JPH03500246A - マラリアのワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のマラリア寄生虫のエ ピトープに関係するペプチド尾タンパク質を発現する、腸侵入バクテリアの弱毒 化バクテリアに関する。有意の病気または疾患を引き起こさないで宿主中で増殖 することができ、そしてマラリアに対する保護的免疫応答を誘発するプラスモデ ィウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）関連ペプチドを発現する、本発明のバクテリ ア菌株は、マラリアの生ワクチン配合物中で使用することができる。このような ワクチン配合物は一価または多価であることができる。 とくに、本発明のワクチンのベクターの菌株は、それらの腸侵入性質を保持する が、大きい部分においてビルレンス性質を損失する、弱毒化サルモネラ属（Ｓａ 　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）バクテリアからなる。 本発明の好ましい実施態様において、サーカムスポロゾイテ（ｃ　ｉ　ｒｃｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）マラリア抗原のすべてまたは一部分をエンコードする遺 伝子または遺伝子断片は、芳香族化合物の生合成のための遺伝子の染色体の欠失 により弱毒化された、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）バクテリア中で発 現して、マラリアのための生ワクチンとして使用することができる。 組み換えＤＮＡ技術は、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡベヒクル（ベクター）中に挿 入して、宿主細胞中で複製することができる組み換えＤＮＡ分子を形成すること を包含する。一般に、挿入されたＤＮＡ配列は受容体ＤＮＡベヒクルに対して異 質である、すなわち、挿入されたＤＮＡ配列およびＤＮＡベヒクルは、自然にお いて遺伝情報を交換しない有機体から誘導されるか、あるいは挿入されたＤＮＡ 配列は完全にまたは部分的に合成的につくることができる。組み換えＤＮＡ分子 を構成することができる、いくつかの一般的方法が開発されてきている。 構成のために使用する方法に無関係に、組み換えＤＮＡ分子くち宿主細胞から適 合性でなくてはならない、すなわち、宿主細胞中の自律的に複製することができ なくてはならないか、あるいは宿主細胞の染色体の１または２以上の中に安定に 組み込まれなくてはならない。組み換えＤＮＡ分子は、好ましくはまた、所望の 組み換えＤＮＡ分子の選択を可能とするマーカーの機能を有する。さらに、適切 な複製、転写、および翻訳のシグナルのすべてが組み換えベクター上に正しく配 置される場合、外来遺伝子は、例えば、形質転換されたバクテリア細胞中で、バ クテリアの発現プラスミドの場合において、あるいは組み換えウィルスで感染さ れているか、あるいは適当な複製の由来を有する組み換えプラスミドをもつ許容 細胞系または宿主中で適切に発現されるであろう。 異なる遺伝シグナルおよび処理の事象は、遺伝子の発現、例えば、ＤＮＡ転写お よびメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の翻訳のレベルヲ制御する。ＤＮＡの 転写は、プロモーターの存在にに依存し、このプロモーターはＲＮＡポリメラー ゼの結合を指令し、これによりｍＲＮＡの合成を促進する。真核生物のＤＮＡ配 列は、原核生物のプロモーターのものと異なる。さらに、真核生物のプロモータ ーおよび付随する遺伝シグナルｈａ原核生物系において認識することができない か、あるいは原核生物系において機能することができず、そしてさらに、原核生 物のプロモーターは真核生物の細胞において認識されず、そして機能しない。 同様に、原核生物中のｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のものと異なる、適切な原核 生物のシグナルの存在に依存する。原核生物におけるｍＲＮＡの効率よい翻訳は 、ｍＲＮＡ上のシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ　ｌ　ｇ　ｒ　ｎ　ｏ ）　（Ｓ／Ｄ）配列と呼ぶリポソーム結合部位を要求する（Ｓｈ　ｉ　ｎｅ、Ｊ 、およびＤａ　Ｉｇｒｎｏ、Ｌ、、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４　３ ８）−この配列はｍ　ＲＮ　Ａの短いヌクレオチド配列であり、タンパク質の末 端メチオニンをエンコードする開始コドン、通常ＡＵＧの前に位置する。Ｓ／Ｄ 配列は１６Ｓ　ｒＲＮＡ（リポソームＲＮＡ）の３′末端に対して相補的であり 、そして多分子ＲＮＡとの二重らせん化によるリポソームへのｍＲＮＡの結合を 促進してリポソームの正しい位置決定を可能とする（同上）。 クローニングした遺伝子の首尾よい発現は、十分なりＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻 訳およびある場合において、タンパク質の転写後の翻訳を要求する。発現ベクタ ーを使用して、適当な宿主中の活性プロモーターの制御下に遺伝子が発現され、 そしてタンパク質の産生を増加してきている。 ２．２．マラリアに対するワクチン接種世界の公衆の健康の目標は、ヒトのマラ リアの抑制および究極的撲滅である。熱帯領域において５００万を鍵える人々は マラリアに毎年されされており、そして１５０〜２００万の人々はこの病気から 死亡する（Ｓｔｕｒｃｈｅｌｅｒ、Ｄ、＋　１９８５、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ 　４０：１３５７）。マラリアを抑制するための努力は、蚊のベクターの抑制お よび抗マラリア薬物の開発に歴史的に集中して来ている。これらの努力は制限さ れた成功をもって満足されたのみである。新しい予防および治療の薬物は、薬物 抵抗性菌株が急速に地方病の領域において現れるので、有効性が制限される。蚊 のベクターの制御は、殺虫剤に基づく抑制のプログラムの実行に大きくに依存し 、このプログラムは、コストおよび他の因子のために、開発途上において維持す ることは困難である。現代の殺虫剤に対するベクターの抵抗性は問題を増加し、 そしてもう一度マラリアの復活を生じた。 哺乳動物の宿主は、餌を取っている間の雌のアノフェレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ）力により注入される、マラリア寄生虫のスポロゾイトの形態により感染される 。血流中に注入されｔ；スポロゾイトは肝臓へ急速に運ｉｆれ、ここで肝細胞を 侵す。いったん肝細胞において、スポロゾイトメロゾサイトの形態に発育すると ；メロゾサイトは肝細胞から解放され、そして赤血球を侵す。赤血球内で、寄生 虫は無性生殖してリングからシゾントになる。成熟しｔ；シゾントはメロゾサイ トを含有し、メロゾサイトは赤血球を破裂すると、他の赤血球を侵し、病気を臨 床的に発現させる。あるメロゾサイトは、生殖母細胞と呼ぶ、性の形態に分化し 、この形態は血液の摂取の間に力により取り上げられる。力の中腸において生殖 母細胞が受精した後、発育するオーキネートは腸の壁および被嚢を浸透すること ができる。このようなオーキネートが破裂すると、スポロゾイトを解放させ、ス ポロゾイトは、雌の力が他の血液を摂取したとき、唾液腺に移動してその中に侵 入し、こうして感染サイクルを完結する。 １９６０年代に５！施された実験において、プラスモディウム・ベルブヘイＣＰ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）（以後、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）のＸ線照 射しｔニスボロゾイトによるワクチン接種は、ワクチン接種しない動物において 致死的であったスポロゾイトの対抗に対してマウスを保護することが５１！証さ れた（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｒ，ｅ虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）（以後、Ｐ、ｆａｖｉｖａｘ）（以後、Ｐ、ｖｉｖａｘ）のＸ線照 射したスポロゾイトによる免疫化は、感染し！二カのパイ）（ｂｉｔｅ）で供給 されるスポロゾイトの対抗に対してヒトのボランティア−を保護した（Ｃ１ｙｄ ｅ。 １９７９、Ｂｕｌｌ、ＷＨ○　５７：２６１）、：の保護は抗体ニよす仲介され ると考えられた。ヒトを包含する、免疫化された動物からの皿清は、生きている 成熟スポロゾイトの表面付近に沈澱を形成した。この沈澱（ＣＳ　Ｆ）反応と呼 ばれてきている。これらの血清は、培養においてヒト肝癌細胞を侵すスポロゾイ トの能力をブロッキングする（ＩＳＩ４、Ｊ、Ｊｍｍｕｎｏｌ、１３２＝９０９ ）−他の研究に８いて、サー呼ぶ、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトの表面上に 局在化する単一の抗原決定基が同定された。Ｐ、ｂｅ　ｒｇｈｅ　ｉのサーカム スポロゾイテ（Ｃクローナル抗体は、受動的に免疫性を受容体動物に転移するこ とができることが示された。これらの動物は、投与量依存性の方法でスポロゾイ トの対抗から保護された（Ｐｏｔｏｅｎｊａｋ、Ｐ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ。 、３９８０、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、１５］　：　１５０４）、また、証拠が示す ように、細胞仲介免疫性は重要であった（Ｃｈｅｎ％Ｄ、Ｈ，ｅｔ　Ｃ１９，１ ９７７、Ｊ、Ｉｍｍｎｏｌ、１１８：１３２２；Ｖｅｒｈａｖｅ、Ｊ、Ｐ、ｅｔ 　ａｌ、、１９７８、Ｊ、Ｉｍｍｎｏｌ、１１８：１２１：１０３１）＠ クローニングすべき第１ＣＳタンパク質遺伝子は、プラスモディウム・ノウレジ （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　Ｋｎｏｗｌｅｓｉ）（以後、Ｐ、Ｋｎｏｗｌｅｓｉ） 、サルの寄生虫のＨ菌株から誘導された（Ｏｚａｋｉｅｔ　ａｌ、、１９８３、 Ｃｅ１１　３４＝８１５）、ヒトのマラリア寄生虫Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（ Ｄａｍｅ酵素活性、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５＝５９３）、三日熱マラ リア原虫（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍ。 ｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ）（以後、Ｐ、ｖｉｖａｘ）（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ　ｅｔ 　ａｌ１．１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３８１）、サル寄生虫三日前 マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｃｙｎｏｍ。 Ｉｇｉ）（以後、Ｐ＋ｃｙｎｏｍｏ１ｇｉ）（Ｅｎｅａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ ４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：６２８）、および醤歯類の寄生虫Ｐ、ｂｅｒｇｈ ｅｉ　（Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、］９８７、Ｅｘｐ。 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、６３：２９５）のＣＳ寄生虫をエンコードする遺伝子を、 また、クローニングし、そして配列決定しｔ；。寄生虫の各々のＣ５遺伝子の特 徴ある面は、１系列の反復したペプチド配列を含有する、タンパク質の１／３を エンコードする中央領域である。アミノ酸配列の一次アミノ酸配列、反復した配 列の長さ、および反復の数は、寄生虫の種の各々とともに変化する。反復領域の エピトープは種の各々について特徴をもつ６　Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳ タンパク質をエンコードする遺伝子は、同一でないテトラペプチド（ａｓｎ−ｖ ｉａ−ｐｒｏ）による４つの位置において中断された、３７回反復されたテトラ ペプチド（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）の中央反復領域を特定する。Ｐ。 ｖｉｖａｘのＣＳタンパク質の中央反復領域は１９のノナペプチドを含有する； Ｐ、Ｋｎｏｗｌｅｓｉの中央配列は１２のドデカペプチドを含有し、そしてＰ、 ｂｅｒｇｈｅｉの反復領域は１２のオクタペプチドを含有する。Ｐ、Ｋｎｏｗｌ ｅｓｉ　（Ｈ菌株）およびＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｊ；よびＰ、ｖｉｖａｘか らの配列を比較すると、反復領域を７ランキングする２つの短いアミノ酸配列、 領域１および領域ｌｌと呼ぶ、を除外して、配列の相同性は明らかにされない。 Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのための有効な抗スポロゾイトのワクチン開発するた めの努力において、サーカムスポロゾイテ（ＣＳ）反復領域および２つのフラン キング領域！および領域１１配列から誘導されたペプチドを使用された（Ｂａｌ ｌｏｕ、Ｗ、Ｒ，ｅｔ　ａｌｏ、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：９９６） 、これらの実験が示すように、保存された配列に対するのでなく、反復領域に対 する抗体は、真性のＣＳタンパク質を認識し、Ｃ３Ｐ活性を産生じ、そして生体 外においてスポロゾイトの侵入（ＩＳＩ）をブロッキングした。テトラサイクリ ン抵抗性遺伝子の３２アミノ酸に融合した３２のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍテト ラペプチドの反復から構成された組み換えＤＮＡのサブユニットのワクチンは、 Ｅ、ｃｏｌｉ中で産生された（Ｙｏｕｎｇ、Ｊ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、１９８５． ５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：９５８）、同様に、テタヌストキソイドに接合したペ プチドａｓｎ−ａ　１ａ−ａｓｎ−ｐｒｏ　（ＮＡＮＰ）の３つの反復から構成 さｉたペプチド−担体ワクチンが開発された（ＺａｖａｌａＳＦ、酵素活性、１ ９８５．５ｃｉｅｎｃｅ２２８：１４３６）。各場合において、症状発現前の研 究におし１て、生物学的に活性な（Ｃ５ＰおよびＩＳＩにより示されるように） 抗スポロゾイト抗体は免疫化の結果例ぎ出され？：（Ｂａｌｌｏｕ、Ｒ，ｅｔｉ ｎｇｔｏｌ酵素活性、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：２５？）。 両者のワクチンを使用するヒトの安全性および免疫原性の研究は同様な結果を生 じｔ：。両者のワクチンの調製物は１０〜８００μｇの範囲の投与量においてよ く許容され、そして両者はすべての免疫化した被検体において多少の抗Ｃ５抗体 を引き出した。しかしながら、高い力価は達成されなかった。さらに、引き続く ペプチド−担体ワクチンによる促進免疫化は増加した抗体力価を生じなかつｊ； 。次いで、各研究からのいつくかの個体を生きているスポロゾイトで対抗して、 これらのワクチン調製物の効能を試験した。もう一度、両者のワクチンを使用し て同様な結果が達成された；保護のレベル（血液段階の寄生虫の出現における遅 延により測定した）は対抗した個体の抗Ｃ５抗体の力価と相関関係をもつが、各 試験において、ただ１つの個体は保護された。ヒトのサブユニットのワクチンの 開発の可能性を評価するための平行の研究は、１歯類のＰ。 ｂｅ　ｒｇｈｅ　ｉのマラリアのモデルにおいて検査された（Ｅｇａｎ　ｅｔ　 ａｌ、、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：４５３）−最近の研究の報告によ ると、サブユニットのスポロゾイトのワクチン接種り達成されたもの（Ｂａｌｌ ｏｕ％Ｗ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ８、Ｌａｎｅｅｔ　ＩＬ８７−１＝　１２７７）と同 程度に高い、レベルのＰ−ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｃｓタンパク質に対する自然に 獲得された抗体は、マラリア−浮腫の領域において９８日の間隔の間のＰ、ｆａ ｌｃｉｐａｒｕｍの感染に対して保護しなかった。 異なる研究において、他のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原のペプチドを含有する サブユニットのワクチンを研究された（Ｐａｔａｒｒｏｙｏ、Ｍ、Ｅ、　ｅｔ　 ａｔ、、１９８７、Ｎａ’ｔｕｒｅ　６２９−６３２；Ｃｈｅｕｎｇｓ　Ａ、　 ｅ　ｔ　ａ　１．．１９８６、Ｐｒｏｃ、Ｎａ、ｔ　ｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３：８３２８　８３３２；Ｃｏ１１ｉｎｓ、 Ｗ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．１９８６、Ｎａｔｕｒｅ３２３　：　２５ ９−２６２）、さらに、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原を発現する組み換えワク チンウィルスは、使用のために記載された（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ３７１０１３ ８６、公開１９８７年３月１２日）。゛マラリアのワクチン接種における展望お よび最近発展は記載された（ＭｉｌｌｅｒＳＬ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、１９８４、 Ｐｈ　ｉ　１．Ｔｒａｎｓ、Ｒ，ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、Ｂ５０７：９９　１１５； １９８５、Ｖａｃｃｉｎｅｓ８７、Ｃｈａｎｎｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓ　コールド・スプリング ・ハーバ−、ニューヨーク、ｐｐ、８１−１０６．１１７−１２４）。 ２．３．サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のバクテリアサルモネラ属（Ｓ ａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）のバクテリアは２．ｏｏｏを趙える血清型を包含し 、それらの多くは人間および動物において腸の病気を引き起こすことができる。 病気のうちで、サルモネラｆｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の発生に最もしばしば 関連する病気のうちで、腸チフスはそのひどさおよび高い致死率について顕著で ある。ヒトにおいて、腸チフス（ｔｙｐｈｏｉｃｌ　または　ｅｎｔｅｒｉｃ　 ｆｅｖｅｒ）はチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）（以後、Ｓ、ｔ ｙｐｈｉ）侵入および流布から生ずるが、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　’ Ｉ　ｌａ）の他の構成員は器官の組織において侵入および局在化して、ひどさの 少ない症候を引き起こすことができる。サルモネラ症（例えば、食中毒）の他の 発生において、病気は非侵入性でパリ、そして胃腸炎の症候に限られ、そしてヒ トにおいて、病気はＳ、ｔｙｐｈｉに関連しない。動物において、腸チフスの発 生は多数の血清型、例えば、ブタにおけるＳ。 ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、家禽においてＳ、ｇａｌ　１　ｉｎａｒｕｍｑおよ びウシにおけるＳ、５ｕｂｌｉｎおよびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（以後、５．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）と関連させ ることができる［生物学、ウィルス学、および免疫学におけるドブレイおよびウ ィルソンの原理（Ｔｏｐｌｅｙ　ａｎｄＷｉ　ｌ５ｏｎ’　ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐ ｌｅｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ。 １ａｇｙ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｌ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第６版 、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、、マリイランド州バルチモア ］。宿主の特異性および生ずる病気のひどさは、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎ ｅ　１１　ａ）の血清をの間で変化する。 ヒトにおける腸チフスのための弱毒化した経口的ワクチンの第１の場合は、スト レプトマイシン依存性Ｓ、’ｔｙｐｈ＋であったが、その菌株の使用は不連続で あった。ゲルマニア−（ＧｅｒｍａｎｉｅｒＳＲ，８よびＦｕｒｅｒ、Ｅ、、１ ９７５、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１３１：５５３；ＧｅｒｍａｎｉｅｒＳＲ ，，１９８４、ＢａｃｔｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅｓｂ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅＳｓｓ　ニューヨーク１ｐｐ、１３７−１６５）は、ヒト腸チフスに対する 経口的ワクチンとしてＳ、ｔｙｐｈｉのｇａ　ＩＥ突然変異体の使用を支持した 。 ５−ｔ３’１）ｈｉ　ｇａｌＥ突然変異体、Ｔｙ２１ｇ、は、ヒトのボランティ ア−における病原性親菌株に対する保護的応答を引き出すことができる（Ｌｅｖ ｉｎｅ、Ｍ、Ｍ、ｅｔ、ａｌ、、１９８３、Ｍ　ｉ　ｃ　ｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ 、４７：５１０；Ｗａｈｄａｎ、Ｍ、Ｈ，ｅｔａｌ、、１９８２、ｊ、Ｉｎｆｅ ｃ、Ｄｉｓ、１４５：２９２）６　Ｔｙ２１ａは、また、エジプトのアレキサン ドリアにおいて２８，０００人の生徒についてのフィールドテストにおいて有望 な保護の結果を生じた（Ｗａｈｄａｎ％Ｍ−Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、１９８２、ｊ、 Ｉｎｆｅｃ。 Ｄｉｓ、１４５：２９２）。このワクチンの菌株は腸チフスのワクチンとしてヨ ーロッパにおいて販売されている。しかしながら、このワクチンの菌株の主要な 欠点は、それが外因性ガラクトースによる殺しのために変化する生存能力を示す ということである。ガラクトースの添加は、Ｔｙ２１ａ　（ｇａ　ＩＥ突然変異 体）菌株への２つの効果を有する。第１に、それは毒性ガラクトース−１−ホス フェートの蓄積を生じ、生存能力を減少する。第２に、添加したガラクトースは 、免疫原性に必要である、リボ多糖の多糖鎖中に組み込まれる。これらの対抗す る要件は、ワクチンの菌株の生存能力および免疫原性を変動させる。 最近、スッカ−（Ｓｔａｃｋｅｒ）および彼の共同研究者らは、すＪレモネラ属 （Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１１ａ）の弱毒化を達成するための信頼性ある方法を記載 した（例えば、Ｈｏ１ｓｅｔｈおよびＳｔａｃｋｅｒ％　１９８１、Ｎａｔｕｒ ｅ　２９１：２３８；５ｔｏｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ。 、１９Ｂ２、Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ　５３：４７；およ び米国特許第４，５５０．０８１号）、この方法において、芳容族生合成通路に 影響を及ぼす特定の欠失突然変異が形質導入により導入される。詳しくは、遺伝 子ａｒｏＡの欠失は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、および葉 酸前駆体、ｐ−アミノ安息香酸、およびニンテロセリン前駆体、ジヒドロキシ安 息香酸の！：めの多面発現の要件を生ずる。芳香族アミノ酸は動物組織中に存在 するが、ｐ−アミノ安息香酸は存在しない；動物細胞中に存在することができる 葉酸は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の構成員により同 化されない。さらに、ユンテロセリンの不存在はａｒｏＡ　サルモ不う属（Ｓａ 　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）菌株中に鉄を必要とする。 サルモネラ属（Ｓａ１ｍｏｎｅ’ｌ　ｌａ）の正確な弱毒化のための技術の導入 依頼、ある数のワクチン接種の研究が動物のモデルの系におい一〇なされて来て いる（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ％Ａ、Ａ、およびＲｏｂｅｒｔｓｓｏｎ、Ｊ、Ａ、、１ ９８３、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、４１　ニア５１；Ｒｏｂｅｒｔｓｓｏｎ％ 　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ａ、％　１９８３、Ｉｎｆｅｅｔ、Ｉｍｍｕｎ、４１ニア４ ２；Ｓｍ１ｔｈ、Ｂ、Ｐ、ｅｔａｈ、１９８４、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４ ５：２２３１；Ｓｍ１ｔｈ、Ｂ、Ｐ、ｅｔ　ａｌｏ、１９８４、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ 　ｔ、Ｒｅ５−４５：５９；５ｔｏｃｋｅｒ、Ｂ、Ａ、Ｄ、ｅｔ　ａｔ−１１９ ８２、Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ　５３：４７）。 仔ウシのモデルの系においてＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＵＣＤ　１０８−］ 　１のａｒｏＡ誘導体、５Ｌ１４７９、を使用して、リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂ ｅｒｇ）および共同研究者らは、Ｓ　Ｌ　１．４７９の侵入を実証し、そして５ Ｌ１４７９でワクチン接種した仔ウシが腸および組織からワクチンの有機体を急 速に浄化したことを示した。生きている５Ｌ１４７９による経口的ワクチン接種 は、熱で殺した有機体による腹腔内ワクチン接種により得られるものより大きい 、Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＵＣＤ　１０８　１１の感染に対する保護およ び細胞仲介免疫反応性を与えた。他の研究において、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およ び同僚は、ビルレットの非経口的菌株により対抗に対して、５Ｌ１４７９を使用 するワクチン接種により仔ウシにおける保護を実証しｔ；。 ある数のグループは、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　１ａ）Ｌ：、おけ る異種遺伝子の発現を実証した。７オルマル（Ｆｏｒｍａｌ）および同僚は、シ ゲラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｉ）のし型抗原についての遺伝 子をチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ中にトランスフ ェクションした（参照、Ｆｏｒｍａｌ、Ｓ。 Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、１９８１、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、３４ニア４６；Ｔｒ ａｍｏｎｔ　ｅｔ　ａｌ−１１９８４、Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓ。 １４９：１３３；および米国特許第４，６３２，８３０号（Ｆｏｒｍａｌ　ｅ　 ｔ　ａ　ｌ　−）　ｅシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）のＬ型抗原は、生きている弱 毒化シゲラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｉ）を使用するワクチン 接種により引き出された免疫性に関連する。生きているトランス接合体（ｔｒａ ｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の皮下または腹腔内の注射は、Ｓ、ｔｙｐｈｉ　Ｔｙ ２１ａまたはシゲラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｉ）による腹腔 内の対抗に対してマウスを保護した。また、接合の寅験により、ヤマモトおよび 共同研究者ら（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ３．