５８８０２４１３international search report I chu--1--1-^6寥11□ζ挕畷-”116PCT/LIS881024 132 International Search Report. 58802413
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