１９８２、Ｊ、ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１５０：１４８２）は、Ｅ、ｃｏｌｉのコロニー化因子の抗原（ ＣＦ　Ａ／　Ｉ　）をチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ ａ中に導入し、そして抗原の発現を実証した。 タレメンツ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）ら（１９８３、Ｉｎｆｅｃｔ−１ｍｍｕｎ、５ ３　：　６８５）は、ヒト由来の腸侵入性Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ　（ＥＩＥ中で組 み換えプラスミド上で発現された、熱不安定性毒素のＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ ）に対する抗体の応答を試験した。Ｓ、ｔｙｐｈｉはヒトおよび高等霊長動物に 限定された宿主の範囲を有するので、免疫原性は動物のモデルにおいて試験され た。Ｔｙ２１ａ中の異種ＬＴ−Ｂの腹腔内注射は、マウスにおいてＬＴ−Ｂに対 する血清抗体の応答を生じた（ＣＩｅｍｅｎｔｓＳＪ、Ｄ、およびＳ、Ｅｌ−Ｍ ｏｒｓｈｉｄｙ、　１９３４、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、４６：５６４）ｅ引 き続いて、ＬＴ−Ｂ産生組み換え体をマウスについての弱毒化したサルモネラ属 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌株の感染において検査された（Ｃｌｅｍｅｎｔｓｓ Ｊ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、１９８３、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５３：６８５）。 この研究において、ＬＴ−Ｂ遺伝子はａｒｏＡ弱毒化腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（以後、Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）血清型 ｄｕｂｌｉｎ菌株：５Ｌ１４３８中に導入した。親のＳ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉ ｓ　ｄｕｂｌｉｎ菌株はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてビルレットである。組み換 えサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌株、ＥＬ２３、で経口的ワクチン接 種した後、粘膜の抗ＬＴ−ＢＩｇＡの有意な増加が観測された。組み換え有機体 により産生されたＬＴ−Ｂに対する応答は、腹腔内注射または経口的投与されｔ ；、精製ＬＴ−Ｈに対する免疫応答より低かった（同上）。 他の研究において、ＬＴ−ＢをエンコードするプラスミドをＳ、ｔｙｐｈｉｍｕ ｒｉｕｍのａｒｏＡ欠失突然変異体、５Ｌ３２６１中に導入した後、マウスにお ける組み換えバクテリアを使用する経口的または腹腔内のワクチン接種はＬＴ− Ｂに対する抗体の応答を誘発した（Ｍｓｋｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７、Ｍ ｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　２：２１１）ｅ いくつかの他のグループは、また、弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍ。 ｎｅｌｌａ）における異種抗原の発現を報告した。マンニヒおよび共同研究者ら （Ｍａｎｎｉｎｇ、Ｐ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ ｎ、５３：２７２）は、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂ、ｒｉｏ　Ｃｈｏｌｅｒａ ｅ）：イナバおよびオガワの主要な生物型の０抗原のリポ多糖の合成の原因であ る遺伝子クラスターをクローニングした。これらの遺伝子クラスターは、Ｓ、ｔ ｙｐｈｉ　Ｔｙ２１ａの表面上で発現された。新生児の子豚の下痢ｊ二関連する Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ菌株のに８８采の付着抗原は、ｓ、ｔｙｐｈ ｉｍｕｒｉｕｍ　５Ｌ１３２６１中でクローニングされかつ発現された（Ｄｏｕ ｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ。 ５２：３４４）。Ｋ８８抗原に対する抗体は、組み換えＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ ｕｍの経口的または静脈内投与を受けｔ；マウスの血清から得られた。さらに、 ベーターガラクトシダーゼはＳ、ｔｙｐｂｉｍｕｒｉｕｍ　５Ｌ３２６１中で発 現され、そして特異的抗ベーターガラクトシダーゼの抗体はマウスへの組み換え バクテリアの投与により引き出され（ＢｒＱＷｎｌ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、１９ ８７、Ｊ、Ｉｎｆ、ｒ）ｒｓ、］５５：８６）、細胞内ベーターガラクトシダー ゼタンパク質は、また、免疫応答を誘発することができる。 ３、発明の要約 本発明は、プラスモディウム属（Ｐ　ｌ　ａ　Ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）のマラリア 寄生虫のエピトープに関係したペプチドおよびタンパク質を発現する、腸侵入バ クテリアの弱毒化菌株に関する。本発明のバクテリア菌株は、そしてマラリアに 対する保護的免疫応答を誘発し、マラリアのための生ワクチン配合物中に使用す ることができる。このようなワクチン配合物は一価または多価であることができ る。 本発明のワクチン配合物中の弱毒化腸侵入バクテリア中のプラスモディウム属（ Ｐ　］　ａ　ｓｍｏ　ｄ　ｉ　ｕｍ）のエピトープの発現は、体液の応答に加え て細胞仲介免疫応答を引き出す能力のために、マラリアに対する保護的免疫性を 提供する。プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のエピトープに対して 向けられた細胞仲介免疫性は、バクテリアの侵入性質から生じ、これはＭＪ胞仲 介免疫性を誘発することができる方法で、免疫系にエピトープを提供させる。 とくに、本発明のワクチンのベクターの菌株は、弱春化すルモ不う属（Ｓａ　Ｉ ｍｏｎｅ　］　ｌａ）バクテリアからなり、前記バクテリアはそれらの腸侵入性 質を保持するが、それらのビルレンス性質の大部分を損失している。弱毒化サル モネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　１　ａ）中でマラリアのエピトープを発現さ せることによって、バクテリアの持続性またはビルレンスなしに、バクテリアの 侵入により免疫の認識において重要なエピトープを細胞に効果的に提供すること ができる。こうして、マラリアに対する有効なワクチンを得ることができる。本 発明の好ましい実ＸＢ様ニおいて、サーカムスボロゾイテのマラリア抗原のすべ てまたバ一部分をエンコードする遺伝子まＩ；は遺伝子断片は、マラリアのだめ の生ワクチンとして使用するため、芳香族化合物の生合成のための遺伝子の染色 体の欠失により弱毒化された、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　ｌ　ａ） のバクテリア中で発現すること、ができる。 本発明は、まＩ；、弱毒化腸侵入バクテリア内でマラリアタンパク質またはその 断片を発現する方法に関する。本発明は、弱雪化腸侵入バクテリア中のマラリア のペプチドまたはタンパク質の発現のために設計されたプラスミドベクターの使 用を明らかにする。特定の実施態様において、本発明は弱毒化サルモ不う属（Ｓ ａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉａ）種中でサーカムスポロゾイテのタンパク質を発現さ せる方法に関し、そしてＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ、ｖｉｖａｘｓ卵形マラ リア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｏｖａｌｅ）（以後、Ｐ、ｏｖａｌｅ）、四 日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｍａｌａｒｉａｅ）（以後、Ｐ、ｍ ａｌａｒｉａｅ）、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉｑプラスモディウム・ニリイイ（Ｐ　ｌ 　ａｓｍｏｄｉｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ）（以後、Ｐ、ｙｏｅ　１　ｉ　ｉ）、Ｐ、 Ｋｎｏｗｌｅｓｉ、およびＰ、ｃｙｎｏｍｏｌｇｉのサーカムスポロゾイテのタ ンパク質をエンコードするＤＮＡ配列に関する。プラスモディウム属（Ｐ　］　 ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）の上の種のサーカムスボロゾイテのタンパク質は、適 当なマラリア寄生虫のための動物宿主において腸侵入である、弱毒化サルモ不う 属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　１　ａ）の種中で発現することができる。 他の実施態様において、本発明は、弱毒化腸侵入バクテリアによる、マラリアタ ンパク質を組み換え融合タンパク質として発現する方法に関する。例えば、サー カムスポロゾイテのタンパク質またはそのエピトープをエンコードするＤＮＡは 、Ｅ、ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）　、またはそ の一部分のための遺伝子に接合して、免疫原性を増強することができる。 ここにおける実施例の節において記載する本発明の特定の実施態様において、Ｐ 、ｂｅｒｇｈｅｉまたはＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイテのタ ンパク質のエピトープをエンフードする、組み換えプラスミドの発現ベクターの 構成を記載する。弱毒化サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）の種中の 組み換えＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質の発現を実証する。ＣＳタンパク質を発 現する組み換えサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　］　ａ）は、マウスにお いて抗Ｃ５抗体の産生を引き出し、そしてスポロゾイトの対抗のときのマラリア の感染に対して保護する免疫応答を誘発することを示す。 ３．１．ｆｆ１ ＣＳ　＝サーカムスポロゾイテ Ｃ５Ｐ　−サーカムスポロゾイテの沈澱反応ＤＮａｓｅ　−デオキシリボヌクレ アーゼＤＴＴ　＝ジチオスレイトール ＥＩＥＣ−腸侵入性Ｅ、ｃｏｌｉ ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　−酵素結合免疫吸収アッセイｉ−ｐ、　−腹腔内 Ｉ　ＰＴＧ　−イングロビルチオーベーターＤ−ガラクトシドＩＳＩ　＝スポロ ゾイトの侵入の阻害 ｋＤ　雛キロダルトン ＫＬＨ−キーホールリンペットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ 　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）ＬＢ　＝ルリアブロス（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）Ｌ Ｔ−Ｂ　＝Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニット ｍＡＢ　−モノクローナル抗体 ＰＡＧＥ　−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動ＰＢＳ　−！Ｊン酸塩生理的塩 類溶液 ＰＬ　−バクテリオファージラムダの左側プロモーターＰＲキバクテリオファー ジラムダの右側プロモーターＲＮａｓｅ　＝リボヌクレアーゼ Ｓ／Ｄ　シャインーダルガルノ（Ｓｈ　１ｎｅ−Ｄａ　Ｉｇｒｎｏ） ＳＤＳ　−ドデシル硫酸ナトリウム ４、

【図面の簡単な説明】

第１図。Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスポロゾイテ遺伝子のヌクレオチド配列 。配列のデータはウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ）ら、１９８７、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、６３：２９５に従う。 遺伝子の配列は成熟遺伝子の配列のほぼ７５％からなり、モしてラムダｇｔｌｌ 中の遺伝子のもとのクローニングにおいて使用するリンカ−の配列を包含する。 主要な制限酵素部位を示す。Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ特異的ＤＮＡは第１Ｎｒｕ　Ｉ を含むＣＧＡコドンで開始する。 第２図。Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスポロゾイテのタンパク質のヌクレオチ ドおよびアミノ酸配列。反復した免疫優性エピトープは括弧内に示し、そしてフ ンセンサスオクタペプチド反復、ＤＰＡＰＰＮＡ。 および第２それほど頻繁ではないオクタペプチド、ＤＰＰＰＰＮＰＮから成る・ 領域Ｉおよび領域ＩＩには下線が引かれてしする。反復したジペプチド単位は、 また、括弧で示す。 第３図。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｈ１０４０７から誘導されたＬＴ −Ｂの遺伝子およびタンパク質配列。ＬＴ−Ｂ遺伝子の解読配列のＤＮＡ配列お よびタンパク質配列は、５８８塩基対のＥＣ０ＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限断片内 に含まれる。短いシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇｒｎｏ）配列は 開始コドンＡＴＧの７塩基対内に存在し、そして下線が引かれている。ＬＴ−Ｅ のタンパク質配列は、成熟の形態で処理され、アラニンで開始する、２１アミノ 酸のシグナル配列（括弧で示す）を包含する。融合タンパク質分子の構成におい て有用でありＩ；、ＬＴ−Ｂ中のＣ１ａｌ、Ｘｍａ　ＩｓおよびＳｐｅ　Ｉ制限 酵素の制限部位を示す。 第４図。プラスミドｐＰＸ１００の構成の線図的表示であり、このベクターはＩ ａｃオペロンの制御下にＬＴ−Ｂを発現する。プラスミドｐＪＣ２１７をＥｃｏ ＲＩで消化し、そしてポリリンカーの外来制限部位を包含するＤＮＡの欠失１８ ０塩基対に再結合して、プラスミドｐＰｘ１００を産生する。 第５図。ｌａｃオペロンの制御下にＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質を発現する。 プラスミドベクターの構成の線図的表示である。第１図に示す１ｂｅｒＨｈｅｉ のＣＳ遺伝子のＤＮＡ配列は、大きい１．１キロ塩基対のＮｒｕ　Ｉおよび小さ い６７０塩基対のｘｍｎｌ断片を包含し・それらの両者はｐＰＸｌｏｏの充填さ れたＣｌａｌ部位中に挿入されて、プラスミドｐｐＸ１５１５およびｐＰＸ１５ ２０を産生じた。 第６図。ＬＴ−Ｂの翻訳開始シグナルにより調節され？：ＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タ ンパク質を融合タンパクロ構成されｔ；ベクターの一部分の線図的表示である。 第５図に記載する６７０塩基対のＸｍｎ１Ｃ３断片は、ＬＴ−Ｂ配列のＣｏａ１ 部位（ｐＰＸ１５１５）に、ＸｍａｌＯまたはｐＰＸ１５２３またはＳｐｅ　Ｉ 　（ｐＰＸｌ　５２５）部位に挿入する。 生ずるベクターはＬＴ−Ｂタンパク質の翻訳開始シグナルを使用してＬＴ−Ｂ／ Ｃ３融合タンパク質を発現する。ＬＴ−Ｂインサートから誘導された配列内の翻 訳停止コドンの相対的位置は、括弧により示されている。 第７図。ｔａｃ誘導ＬＴ−Ｂ／Ｃ３融合タンパク質の構成の線図的表示テする。 ｐＰＸ１５１５、ｐＰＸ１５２３ｔたはｐＰＸｌ５２５からのＬＴ−Ｂ／ＣＳ融 合配列を含有する、ＥｃｏＲＩ−Ｈ４ｎｄｌｌ　Ｉ制限酵素の断片を分離し、そ してｐＫＫ２２３のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＴ１１部位中に結合した。生ずるプラ スミドはｔａｃプラスミドの制御下にＬＴ−Ｂ／Ｃ３融合タンパク質を発現する ことができる。ｐＰＸ１５２８の構成を一例として示す。 第８図は、ＰＬ誘導ＬＴ−Ｂ／Ｃ３融合タンパク質の構成の線区的表示ｆアロ、 　ｐ　ＰＸ　ｌ　５１５、ｐＰＸ１５２３またはｐＰＸ１５２５から分離した、 ＬＴ−Ｂ／ＣＳＭ合配列を含有する、ＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の断 片をクレノー酵素で「フィルドアウト（ｆｉｌｌｅｄ　ｏｕｔ）ＪＬ、そしてプ ラスミドＰ、ラムダのＨｐａ１部位中部位置した。生ずるプラスミドはＬＴ−Ｂ ／Ｃ５融合タンパク質をＰｔプロモーターの制御下に発現することができる。ｐ ＰＸ１６０１の構成を一例として示す。 第９図。ＰＬプロモーター誘導ベクターｐＰＸ１６００の構成の線図的表示であ る。すべての３つのリープづフグフレーム中のいくつかの制限酵素部位、コンセ ンサスンヤインーダルガルノ（Ｓｈ　ｉ　ｎ　ｅ−Ｄａ　１ｇｒｎｏ）配列、翻 訳開始コドン、および翻訳停止コドンをエンコードするオリゴヌクレオチドを合 成し、そし−ｅｐｐＬラムダのＨｐａ１部位中部位置してｐＰＸ１６００を産生 した。ｐＰＸ１６００を使用して、Ｐ、プロモーターの制御下に異種配列を便利 に挿入および発現することができる。 第１０図ｏＰＬプロモーターにより誘導されｆ：Ｐ、ｂｅ　ｒｇｈｅ　ｉＣ５遺 伝子を含有するプラスミドベクターの構成の線図的表示である。 Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ　ＣＳ遺伝子の６７０塩基対のＸｍｎ　Ｉ断片を分離し、そ してプラスミドｐＰＸ１６００のフィルドアウトしたＮｃｏ１部位部位中に直接 結合してｐＰＸ１５２９を産生した。プラスミドｐＰＸ１５２９は、Ｐｔプロモ ーターのの制御下にＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳ遺伝子を発現することができる。 第１１図。Ｐｔプロモーターにより誘導されｔ；、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍま たはＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳタンパク質の免疫優性エピトープをエンコードす る、プラスミドのベクターの構成の線図的表示である。 ｐＰＸ１６００のフィルドアウトしたＮｃｏ１部位中に、ＣＳエピトープをエン コードする重合したオリゴヌクレオチドインサート（節７．７に記載するように して得ちれた）を結合することによって、インサートとしてオリゴヌクレオチド を含有する種々のプラスミドを分離した。 寅証の目的で、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳエピトープの４つの反復をエン コードするオリゴヌクレオチドのインサートを示す。七ノナ−のインサートは、 Ｎｃｏ工部位中にオリゴヌクレオチドの１つのコピーを挿入することから生ずる 。生ずるプラスミドはＰｔプロモーターの制御下にＣＳエピトープを発現するこ とができる。 ′１ｇ１２図。Ｐｔプロモーターの制御下に全長のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　 ＣＳタンパク質遺伝子を発現する、プラスミドベクターの構成の線図的表示であ る。Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＣＳタンパク質遺伝子の５ｔｕＩ−Ｒｓａｌ　 ＤＮＡ断片をプラスミドｐＰＸ１６００のＳｔυト部位中に結合してｐＰＸ１５ ３４を生成し、これはＰ、プロモーターからの全長のＣ８遺伝子（推定上の１６ アミノ酸のシグナル配列をエンコードする領域のみを欠く）を発現する。 第１３図。プロモーターの強さ増加するＳ、ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８中のＬ Ｔ−Ｂ／ＣＳＢ合タンパク質の発現、成熟ＬＴ−Ｂの３０アミノ酸がインフレー ムでＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳタンパク質の２２３アミノ酸と融合されている融 合タンパク質をエンコードする、遺伝子を、同一翻訳開始シグナルを使用して、 異なるプロモーターに結合した。タンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル の電気泳動により分離し、そしてウェスタン・プロッティングの手順において、 抗Ｃ３ｍＡＢ３．２８でＣＳタンパク質で検出するためにニトロセルロースに移 した。 次のベクターをＳ、ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８中で発現した：レーン１、ベク ターＰＵＣ８；レーン２、ｐＰＸ１５１５　（Ｉａｃプロモーター）；レーン３ 、ｐＰＸ１５２８　（ｔａｃプロモーター）；ｌ／−７４、ｐＰＸ１６０］　（ ＰＬプロモーター）。矢印はＣＳタンパク質の位置を示す。 第１４図。ｌａｃプロモーターにより誘導されたベーターガラクトシダーゼ／Ｃ ３またはＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タ融合タンパクルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）（以後、Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）中の発現。Ｓ、ｄｕｂ ｌｉｎ　５Ｌ１４３８中で合成したタンパク質を、５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲルの電気泳動により分離し、そしてウェスタン・プロッティングの手順におい て、抗Ｃ５ｍＡＢ　３゜２８でＣ５特異的タンパク質で検出するためにニトロセ ルロースに移しｌ；。次のベクターをＳ、ｃｌｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８中で発 現しｔ；：レーンｌ、ベクターｐＵｃ８；レーン２、ｐＰＸ１５１２；レーン３ 、ｐＰＸ１５１４；レーン４、ｐＰＸ１５１５；レーン５、ｐＰＸ１５２０：レ ーン６、ｐ　ＰＸ　１５２２゜（プラスミドの構成の各について、下の節７．１ 〜７．９）。 第１５図。種々のプロモーターの制御下の、Ｓ、ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ、 Ｓ、ｄｕｂｌ　ｉｎ、およびＳ、ｔｙｐｈｉ中のＬＴ−Ｂ／Ｃ５Ｐ、ｂｅｒｇｈ ｅｉの発現。示したサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉａ）菌株のａｒｏ Ａ突然変異体は、５０μｇ　／　ｍ　Ｑのアンピシリンを含有するシリアブロス 中でミドログ相（ｍｉｄｌｏｇ　ｐｈａｓｅ）！：Ｊｌｉ殖させた。合計のタン パク質試料を、節６．９および６．１０に記載されているように、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ中の電気泳動にかけ、そしてウェスタン・プロッティングにかけた。左の矢 印はタンパク質の分子量（キロダルトン）を示す；右の矢印はＬＴ−Ｂ／Ｃ３融 合タンパク質の位置を示す。 第１６図ｅＬＴ−Ｂの最初の３０アミ／ａに融合したＰ、ｆａｌｃ１ｐａｒｕｍ 反復二ビトーブを発現する、Ｅ、ｃｏｌ□およびサルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎ ’ｅ　ｌ　ｌ　ａ）菌株から得られたタンパク質の等電点電気泳動。はぼ５０マ イクログラムのタンパク質を含有する、示した菌株の超音波九理した抽出物を、 節６．１０に記載されているように垂直のゲル装置中で等電点電気泳動にかけた 。Ｔｙ５２３は’３．ｔｙｐｈｉ　ａｒｏＡ突然変異体である；５Ｌ３２６１は Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍａｒｏＡ突然変異体であり、そしてＳＬ］４３８は Ｓ、ｄｕｂｌｉｎａｒｏＡ突然変異体である。グラスミドｐＰＸ１５３２を含有 するＥ。 ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０３を１ミリモルのＩＰＴＧで誘発した；対照きして、ＩＰ ＴＧで誘発しない同一の菌株を示す。主な免疫活性種を右に矢印で示す。 第１７図。ＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質、まｔ；はＬＴ−Ｂを発現する組み換 えＳ、ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８に対する抗ＣＳタンパク質血清抗体の応答。 示したプラスミドを有する１０７のＳ、ｄｕｂｌｉｎの一次ワクチン接種投与量 を、腹腔内（ｉ、ｐ、）ルートにより、Ｃ５７ｂ　１／６マウスに与えた。マウ スを週４において一次投与量と同一の１０８の有機体で推進した。抗ＣＳタンパ ク質の抗体応答を、週４において採取した血清の１：１６０希釈物でＥＬＩＳＡ において測定した。 データは４１０ｎｍにおけるＯＤ（光学密度）値として表す。ｐＰＸ１５２７は ｔａｃプロモーターにより誘導されたＬＴ−Ｂ／Ｃ９融合タ融合タンパクンコー ドする；そしてｐＰＸ１６０１はＰＬプロモーターにより誘導されたＬＴ−Ｂ／ Ｃ５融合タ融合タンパクルコードする。 ５、発明の詳細な説明 本発明は、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のマラリア寄生虫のエ ピトープに関係しＩ；ペプチドおよびタンパク質を発現する、腸侵入バクテリア の弱毒化菌株に関する。本発明のバクテリア菌株は、宿主中で有意な病気または 疾患を引き起こさないで増殖することができ、そしてマラリアに対する保護的免 疫応答を誘発し、マラリアのだめの生ワクチン配合物中に使用することができる 。このようなワクチン配合物は一価まｔ：は多価であることができる。 本発明のワクチン配合物中の弱毒化腸侵入バクテリア中のプラスモディウムＫ　 （Ｐ　１　ａ　ｓｍｏ　ｄ　ｉ　ｕｍ）のエピトープの発現は、体液の応答に加 えて細胞仲介免疫応答を引き出す能力のｔ；めに、マラリアに対する保護的免疫 性を提供する。プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のエピトープに対 して向けられたｍ胞仲介免疫性は、バクテリアの侵入性質から生じ、これは細胞 仲介免疫性を誘発することができる方法で、免疫系にエピトープを提供させる。 とくに、本発明のワクチンのベクターの菌株は、弱毒化サルモネラ属（Ｓａ　Ｉ ｍｏｎｅ　］　ｌａ）バクテリアからなり、前記バクテリアはそれらの腸侵入性 質を保持するが、それらのビルレンス性質の大部分を損失している。サルモネラ 属（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）のバクテリアは、腸の上皮細胞を侵し、そして宿 主動物の網状内皮系を侵すことによって前身の感染を確立することができる。ビ ルレントのバクテリアを弱毒化することｊこよって、バクテリアの侵入性質は保 持されるが、それらのビルレンス性質は損失される。 本発明の好ましい実施態様において、サーカムスポロゾイテのマラリア抗原のす べてまｔ；は一部分をエンコードする遺伝子まＩ；は遺伝子断片は、マラリアの ための生ワクチンとして使用するため、芳番族化合物の生合成のｔ；めの遺伝子 の染色体の欠失により弱毒化された、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　］ 　Ｉａのバクテリア中で発現することができる。 弱毒化サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉａ）中でマラリアのスポロゾイ トのサーカムスポロゾイテのタンパク質を発現させることによって、スポロゾイ トの抗原は、バクテリアの持続性またはビルレンスなしに、バクテリアの侵入に よる免疫認識において重要な特定の細胞に効果的に供給することができる。この 方法で、マラリアのスポロゾイトに対して有効なワクチンを得ることができる。 本発明は、また、弱毒化腸侵入バクテリア内でマラリアタンパク質またはその断 片を発現する方法に関する。本発明は、弱毒化腸侵入バクテリア中のマラリアの ペプチドまｔ；はタンパク質の発現のために設計されたプラスミドベクターの使 用を明らかにする。特定の実施態様において、本発明は弱毒化サルモネラＪｌｉ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種中でサーカムスポロゾイテのタンパク質を発現させ る方法に関し、そしてＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ、ｖｉｖａｘ、卵形マラリ ア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｏｖａｌｅ）（以後、ｐ、ｏｖａｌｅ）、四日 熱マラリア原虫（Ｆ’ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｍａｌａｒｉａｅ）（以後、Ｐ、ｍ ａｌａｒｉａｅ）、Ｐ、ｂｅ　ｒｇｈｅ　＋ｓプラスモディウム・エリイイ（Ｐ ｌａｓｍｏｃ！ｉｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ）（以後、Ｐ、ｙｏｅｌｉｉ）、Ｐ、Ｋｎ ｏｗｌｅｓｉｓおよびＰ、ｃｙｎｏｍｏｌｇｉのサーカムスポロゾイテのタンパ ク質をエンコードするＤＮＡ配列に関する。プラスモディウムＩ！＞（Ｐｌａｓ ｍｏｄ　ｔｕｒｎ）の上の種のサーカムスポロゾイテのタンバク質は、適当なマ ラリア寄生虫のための動物宿主において腸侵入である、弱毒化サルモ不う属（Ｓ ａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　］　ｌａの積置で発現することができる。特定の実Ｎ１！ 様において、本発明は、まｌ：、最も重大な形態のヒトのマラリアに対する生ワ クチンとして使用するための、ａｒ。 Ａ染色体の欠失突然変異を含有する弱毒化Ｓ、ｔｙｐｈｉ中のＰ、ｆａｌｃｉｐ ａｒｕｍのサーカムスポロゾイテのタンパク質の発現に関する。 他ノ特定の実施態様において、本発明は、ヒトのマラリアのｔ；めの生ワクチン の効能を研究するためのモデルの系゛として、マウスについて侵入性である、弱 毒化サルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　］　ｌａ）中のＰ、ｆａＩｃｉｐａｒｕ ｍのサーカムスポロゾイテのタンパク質の発現に関する。 他の実施態様において、本発明は組み換え融合タンパク質としてマラリアのタン パク質の発現に関する。このような融合タンパク質はマラリアのエピトープの増 加しｔ；免疫原佳を示すことができる。特定の実施態様において、組み換えＤＮ Ａ技術を使用して融合サーカムスポロゾイテのタンパク質を得ることによって、 サーカムスポロゾイテのタンパク質の免疫原性は変更することができる。このよ うな実施態様において、サーカムスポロゾイテのタンパク質またはそのエピトー プをエンコードするＤＮＡは、Ｅ、ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニッ ト（ＬＴ−Ｂ）、またはその一部分のための遺伝子に接合して、免疫原性を増強 することができる。サルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ）中で発現され た融合ＬＴ−Ｂ／サーカムスボロゾイテのタンパク質の免疫原は、追加のＴ細胞 のヘルパー機能を供給することができる。この実施態様において、ＬＴ−Ｂへの サーカムスポロゾイテのタンパク質のエピトープのカップリングは、また、侵入 性サルモ坏う属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のゝリブラスミック空間へ組み換えＤ ＮＡ誘導誘導融合タンク質を向けさせ、そして抗原の発現を促進する。 本発明の詳細な説明の目的で並次の段階に分割することができる：　（ａ）マラ リア寄生虫のエピトープをエンコードする遺伝子、または遺伝子断片の分離；　 （ｂ）発現ベクター中への遺伝子まｔ：は遺伝子断片の挿入；　（Ｃ）弱毒化腸 侵入バクテリアへの遺伝子または遺伝子断片の転移およびその中の発現；　（ｄ ）組み換え腸侵入バクテリアにより発現こ；における実施例の節において記載す る本発明の特定の実施態様において、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉまたはＰ、ｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍのサーカムスボロゾイテのタンパク質のエピトープをエンコードする 、組み換えプラスミドの発現ベクターの構成を記載する。弱雪化すルモ不う属（ Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１　ａ）の積置の組み換えＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質 の発現を実証する。ＣＳタンパク質を発現する組み換えサルモネラ属（Ｓａ　１ ｍｏｎｅ　］　］　ａ）は、マウスにおいて抗Ｃ８抗体の産生を引き出し、そし 、てスポロゾイトの対抗のときのマラリアの感染に対して保護する免疫応答を誘 発することを示す。 ５．１．　プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のエピトープをエンフ ードする遺伝子または遺伝子断片の分離弱毒化腸侵入バクテリア中で融合タンパ ク質または非融合タンパク質として発現するとき、マラリアに対する免疫性を産 生ずる、プラスモディウムＪ！！（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のエピトープをエン コードするＤＮＡ配列は、本発明のワクチン配合物中で使用するために分離する ことができる。ＤＮＡ源として働Ｘことができるプラスモデイウム属（Ｐ　Ｉ　 ａ　ｓｍｏ　ｄ　ｉ　ｕ　ｍ）の種は、次のものを包含するが、これらに限定さ れない：ヒトのマラリア寄生虫のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｓ　Ｐ、ｖｉｖａｘ 。 Ｐ、ｏｖａｌｅ、Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅ、および動物のマラリア寄生虫のＰ、ｂ ｅｒｇｈｅ　Ｌ　Ｐ、ｙｏｅ　］　ｉ　Ｌ　Ｐ、Ｋｎｏｗｌｅｓ　ｉおよびＰ、 ｃｙｎｏｍｏｌｇｉｅ ＤＮＡ配列源として働いて、分離しそして本発明による弱毒化腸侵入バクテリア 中で発現することができる、プラスモデイウム属（Ｐ　Ｉ　ａ　ｓｍｏｄｉｕｍ ）抗原をエンコードする多数の遺伝子が存在する。本発明のワクチン中の組み換 えバクテリアにより発現することができる、抗原またはその断片は、ライフサイ クルにおける種々の段階のいずれかにおいてマラリア寄生虫により発現される抗 原、例えば、スポロゾイト、赤血球外（肝臓の実質細胞中の発育）、無性の赤血 球、または性の（例えば、配偶子、接合体、オーキネート）の段階の抗原である 。抗原は、マラリア寄生虫それ自体によるか、あるいは感染した細胞により発現 されることができる。使用することができるプラスモデイウム属（Ｐ　ｌ　ａ　 ｓｍｏｄｉｕｍ）の抗原は、次のもの刊行物（それらの開示をここに引用によっ て加える）を包含するが、これらに限定されない：Ｖａｃｃｉｎｅｓ８５．１９ ８５．　Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｒ，Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、編、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ （ａｒｂｏｒ、　ニヨーヨーク、　ｐｐ、１−５７゜Ｖａｃｃｉｎｅｓ８６．１ ９８６．　Ｂｒｏｗｎ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ−、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ、　ニヨーヨーク。 ｐｐ、　１３５−１７９゜ Ｖａｃｃｉｎｅｓ８７．１９８７．　Ｃｈａｎｎｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、編、　 Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　＝ヨーヨーク。 ｐｐ、８１−１０６．１１７−１２４゜Ｋｅｍｐ、　Ｄ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、 、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。 ８０　：３７８７゜ Ａｎｄｅｒｓ、　Ｒ，Ｆ、、　ｅｉ　ａｔ、、　１９８４．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、　Ｍｅｄ、　２（３）：１７７−１９１Ｍ１ｌｌｅｒ、　Ｌ、Ｈ，、ｅｔ　 ａｌ、、１９８４．　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３２（１）：４３８−４４２Ｃａ ｒｔｅｒ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｏｖ、　１３．　１９８４．　Ｐｈ１ｌ ｏｓ、　Ｔｈｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓａｃ。 Ｌａｎｄ、　ＣＢｉｏｌ、）３０７（１１３１）：２０１−２１３）ｆｏｌｄｅ ｒ、　Ａ、Ａ、　ａｎｄ　Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｒ，Ｒ，、１９８１，Ｎａｔｕｒ ｅ　２９４：３６１１、　ｅｃｈ、　Ｊ、Ｈ，、ｅＬ　ａｌ、、　１９８４．　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５９：１５６７Ｒｅｎｅｒ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８３．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５８：９７１Ｄａｍｅ、　Ｊ 、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．５ｃｉｎｃｅ　２２５：５９３＾ｒｎｏ ｔ、　Ｄ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．５ｃｉｎｃｅ　２３０：８１５ Ｃｏｐｐｅｌ、　Ｒ，’Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　 ３０６：７５１Ｃｏｐｐｅｌ、　Ｒ，Ｌ、、　ａｔ　ａｌ−、１９８４，Ｎａｔ ｕｒｅ　３１０ニア８９Ｈｏｌｄｅｒ、　Ａ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、１９８５ ．　Ｎａｔｕｒｅ　３１７：２７０Ａｒｄｅｓｈｉｒ、　Ｆ、ｌ　ｅｔ　ａｌ、 ＋　１９８７＋　ＥＭＢＯＪ、　６：４９３Ｒａｖｅｔｃｈ、　Ｊ、Ｖ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１５９３Ｓｔａｈｌ、　Ｈ ，−Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。 ８２：５４３ Ｌａｎｇｓｌｅｙ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：４１９１Ｃｏｐｐｅｌ、　Ｒ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ−、 １９８５，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。 ８２：５１２１ Ｈｏｗａｒｄ、　Ｒｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、１０４：１２６９Ｂｕｒａｎａｋｉｔｊａｒｏｅｎ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｎ ｅｖｙｂｏｌｄ、　Ｃ，１１，１９８７＋　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 ｐＢｒａｓｉｔｏｌ、　２２：６５ Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｅｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ。 １８：１８３ Ａｌｅｙ、　Ｓ、Ｂ、、　ｅｔ　ｍｌ、、　１９８４．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅ ｄ、　１６０：１５８５Ｋｎｏｗｌｅｓ、　に、およびＤａｖｉｄｓｏｎ、　Ｗ 、Ｌ、、　１９８４．　Ａｍ、　Ｊ、丁ｒｏｐ、　Ｍａｄ。 Ｈｙｇ、　３３ニア８９ Ｈ３ｌｅｊｊａｎ、　Ａ、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　’Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７６：４６５０Ｌｅｅｃｈ、　Ｊ、ＩＬ、　 ｅｔ　ａｌ−＋１９８４．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９８：１２５６Ｈ ａｄｌｅｙ、　Ｔ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４０：４５１Ｃａｍｕｓ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｈａｄｌ ｅｙ、　Ｔ、Ｊ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：５５３Ｖｅｍｅｕｌ ｅｎ、　Ａ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１６２：１４６０゜Ｖｅｍｅｕｌｅｎ、　Ａ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、＋　１９ ８６＋　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ。 ２０：１５５ Ｋｕｍａｒ、　Ｎ、およびＣａｒｔｅｒ、　Ｒ，、１９８４＋　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ。 １３：３３３ Ｐａｔａｒｒｏｙｏ、　Ｍ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒ ｅ　３２８：６２９−６３２Ｍ１ｌｌｅｒ、　Ｌ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８４．　Ｐｈ１１．　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄ。 Ｂ５０７：９９−１１５゜ 特定の例として、このような抗原は、次のものを包含する：サーカムスポロゾイ テ（ｃ　＋　ｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏ　ｉ　ｔｅ）の抗ｊＫ；Ｐ、ｆａｌｃｉｐ ａｒｕｍの血液段階のリング感染した赤血球の表面抗原（ＲＥＳＡ）、Ｓ抗原、 熱帯熱マラリア原虫（Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の散在しｆ：ｒｔｐ抗原（Ｆ　Ｉ 　ＲＡ）、グリコホリン（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ）結合タンパク質（ＧＢＰ） 、Ｐｆ　１９５　ｋｐの抗原、サーカムスボロゾイテのタンパク質関遮抗原（Ｃ ＲＡ）、Ｐｆ　１５５抗原、Ｐｆ７５ｋＤ抗深、Ｐｆ　ＥＭＰ　２抗原、および Ｐノブ関連（ｋｎｏｂ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）抗原；分子量２６０，０００． ５９．０００および５３．０００のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの性の段階の抗原 、分子量２３０．０００．４８，０００および４５．０００の抗原など。 特定の実施態様において、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のペプ チドはバクテリアの分泌されたタンパク質の配列をもつ融合タンパク質として発 現されることができるので、組み換え融合タンパク質はバクテリアの実質空間に 向けられ、こうして免疫系への提供を促進し、そして免疫原性を増強する。 組み換え腸侵入バクテリアにより発現されｔ；プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ）のエピトープの細胞外の局在化は好ましいが、細胞内の局在化はま た有効な免疫応答を誘発することができるので、細胞外の局在化は要求されない 。細胞内のタンパク質であるベーターガラクトシダーゼがＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍ　５Ｌ３２６１中で発現されるとき、特定の抗ベーターガラクトシダーゼ 抗体は組み換えバクテリアをマウスに投与することによってぢ１き出された（Ｂ ｒｏｗｎ％Ａ、ｅｔ　Ａ１．．１９８７、Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓｃ、１５５：８６ ）。 好ましい実施態様において、発現すべきマラリアのエピトープはプラスモディウ ム属ＣＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種のサーカムスボロゾイテ（ＣＳ）のタンパク 質のエピトープである。類似のＣＳタンパク質は、プラスモディウム属（Ｐｌａ ｓｍｏｄｉｕｍ）のすべての種のスポロゾイトの表面上で同定された。弱毒化サ ルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１１ａ）装置で発現されたサーカムスポロゾイ テのタンパク質の抗原は、スポロゾイト、雌のアノ７エレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅ ｓ）力により伝播されるマラリア寄生虫の侵入性の形態、に対して向けられた生 ワクチンとして使用することができる。ｃｓエピトープをエンコードしかつ使用 のために分離することができる遺伝子は、上に列挙したプラスモディウム、Ｉ（ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を包含するが、これらに限定されない。 とくに、ヒトのマラリア寄生虫Ｐ、ｆ　ａ　ｌ’ｃ　ｉ　ｐａ　ｒｕｍ、　Ｐ、 　ｖ　１ｖａｘ、サルの寄生虫Ｐ、ｃｙｎｏｍｏ１ｇｉおよびＰ、Ｋｎｏｗｌｅ ｓｉ％および醤歯類のＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳタンパク質をエンフードする遺 伝子を使用することができる；これらの遺伝子は、次の刊行物（これらの開示を ここに引用によって加える）中に報告されているように、クローニングしそして 配列決定された：Ｄａｍｅ、Ｊ、Ｂ、ｅ　ｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５ ：５９３；Ａｒｎｏｔ％Ｄ、Ｄ、ｅｔａｌ、、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３ ０：８１５；Ｗｅｂｅｒｅｔ　ａｌ、、１９８７，１Ｅｘｐ、Ｐａｒａｓｉｔｏ ｌ、６３：２９５；Ｅｎｅａ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ−１１９８４、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　 ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１　ニア５２０；Ｇｏｄｓｏｎ、ｃ 、Ｎ。 ｅ　ｔ　ａ　１−　％　ｌ　９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：２９；およびＭｅ Ｃｕｔｃｈａｎ、Ｔ、Ｆ−ｅｔ　ａｌ−１１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ２３０７１ ３８１゜寄生虫の各のｃｓ遺伝子の特徴ある面は、タンパク質の１／３からなり 、そして大きい系列の厘復タンパク質配列（Ｄａｍｅｓ　Ｊ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ− １１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：５９３；０ｚａｋｉ、Ｌ、Ｓ、ｅｔ　ａ ｌ、、１９８３、Ｃｅ１１３４：８１５）。−次アミノ酸配列、反復配列、およ び反復の数は寄生虫の各種とともに変化する。例として、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒ ｕｍのＣＳタンパク質をエンフードする遺伝子は、変異型テトラペプチド（ａＳ ｎ−ｖａｌ−ａｓｐ　ｐｒｏ）により４つの位置において中断されている、テト ラペプチド（ａｓｎ−ａ　１ａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）３７回反復した中央反復領域 を特定する。Ｐ、ｖｉｖａｘの反復領域は１９０ノナベズチドを含有する；Ｐ、 Ｋｎｏｗｌｅｓ　ｉの中央配列は８つのドデカペプチドを含有し、そしてＰ、ｂ ｅｒｇｈｒｉの反復領域は１２のオクタペプチドを含有するｅ　Ｐ、Ｋｎｏｗｌ ｅｓｉ　（Ｈ菌株）およびＰ−ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ、ｖｉｖａＸから の配列の比較は配列の相同性を明らかにしなかったが、ただし反復領域を７ラン キングする２つの域は、ヒトマラリア寄生虫Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ 、ｖｉｖａｘ　（Ｗｅ　ｂｅ　ｒ、Ｌ　Ｌ、およびＨｏｃｋｍｅｙｅｒ、ＩＷ、 Ｔ、、１９８４、Ｍｏ　１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓ　ｉ　ｔｏ　１． １５　：　３０５；ＺａｖａｌａｌＦ、ｅｔ　ａｌ、、’１９８５、Ｊ、１ｍｍ ｕｎｏｌ＋１３５：２７５０）内に高度に保存されるように思われるが、種内部 の変化はＰ、Ｋｎｏｗｌｅ　ｓ　ｉおよびＰ、ｃｙｎｏｍｏｌｇｉｌ：おいて観 測された。反復領域は、また、免疫優性であるように思われる（Ｄａｍｅ、Ｊ、 Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：５９３；Ｈ。 ｃ　ｋｍｅ　ｙ　ｅ　ｒｌｗ、　”ｒ、およびＤａｍｅ、Ｊ、Ｂ−１１９８５、 タンパク質およびペプチドエＩＩの免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　 ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ＩＩＩ％Ａｔａｓｓｉｓ Ｍ、２８編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓｓ　二、−ヨーク、ｐｐ、２３３　２４ ６；Ｚａｖａｌａ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ−１Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ−１５７：１９４ ７：Ｚａｖａｌａ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１４３６） 、本発明の好ましい実施態様において、反復領域、領域Ｉ８よび領域ＩＩ、を含 有するＤＮＡ配列は、本発明のワクチン配合物中で使用するために分離すること ができる。例えば、１つの実施態様において、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳ 反復領域に関係する、ペプチドａｓｎ−ａｈａ−ａｓｎ−ｐｒｏは、本発明の組 み換えバクテリアにより発現することができる。他の実施態様において、Ｐ、ｂ ｅｒｇｈｅ　１（７）ＣＳタンパク質の反復領域を発現する、ペプチドａｓｐ− ｐｒｏ−ａ　１ａ−ｐｒｏ−ｐ　ｒｏ−ａ　５ｎ−ａ　１ａ−ａｓｎを発現する ことができる。 本発明による組み換え腸侵入バクテリア中で発現すべきプラスモディウム属（Ｐ 　ｌ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）のＣＳペプチドは、組み換えＤＮＡ方法、化学 的合成、または精製技術のいずれににより産生されるでも、次のものを包含する が、これらに限定されない：ブラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）特異 的抗原のアミノ酸配列のすべてまたは一部分、機能的に同等のアミノ酸残基がサ イレントの変化を生ずる配列内の残基で置換されている、変更された配列を包含 する。例えば、配列内の１または２以上のアミノ酸残基は、機能的同等体として 作用し、サイレントの変更を生ずる、同様な極性の他のアミノ酸により置換する ことができる。配列内アミノ酸の置換基は、アミノ酸が属するクラスの他の構成 員から選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、次のもの を包含する：アラニン、ロイシン、インロイシン、バリン、プロリン、フェニル アラニン、トリプトファン、およびメチオニン。極性中性アミノ酸は１　グリシ ン１セリン、スレオニン、システィン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミ ンを包含する。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン・　リジン、お よびヒスチジンを包含する。負に帯ＫＬ／た（酸性）アミノ酸は、アスパラギン 酸およびグルタミン酸を包含する。 ハブテン、すなわち、同種の抗体と選択的に反応することができることにおいて 抗原性であるが、免疫応答を引き出すことができないことにおいて免疫原性であ る分子、であるマラリアのエピトープをエンコードするＤＮＡ配列は、本発明の ワクチン配合物における使用のために分離することができる。なぜなら、特定の 実施態様において、本発明の腸侵入性の弱毒化されたバクテリアによる発現は、 バクテリアにより発現されＩ；ハブテンに免疫原性を与えるすることができるか らである。特定の例として、免疫原性ペプチド、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉの腸毒素 のサブユニットＢ　（ＬＴ−Ｂ）から誘導されたものとの融合タンパク質として 、マラリアのハブテンの発現は免疫原性を与えることができる。 ５．２．　プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のエピトープをエンコ ードする配列を含有する発現ベクターの構成 本発明のこの面において、マラリアのエピトープをエンコードする所望のＤＮＡ 配列を、組み換えＤＮＡ方法（参照１Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｔ。 、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＳＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｎｕａ＋、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）を使用して、発現ベク ター中にインサートし、こうしてそれを宿主弱毒化腸侵入バクテリア中で活性プ ロモーターの制御下に発現することができる。プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ）のエピトープをエンコードするＤＮＡ配列は、多数の源、例えば、 クローニングしたマラリアのＤＮＡ、ゲノムのマラリアのＤＮＡ、マラリアのＲ ＮＡのｃＤＮＡ、または化学的に合成したＤＮＡのいずれからも得ることができ る。 プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡの断片を発生させるため に、プラスモディウム属（Ｐｌ’ａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡを特異的部位にお いて種々の制限酵素を使用して切断することができる。 あるいは、マンガン、まｔ；はヤエナリヌクレアーゼの存在下にＤＮａｓｅｌを 使用して（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ２５：６２６）ＤＮＡを断片化することがテキルカ、あるいはＤＮＡは、例えば 、超音波処理により、物理学的に剪断することができる。次いで、線状のＤＮＡ 断片を標準の技術により大きさに従い分離することができ、Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ技 術は次のものを包含するが、これらに限定されない：アガロースおよびポリアク リルアミドゲルの電気泳動およびカラムクロマトグラフィー。 制限酵素または制限酵素の組み合わせを使用して、所望のペプチドを含有するプ ラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡ断片を発生することができ るが、ただし酵素はエンコードされた免疫効能を破壊しないことを条件とする。 結局、多くの制限酵素の組み合わせを使用してＤＮＡ断片を発生させるすること ができ、これらのＤＮＡ断片は、適当なベクター中に挿入するとき、プラスモデ ィウム属（Ｐｌａｓｍ。 ｄｉｕｍ）のエピトープを含有するペプチドの産生を指令することができる。 いったんＤＮＡ断片が発生すると、所望のマラリアの配列を含有する特異的ＤＮ Ａ断片の同定はある数の方法で達成することができる。例えば、少量の所望のＤ ＮＡ配列または相同性の配列が削具て入手可能である場合、それはとして標識し たプローブ（例えば、ニック翻訳した）として使用して、核酸のハイブリダイゼ ーションにより、所望の配列を含有するＤＮＡ断片を検出することができる。あ るいは、誘導された遺伝子または遺伝子断片が知られている場合、分離された断 片または一部分はこの分野において知られている方法により配列決定し、そして 誘導された配列を既知のＤＮＡまたはタンパク質配列のそれと比較して同定する ことができる。あるいは、所望の断片は既知の技術により同定することができ、 これらの技術は次のものを包含するが、これらに限定されない：ｍＲＮＡの選択 、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを同定されたｍＲＮＡいすること、遺伝子配列（Ｉ：だし、配 列が知られている場合）を化学的に合成すること、まｔ；は種々のＤＮＡ断片を 発現系中に「ショットガンクローニング」しｔ；後、エンコードされたタンパク 質の発現に基づいた選択（例えば、抗体の結合による）。 いったん同定および分離した後、問題の配列を含有するプラスモディウム属（Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ）ＤＮＡ断片を、宿主の腸侵入バクテリア中で複製および発 現することができるベクター中に挿入する。プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ）のＤＮＡはバクテリアの染色体のＤＮＡ中に挿入することができる。 あるいは、好ましい実施態様において、プラスモディウム属（Ｐ　１　ａ　ｓｍ ｏ　ｄ　ｉ　ｕｍ）のＤＮＡを、エピソーム的に存在することができるクローニ ングベクター、例えば、プラスミドまｔ：はバクテリオファージ中に挿入し、次 いでこれを適当な宿主のバクテリア細胞の形質転換または感染し、ここでプラス モディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡは複製および発現される。 プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡを断片化するために使用 する相補的制限部位がクローニングベクター中１こ存在しない場合、ＤＮＡ分子 の末端は修飾することができる（例えば、参照、下の節５）ゎこのような修飾は 、末端が平滑末端結合されるように、−末鎖ＤＮＡの末端を逆消化するか、ある いは−末鎖の末端を充填することを包含する。あるいは、所望の任意の部位をヌ クレオチド配列（リンカ−）をＤＮＡ末端上に結合することによって産生ずるこ とができる；これらの結合したリンカ−は制＠部位認識配列をエンコードする、 特異的に化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからなる。他の方法に従い、切 断されたベクターおよびプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡ 断片はホモポリマーのティリングにより修飾することができる。 プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のＤＮＡを組み込んだ組み換えＤ ＮＡ分子を使用する弱毒化膿侵入バクテリアの形質転換は、プラスモディウム属 （Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）の配列の多数のコピーの発生を可能とする 。種々のベクターの系は、バクテリアの宿主内の発現に利用することができ、こ のようなものは次のプラスミドを包含するが、これらに限定されない＝ｐＬＩＣ プラスミドおよび誘導体、ｐＢＲ３２２プラスミドおよび誘導体、バクテリオフ ァージ、例えば、ラムダおよびその誘導体、およびコスミド。特定の実施態様に おいて、使用することができるプラスミドのクローニングベクターは、Ｃｏ１Ｅ ＩＷレグリコンの誘導体を包含する（追加の情報については、次の文献を参照、 ０ｋ２１　ｓｔ　ａｌ、、１９７９、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１７２：１ ５１　１５９）。Ｃｏ１Ｅ１プラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉおよびネズミチフス菌 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）菌株中で、約１５〜２０コ ピー／細胞のコピー数をもつ七ノで−の分子として、安定に維持される。種々の 調節発現要素を使用することができ、これらは本発明の弱毒化膿侵入バクテリア 中で活性である、任意の数の適当な転写および翻訳の要素である。例えば、プラ スモディウム属（Ｐ　］　ａ　ｓｎｏ　ｄ　ｉ　ｕ　ｍ）のＤＮＡ配列の発現を 指令することができるプロモーターは、次のものを包含するが、これらに限定さ れない：Ｅ、ｃｏｌｉのラクトースのオペロンのプロモーター、ハイブリッドの ｔｒｐ−１ａｃＵＶ−５プロモーター（ｔａｃ）（ＤｅＢｏｅｒｌ　Ｈ，ｅｔ　 ａｌ、、１９８２、プロモーターの構造および機能（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ｅｔ　ａ　 ｌ　０、ＲｌＬ−およびＣｈａｍｂｅ　ｒ　ｌ　ａ　ｉ　１％　Ｍ、Ｊ、編、Ｐ ｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク）、バクテリオファージラ ムダの左側（ｐＬ）および右側（Ｐ、）のプロモーター、バクテリオファージエ フプロモーター、ｔｒｐオペロン、１１）ｌプロモーター（Ｅ、ｃｏｌｉリポタ ンパク質遺伝子プロモーター；Ｎａｋａｍｕｒａｓ　Ｋ。 およびＩｎｏｕｅ、１．．１９７９、Ｃｅ１１　１８：１１０９−１１１７）な ど。組み換えＤＮＡまたは合成の技術により産生された他のプロモーターは、ま た、挿入された配列の転写を提供するために使用することができる。 特定の開始シグナルは、また、挿入されたタンパク質解読配列の効率よい翻訳に 要求される。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を包含 する。それ自体の開始コドンおよび隣接する配列を含む全体のプラスモディウム 属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子が適当な発現ベクター中に挿入される場合、 追加の翻訳制御シグナルは必要ではない。しかしながら、遺伝子配列の一部分の みが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを包含する、外因性翻訳制御シグナルを 準備しなくてはならない。さらに、開始コドンはタンパク質解読配列のリーディ ングフレームと同調して、全体のインサートの翻訳を保証しなくではならない。 これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、自然および合成の両者の 種々の由来であることができる。 ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入について前述した方法のいずれをも使用して、 適当な転写／翻訳制御シグナＪ’ｕおよびタンパク質解読配列から成るキメラ遺 伝子を含有する発現ベクターを構成することができる。 これらの方法は、生体外組み換えＤＮＡおよび合成の技術および生体内の組み換 え（遺伝子組み換え）を包含することができる。 遺伝子の発現を最大にすることについての外観については、次の参考文献を参照 ：ＲｂｅｒｔｓおよびＬａｕｅｒＳＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。 ］、６８：４７３；およびＲｅｎｚｎ　ｉｋｏ　ｆ　ｆＳＷ、およびＧｏｌｄ、 Ｍ、、Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＰＩｅｎｕｍ 　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク。 プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のペプチドまｔ；はタンパク質ｈ ａ、融合または組み換えクンバク質として発現することができる。Ｅ、ｃｏｌｉ および他のバクテリアは、「異常の」または外来のタンパク質を選択的に破壊す るように思われる、活性のタンパク質分解系を含有する（Ｂｕｋｂａ　ｒ　＋、 Ａ、思われるＺｉｐｓｅｒ、Ｄ、、１９７３、Ｎａｔｕｒｅ　２４３：２３８） 。タンパク質分解分解からバクテリア中で発現された真核生物を保護するために 、使用することができる１つの方法は、外来配列が原核生物の遺伝子と同調して （すなわち、正しいリーディングフレーム中で）結合される、ハイブリッドの遺 伝子を構成することである。このハイブリッドの遺伝子の発現は融合タンパク質 の産生物（すなわち、原核生物および外来アミノ酸配列であるタンパク質）を生 ずる。プラスモディウム属（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍｏ　ｄ′ｉ　ｕｍ）のエピトープ が融合タンパク質の一部分として発現される特定の実施態様において、プラスモ ディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の配列は異種の免疫原性配列に融合するこ とができる。特定の実施態様において、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉ ｕｍ）の配列はＥ、ｃｏｌｉの腸毒素のサブユニットＢのすべてまたは一部分に 融合することができる。 米国特許第４，２３７．２２４号（ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒ）は、制限酵素 を使用する切断の処理を使用し、そして結合の既知の方法によりＤＮＡリガーゼ で接合する、組み換えプラスミドの産生を記載している。次いで、これらの組み 換えプラスミドは、形質転換により導入し、そして組織培養中で増殖した原核生 物の有機体８よび真核生物を包含する、単細胞の培養物中で複製する。この中に 記載する技術の一般の適用可能性のために、米国特許第４．２３７，２２４号の 開示をこの明細書中に引用ｇ；よって加える。 単細胞中への組み換えＤＮＡ分子を導入する他の方法は、米国特許第４．３０４ ．８６３号（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＨｏｈｎ）（その開示をここに引用によって 加える）に記載されている。この方法はバクテリオファージのベクター（コスミ ド）によるバッキング／形質導入を利用す５．３．　プラスモディウム属（Ｐ　 Ｉ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）の抗原またはその断片を複製および発現する、組 み換え発現ゝフタ−の同定 外来遺伝子を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチにより同定する ことができる：　（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション、（ｂ）「マ ーカー」遺伝子の機能の存在または不存在、および（Ｃ）挿入した配列の発現。 第１アプローチにおいて、発現ベクター中に挿入された遺伝子の存在は、外来の 挿入されｔ；遺伝子に対して相同性の配列からなるグローブを使用するＤＮＡ− ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出することができる。第２アプローチに おいて、組み換えベクター／宿主系は、ベクター中の外米遺伝子の挿入により引 き起こされた、ある種の「マーカーｊ遺伝子機能（例えば、ベーターガラクトシ ダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する活性など）の存在または 不存在に基づいて、同定および選択することができる。例えば、プラスモディウ ム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）ＤＮＡ配列がベクターのマーカー遺伝子内挿入さ れる場合、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｒｒｌ）のインサートを含 有する組み換え体はマーカー遺伝子機能の不存在により同定することができる。 第３アプローチにおいて、組み換え発現ベクターは組み換え体により発現された 外来遺伝子産生物のアッセイにより同定することができる。このようなアッセイ は、遺伝子産生物の免疫学的、または機能的性質に基づくことができる。例えば 、ＥＬＴＳＡを使用して、適当な抗プラスモディウム属（Ｐ　１　ａ　ｓｍｏｃ ｌ　ｉ　ｕｍ）抗体と結合抗原決定基の存在を検出することができる（例えば、 下の節６．１２参照）、いったん所望の組み換え分子が同定および分離されると 、それはこの分野において知られている方法によりある量で増殖および調製する ことができる。 ５．４．　弱毒化膿侵入性バクテリアによる発現次いで、マラリアのＤＮＡ配列 からなる発現ベクターを弱毒化膿侵入バクテリア中に移し、ここでそれを複製お よび発現することができる・これはこの分野において知られている多数の方法に より達成することができ、このような方法は次のものを包含するが、これらに限 定されない；形質転換（例えば、分離したプラスミドＤＮＡの弱毒化バクテリア 宿主中への形質転換）、ファージの形質導入、バクテリアの宿主種間の接合、ミ クロ注入など。プラスミドの発現ベクターの使用を包含する好ましい実施態様に おいて、プラスミドの構成体はＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２中でまず分離および特性決 定しＩ；後、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　ｌａ）菌株に、例えば、フ ァージ形質導入により転移することができる（Ｓｃｈｍｅｉｇｅｒ、１９７７、 Ｍｏｌ＋Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１９ニア５）、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉ ｍｏｎｅ　ｌ　ｌ　ａ）　、例えば、Ｓ。 ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのものに関するＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２の形質転換の頻度 のために。 種々の弱毒化膿侵入バクテリアのいずれをもマラリアのエピトープを発現するベ ヒクルとして使用することができるので、それは本発明のワクチン配合物におい て、宿主免疫系に効果的に提供される。ワクチンのバクテリアはそれらの侵入性 質を保持するが、それらのビルレンス性質の大部分を損失し、こうしてそれらを 宿主中で、有意の病気または疾患を引き起こさないで、増殖させることができる 。本発明のワクチン配合物中で、弱毒化した形態で、使用することができる腸侵 入バクテリアの例は、次のものを包含するが、これらに限定されない：サルモネ ラ、＠（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、腸侵入性Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　（ＥＩＥＣ）、 および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種。好ましい実施態様において、リンパ系 組織、例えば、牌臓中に存在する腸侵入バクテリア（例えば、サルモネラ属（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ）種）を使用する。このようなバクテリアは腸の上皮組織を 侵し、網状内皮系を通して分散し、そして腸間膜のリンパ系に接近し、ここで増 殖しそして体液および細胞仲介の免疫性を誘発する。 弱毒化膿侵入バクテリアは、多数の方法により得ることかでき、このような方法 は次のものを包含するが、これらに限定されない：化学的突然変異誘発、遺伝子 の挿入、欠失（Ｍｉ　］　ｌｅｒ、Ｊ、　、１９７２、分子遺伝学における実験 （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｊａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂＯｒｌｔＯｒＦ％コールドやスプ リング争ハーバ−、ニューヨーク）または組み換えＤ−ＮＡ方法を使用して組み 換え（Ｍａｎｉａｔｉｓ、”ｒ、　、１９８２、モレキュラー・クローニング、 実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ、　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク ）自然突然変異の実験室の選択など。生ワクチンとして使用に適当な非復帰性非 ビルレントの両栄養性突然変異体は、同時係属出願の米国特許出馴第６７５，３ ８１号、提出１９８４年１１月２７日、および米国特許出願第７９８．０５２号 、提出１９８５年１１月１４日（）ｔｏｃｋｅｒ）（それらの開示をここに引用 によって加える）に記載されている。 本発明の生ワクチン配合物中で使用することができる弱毒化サルモネラ属（Ｓａ 　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　Ｉ　ａ）は、下表１のものを包含するが、これらに限定され ない。 表１ 本発明のワクチン配合物中で、弱毒化し！；形態で、使用することができ（例え ば、丁ｙ２１ａ、　Ｔｙ５２３．　Ｔｙ５４１）Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ （例えば、５Ｌ３２６１．　ＬＴ２４１）Ｓ、　ｐａｒａｔｙｐｈｉ　Ａ Ｓ、　ｐａｒａｔｙｐｈｉ　Ｂ Ｓ、　ｅｎｔｅｒｉＬｉｄｉｓ （例えば、血清型ｄｕｂｌｉｎ、例えば、菌株５Ｌ１４３８）Ｓ、　ｃｈｏｌｅ ｒａｅ−ｓｕｉｓ 本サルモすラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　ｌａ）血清をの完全な記載については 、次ぎの参考文献を参照：Ｅｄｗａｒｄｓ＃よびＥｗｉｎｇＳ　１９８６、腸内 細菌科の分類（Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｔｅｒｏｂ ａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、第４版、ニューヨーク、エルセピア−０ 特定の実施態様において、芳香族化合物の生合成（ａｒｏ）またはｇａＩＥ遺伝 子中の突然変異のために遺伝子の染色体の欠失により弱毒化したサルモネラ属（ Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ）のバクテリアを使用することができる。 Ｓ　−’ｔ　ｙ　ｐ　ｈ　＋　＊例えば、Ｔｙ５２３およびＴｙ５４１は、ヒト において、ヒトにおいて、ａｒｏＡおよび／またはｐｕｒＡをエンコードする遺 伝子による弱毒化により、ヒトにおいてビルレットでない（Ｌｅｖｉｎｅ、Ｍ、 Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、１９８７、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７９：８８８） ｅ　Ｓ、ｄｕｂｌｉｌの突然変異体、例エバ、５Ｌ１４３Ｂ、および３．ｔｙｐ ｈｉｍｕｒｉｕｍの突然変異体、例えば、５Ｌ３２６］は、腸チフスに同等の動 物の病気をつ１き起こすことができるので、動物のモデルの系の発育において使 用することができる。 ５．４−１．ｇａｌＥ突然変異体による弱毒化ｇａｌＥ突然変異体は、本発明の ワクチン配合物中で使用する弱毒化のを包含するが、これらに限定されない：チ フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）菌株Ｔｙ２、Ｔｙ２１（Ｈｏｎｅ 　ｅｔ　ａ、１．、］９８７、Ｊ、Ｊｎｆ、Ｄｉｓ、１５６：１６７）、および ＣＤＣｌＯ−３０１およびネズミチ７ス薗（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）菌株、ＬＴ−２、ＬＴ−２４１など。Ｓ、ｔｙｐｈｉ　ｇａｌＥ 突然変異体、Ｔｙ２１ａ、およびＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｇａ　ＩＥ、ＬＴ ２４１ｈａ酵素ＵＤＰ−ガラクトシダーゼ−エピメラーゼを欠き、そしてガラク トース代謝の２つの他の酵素に欠損する（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒｓ　Ｒ，２３よび ＦｕｒｅｒＳ　Ｅ、、１９７５、Ｊ、ｒｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１３１：５５３） 、ＬＰＳ（リポ多糖）はコノ菌株中で合成されるが、毒性ガラクトース−１−ホ スフェートは蓄積し、そして細胞溶菌が統いて起こる。 ５−４．２−　ａｒｏ突然変異体の弱毒化ａｒｏ只然寂然変異体毒化バクテリア の他の潜在的源を提供する。遺伝子ａｒｏＡの欠失は、フェニルアラニン、トリ プトファン、チロシン、および葉酸前駆体、ｐ−アミノ安息香酸、およびエンテ ロセリン前駆体、ジヒドロオキシ安息香酸についての多面作用の要件を生ずる。 芳香族アミノ酸は動物組織中に存在するが、ｐ−アミノ安息香酸は存在しない１ 動物細胞中に存在することができる葉酸は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ ｒｉａｅｅａｅ）の構成員により同化されない。さらに、エンテロセリンの不存 在はａｒｏＡサルモネラ属（Ｓａ　’ｒｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）ワクチンの菌株に おける鉄の要件を生ずるＣ５ｔｏｃｋｅｒｓ　Ｂ、Ａ。 Ｄ、ｅｔ　ａｌ、−１９８２、Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏ’１．５ｔａｎｃｌａｒ ｄ　５３：４７）−こうして、ａｒｏＡ遺伝子における欠失は、侵入のために重 要であることができる他の因子に多分影響を及ぼさず、こうして侵入性質を保持 する弱毒化バクテリアを生ずる、生化学的を生ずる。 使用することができるａｒｏ突然変異体は、次のものを包含するが、これらに限 定されないニヒトのためのワクチンにおける使用のため、ｓ。 ｔｙｐｈｉ菌株Ｔｙ５２３およびＴｙ５４］、および動物における使用のため、 Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｔ　１ｄｉｓ血清型ｃｉｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８（参照、米 国特許第４．！５５０．ｏａ１号、Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＷ株５Ｌ１４７ ９およびＳ、ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８の説明について）。 サルモネラＪ！（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１ａ）の弱毒化を達成する信頼性ある方 法は記載され（ＨｏｉｓｅｔｈＳＳ、に、および５ｔｏｃｋｅｒ。 Ｂ、Ａ、Ｄ、　、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９１：２３８；５ｔｏｃｋｅｒ、 Ｂ、Ａ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８２、Ｄｅｖｅ　ｌ　ｏｐ、Ｂ　ｉｏｌ、５ ｔａｎｄａｒｄ　５３：４７；および米国特許第４．５５０゜０８１号）そして 本発明の特定の実施態様において使用することができる。この方法において、芳 香族生合成通路に影響を及ぼす特定の欠失突然変異は形質導入により導入される 。この方法の利点は、正確に規定された突然変異を、化学的または放射線突然変 訴発を使用しないで、操作することができるということである。原理的には、サ ルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）中の芳香族生合成において欠陥は、バ クテリアの増殖を支持するために動物組織中の適切な遊離の濃度で存在しない栄 養を必要とさせる；それゆえ、侵すバクテリアを弱毒化し、そして病気を引き起 こすことができない。突然変異体は１または２以上の遺伝子の大部分を欠失して いるので、突然変異の復帰は不可能である。 ５．５．　組み換え腸侵入バクテリアにより発現されたプラスモディウム属（Ｐ ｌａｓｍｏｄｊｕｍ）のエピトープの免疫効能の決定 その生ワクチン配合物においてマラリアのエピトープの免疫効能は、マラリアの エピトープを発現する弱毒化膿侵入バクテリアで免疫化しｌ；後、試験動物の免 疫応答を監視することによって決定することができる。 体液の応答の世代は、一般化しｔ；免疫応答の指示として、マラリア寄生虫に対 する保護のために重要であろうる他の成分、とくに細胞仲介免疫性を取ることが できる。試験動物は、マウス、ウサギ、チンパンジーおよび究極的にヒトの被検 体を包含することができる。免疫原の導入の方法は、経口的、脳内、皮膚内、筋 肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内または他の操準の免疫化のルートを包含する ことができる。試験被検体の免疫応答は、種々のアプローチ、例えば、次のアプ ローチにより分析することができる：マラリア抗原に対して生ずる免疫血清の反 応性、既知技術、例えば、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりアッ セイする、イムノブロッティング、放射線免疫沈澱、など；ブラスモディウム属 （Ｐ　］　ａ　ｓｍｏ　ｄｉ　ｕｍ）の感染からの保護および／またはまたは免 疫化宿主中のマラリアの症候の減衰。 ５．６．ワクチンの配合 本発明の目的はワクチンを配合することであり、このワクチンにおいて、免疫原 は弱毒化膿侵入バクテリアであり、このバクテリアはマラリアのエピトープを発 現して、マラリアを防止するためのプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ）の感染に対する保護的免疫（体液および／または細胞仲介）応答を引き出す。 ワクチンのバクテリアは、ワクチン接種すべき宿主について感染性である、弱毒 化膿侵入性菌株からなる。 このような生ワクチンは一価または多価であることができる。 多価ワクチンは、１または２以上のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｃｉｉｕ ｍ）関連エピトープを発現する、単一のまたはわずかの組み換え弱毒化膿侵入バ クテリアから調製することができる。ワクチンは、また、マラリア寄生虫のエピ トープに加えて、他の病気を引き起こす有機体のエピトープを発現するバクテリ アを包含することができる。単一の腸侵入バクテリアは、同一まｔ；は異なる抗 原の１より多いマラリアのエピトープ、および／または異種８体のエピトープを 発現することができる。種々のエピトープは、同一タンパク質内（すなわち、融 合タンパク質的）で、同一または異なる発現ベクターｊこよりコードされた別の りンパク賃上で、または異なるバクテリア中で発現されることができる。 本発明の生ワクチン配合物を挿入するために多数の方法を使用することができる ：これらは次のものを包含するが、これらに限定されない：経日的、皮膚内、中 間体、腹腔内、静脈内、皮下、および鼻内のルート、親の野生型バクテリア菌株 の感染の自然のルートを包含する。 特定の実施態様において、マラリアのサーカムスポロゾイテのタンパク質のエピ トープを発現する弱毒化サルモ不う属（Ｓａ　ｊｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）をワクチ ンとして使用することができる。 ５．６．１．ワクチン接種の方法 マラリアのワクチンは、寄生虫のライフサイクルの特定の段階に対して向けるす ることができる。特定の実施態様において、ワクチンはスポロゾイト、力により 伝播される段階、およびヒトにおける感染を開始する段階に対して向けらること ができる。 有効な抗スポロゾイトワクチンは、感染を完全に防止するという固有の利点を有 するであろう。力により場合されｔ；後、スポロゾイトは生きている細胞を急速 に侵し、ここでスポロゾイトは赤血球を感染する段階に発育し、そして臨床的病 気を引き起こす。こうして、肝細胞のスポロゾイトの感染を完全にブロッキング するために、高いレベルのスポロゾイトに対する抗体が存在すべきである。 他の実施態様において、本発明のワクチン配合物はマラリア寄生虫の赤血球の段 階に対して向けられることができる。このワクチンは、スポロゾイトの段階に対 する抗体は赤血球を感染する無性のスポロゾイトの段階に作用をもたないので、 ことに価値があり、こうして抗スポロゾイト抗体仲介免疫応答を逃れる単一のス ポロゾイトは、なお、マラリアの臨床的場合を開始することができる。マラリア の致死率は寄生虫血症の程度に関係するので、完全より低い免疫性を生成しかつ 感染した赤血球の数を減少する血液段階のワクチンは臨床的に有用であろう。 本発明の他の特定の実施態様は、伝播ブロッキング免疫性の概念を包含する。血 液を摂取するとき取られる性の（生殖母細胞）に対する抗体は、力の牛腸中の寄 生虫の受精をブロッキングし、配偶子および接合体を溶菌するか、あるいは接合 体の発育をブロッキングすることができる。 特定の実施態様において、個体と反対に集団に対する保護を提供する、このよう なワクチンはマラリアの抑制のプログラムの一部分として使用することができる 。 サブユニットのワクチンを使用する前の研究は、有効なマラリアワクチン配合物 の必要性を実証した。Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのＯ５遺伝子は、最近クローニングさ れ、そして配列決定された（Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｓ１９８７ＳＥｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｒａｓｉｔｏｌ、６３：　２９５−３００　；参照、下の節 ７．ｌ）、ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉの反復領域は合計１２単位の４つの異なるオクオ ペプチド、ならびに１６単位の反復の２つのジペプチドを含有する。コンセンサ スオクオベブチドの２つの反復から成るペプチドは、キーホールリンペットのヘ モシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ ）にカップリングされた。あるいは、反復領域のすべてを含む成熟遺伝子産生物 の寅際の解読配列のほぼ７０％を含有するクローニングされた遺伝子は、Ｅ、ｃ ｏｌｉ中で発現された。ペプチド、組み換えタンパク質、またはガンマ照射した スポロゾイトはマウスの免疫化に使用された。ペプチド、組み換えタンパク質、 および完全なスポロゾイトに対するＥＬＩＳＡにより測定した抗体力価、ならび にＣＳＰおよびＩＳ■活性は、少なくとも照射したスポロゾイトで免疫化した群 におけるのと同程度にマウスのサブユニットワクチン接種した群において高かっ た。有意には、照射したスポロゾイトで免疫化した動物のみは高いスポロゾイト の対抗（１０つに対して保護する（９０％）ことができツ；。サブユニットのワ クチン接種した動物は、わずかに最低の対抗投与ｊｉ　（５００）で保護された 。保護は部分的であるだけであり、４０％を決して越えなかった（Ｅｇａｎ、Ｊ 、ｅｔ　ａｌ、、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：４５３）。 最近の研究において、スポロゾイト免疫化マウスからのＴ細胞の転移は受容体の 動物を保護したが、Ｂ細胞またはポリクローナル免疫血清を与えｌ；マウスは保 護されず、こうして細胞の免疫性が重要であることを示唆することをわれわれは 示した。 本発明は、体液の免疫性に加えて、細胞仲介免疫性（ＣＭＴ）を誘発することが できる、弱毒化膿侵入バクテリア中のマラリアのエピトープの発現の結果、マラ リアに対する保護的免疫性を提供する。 スポロゾイトによる免疫化の正常の過程において、抗体はスポロゾイトの肝臓へ の到達のすべてでなく、一部分を防止するとわれわれは推測する。スポロゾイト は、侵すとき、肝細胞の表面にＣＳタンパク質を付着し、そして発育する赤血球 外の形Ｂ（ＥＥ）はスポロゾイトに対してレイズされたｍＡＢにより認識される 発現を発現する。これらの発育するＥＥの形態は、同様に、自然キラー細胞およ び細Ｂ：！！毒性Ｔｍ胞またはサイトキン仲介応答を標的するであろう。非経口 的に投与されたＣＳワクチンが保護的細胞応答を誘発することが出来ないことは 、ＭＢＣ（主要な組織適合性）に関連する不適当な抗原の表現の結果であること があるか、あるいはスポロゾイト誘発免疫性にとって重要であるエピトープがＣ Ｓタンパク質上に存在しないことを示しうる。しかしながら、ＣＳタンパク質は 唯一の検出可能な表面抗原であるので、後者の説明はあり得ない。有機体が特定 の細胞を標的し、引き続いて適当なＭＨＣ分子と関連して抗原の発現はＣＭＩの 誘発にとって重要であるという可能性は、スポロゾイトの対抗に対する保護的免 疫化が、完全なの弱毒化スポロゾイトの静脈内投与を要求するという本実により 支持される。筋肉内の免疫化および凍結−融解まｔ；は超音波処理し！；有機体 のいずれも、有意の保護を誘発しない（Ｓｐｉｔａｌｎｙ、ｃ、Ｌ、およびＮｕ ｓｓｅｎｗｅ　ｉｇ、Ｒ，Ｓ、　、１９７２、Ｐｒｏｃ、Ｈｅ　１ｍ、Ｓｏｃ、 Ｗａｓｈ。 ３９：５０６）。 この問題に対する回答は、本発明のワクチン配合物により提供されるように、適 当な抗原発現細胞への供給を促進する弱毒化有機体中で発現されたＣＳタンパク 質（他のマラリア抗原、またはそのエピトープ）を供給することである。本発明 の好ましい実施態様は、ピルレントない非病原性サルモネラ属（Ｓａ　ｊｍｏｎ ｅ　Ｉ　ｌａ）の経口的ベクターの供給系の使用である。この系の使用は他の供 給ワクチン、例えば、ワタシニアウイルスの使用に関連する潜在的副作用のある ものを排除するばかりでなく、かつまたマラリアワクチンの便利な経口的投与を 提供する。この後者の点は、非経口的投与のワクチンの多数の投与を支持するこ とができない、健康の源が限定されている開発途上国にとって極めて重要である 。 用する経口的ワクチン接種 本発明の特定の実施態様において、サルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１ｌａ） の弱毒化菌株を使用して外来抗原を供給するという概念は、腸の上皮組織を侵し 、これにより腸間膜のリンパ系に接近するサルモ不う属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ 　ｌａ）種の能力に基づく。マウスのチフス様モデルにおいて、タケウチ（１９ ７５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｊｅａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１ワシンｔ−ンＤ、ｃ、、ｐｐ１７４　１８１）は 、管腔ブラシボーダー（ｂｒｕｓｈ　ｂｏｒｄｅｒ）におけるＳ、ｔｙｐｈｉｍ ｕｒｉｕｍの結合後、バクテリアは絨毛先端を侵し、そして飲細胞膜の小胞中に 吸い込まれるようになることを示した。上皮細胞の末端の膜を交差すると、バク テリアは細網内系通して分散する。固有層に到達すると、サルモネラ属（Ｓａ　 １ｍｏｎｅ　］　ｌａ）、！［Ｉ胞はバクテリアを摂取するマクロファージを殺 到させる。ある細胞はファゴサイトーシスを逃れ、腸間膜のリンパ節中に排出さ れ、ここでそれらは増殖する。細胞仲介応答の刺激は細網内系の侵入の結果であ る。こうして、本発明の弱毒化経口的ワクチンの本来の特徴は、病原性有機体と 同様に腸上皮を侵すことができるが、活性な病気を引き起こすことができず（例 えば、正確に規定された遺伝子障害のため）病原性を損失することである。サル モネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に基づく経口的マラリアのワクチンは、現在 開発されているワクチンを越えたいくつかの利点を有する。例えば、適当な遺伝 子構成体ヲ使用して、ベクターは抗原の表面の発現においてスポロゾイトをまね 、そして細胞仲介および体液の両者の免疫性を刺激することができる。組み換え タンパク質の精製工程は不必要であり、そして生きている弱毒化サルモ不う属（ Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌ　ａ）ワクチンは安価に産生し、そして便利に投与す ることができる。さらｌ：、入手可能な動物およびヒｌ−７７）研究に基づく悪 い反応の可能性は低い（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ、Ｒ，１９８４、バクテリアのワク チン（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓｓニューヨーク−ｐｐ、１３７−１６５；Ｇｉｌｍａｎ、Ｒ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ 、、１９７７、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、１３６：７１７；Ｌｅｖｉｎｅ、Ｍ、 Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４７：５］Ｑ：Ｓｍ１ｔｈ１ 　ｅｔ　ａｌｌ、１９８４、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４５：２２３１；Ｓｍ １ｔｈ１Ｂ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、１９８４、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ　ｔ、Ｒｅ　ｓ４５ 　：　５９　；Ｗｒａｙ、Ｃ１ｅ　ｔ　ａ　ｌ−１】９８２、Ｄｅｖｅｌ。 ｐ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｃｌ　５３：４１；ＷｒａｙｌＩＣ，ｅｔａｌ、 、１９７７、Ｊ、Ｈｙｇ、Ｃａｍｂ、７９：１７）。 制限エンドヌクレアーゼはＢＲＬ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、？リイランド州ベセスダ）、ＩＢＩ（１ｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、工ｎｃ。 、コネチカット州二二一ヘブン）、二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（？サチュセッッ州ベベリイ）、まプニ はｔＪ、　Ｓ、バイオケミカル・コーポレーション（ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（オハイオ州りレベランド）から 購入した。 割型酵素の消化は、ＤＮＡを適当な制限緩衝液中に懸濁させ、制限エンドヌクレ アーゼを添加し、そして適当な時間インキュベーンフンして消化を完結すること によって実施した。１単位の酵素を１．７μｇの７フージラムダＤＮＡを１時間 で１０μρの体積の合計の反応混合物中で完全に消化するために要求される量と 定義される。種々の酵素とともに使用する酵素は下に列挙する： Ｃｏａｌ、Ｈｐａｌ、１（ｐａｌｌ、およびＫｐｎｌの消化のために使用した低 い塩の緩衝液は、次の成分から成る：ｌＯミリモルのトリス−Ｃ１（ｐＨ８，０ ）、１０ミリモルのＭｇＣ１，、および１０ミリモルのジチオスレイトール（Ｄ 　Ｔ　Ｔ）。 ＡＩｕＬＡｖａＩ、５ＳＩ）Ｉ、Ｔ＆ＱＩ％　Ｘｍａｌ、およびＸｍｎ１の消化 のために使用した中程度の塩の緩衝液は、次の成分から成る：５０５０モルのト リス−ｃｌ　（ｐＨ８，０）、１０ミリモルのＭｇＣ１３，５０ミリモルのＮａ Ｃｏ、および１０ミリモルのＤＴＴ。 ＢａｍＨＩ％ＥｃｏＲＩ％ＥｃｏＲＩＶ、Ｎｃｏｌ、および５ａｌｌの消化のた めに使用した高い塩の緩衝液は、次の成分から成る＝５０５０モルのトリス−Ｃ Ｉ　（ｐＨ８，０）、１０ミリモルのＭｇＣＩ、、１５０ミリモルのＮａＣ１、 および１０ミリモルのＤＴＴ。 Ｓｍａｌの消化のために使用しＩ；高い塩の緩衝液は、次の成分から成る＝１０ １０モルのトリス−ＣＩ　（ｐＨ８，０）、２０ミリモルのＫＣｌ、ＪＯミリモ ルのＭｇＣ１、、および１０ミリモルのＤＴＴ。 すべての制限消化は、６０℃において実施したＴａｑｌを除外して、３７℃にお いて実施した。 ６．２．ＤＮＡ断片のゲル精製 制＠酵素の消化後、変化する大きさのＤＮＡ断片を分離し、そして２ミリモルの ＥＤＴＡを含有する０、１モルのトリス−ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）を使用 するアガロース中のゲル電気泳動により１０ボルト／ｃｍにおいて精製した。ア ガロースの濃度は、回収すべき断片の大きさに依存して０．８〜１．５％で変化 しｌ；。ＤＮＡのバンドは臭化エチジウムの蛍光により可視化した。選択したＤ ＮＡ断片をＮＡ４５紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、ニュ ーハングシャイヤー州ケーネ）上に電気溶離し、次いでＮＡ４５紙を６８℃にお いてｌＯミリモルのトリス（ｐＨ８，０）、１ミリモルのＥＤＴＡおよび１モル のＮａＣ１から成る緩衝液中でインキュベーションすることによって、ＤＮＡを 回収した。 ６．３．オリゴヌクレオチドの合成および精製オリゴヌクレオチドは、０．２μ モルの規模で、アプライド・バイオラステムス・インコーホレーテッド（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）の３８０Ｂ型の合成装置で、ベー ターシアノエチル−ホスホルアミダイトの化学を使用して合成した（Ｓｈｉｎｈ ａ、Ｎ。 Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、１９８４、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ）、１２　：　４５９３−４５４４）。 オリゴヌクレオチドは電気泳動により０．４ｍｍの厚さの８％のポリアクリルア ミドゲル中のＴＢＥ緩衝液（０，０１モルのトリス−ホウ酸塩、ｐＨ８，２，１ ミリモルのＥＤＴＡ）中において、はぼ１６００ポルトおよび７５ワツトの一定 電力において精製しｔ；。オリゴヌクレオチドのバンドをＰＥＩ（ポリエチレン −イミン）薄層クロマトグラフィー板上で紫外線下に負のシャドウィングにより 可視化し、そして全長の産生物のバンドをゲルから切除した。合成オリゴヌクレ オチドは０．３モルの酢酸ナトリウムｐＨ５，０中で溶離し、そして２体積の１ ００％のエタノールの添加により沈澱させ、−２０℃に冷却し、そして１４，０ ００％ｇで遠心した。ＤＮＡのベレットを真空乾燥し、モしてＴＥ緩衝液（１０ ミリモルのトリス−０１、ｐＨ７，４，１ミリモルのＥＤＴＡ）中に溶解した。 ホスフェート発育期を合成オリゴヌクレオチドの５′末端にＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼ［二ニー・イングランド・バイオラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｃｌ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュセッツ州ベベリイ］を使用して組み込んだ。１μｇ の量の精製したオリゴヌクレオチドを、７０ミリモルのトリス−ｃ＋　（ｐＨ７ ，６）、１０ミリモルのＤＴＴおよび１ミリモルのアデノシントリホスフェート （ＡＴＰ）から成るキナーゼ緩衝液中に溶解した。この溶液を２０単位のＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼとともに３０分間３７℃ｌ“；おいてインキュベーショ ンした。 相補的鎖のアニーリングは、キナーゼ化鎖を混合し、６０℃に１時間加熱し、そ して室温に冷却することによって達成した。アニーリングした鎖をｉ接結合手順 において使用した。 ６．４．ＤＮＡ断片中の平滑末端の生成結合のための平滑末端をつくため、制限 酵素を使用する消化から得られた５′オーバーハングをもつＤＮＡ末端を、ＤＮ ＡポリメラーゼＩの大きい断片（クレノー断片）の作用によりフィルドアウトす るか、あるいはヤニナリヌクレアーゼの作用により除去した。クレノー酵素を使 用するフィルドアウトのため、はぼ１μｇのＤＮＡを１単位の酵素で５０ミリモ ルのトリス−ＣＩ　（ｐＨ７，０）、１０ミリモルのＭｇ５Ｏ，，０，１ミリモ ルのジチオスレイトールおよび５０μｇ／ｍＱの血清アルブミンから成る２５μ ａの緩衝液中で処理した。１００μモルの最終濃度でデオキシヌクレオチドトリ ホスフェートの組み合わせ（ｃｌＧＴＰ。 ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰｌ　ｄＴＴＰ）を、まｔ二、含めた。ヤニナリヌクレアーゼ を使用する消化のため、はぼ１μｇのＤＮＡを１単位のヤユナリヌクレアーゼと ともに５０ミリモルの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）、３０ミリモルのＮａＣＩ および１ミリモルのＺｎ５Ｏ，から成る緩衝液中でインキュベーションした。イ ンキュベージタンは３０℃において０゜５〜１時間であり、そしてクレノー酵素 は二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ＋：ｌ　Ｂｉｏ ｌａｂｓ）（マサチュセソッ州ベベリイ）から入手した。 ６．５．ＤＮＡの結合 すべての結合はＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用して達成した。Ｔ４　ＤＮＡリガー ゼはＢＲＬ　（マリイランド州ベセスダ）、Ｕ、Ｓ、バイオケミカル９コーポレ ーシヨン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（オハイオ州タ レベランド）、またはベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（インジアナ州） から購入した。１単位（Ｕ）のＴ４ＤＮＡリガーゼは、０．１２μモル（３００ ｐ　ｇ／ｍＱ　）の５″−ＤＮＡ温度濃度において２０μＱの体積のりガーゼ緩 衝液において３０分でバタテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄＩＩｌ断片の ５０％の結合を生ずるために要求される量として定義される。ＤＮＡの結合は、 ５０ミリモルのトリス−ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０５９モルのＤＴＴ、および １ミリモルのＡＴＰから成るリガーゼ緩衝液中で実施した。通常、ＤＮＡの濃度 は２０〜３０　ｐ　ｇ／ｍａの範囲であった。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼはＩＵ／２ ０μｇの反応体積の比で添加した。インキュベーションは１８〜２４時間の間実 施した。使用した温度は粘着末端の結合のｔ；めに１５℃、および平滑末端の結 合のために２２°Ｃであった。十分な材料が入手可能であった場合、結合は反応 混合物の反応混合物の一部分をアガロースゲルの電気泳動により分析して検査し ｔ：。 ６．６．プラスミドＤＮＡの形質転換 クローニングまたは発現ベクターへのサーカムスボロゾイテ遺伝子（またはこの ような遺伝子配列に関係する合成オリゴヌクレオチド）の結合から生ずるプラス ミドの構成体を、Ｅ、ｃｏｌｉの普通の実験室菌株中に、形質転換技術により挿 入した（詳細については、参照、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ＋８．１９８２、 モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−＃　？　二、アル（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ）、Ｃｏ １ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｌ）−ルド・スプリン グ・ハーバ−、ニューヨーク）。プラスミドの構成体は分離し、そしてまずＥ。 ｃｏｌｉ中で特性決定し、次いでサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　ｌａ） 種へ転移した。なぜなら、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２の形質転換の頻度はＳ、ｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍのそれに関して高いからである。プラスミドはＳ、ｔｙｐｈ ｉｍｕｒｉｕｍ　ＬＴ−ｗ　ＬＢ５０１０中に転移させた。このＬＢ５０１０は 種々のサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　］　ａ）種牛に存在することが知 られている抵抗性系のいくつかを欠きそして、また、より高い形質転換の頻度を 生ずるｇａ　ＩＥ中に突然変異を含有する［ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の制限系の説明については、参照、Ｂｕｌｌａ ｓ　ａｔ　ａｌｌ、１９８０、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４１：２７５］　、 ＬＢ５０１０中に形質転換したプラスミドは、所望のＯＳタンパク質の構成体の 発現について特性決定しそして、制限酵素の分析により評価した後、プラスミド は弱毒化サルモイ・う属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉ　ａ）中に形質導入技術に より挿入した。所望のプラスミドを含有するＬＢ５０１０をルリアブロス（Ｌ　 Ｂ）中で３ＸＩＯ’細胞／ｍＱの密度に増殖させ、この時点において、Ｄ−ガラ クトース（１％の最終濃度に）増殖培地に添加して、リボ多糖（ＬＰＳ）の合成 を誘発させた。Ｄ−ガラクトースの存在下に１゜５時間増殖させた後、バタテリ オファージＰ２２２ＨＴ１０５／Ｉ　ｉｎｔを培養物に１の感染の多重度に添加 した。７アージの吸着後、細胞を０．７％の寒天を含有するＬＢ中で免疫化した 。ファージを収穫し、そして形質導入のファージＰ２２のだめの成分としてＬＰ Ｓを含有する弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中にプラスミドを形 質導入するために使用した。 ６．７．　疫優性ユピトーブの合成尾精製ＣＳタンパク質を有する生きている弱 毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍ。 ｎｅｌｌａ）と比較するとき、サブユニットのワクチンの抗原性または免疫原性 を実証するために、２つの合成ペプチド、すなわち、プラスモディウム・ベルブ ヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）からのサーカムスボロゾイテ（ ＣＳ）のタンパク質の２つの反復単位を表す１つ（ＤＰＡＰＰＮＡ；Ｄ−１６− Ｎ）および熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）からのＣＳの２反復単位を表す第２　［（ＮＡＮＰ）３］を、自動化ペプチド 合成装置［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ　ｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、）、４３０Ａ型］で固相方法により合成した。合成ペプチドは、また、Ｅ ＬＩＳＡアッセイにおいて捕捉抗原として働いた・ペプチド鎖は、特２りの有機 スペーサーのカルボキシ末端のアミノ酸をｒＰＡＭＪ　リンカ−として知られて いる特Ｍの有機スペーサーを通して取り付けられている、不溶性ポリスチレン樹 脂上で組み立てｆ：、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）で保護されたアミ ノ酸を、非プロトン性極性溶媒中で成長するペプチド鎖上の遊離アルファーアミ ノ発育期にカップリングした。樹脂支持体上の早期の鎖の停止およびペプチドの 自己凝集は、カップリング工程の間ジメチルホルムアミド中に溶解してペプチド 鎖を保持することによって最小にした。カップリング反応は、ペプチド樹脂上の 残留遊離アルファーアミノ発育期を測定する、定量的ニンヒドリン手順により監 視した。個々のｔ−ＢＯＣアミノ酸のすべての反応性側鎖を、ベンジルに基づく 保護基で保護した。 完結したペプチドを樹脂から切り放し、そしてすべての側鎖の保護基を無水フッ 化水素酸（ＨＦ）の処理により除去した。酸の切り放しおよび脱保護後、反応混 合物を無水ニーチルでより洗浄し、そして希酢酸中に溶解した。樹脂を濾過し、 そして水溶液を集め、そして凍結乾燥して粗製のペプチド調製物を調製した。 ＨＦの切り放しから得られたペプチドの均質性は、微小孔のＨＰＬＣ（高性能液 体クロマトグラフィー）系［アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１３０Ａ型分離系〕で逆相カラムを使用して評価した。 ＨＰＬＣ分析は単一の主要なピークを明らかにする場合、それ以上の精製は実施 しなかった。ＨＰＬＣのクロマトグラムがピークの混合を示した場合、調製用） ＴＰＬＣを実施してピークを分割した。精製した産生物をアミノ酸分析のための 酸加水分解にかけて、アミノ酸組成を評価した。合成ペプチドは、完全に自動化 されたオンラインのフェニルチオヒダントイン（ＰＨＴ）アナライザー（１２０ Ａ型）を装備したタンパク質配列決定装置［アプライド・バイオシステムス４７ ７Ａ２Ｑ］で自動化エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解により配列決定した。 合成ペプチドをグルタルアルデヒドの交差結合によりキーホールリンペットのヘ モシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａ　ｎ　ｉ　ｎ）（ ＫＬＨ）のカップリンブレ：、ＫＬＨｒカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） 、カリフォルニア州すンディエゴ１１．１モルの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９，６）に対して透析し、そして同一緩衝液中で１ｍｇ／ｍΩに調節した。ペプ チドは水または０．１モルの重炭酸ナトリウム緩衝液中で４ｍｇ／ｍＱにした。 等しい体積のタンパク質およびペプチド溶液を混合し、そして室温において１時 間回転した。 ４μΩのグルタルアルデヒドの２５％の水溶液を添加し、さらに２４時間回転し 、次いで他の２５μＱの２５％のグルタルアルデヒドを添加し、そして７２時間 室温において回転した。接合した物質をリン酸塩緩衝生理的塩類溶液に対して２ ４時間透析した。ペプチド−ＫＬＨ接合体を、前に記載されたようにＥＬＩＳＡ で試験した（Ｅｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：４ ５３）、最初に、板を異なる濃度の接合体で被覆し、そして適当なモノクローナ ル抗体とよく反応しＩ；濃度をすべての将来の実験において板を被覆するために 選択した。 ６．９．ポリアクリルアミドゲルの電気泳動タンパク質をポリアクリルアミドゲ ルの電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析するために、１ｍ＋２の培養物からの細胞 を洗浄し、そして１００μＱの溶菌緩衝液（０，２モルのトリス−ＨＣｌ、５％ のＳＤＳ、０．０２５％のブロモフェノールブルー、０．１〜１モルの２−メル カプトエタノール、および２０％のグリセロールを含有する）中に再懸濁し、モ して１００において５分間加熱した。大部分の分析をバイオ−ラドのミニ・プロ チアン・ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｉｎｉ　ＰｒｏｔｅａｎＧｅ　１）系（カリ フォルニア州しドモンド）を使用して実施した。ゲルは１．５ｍｍの厚さであり 、そして分離用ゲルは１５％のアクリルアミド、アクリルアミド対ビス−アクリ ルアミドの比は３０：０．８である、０．３７５モルのトリス−Ｈｃｌ　（ｐＨ ８，８）および０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有した。積み 重ねたゲルは４．８％のアクリルアミド、同一のアクリルアミド対ビス−アクリ ルアミドの比をもつ、１２５ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）および ０．１％のＳＤＳを含有しｔ；。 ｌＯ〜１５μｇの試料（５〜２０μｇのタンパク質を含有する）を各レーンに適 用した。電気泳動後、ゲルを少なくとも１時間０．１２５％のクーマツシー（Ｃ ｏ　ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）ブルーでエタノール：酢酸：水（５：　１　：　 ５）で染色し、次いで染料を含まない同一溶媒で脱色した。 染色前の低分子量の標準（オバルブミン、４３．０００　；アルファーキモトリ プシン、２５．０００；Ｂ−ラクトグロブリン、１８．４００；リゾチーム、１ ４．０００；ウシトリプシン阻害因子、６．２００；インスリン、２．３００お よび３．４００；　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓｓマリイランド州ガイサーバーグ、から入手した）を、また、電気泳動に かけて、観測されｔ；タンパク質の相対的分子量の決定を促進した。染色しない 非染色の二重反復のゲルをウェスタン分析のために使用した。 ６．１０．ウェスタン・プロットおよび等電点電気泳動分析ＰＡＧＥにより分離 された試料を、ヘファー・トランスファー（Ｈ。 ｅｆｆｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ）装置により０．４５ミリアンペアで９０分間２ ５ミリモルのトリス、３８５ミリモルのグリシン（ｐＨ８゜８）中の室温におい て、ニトロセルロース膜上に電気泳動的に移した。いったんタンパク質の転移が 完結したとき、ニトロセルロース膜をＢＬＯＴＴｏ（リン酸塩緩衝液中の５％の 非油脂ドライミルク）３７℃において１時間中でソーキングした。膜を削具て決 定しＩ；濃度のＰ、ｂｅｒｇｈｅｉまｔ；はＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｃｓタン パク質の反復領域に対するモノクローナル抗体で１時間３７℃においてプロービ ングし、モしてＢＬＯＴＴＯで３７℃において２０分間洗浄した。結合した抗体 は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス１ｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａ ａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙｓマリイランド州）とともに１時間３７℃において ｌ：２５０希釈でインキュベーションして検出した。プロットをＰＢＳで３回洗 浄し、そしてメタノール中の０．０１％の過酸化水素、０．０６％の４−クロロ −１−ナフトール［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌＣｏ、）、ミゾリー州］を含有するＰＢＳで２０分間室温において展開した 。反応をフィルターを蒸留水に移して停止した。フィルターをプロッティングに より乾燥した。 ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の等電点電気泳動のｔ；めに、はぼ１０ 〜５０μｇの合計の細胞タンパク質をゲルに適用した。増殖の対数期のバクテリ アを収穫し、それらを遠心により５０倍に濃縮し、そして１ミリモルのＥＤＴＡ および２０μｇのリゾチー”を含有する〜　０・５ｍＱの１０ミリモルのトリス −ＭＣＩ、ｐＨ８，０、中に再懸濁ことによって、ｍａの抽出物を調製した。リ ゾチームで消化した後、抽出物を超音波処理した。細胞および細胞の破片を１２ ，０００Ｘｇにおける遠心により除去し、そして１０〜５０μＱの体積で上澄み 液の試料を、１０％ｖ　／　ｖのグリセロール、２％の担体面性電解質（ｐＨ３ 〜１０）および０．００１％のメチルレッドから成る試料緩衝液中の等電点電気 泳動に適用した。電気泳動ゲルは、２％の両性電解質Ｃ（ｐＨ３〜１０；Ｂｉｏ Ｒａｄ１カリフォルニア州リッチモンド、から購入した。タンパク質の電気泳動 は、２０００Ｖにおいて４〜５時間にわたり実施した。 電気泳動したタンパク質をニトロセルロースに電気プロッティングにより移し、 次いでＣＳタンパク質の反復領域に対するモノクローナル抗体で、ウェスタン・ プロット技術について前述のしたように、可視化した。 ６．１１．　Ｅ、ｃｏｌｉ中のサーカムスポロゾイテのタンパク質のためのコロ ニープロットスフリーグ Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換体のコロニーを、クロロホルムの蒸気に２０分間暴露す ることによって、ニトロセルロースのフィルター上に保持された免疫優性ＣＳエ ピトープの発現についてスクリーニングした。０゜１５モルのＮａＣ１，５ｇの カルナチオン（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）インスタントドライミルク（ＢＬＯＴＴＯ ）／１００ｍＱの溶液、ｌｐｇの沸騰したＲＮａｓｅ／ｍＩ２、ｌｐｇのＤＮ　 ａ　ｓ　ｅ　／ｍ１２　、および２００μｇの卵白リゾチーム／ｍＩ２を含有す る、５０ミリモルのトリス−Ｃ１、ｐＨ８，０，から成るブロッキング溶液中に ニトロセルロースのフィルターを浸漬することによって、溶菌したコロニーをニ トロセルロースのフィルターから洗浄除去した。フィルターをさらにＢＬＯＴＴ Ｏ中で洗浄し、そしてＰ、ｂｅｒｇｈｅｉの免疫優性反復エピトープを認識する ことができるモノクローナル抗体３．２８　（Ｅｇａｎ　ｅｔ　ａｔ、、１９８ ７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：４５３）、あるいはＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの 反復エピトープと反応する、２またはそれ以上のモノクローナル抗体、ｍＡＢ　 ４Ｄ９．ＩＦまたはｍＡＢ　５６５の混合物（Ｄａｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ ４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：’５９３）を１０〜］ＯＯｎｇ／ｒｒＪのブロッ キング溶液の濃度に添加した。フィルターを１時間３７℃においてインキュベー ションし、次いでＢＬＯＴＴＯ中で洗浄した。結合した抗体をウサギ抗マウスＩ ｇＧ抗体の添加およびさらに１時間３７℃においてインキュベーションして増幅 した。セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングしたヤギ抗ウサギＩｇＧ とのインキュベーションにより、シグナルを発生した。セイヨウワサビペルオキ シダーゼは、０．０６％の４−クロロ−１−ナフトール（Ｗ　／Ｖ）および０． １５％の過酸化水素（Ｖ／Ｖ）の存在下の反応により、可視化した。 ６゜１２．　血清抗Ｃ５および抗ＬＴ−Ｂ抗体についての酵素結合免疫不存在ア ッセイ 血清抗体を測定するために、９６ウエルのポリプロピレン板（ＮＵＮＣ，）をｌ ｐｇ／ｍＱのＬＴ−Ｂまたは５ｐｇ／ｍＱのＤ−１６−Ｂ−ＫＬＨ，すなわち、 グルタルアルデヒドの交差結合によりＫＬＨにカップリングしたプラスモディウ ム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｊｕｍｂｅ　ｒｇｈｅ　＋）の２つの反復単位 を表す合成ペプチド、で被覆した。 各ウェルに０．１モルの炭酸塩／重炭酸塩の緩衝液（ｐＨ９−６）中の０１ｍＱ の抗原を与えた。板を３７℃において湿潤インキュベーター内で１８時間インキ ュベーションした後、０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し 、そしてＰＢＳ中の０．１％のゼラチンで６０分間室温においてブロッキングし ｔ：。板をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、そして血清の系統的希釈物を添加し、そし て室温において９０分間インキュベーションした。ヤギ抗ＬＴ−ＢまプニはｍＡ Ｂ３．２８、またはｍＡＢ　４Ｄ９１ＦおよびｒｎＡＢ５６５のプールをアッセ イにおいて陽性の対照として使用した。板を前のように洗浄し、そして前厄て決 定した濃度のアルカリ性ホスファターゼ接合つサギ抗ヤギ免疫グロブリン（１： 　３０００血清希釈物；Ｔａｇｏ、カリフォルニア州バーリンゲイム）、および ヤギ抗マウス免疫グロブリン（１：　５０００血清希釈物；Ｔａｇｏ１カリフォ ルニア州バーリンゲイム）を適当なウェルに添加し、そして室温において６０分 間インキュベーションしｊ；。板を再び洗浄し、そして１００μａの基質の溶液 （ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ジェタノールアミン緩衝液中の１ｍｇ／ｍ Ｑ、ｐＨ９，６）を各ウェルに添加した。シグナルを６０分間室温において発生 させ、そしてパイオーテックス（Ｂｉｏ−Ｔｅｘ）自動化ＥＬＩ　ＳＡのリーダ ーで二重波長を使用して４１０ｎｍおよび６９０ｎｍにおいて、空気についてブ ランキングして読んだ。 ６．１３．生きているスポロゾイトを使用する方法の対抗プラスモディウム・ベ ルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）のスポロゾイトを、感染し た雌のアノ７エレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）力の唾液腺から得た。唾液腺を切除 し、そして１０％の正常マウス血清を補充した氷冷した組織培地Ｍ２Ｏ３中に集 めｔ；。腺をゆるい勘合ガラスグラインダーでおだやかに粉砕した。粉砕した腺 を５０Ｏｒｐｍでツルパル（Ｓｏｒｖａ　Ｉ　］）ＳＳ３４０−ター中で３分間 ４℃で遠心し、そして寄生虫を含有する懸濁を集めることによって、力の組織破 片からスポロゾイトを分離した。収率を最大とするため、抽出を２回反復した。 スポロゾイトの濃度は血球計中で計数することによって決定した。 最後のワクチン接種後７〜１４日に、動物を下位群に分割し、そして低い投与量 （５００）または高い投与量（２０００）のプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）のスポロゾイトで対抗した。対抗後第３ 日から出発して、マウスを毎日致死率についておよびギエムサ（Ｇｉｅｍｓａ） 染色血液の汚点（ｓｍｅａｒ）中の検出可能な寄生虫血症について検査した。す べての特許の感染は通常対抗後１０日に現れた。 ７、　実施例：プラスモディウム属（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍｏ　ｄ　ｉ　ｕｍ）サー Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスボロゾイテのタンパク質のカルボモジ末端部分 のほぼ７５％をエンコードする遺伝子は、グラスミドベクター　ｐ　ＬＩ　ＣＳ 中で１１４０塩基対のＥｃｏＲＴ＊Ｊ限断片として得？＝（ＶｅｌｒａＳ　Ｊ、 およびＭｅｓｓｉｎｇ％　Ｊ−１１９８２、Ｇｅｎｅ　１９：２５９）、断片の ＤＮＡ配列を前に決定されており（Ｗｅｇｅｒ　ｅｔ　ａ＋＋、１９８７、Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔ。 １．６３：２９５）、そして第１図に描写し、推定されたアミノ酸配列は第２図 に記載する。、第１図に示す配列に加えて、ＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩオリゴヌクレ オチドリンカーを最初のクローニングの間使用し、モしてＥｃｏＲ１制限断片内 に含有させる。このアダプターまたはリンカ−領域は、制限エンドヌクレアーゼ の切断のだめの制限部位からなるヌクレオチド配列を含有する。これらの制限酵 素の部位は、発現ベクター中への遺伝子配列のサブクローニングのための便利な 切断部位として使用することができる・アダプター領域の配列は示す通りである （アダプター配列には下線が引かれている）： サーカムスボロゾイテのタンパク質の遺伝子７−２．　ｌａｃオペロンの制御下 にＬＴ−Ｂを発現するプラスミドｐＰＸ１００の構成 プラスミドｐＪＣ２］７は成熟Ｅ、ｃｏｌｉ腸毒素サブユニットＢ１ＬＴ−Ｂ、 の１００アミノ酸をエンコードしそして、また、成熟分子から培養された２０ア ミノ酸のアミン末端のシグナル配列をエンコードする。腸毒素発生のＥ、ｃｏｌ ｉ　Ｈ１０４０７のゲノム断片からの、はぼ８００塩基対の］　ｔ　ｂＤＮＡ　 （第３図に示す配列）を、プラスミドベクター＄）ＵＣ８のＢｉｎｄｌ１１部位 中に挿入することによって、プラスミドｐＪｃ２１７を得た。 ＬＴ−Ｂの種々の領域とのｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスポロゾイテのタンパ ク質の融合をつくることができる、発現ベクターを得るために、プラスミドｐＪ ｃ２１７を修飾してｐＵＣ８のポリリンカー領域に関連する外因性制＠部位を欠 失した。ｐＪｃ２１７を制限酵素Ｒｓａｌで消化し、そして反応産生物を再結合 することによって、ポリリンカー領域の制限部位を特定するＤＮＡを含む１８０ 塩基対のＤＮＡを欠失させて、プラスミドベクターｐＰＸｌｏｏを得た（第４図 ）。この形状において、ＬＴ−ＢをＥ、ｃｏｌｉのｌａｃオペロンプロモーター により制御する。プラスミドを適当なバクテリアの宿主、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ 　ＪＭ１０３（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４、Ｉｎｆｅｃ、ｒｍ ｍｕｎ、４６：５６４）中に転移させた後、ＬＴ−Ｂの転写は組み換えバクテリ アの増殖培地中にイソプロピルチオ−ベーター〇−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を 含めることによって誘発することができる。 ＬＴ−ＢのＤＮＡ配列は第３図に描写されている；融合タンパク質分子の発生に おいて有用な制限酵素を示す。 ７．３．　ベーターガラクトシダーゼとの融合タンパク質として、Ｅ、ｃｏｌｉ 中のｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスポロゾイテのタンパク質の発現 Ｅ、ｃｏｌｉ中でサーカムスポロゾイテのタンパク質で発現させるために、１． １キロ塩基対のＥｃｏＲＩ　Ｃ５断片を含有するプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ’８をＮ ｒｕ　１またはＸｍｎ　＋でこれらの酵素について標準の条件下に消化した。６ ７０塩基対のＸｍｎＴ断片を１％のアガロースゲルを通す電気泳動により精製し 、モしてＮＡ４５紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｎｅｌｌ、ニューハ ンプシャイヤー州キーネ）上への電気泳動によりアガロースから溶離した。１モ ルのＮａＣ１および５ミリモルのＥＤＴＡを含有する、２５０μＱの体積の１０ ミリモルのトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８，０、中で紙をインキュベーションする ことによって、ＤＮＡ断片をＮＡ４５紙から溶離した。ＤＮＡをＮａＣ１緩衝液 から２体積のエタノールの添加により沈澱させ、そしてＤＮＡのペレットを１２ ，０００Ｘｇで５分間４°Ｃにおいて遠心することによって得た。 １．１キロ塩基対のＮｒｕｌ断片を同一方法で精製しｌ；。Ｘｍｎ１およびＮｒ ｕ　ＩのＤＮＡ断片の各々を、はぼｌｐｇ／＊４の最終濃度を生ずるように十分 な体積の１０ミリモルのＥＤＴＡを含有するｌＯミリモルのトリス塩酸塩中に再 び溶解した。プラスミドのベクターｐＵｃ８をＨｉｎｃｌｌで消化し、そして精 製したＸｍｎ　ＩまたはＮｒｕ　Ｔ断片を混合し、そしてＤＮＡの末端をＴ４　 ＤＮＡリガーゼで接合した。結合産生物をＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３中に形質転 換し、アンピシリンに対する抵抗性について選択した。 ７．３．１．　サーカムスポロゾイテのタンパク質の反復二ピトープを発現する 形質転換体のコロニーの検出Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ　Ｃ３の免疫優性反復エピトー プを認識する抗体を、１ミリモルのＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天板にコロニーを 移して１ａＣオペロンの発現の誘発後、節６．１１に記載されているコロニープ ロット方法により検出した。 １．１キロ塩基対のＮｒｕｌ　Ｃ３断片または６７０塩基対のＸｍｎＩ　Ｃ３断 片の存在下にＨｉｎｃｌｌにより制限されたｐＵＣ８の再結合から生ずるプラス ミドで、前述したように、形質転換した後、生ずる形質転換体のほぼ１０％は、 ｍＡＢ３．２８と反応させたとき、有意の色の発生を実証した。各結合からの反 応性コロニーのうちで、いくつかの候補を保持し、そしてさらに分析した。各候 補のコロニーから分離したプラスミドを、制限酵素の分析にかけて特徴ある切断 部位の存在を確証した。プラスミドｐＰＸ１５１２はｐＵＣ８のポリリンカー領 域によりエンコードされる最初の１７のアミノ酸とインフレームの６７０塩基対 のＸｍｎＴ断片から生じ、そしてｐＵＣ８ベクター中でエンコードされた。ｌａ ｃアルファペプチドと呼ぶ、ベーターガラクトシダーゼの次の６８アミノ酸を通 してｘｍｎＩ断片のＤＮＡによりエンフードされＩ；、２２３アミノ酸を通して インフレームで読む。プラスミドｐＰＸ１５１４はｐＵＣ８中のＨｐａ１１部位 中への１．１キロ塩基対のＮｒｕ　Ｉ断片の結合から生じ、モして２７２アミノ 酸のサーカムスポロゾイテのタンパク質へのポリリンカー領域の最初の１７アミ ノ酸の融合を含有する。 ｐＰＸ１５１４の翻訳されｌ；タンパク質は、サーカムスポロゾイテのタンパク 質の配列中に供給された翻訳停止コドンＴＡＡで停止する。 ７．４．　担体のポリペプチドのＬＴ−ＢへのＰ、ｂｅｒｇｈｅｉサーカムスポ ロゾイテのタンパク質の融合Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスボロゾイテ遺伝子 を、Ｅ、ｃｏｌｉの腸毒素のＢサブユニットの遺伝子、ＬＴ−Ｂ、に、遺伝子配 列内の３つの別の位置において結合した。第５６図および第６図に線区的に示さ れているように、ｐＰＸｌｏｏを３つの別の制限酵素で標準により切断し、そし て生ずる粘着末端を修飾して、サーカムスボロゾイテ遺伝子の反復領域を含有す るＸｍｎ１またはＮｙｕ　Ｉ断片の平滑末端の結合はｐＰＸ１００中に含有され るＬＴ−Ｂ遺伝子の領域とのＣ５遺伝子のインフレーに融合を生ずるであろう。 第１に、ｐＰＸｌｏｏをＣ１ａｌで切断し、そして粘着末端をＤＮＡポリメラー ゼＩのクレノー断片の作用によりｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの存在下に「フィルド アウト」した。６７０塩基対のＸｍｎ１のＣ５断片を修飾しｔ：ｃ］ａＬ部位に 結合し、ＬＴ−Ｂ融合タンパク質が生じた。このタンパク質は、ｐＰＸ１５１５ 中にエンフードされると、Ｃ８遺伝子の２２３アミノ酸へ融合した成熱ＬＴ−Ｂ の最初のアミノ酸、および引き続＜Ｃ］ａＴ部位から下流のＬＴ−Ｂ　ＤＮＡか ら誘導された２８アミノ酸のアウトーオブーフレームのリードスルーからなる。 １．１キロ塩基対のＮｒｕ　Ｔ断片を修飾゛されたＣｌａｌ部位に結合するとき 、成熟ＬＴ−Ｂの最初の３０アミノ酸がｃｓ遺伝子の２７２アミノ酸と融合し、 Ｃ８遺伝子の停止コドンで翻訳停止している、タンパク質が生じた。 等しく、ｐＰＸｌｏｏをＸｍｎ　Ｉで消化し、そしてさらにヤニナリヌクレアー ゼで処理すると、アウトハンギング５′末端を除去した。１゜１キロ塩基対のＮ ｒｕｌＣＳ断片をこの修飾した部位に結合して、プラスミドｐＰＸ１５２３を産 生した。生ずる融合タンパク質はＣ５遺伝子の２２３アミノ酸に結合した成熟Ｌ Ｔ−Ｂの６０アミノ酸、および引き統＜ＬＴ−Ｂ　ＤＮＡから誘導された４アミ ノ酸のアウトーオブーフレームのリードスルーを含有した。タンパク質配列を成 熟ＬＴ−Ｂカルボキシ末端に融合するために、ｐＰＸｌｏｏを制限酵素Ｓｐｅ　 Ｔで消化した。生ずる粘着末端をｄＣＴＰの存在下にＤＮＡポリメラーゼＩのク レノー酵素の作用により部分的に充填し、そして残りのオーバーハングをヤエナ リヌクレアーゼで消化した。１．１キロ塩基対のＮｒｕ　Ｉまたは６７０塩基対 のＸｍｎ　ＩのＣ５断片の平滑末端の結合は、第６図に描写する融合タンパク質 を生じた。プラスミドｐＰＸ１５２５は、成熟ＬＴ−Ｂの１００アミノ酸がＣＳ タンパク質の２２３アミノ酸に結合し、引キ続いてＬＴ−Ｂクローン中に存在す るＤＮＡから誘導された、リード−アウト−７レームされた４０アミノ酸（ＬＴ −Ｂの解読配列の外側）が存在するＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質をエンコード する。 ７．５．　高いレベルのＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質を得るｔユめの転写プロ モーターおよび翻訳開始シグナルの操作ＬＴ−Ｂ　ＣＳ融合タンパク質の増加し た発現は、融合した遺伝子配列をＥ、ｃｏｌｉ中でよく機能することが知られて いる２つの強いプロモーターのいずれからも直ぐ下流に挿入することによって得 た。ｔａｃプロモーターはｔｒｐオペロンプロモーターの−３５領域ヲＵＶ５　 ］　ａＣプロモーターの一１０領域と融合して生ずる（ＤｅＢｏｅ　ｒｓ　Ｈ。 ｅｔａ、１．．１９８２、プロモーターの構造および機能（Ｐｒｏｍ。 ｔｅｒ　５ｔｒａｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｄｒｉｇｕｅ ｚ、Ｒ，Ｌ−およびＣｈａｍｂｅ　ｒ　ｌ　ａ　ｉ　ｎ、　Ｍ、　Ｊ、　ｔｌＡ 、　Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク）。ｔａｃプロモー ターは１ａｃＩ遺伝子産生物、すなわち、ＤＮＡのＩａｃ領域に結合しかつＲＮ Ａポリメラーゼによる転写を阻害するリプレッサー、により制御される。Ｉａｃ ｌ遺伝子産生物の不存在下に、遺伝子の発現はバクテリアの増殖培地中に存在す るＩＰＴＧにより誘発することができる。 コリ７アージラムダのＰＬプロモーターは、その自然宿主、Ｅ、ｃｏｌｉ中のウ ィルスの溶菌増殖の間にｍＲＮＡの左側の転写を制御する（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ 、Ｈ−およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、　、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９２： １２８）、ＰＬプロモーターはｃＩ遺伝子のりブレッサータンパク質による溶原 化の間に抑制される。ｔａｃプロモーターまたはＰＬプロモーターを使用して、 密接の関係する腸の宿主バクテリア、例えば、サルモ不う属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ 　ｌ　ｌ　ａ）種牛の遺伝子の転写を推進するとき、遺伝子の転写は適当なリプ レッサーの機能がまた導入されないかぎり構成的である。遺伝子の転写は、プロ モーター配列から下流のＤＮＡによりエンコードされるタンパク質の構成的合成 を生ずる。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の宿主中の抗原タンパク質 、例えば、節７，４に記載されているＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質の合成は、 弱毒化バクテリアが動物宿主内で、実験の試験動物、例えば、マウスまたはヒト において、複製することができる間、抗原の分子の一定の発現を生ずる。内因性 バクテリアの宿主タンパク質に関する特゛定のタンパク質合成の高いレベルは、 組み換えＤＮＡ誘導タンパク質に対する宿主の免疫応答に好適である。　゛サル モネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種牛で発現される同等のタンパク質の合成の 増加を実証するために、第６図中に線図的に示されているＬＴ−Ｂ／Ｃ３融合タ ンパク質の族の各々をｔａＣプロモーター（第７図）またはＰ、プロモーター（ 第８図）からの直ぐ下流に挿入した。 ＬＴ−Ｂから誘導された翻訳開始シグナルは、ＬＴ−Ｂ／Ｃ９融合タンパク質を エンコードするＥｃｏＲＴ−ＨｉｎｄＴ　ＩＩ断片内に保持され、そしてリポソ ーム結合部位（Ｓ／Ｄ配列）および遺伝子配列の５′末端においてＬＴ−Ｂの翻 訳開始コドンを包含する（第６図）。プラスミドベクターｐＫＫ２２３　［ファ ーマシア・モレキュラー・バイオロジカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳ）％ニュージャーシイ州ビス力タウエイ〕は ｔａＣプロモーターを含有するが、プロモーターから下流に適当な翻訳開始配列 を欠く。プラスミドｐＫＫ２２３を制限酵素ＥｃｏＲＴおよびＨｉｎｄｌｌｌで 消化した。プラスミドベクターの断片をアガロースの電気泳動により精製し、そ してｐＰＸ１５１５、ｐＰＸ１５２３、またはｐＰＸ１５２５から誘導された精 製されたＥＣ０ＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限断片に結合した。 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３中で得られた形質転換体を、１ミリモルのＩＰＴＧを 含有するＬＢ寒天にバクテリアのコロニーを移した後、特定の抗ＣＳモノクロー ナル抗体、ｍＡＢ３．２８に対して反応性のタンパク質の産生についてスクリー ニングした。反応性のコロニーを精製し、そしてそれらから分離しｆ：　Ｄ　Ｎ 　Ａをさらに制限酵素の分析によりスクリーニングした。期待する制限パターン を示すコロニーを保持した。第７図において線図的に示すように、プラスミドｐ ＰＸ１５２８はこの方法で得られた。 コリファージラムダのＰＬプロモーターにより制御される融合タンパク質の同等 の族を発現させるために、ｐＰＸ１５１５、ｐＰＸ１５２３およびｐＰＸ１５２ ５から誘導されたＥｃｏＲｌ−Ｈ４ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限断片をｄＡＴＰ、ｄＴ ＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの存在下にＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断 片で処理して、断片の両者のＥｃｏＲＩ末端およびＨ４ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ末端に おいて平滑末端をつくり！；（第８図）、。 平滑末端をプラスミドベクター１）Ｐ’Ｌ−ラムダ（）７−マシア）のＨｐａ１ 部位に結合することによって、プラスミドｐＰＬプロモーターにより制御された 融合タンパク質をエンコードする１系列のプラスミドをＥ。 ｃｏｌｉ　Ｎ９９　ｃｌ”の形質転換により得た。ｐＰＸ１６０１をｐＰＸ１５ １５の断片から誘導し、発現ベクターＰＬ−ラムダ（第８図）。 形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ中で独特制限断片の存在についてスクリーニングしｔ ；。次いで、適当な候補を、温度感受性のリプレッサーアレル、ｃ　Ｉ　８５７ を収容する欠陥のあるバクテリオファージラムダについて溶原性である、）：、 ｅｏｌｉ菌株Ｎ４８３０中に形質転換した。このＥ。 （ｏｌｉ宿主菌株において、ラムダＰ、ズＣモーターにより制御される遺伝子を 増殖培地の温度を３２℃から４２℃に切り替えることによって誘発可能である。 第８図に描写するように、この立体配置において、翻訳開始シグナルはＳ／Ｄ配 列により供給され、そして翻訳開始コドン（ＡＴＧ）はＬＴ−Ｂから誘導される 。このベクターは、また、その転写がＰ、プロモーターにより制御される、バク テリオファージラムダＮ４８３０遺伝子の部分をエンコードする。Ｈｉｎｃ１部 位中にＬ　Ｔ　−Ｂ／Ｃ５融合タンパク質の平滑末端のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ ｌｌ断片を挿入することによって、Ｎ遺伝子は第８図に示すようにＳ／Ｄ配列の 直後に７．６．　サーカムスポロゾイテのタンパク質をエンコードする遺伝子の ラムダＰＬプロモーターからの翻訳を促進する発現ベクターの構成 ｐＬ、／ｅ＋モーターから下流の適当な翻訳開始シグナルを提供するために、Ｉ ）ＰＬラムダの）（ｐａｌｓｉＥ位中に挿入すべきオリゴヌクレオチドを設計し た。このオリゴヌクレオチドは５３塩基対から成る；センス鎖は第９図中に線図 的に示されている。Ｎ遺伝子の翻訳がＳ／Ｄ配列から直ぐ上流のＴＡＡにおいて 停止するように、合成オリゴヌクレオチドを設計した。さらに、Ｓ／Ｄ配列を囲 むＫｐｎ　ＩＳよびＮｒｕ　１部位の存在は、Ｓ／Ｄ配列付近の塩基配列をラン ダム化しかつ翻訳効率を増加するための、短い合成オリゴヌクレオチドの円滑な 挿入を可能とする。さらに、オリゴヌクレオチドは３つの制限部位、すなわち、 Ｎｃｏｌ、５ｔｕ１、およびＥｃｏＲＶを特定し、これらはすべての３つのリー ディング７レーム中の異種配列の挿入を可能とする。′Ｎｃ０１部位は要求され るＡＴＧ開始コドンを包含し、このコドンは粘着Ｎｃｏｌ末端をクレノー酵素で すべての４つのデオキシヌクレオチドの存在下にフィリングアウトすることによ って平滑末端として供給される。そのうえ、この配列はすべての３つのリーディ ングフレーム中の停止コドンをエンコードするので、融合タンパク質のｌ；めの 予測可能な末端が得られる。 ベクターｐＰＸ１６００をＣＮｃｏｌで処理し、そして粘着末端をクレノー酵素 でフィリングアウトした後）Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ　ＣＳタンパク質反復エピトー プおよび領域Ｉおよび１１をエンコードする、６７０塩基対のＸｍｎ　Ｉ断片に 結合ことによって、プラスミドｐＰＸ１５２９を得た（第１０図）、さらに、６ ７０塩基対のＸｍｎ　ＩをＮｒｉ＋１で処理し、次いで生ずるＩ）ＮＡ断片を精 製しそしてｐＰＸ１６００の充填したＮｃｏ１部位中に結合することによって、 適切なＰ、ｂｅｒｇｈｅｉ　Ｃ５ＤＮＡ配列から誘導された、アルギニンのコド ン（ＣＧＡ）がアミノ末端メチオニンに直接融合されているプラスミド（ｐ　Ｐ Ｘ　１５３１）が得られた。こうして、ｎｉｎメチオニン以外の、リンカ−ＤＮ Ａの翻訳から生ずる外来のアミノ酸は得られなかった。７アミノ酸のカルボキシ 末端の付加はこの方法で得られ、ｐＰＸ１６００の合成インサートから誘導され たコドンの翻訳から生じた。 ７．７．　Ｐ’、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのエピトープ のｐＰＸ１６００発現ベクター中の挿入語書類のマラリア寄生虫Ｐ、ｂｅｒｇｈ ｅｉまたはヒトのマラリア寄生虫Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣ８反復領域を適 当に高いレベルでＥ。 ｃｏｌｉおよびサルモ不う属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）種牛で発現するた めに、合成相補的オリゴヌクレオナトの鎖を第１１図に線図的に示すように設計 した。Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの反復領域をエンコードするオリゴヌクレオチ ドは、４回反復したフンセンサス配列ＡＳＮ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＰＲＯ（ＮＡＮ Ｐ）に基づいた。さらに、非対称ＨｉｎｆＩ粘着末端が各末端に形成されるよう に、オリゴヌクレオチド設計した。 アニーリングした相補釣鐘をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼお゛よびＴ４ＤＮＡ リガーゼで処理することによって、反復したエピトープの頭尾重合が達成された 。生ずる単一のＨｉｎｃＬ粘着末端から平滑末端をつくりそして断片をｐＰＸ１ ６００の平滑末端のＮｃｏ１部位中に結合すると、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの 反復エピトープを含有するｌ系列のＥ−ｃｏｌｉ菌株Ｎ９９　ｃＴ”″が生じｆ ；、（Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉのこの菌株はｃｌ”温度不感受性野生型ラムダリプレ ッサーを発現し、そしてバクテリオファージラムダに対して溶原性である。）形 質転換体を適当な制限酵素でスクリーニングすることによって、ＰＬプロモータ ーに関して正しい向きでＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのオリゴヌクレオチドの１　 （モノマー）〜４（テトラマー）コピーが得られた。これらのプラスミドをＥ、 ｃｏｌｉ発現宿主Ｎ４８３０　（ｃ１８５７）中に形質転換し、ここで温度のシ フトにより誘発されたエピトープの発現はコロニープロット分析およびウェスタ ン・プロット分析により確証された。 同時に、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ：＋ンセンサスオクタペプチドのエピトープの２つ の反復をエンコードするオリゴヌクレオチド（Ａ　Ｓ　Ｐ　Ｐ　Ｒ０ＡＬＡ　Ｐ ＲＯＰＲＯＡＳＮ　ＡＬＡ　ＡＳＮ；ＤＰＡＰＰＮＡ４ポリヌクレオチドキナー ゼおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼで処理後結合するとき起こることができるように 、２つの相補釣鐘を設計した。結合したオリゴヌクレオチドをクレノー酵素でデ オキシヌクレオチドの存在下に処理し、そして断片の生ずる平滑末端の族をｐＰ Ｘ１６００のフィリングアウトしたＮｃｏＩ部位に結合した。形質転換体のコロ ニーをＥ。 ｃｏｌｉ　Ｎ９９（ｃｌつ中で選択し、そして制限酵素の消化により分析した。 モノマー〜テトラヤーを分離し、そして形質転換後Ｅ、ｃ。 １１発現宿主Ｎ４８３０中に誘発についてプラスミドをスクリーニングすること によって免疫優性エピトープの発現についてさらに特性決定しｌこ。 推定の１６アミノ酸のシグナル配列をエンコードする配列のみを欠く全長のクロ ーンからＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＣＳタンパク質遺伝子を発現するために、 ５ｔｕｌ−Ｒｓａｌ　ＤＮＡ断片をプラスミドｐＰＸ１６００中に直接クローニ ングした。デイム（Ｄａｍｅ）らのデータ（１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ　２２５ ：５９３）を使用して、制限断片内のＣＳタンパク質のリーディングフレームを 確立しかつｐＰＸ１６００の５ｔｕ１部位中に挿入された遺伝子の発現を予測し た。この立体的配置において、会長の成熟遺伝子をベクターのＰＬプロモーター から発現し、そして開始ＡＴＧ　（メチオニン）はベクターのそれである。生ず るプラスミドをｐＰＸＩ５３４と命名し、そして第１２図に線図的に示す。 ７．８．　合成オリゴヌクレオチド反復配列の挿入による、ＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合 タンパク質を発現するベクターの構成ＬＴ−Ｂ配列の部分へのＰ、ｆａｌｃｉｐ ａｒｕｍまたはＰ、ｂｅｒｇｌｌｅｉ免疫優性ＯＳエピトープの融合をエンコー ドするプラスミドベクターを構成するために、そのエピトープをエンコードする 合成オリゴヌクレオチドを（リセスド３″末端のフィリングアウト後）ｐＰＸｌ ｏｏのＣｌａｌ部位中に結合した（第４図）。ＣｌａＴ部位はクレノー酵素の作 用によりフィリングアウトして、ＣＳタンパク質のリーディングフレームを維持 しｔ；口とくに、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの反復エピトープを包含するように 設計したオリゴヌクレオチドを下にしめし、翻訳アミノ酸配列はその下に存在す る： ５’、、、ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＡＡＣＧＣＴ　ＡＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＣＴ　ＡＡ ＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＣＴ３’、、、　ＧＣＣＴＴＧ　ＣＧＡ　ＴＴＧ　ＧＧＣＴ ＴＧ　ＣＧＡ　ＴＴＧ　ＧＧＣＴＴＣＣＧＡＡｓｐ　Ｐｒｏ　［Ａｓｎ　Ａｌａ 　Ａｓｎ　Ｐｒｏｌ［Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏｌ［Ａｓｎ　ＡｌａＡＡ ＣＣＣＧ　ＡＡＣ０７丁　、、、３’ＴＴＧ　ＧＧＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ、 、’、５’Ａｓｎ　Ｐｒｏｌ［Ａｓｎ　Ｖａｌ コノ配列はコンセンサステトラペプチド（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏｌの ３つの反復を包含する。粘着末端をもつこの二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ク レノー酵素により平滑末端とし、そしてｐＰＸｌｏｏのＣｌ　ａ　ト部位中に結 合してプラスミドｐＰＸ１５３２を生成し、ここで２つの４８マーのオリゴヌク レオチド単位はＬＴ−Ｂの最初の３０アミノ酸とインフレームで、引き続いてＬ Ｔ−Ｂ配列から誘導された２８アミノ酸のアウトーオブーフレームのリーディン グでクローニングされていた。組み換えクローンを分離し、そしてプラスミドの ＤＮＡをＥ・ｃｏｌｉ　３Ｍ１０３中で特性決定しｔ；。 ７．９．　Ｅ、ｃｏｌｉ中およびサルモ坏う属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種牛の サーカムスボロゾイテのタンパク質のエピトープの発現 前述のようにプラスミドを設計して、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたはＰ、ｂｅ ｒｇｈｅｉのサーカムスボロゾイテのエピトープの変異型を発現した。ここに記 載されているようにこれらのタンパク質またはこれらのタンパク質の一部分の発 現は、機能することが知られているいくつかの異なるプロモーター系により制御 されかつＥ、ｃｏｌｉ中の遺伝子の発現を推進するように設計した。それ自体、 プラスミドの構成体はまず分離し、そしてＥ、ｃｏｌｉの商業的に入手可能な実 験室の菌株中で試験した。このような菌株の例は、次のとおりである：ＪＭ１０ ３、これは、ｌａｃプロモーターおよびリプレッサーにより制御される遺伝子の 発現の制御の研究に適当である、およびＮ９９（ｃｌつおよびＮ４８３０　（ｃ １８５７）、これらはＰ１プロモーターにより制御される遺伝子の発現の検査の あための適当なＥ、ｃｏｌｉ宿主である。遺伝子産生物の過度の発現はバクテリ ア細胞の増殖へを害な作用をしばしば及ぼすので、遺伝子の発現の制御は所望の 発現プラスミド構成体を得るとき重要であることがある。 所望のプラスミドが適当なをエンコードする宿主中で得られた後、Ｃ８遺伝子の 変異型を有するプラスミドをサルモネラ属（９ａ］ｍｏｎｅｌｅａ）の異なる種 牛に移した。発現プラスミドを腸炎菌（Ｓａｌｍ。 ｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）血清型ｄｕｂｌｉｎ（普通にＳ。 ｄｕｂｌｉｎとして知られている）ＳＬ１４３８　（ＡＴＣＣ受は入れ番号３９ １８４）、Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　５Ｌ３２６１）％または５−ｔｙｐｈ ｉ　Ｔｙ５２３または５４１中に転移させた。［チフス薗（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ　ｔｙｐｈｉ）菌株ＳＬ］４７９、ＡＴＣＣ受は入れ番号３９１８３、および Ｓ、ｔｙｐｈｉ菌株５３１、ＡＴＣＣ受は入れ番号３９９２６は使用に入手容易 な他の菌株である。）弱毒化したマウスのビルレント菌株５Ｌ１４３８および５ Ｌ３２６１はａｒ。 Ａ遺伝子の染色体の欠失を有する（Ｈｏｒｓｅ　ｔｈｓ　Ｓ、に、および５ｔｏ ｃｋｅｒｓＢ、Ａ、Ｄ、ｅ１９８１ｓＮａｔｕｒｅ　２９１：２３８）。弱毒化 Ｓ、ｔｙｐｈｉ菌株Ｔｙ５２３はａｒｏＡ遺伝子の染色体の欠失を有し、そして Ｔｙ５４１はｐυｒＡ遺伝子追加の欠失を有する。 選択したプロモーターが３つのサルモネラ属（Ｓａ、Ｉｍｏｎｅｌ　ｌａ）菌株 の各々中で機能するかどうかを決定するために、プラスミドｐＰＸ１５１５、ｐ ＰＸ１５２８、およびｐＰＸ１６０１をＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬＴ−２、 菌株ＬＢ５０１０（非制限性の形質転換可能な突然変異体）中に形質転換し、こ れらからＰ２２７アージのリゼイト（Ｓｃｈｍｅｉｇｅｒｓ　１９７２、Ｍｏ１ ．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１Ｌニア５）をプラスミドの各々をサルモ坏う 属（Ｓａ　］ｍ＋：＋ｎｅ　ｌ　ｌａ）の所望の菌株中に形質導入するために得 た。ＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質の発現は、バクテリアの培養物の各々中で節 ６．１０のウェスタン技術的により検査した。第１５図ｔ：示すように、各プロ モーターにより制御される融合タンパク質の発現は宿主サルモネラ属（Ｓａｌｍ 。 ｎｅｌｌａ）の菌株の各々において得られた。第１５図が示すように、Ｉａｃプ ロモーター、ｔａｃプロモーター、またはラムダＰＬプロモーターにより制御さ れる、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ　ＣＳタンパク質配列を含有するＬＴ−Ｂ／ＣＳ融合 タンパク質の発現は、３つのサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１１ａ）菌株の 各々において観測され？：：５Ｌ３２６１．５Ｌ１４３８およびＴｙ５２３ｅ さらに、成熟ＬＴ−Ｂタンパク質の最初の３０アミノ酸へ融合したＰ。 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＣＳタンパク質の反復エピトープの発現は実証されｔ； （第１６図）。サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　ｌａ）菌株５Ｌ３２６１ ．５Ｌ１４３８おＪ：びＴｙ５２３、ｐＰＸ１５３２を有する、の細胞抽出物を 、ｄｓｅｃ６．１０に記載されているように等電点電気泳動により分析した。Ｐ 、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのエピトープは、菌株の各々において、節６．ｌＯに記 載されているように抗ＣＳタンパク質モノクローナル抗体の結合により発現され たことが示された。 ８、　実施例：ＣＳタンパク質を発現する弱毒化組み換えサルモ不う属（Ｓａ　 Ｉｍｏｎｅ　１１　ａ）によるワクチン接種節７．９において実証するように、 Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたはＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのサーカムスポロゾイテの タンパク質は、Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ、Ｓ、ｔｙｐｈｉおよびＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍを包含する、いくつかの異なるサルモ洋う属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　ｌ ａ）種牛に有意のレベルで発現することができる。ｌａｃ、ｔａｃおよびＰ、プ ロモーターの各々はＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タンパク質またはＣＳタンパク質の一部 分の発現を推進することができる。合成オリゴヌクレオチドによりエンフードさ れる免疫優性ＣＳペプチドは、ＰＬプロモーターにより調節されるとき、効率よ く発現されることができ、そして翻訳關始シグナルは発現ベクターにより供給さ れる。動物モデル中のプラスミド構成体の各々のワクチンの効力を試験するため に、ＣＳペプチドを発現するプラスミドを有するサルモネラｉ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ）バクテリアの各々を使用してマウスをワクチン接種した。 ８．１．ＣＳペプチドを発現する組み換えサルモネラ属（Ｓａｌ換えサルモ不う 属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉａ）の能力は、組み換えバクテリアでワクチン接 種したマウスの血清中の抗Ｃ５抗体の検出により実証されｔ；。生後６週のＣ５ ７Ｂ１／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ　ｊａｂｓ）をこの研究を通じて使用した。 適当なバクテリアの対数期の培養物を無菌のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗 浄し、そしてＰＢＳ中に１０”細胞／　ｍ　（ｌに再懸濁した。マウスを５〜１ ０匹の群に分割し、そして０゜１ｍ１２のバ適当なりテリア細胞懸濁液（１０７ 細胞）で腹腔的注射した。 あるいは、マウスは第０日に１０１０の組み換えバクテリアを経口的に投与し、 次いで第３日に１０１ａバクテリアを経口的に第２投与して接種した。対照群に 組み換えプラスミドからのＬＴ−Ｂタンパク質を発現するサルモネラ属（Ｓａ　 Ｉｍｏｎｅ　ｌ　ｌ　ａ）菌株、またはｐｕｃ３またはｐＵＣ１８の親のプラス ミドを有するサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｔａ）菌株を与えた。各マ ウスを免疫化前に採血し、そして血清を一７０℃において将来の分析のために貯 蔵した。腹腔内ルートで最初にワクチン接種したマウスを再び８４週に採血し、 そして１０”バクテリアでｔ４腹腔内促進した。経口的にワクチン接種しｔ；マ ウスを第４週で促進し、次いで３８後第２促進投与量を与えた。血清試料を、酵 素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＴＳＡ）により、節６．１２に記載されているよ うに、抗Ｃ５抗体および抗ＬＴ−Ｂ抗体の存在について試験したＣ１：１６０希 釈における対照および寅験の血清の寅際のＯＤ（光学密度）値を第１７図に記載 する。免疫前の血清の平均のＯＤ＋３標準偏差に相当するカットオフＯＤに基づ いて、力価を決定した。免疫前から後までの力価の４倍の上昇は有意であると考 えた。ｐＰＸ１５２８またはｐＰＸ１６０１プラスミドを有するサルモ不う・デ ュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ１４３８は、有意の抗Ｃ Ｓ−次抗体応答を誘発したが、抗ＬＴ−Ｂ抗体の応答を誘発しなかった；両者の プラスミドはＬＴ−Ｂ／Ｃ３融合タンパク質を発現する。対照的に、５Ｌ１４３ ８中のｐＰＸｌ　５２７　（ＬＴ−Ｂ遺伝子を発現する）は抗ＬＴ−Ｂ抗体を刺 激した。ＳＬ］１Ｉ３８中でｐＰＸ１５２８により観測されたもの（ｔａｃプロ モーターの制御下にＯ５遺伝子を発現する）よりわずかに高い抗ＣＳ応答は５Ｌ １４３８中でｐＰＸ１６０１　（ＰＬプロモーターの制御下にＣ８遺伝子を発現 する）で観測され、発現のより高いレベルはこの系におけるより大きい抗体の応 答を引き出すために非常に重要であることを示唆する。促進可能な応答はプラス ミド構成体の各々について観測され、最高の力価は最大量のＣＳタンパク質また はＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タンパク質を発現するバクテリアを使用して観測された。 ］ａＣプロモーターにより推進されるＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タンパク質を発現する サルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ１４３Ｂ でワクチン接種したマウスは、−次または二次のワクチン接種後に有意の応答を 示さず、融合タンパク質の発現レベルがまた低すｍｏｎｅｌｌａ）を使用する免 疫化後のマウスにおけるプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の感染に 対する保護 ＣＳタンパク質を発現する組み換えサルモ不う属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１ｌａ） 菌株のワクチンとしての効能を、マウスのモデル系において、スポロゾイトで対 抗したとき免疫化したマウスにおけるプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ ｍ）の感染に対する保護を示すことによって実証した。Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ ｍの免疫優性エピトープの発現はＳ。 ｔｙｐｈｉおよび他のサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　］　Ｉａにおいて 実証することができるが、マウスはＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイトで 感染することができない、ＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タンパク質を有する組み換えサル モネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ１４３８を エンコードするプラスミドまたはＣＳタンパク質ヲエンコードするプラスミドが 保護を引き出す能力を実証するために、組み換えサルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎ ｅ　ｌ　］　Ｉａで前にワクチン接種したマウスを低い投与量（１０００／マウ ス）または高い投与量（１０４／マウス）のＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのスポロゾイト で尾の静脈の注射により対抗した。対照として、ワクチン接種しないマウスをま た対抗した。 Ｌ　Ｔ　−Ｂ／ＣＳ融合タンパク質を発現するｐＰＸ１５２８　（ｔａｃ促進し た）またはｐ　Ｐ　Ｘ　ｌ　６０１　（Ｐ　Ｌ促進した）を有するか、あるいは ＣＳタンパク質の免疫優性反復領域を発現するＳ、ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ１４３８ は、保護的応答を引き出すことができる。対照寅験において、週０でワクチン接 種しそして週４において１０μｇのＤ−１６−Ｎ−ＫＬＨ（ＤＰＡＰＰＮＡＮ− ＫＬＨ；Ｅｇａｎ酢酸エチル、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：４５３）で または１０ｐｇのＥ、ｃｏｌｉ（ｐＰＸ１６０１を含宵する菌株Ｎ４８３０）か ら誘導された部分的に精製しｆ：ＬＴ−Ｂ／Ｃ５融合タンパク質で促進すると、 保護を引き出すしない。 １０９のＳ、ｄｕｂｌｉｎ　（ｐＰＸ１６０１を有する）またはＳ、ｄｕｂｌｉ ｎの対照細胞で経口的にワクチン接種しそして週４において１Ｏ１０の同一有機 体で促進したマウスを週１３において対抗した。１０３のＰ、ｂｅｒｇｈｅｉの スポロゾイトで尾の静脈注射により対抗後８日に、対照Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ細胞で 免疫化した動物の５匹のうち４匹は解放性の血液段階の寄生虫血症を示したが、 Ｓ、ｄｕｂｌ　ｉｎ　（ｐＰＸ１６０１を有する）で免疫化した５匹の動物のう ち１匹のみは血液段階の寄生虫を示した。こうして対照動物の２０５は感染を逃 れたが、免疫化動物の８０％は保護された。 こうして、弱毒化された生きているサルモ不う属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、 普通のルートのワクチン接種で達成されない保護的免疫性を引き出す方法で免疫 系にスポロゾイトのエピトープを供給することができる。 ９、微生物の受託 プラスモディウム属（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）のエピトープをエンコ ードする列挙したプラスミドを有する、次のバクテリアの菌株は、アメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（米国マリイランド州ロツ クビ呟パークロウンドライブ１２３０１）に受託され、そして示す受け入れ番号 を割り当てられた：バクテリアの菌株 チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、Ｔｙ５２３ｐＰＸｌ　５３２ 　：　ＬＴ−Ｂ遺伝子の最初の３０アミノ酸および引き続く４つのテトラペプチ ドの反復の二量体の融合タンパク質を発現するプラスミドを発現し、Ｐ、ｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍのＣＳタンパク質の各々はＬＴ−Ｂからのリードアウトーオブー フレームの２８アミノ酸に融合している。この融合タンパク質はＩａｃプロモー ターから発現される。 バクテリアの菌株 腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）血清型ｄｕｂ　］　 １ｎｓＬ１４３８ 受は入れ番号 ｐＰＸ１５２８二アミノ末端においてＬＴ−Ｂの最初の３０アミノ酸および引き 続くＣＳタンパク質のＸｍｎ１から転写されたＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳタンパ ク質の２２３アミノ酸の融合タンパク質を発現するプラスミド、２８アミノ酸は カルボキシ末端においてＬＴ−Ｂ遺伝子からリードアウトーオブーフレームであ る。この融合タンパク質はｔａＣプロモーターから発現される。バクテリアの菌 株バクテリアの菌株 腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）血清型ｄｕｂｌｊｎ ｓＬ１４３８ 受は入れ番号 プラスミド ｐＰＸ１６０］二アミノ末端においてＬＴ−Ｂの最初の３０アミノ酸および引き 続くＣＳタンパク質のＸｍｎ　ｌから転写されたＰ、ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳタン パク質の２２３アミノ酸の融合タンパク質を発現するプラスミド、２８アミノ酸 はカルボキシ末端においてＬＴ−Ｂ遺伝子からリードアウトーオブーフレームで ある。この融合タンパク質はＰ、プロモーターから発現される。 バクテリアの菌株 Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ　Ｎ９９ｃ　Ｉ” 受は入れ番号 プラスミド ｐＰＸ１５３４：全長のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳタンパク質遺伝子を発 現するプラスミド（推定の１６アミノ酸のシグナル配列をエンコードする配列の みを欠く）。このタンパク質はＰＬプロモーターから発現される。 本発明は受託された微生物により範囲が限定されるべきではない。なぜなら、か らである。受託された実施態様は本発明の１つの面の単一の例示として意図し、 そして機能的に同等の微生物は本発明の範囲内である。事実、ここに示しかつ記 載するものに加えて本発明の種々の変更は上の記載および添付図面から当業者に は明らかである。このような変更は添付する請求の範囲内に入ること意図する。 まｔ；、ヌクレオチドについて与えたすべ゛ての塩基対の大きさは概算であり、 モしてせい説明の目的で使用し、そして線図的に描写したＤＮＡ配列の図面は必 ずしも一定の尺度に応じて描かれていない。 微生物 Ａ、受託の証明 ｐＰＸ１５３２を有するＳ　ａｍｏｎｅｌ　ｌａ　ｔｙｐｈｉ　Ｔｙ５２３受託 機関名 名　称　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴｃｃ）受託日 受託微生物　受は入れ番号　受託日 Ｅ、Ｃｏ１１　Ｎ９９ｃｌ″を有する　６７５１８　１９８７年９月３０日受託 研究所：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＦＩＧ、ｆ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｖａｉｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐ ｈｅ　Ｐｈｅ　ＡｓｎＡＧＡ　ＴＡＡＴＴＡ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＡＴＡ　ＴＡＡ 　ＡＴＡ　Ｔ１Ｔ　ＴＡＣＡＴＡ　ＣＡＴ　ＡＴＣＡＣに　ＴにＴ　（：ＴＡ　 Ａ`ＣＴＴＴ　ＡＴｒ　丁ｒｒ ＩＧ−２ ＡＣＣＴＡＴ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＡＴＡ　Ｃ ＴＡ　ＡＴＣ；　ＡＣ；Ｃ１ｃｒｒ　ＡＴＧ　ｃＴＧ　ＣＡs　ｒｒｃ　ＡＡＡ 　ＡＧＧ　ＣＧＧ ＦＩＧ、３ Ｈｉｎｄｌｆｌ ＦｒＩｎｄＮ ＦＩＧ、１６ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年４月２日　 響。 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０３３７６ ２、発明の名称 マラリアのワクチン ３、特許出願人 名　称　プラクシス・バイオロジクス・インコーホレーテッド４、代理人　〒１ ０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 う 一０７パ 添付された補正書の写しく翻訳文）は請求の範囲の全文訂正であります。 請求の範囲（補正） １、マラリア寄生虫のエピトープをエンコードするＤＮＡ配列を含有する弱毒化 膿侵入バクテリアからなり、前記配列はバクテリアにより発現されるすることが でき、こうしてマラリア寄生虫に対する免疫応答は前記バクテリアを接種した宿 主により発生される、組み換えバクテリア。 艶笑１項記載・の組み換えバクテリア。 ３、バクテリアはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフ ス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または腸炎菌（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上記第２項記載の組み換 えバクテリア。 ４、Ｔｙ２１ＳＴｙ２１ａＳＴｙ５２３、およびＴｙ５４１から成る群より選択 される、上記第３項記載のバクテリア。 ５、バクテリアは血清１１ｄｕｂｌｉｎである、上記第３項記載の組み換えバク テリア。 ６、バクテリアは芳香族化合物の生合成において１または２以上の遺伝子機能の 欠失を有する、上記第１または２項記載の組み換えバクテリア。 ７、ｇａ　ＩＥ突然変異体からなる、上記第１または２項記載の組み換えバクテ リア。 ８、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ） タンパク質抗原のそれである、上記第１項記載のバクテリア。 ９、エピトープはサーカムスボロゾイテ（ｃｊｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏ　ｉ　ｔ 　ｅ）タンパク質抗原のそれである、上記第２項記載のバクテリア。 ｌＯ、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒ。 ２ｏｉｔｅ）タンパク質抗原のそれである、上記第２項記載のバクテリア。 １１、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒ。 ｚｏｉｔｅ）タンパク質抗原の反復領域からなる、上記第８または９項記載のバ クテリア。 １２、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒ。 ｚｏｉｔｅ）タンパク質抗原の領域Ｉまたは領域ＩＩである、上記第８まｔ；は ９項記載のバクテリア。 １３、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃ　ｉ　ｒｃｕｍｓｐｏｒ。 ｚｏｉｔｅ）タンパク質抗原の領域Ｉからなる、上記第８または９項記載のバク テリア。 １４、エピトープは融合タンパク質の一部分として発現される、上記第１項記載 のバクテリア。 １５、エピトープは融合タンパク質の一部分として発現される、上記第２項記載 のバクテリア。 １６、エピトープは融合タンパク質の一部分として発現される、上記第８項記載 のバクテリア。 １７、融合タンパク質はＥ、ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニットまた は免疫活性の融合タンパク質主ずるその断片からなる、上記第１４または１５項 記載のバクテリア。 １８、融合タンパク質はＥ、ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニットまた はその断片からなる、上記第１６項記載のバクテリア。 １９、ＤＮＡ配列は、Ｅ、ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモーター、ｔａＣプ ロモーター、バクテリオ７フージラムダのπ側のプロモーター、またはバクテリ オ７フージラムダの右側のプロモーターの制御下にある、上記第１項記載のバク テリア。 ２０、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第１．２または３項記載のバクテリア。 ２１、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第８項記載のバクテリア。 ２２、エピトープはアミノ酸配列ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏからなる、上 記第２１項記載のバクテリア。 ２３、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第９項記載のバクテリア。 ２４、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５１９を割り当 てられたチフス薗（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）である、上記第２３項 記載のバクテリア。 ２５、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第１８項記載のバクテリア。 ２６、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ２７、マラリア寄生虫は卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ） である、上記第１まＩ；は２項記載のバクテリア。 ２８、マラリア寄生虫は四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒ ｉａｅ）である、上記第ＪまＩ；は２項記載のバクテリア。 ２９、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｃｌｉｕ ｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ３０、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐ　Ｉ　ａ　ｓｍｏｃ ｌｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第８項記載のバクテリア。 ３１、エピトープはアミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ａ ｓｎ−ａｌａ−ａｓｎからなる、上記第３０項記載のバクテリア。 ３２、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第９項記載のバクテリア。 ３３、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２１を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａ１ｍｏｎ′ｅＩ］ａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、 上記第３２項記載のバクテリア。 ３４、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２０を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上 記第３２項記載のバクテリア。 ３５、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第１８項記載のバクテリア。 ３６、マラリア寄生虫はプラスモディウム・エリイイ（Ｐｌａｓｍ。 ｄｉｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリ乙 ３７、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ノウレジ（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍ。 ｄｉｕｍ　Ｋｎｏｗｌｅｓｉ）である、上記第１まｔ；は２”Ｊ記載のバクテリ ア。 ３８、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｆ’　ｌ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕ ｍｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ３９、エピトープはマラリア寄生虫のスポロゾイトの段階の特性をもち、そして バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性 である、上記第１項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４０、エピトープはマラリア寄生虫の赤血球の段階の特性をもち、そしてバクテ リアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性である 、上記第１項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４１エピトープはマラリア寄生虫の赤血球外部の段階の特性をもち、そしてバク テリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性であ る、上記第１：！ｌＪ記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４２、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１．２．３．４、または５項記載のバクテリアからなるワ クチン配合物。 ４３、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第６項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４４、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４５、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第８．９、または１０項記載のバタテリアからなるワクチン 配合物。 ４６、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１１項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４７、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１２項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４８、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１３項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４９、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１４．１６、または１６”Ｊ記載のノ（クチリアからなる ワクチン配合物。 ５０、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５１、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１８項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５２、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１９項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５３、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２０項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５４、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２１または２２項記載のバクテリアからなるワクチン配合 物。 ５５、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２３または２４項記載の）くクテリアカ）らなるワクチン 配合物。 ５６、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２５項記載の７（クチリアからなるワクチン配合物。 ５７、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２６項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５訳バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感 染性である、上記第２７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５９、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２８項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６０、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２９項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６１、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３０または３１項記載のバクテリアからなるワクチン配合 物。 ６２、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３２．３３、または３４項記載の）（クチリアからなるワ クチン配合物。 ６３、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３５項記載のｌ（クチリアからなるワクチン配合物。 ６４、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３６項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６５、バクテリアはワクチン接種すべき檜主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６６、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３８項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６７、上記第１または２項記載のバクテリアおよび第２の異種エピトープを発現 することができるバクテリアからなり、前記／ぐクチリアはワクチン接種すべき 宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性である、多価ワクチン配合物。 ６８、工程： （ａ）マラリア寄生虫のエピトープをエンコードするＤＮＡ配列を含有する弱毒 化膿侵入バクテリアからなり、前記配列はＩくクチリアにより（ｂ）エンコード されたエピトープの発現を誘発する条件下に前記バクテリアを増殖させる、 からなる、マラリア寄生虫のエピトープを発現する方法。 ６９、バクテリアはサルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　］　ｌ　ａ）である、上 記第６８項記載の方法。 ７０、バクテリアはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、ネズミチ フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、）、または腸炎菌（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上記第６９項記載の 方法。 ７１、エピトープはサーカムスボロゾイテ（ｃｉ　ｒｃｕｍｓｐｏｒ。 ｚｏｉｔｅ）の抗原である、上記第６８まｔ；は６９項記載の方法。 ７２、ＤＮＡ配列はＥ、ｃｏｌｉのｌａｃオペｏ７のプロモーターの制御下に発 現される、上記第６８項記載の方法。 ７３、ＤＮＡ配列はｌニーｃｏｌｔのＩａｃオペロンのプロモーターの制御下に 発現される、上記第６９項記載の方法。 ７４、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５１９を割り当 てられたチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）である、上記第７３項 記載の方法。 ７５、ＤＮＡ配列はｔａｃプロモーターの制御下に発現される、上記第６８項記 載の方法。 ７６、ＤＮＡ配列はｔａＣプロモーターの制御下に発現される、上記第６９項記 載の方法。 ７７、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２１を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上 記第７６項記載の方法。 ７８、ＤＮＡ配列はバクテリオファージラムダの左側プロモーターの制御下に発 現される、上記第６８項記載の方法。 ７９、ＤＮＡ配列はバクテリオファージラムダの左側プロモーターの制御下に発 現される、上記第６９項記載の方法・８０、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそ して受け入れ番号６７５２０を割り当てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　 ｅｎｔｅｒｉ、ｔｉｄ　ｉ　ｓ）である、上記第７９項記載の方法。 ８１、ＤＮＡ配列はバクテリオファージラムダの右側プロモーターの制御下に発 現される、上記第６８または６９項記載の方法。 ８２、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第６８または６９項記載の方法。 ８３、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ ）である、上記第６８項記載の方法。 ８４、マラリア寄生虫は卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ） である、上記第６８項記載の方法。 ８５、マラリア寄生虫は四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒ ｉａｅ）である、上記第６８項記載の方法。 ８６、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｃｌｉｕ ｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第６８または６９項記載の方法。 ８７、マラリア寄生虫はプラスモディウム・エリイイ（Ｐｌａｓｍ。 ｄｉｕｍ　ｙｏｅｌｉ’ｉ）である、上記第６８項記載の方法。 ８８、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ノウレジ（Ｐｌａｓｍａｄｉｕｍ　 Ｋｎｏｗｌｅｓｉ）である、上記第６８項記載の方法。 ８９、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）である、上記第６８項記載の方法。 ９０、ａｒｏＡまたはｇａ　ＩＥの突然変異を有し、そして四日熱マラリア原虫 の寄生虫のサーカムスボロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）のタン パク質抗原のエピトープをエンコードする組み換えＤＮＡ配列を含有し、前記配 列はマラリア寄生虫に対する免疫応答がバクテリアを接種されｔ；宿主中に発生 するように発現されることができる、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　］　］ 　ａ）の弱毒化バクテリア。 ９］、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒ。 ｚｏｉｔｅ）タンパク質抗原のそれである、上記第９０項記載の弱毒化バクテリ ア。 ９２、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第９０項記載の弱毒化バクテリ乙 ９３、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第９０項記載の弱毒化バクテリア。 ９４、エピトープは融合タンパク質の一部分として発現される、上記第９０項記 載の弱毒化バクテリア。 ９５、融合タンパク質はＥ、ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニットま！ ；は免疫活性融合タンパク質を提供するその断片からなる、上記第９４項記載の 弱毒化バクテリア。 ９６、融合タンパク質はＥ、ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニットのＮ 末端の３０アミノ酸からなる、上記第９５項記載の弱毒化バクテリア。 国際調査報告 １）Ｃ’Ｔ／Ｔｌ５ＲＲ／ｎ’、ｆｆ７Ｉ第７Ｉの続き ［相］Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発　明　者　マジャリア ン、ウィリアム・ロ　アメーク リカ合衆国ニューヨーク州１４５３４　ビッツフォード・グリーン合衆国ニュー ヨーク州１４６２３　ロチニスター・ホルマーパラエイ２８６ 合衆国ニューヨーク州１４５３４ビッツフォード・ブルツクウ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マラリア寄生虫のエピトープをエンコードするＤＮＡ配列を含有する弱毒化 腸侵入バクテリアからなり、前記配列はバクテリアにより発現されるすることが できる、組み換えバクテリア。 ２、バクテリアはサルモネラ属（Ｓａｋｍｏｎｅｌｌａ）である、上記第１項記 載の組み換えバクテリア。 ３、バクテリアはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフ ス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または腸炎菌（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上記第２項記載の組み換 えバクテリア。 ４、Ｔｙ２１、Ｔｙ２１ａ、Ｔｙ５２３、およびＴｙ５４１から成る群より選択 される、上記第３項記数のバクテリア。 ５、バクテリアは血清型ｄｕｂｌｉｎである、上記第３項記載の組み換えバクテ リア。 ６、バクテリアは芳香族化合物の生合成において１または２以上の遺伝子機能の 欠失を有する、上記第１または２項記載の組み換えバクテリア。 ７、ｇａｌＥ突然変異体からなる、上記第１または２項記数の組み換えバクテリ ア。 ８、エピトプはサーカスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タン パク質抗原のそれである、上記第１項記数のバクテリア。 ９、エピトープはサーカムスポロノイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ） タンパク質抗原のそれである、上記第２項記載のバクテリア。 １０、エピトープはサーカムスポロノイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）タンパク質抗原のそれである、上記第２項記載のバクテリア。 １１、エピトープはサーカムスポロノイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）タンパク質抗原の反復領域のそれである、上記第８または９項記載のバクテリ ア。 １２、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）タンパク質抗原の領域１のそれである、上記第８または９項記載のバクテリア 。 １３、エピトープはサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）タンパク質抗原の領域１１のそれである、上記第８または９項記載のバクテリ ア。 １４、エピトープは農舎タンパク質の一部分として発現される、上記第１項記載 のバクテリア。 １５、エピトープは融合タンパク質の一部分として発現される、上記第２項記載 のバクテリア。 １６、エピトープは融合タンパク質の一部分として発現される、上記第８項記載 のバクテリア。 １７、融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニットまた はその断片からなる、上記第１４または１５項記載のバクテリア。 １８、融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性腸毒素のＢサブユニットまた はその断片からなる、上記第１６項記載のバクテリア。 １９、ＤＮＡ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉの１ａｃオペロンのプロモーター、ｔａｃプ ロモーター、バクテリオフアージラムダの左側のプロモーター、またはバクテリ オファージラムダの右側のプロモーターの制御下にある、上記第工事記載のバク テリア。 ２０、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第１、２または３項記載のバクテリア。 ２１、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第８項記載のバクテリア。 ２２、エピトープはアミノ酸配列ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏからなる、上 記第２１項記載のバクテリア。 ２３、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆ８ｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第９項記載のバクテリア。 ２４、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５１９を割り当 てられたチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ１ｌａ　ｔｙｐｈｉ）である、上記第２３項 記載のバクテリア。 ２５、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第１８項記載のバクテリア。 ２６、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ２７、マラリア寄生虫は卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ） である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ２８、マラリア寄生虫は四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａ１ａｒ ｉａｅ）である、上記第１または２項記数のバクテリア。 ２９、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ３０、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第８項記載のバクテリア。 ３１、エピトープはアミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ａ ｓｎ−ａｌａ−ａｓｎからなる、上記第３０項記載のバクテリア。 ３２、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第９項記載のバクテリア。 ３３、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２１を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｏｒｉｔｉｄｉｓ）である、上 記第３２項記載のバクテリア。 ３４、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２０を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上 記第３２項記載のバクテリア。 ３５、マラリア寄生虫はブラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第１８項記数のバクテリア。 ３６、マラリア寄生虫はプラスモディウム・エリイイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　 ｙｏｅｌｉｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ３７、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　 Ｋｎｏｗ王ｅｓｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ３８、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｃｙｎｏｍ ｏｌｇｉ）である、上記第１または２項記載のバクテリア。 ３９、エピトープはマラリア寄生虫のスポロゾイトの段階の特性をもち、そして バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性 である、上記第１項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４０、エピトープはマラリア寄生虫の赤血球の段階の特性をもち、そしてバクテ リアはワクチン接種ずべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性である 、上記第１項記数のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４１、エピトープはマラリア寄生虫の赤血球外部の段階の特性をもち、そしてバ クテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで感染性で ある、上記第１項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４２、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１、２、３、４、または１５項記載のバクテリアからなる ワクチン配合物。 ４３、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第６項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４４、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４５、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第８、９、または１０項記載のバクテリアからなるワクチン 配合物。 ４６、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１１項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４７、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１２項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４８、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１３項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ４９、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１４、１６、または１６項記数のバクテリアからなるワク チン配合物。 ５０、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５１、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１８項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５２、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第１９項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５３、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２０項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５４、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２１または２２項記載のバクテリアからなるワクチン配合 物。 ５５、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２３または２４項記載のバクテリアからなるワクチン配合 物。 ５６、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２５項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５７、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２６項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５８、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ５９、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２８項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６０、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第２９項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６１、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３０または３１項記載のバクテリアからなるワクチン配合 物。 ６２、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３２、３３、または３４項記数のバクテリアからなるワク チン配合物。 ６３、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３５項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６４、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３６項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６５、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３７項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６６、バクテリアはワクチン接種すべき宿主中で有意の病気を引き起こさないで 感染性である、上記第３８項記載のバクテリアからなるワクチン配合物。 ６７、上記第１または２項記載のバクテリアおよび第２の異種エピトープを発現 することができるバクテリアからなり、前記バクテリアはワクチン接種すべき宿 主中で有意の病気を引き起こさないで感染性である、多価ワクチン配合物。 ６８、工程： （ａ）マラリア寄生虫のエピトープをエンコードするＤＮＡ配列を含有する弱毒 化腸侵入バクテリアからなり、前記配列はバクテリアにより発現されるすること ができる、組み換えバクテリアを構成し、そして（ｂ）エンコードされたエピト ープの発現を誘発する条件下に前記バクテリアを増殖させる、 からなる、マラリア寄生虫のエピトープを発現する方法。 ６９、バクテリアはサルモネラ層（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、上記第６８ 項記載の方法。 ７０、バクテリアはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、ネズミチ フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または腸炎菌（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上記第６９項記載の方 法。 ７１、エピトープはサーカムスポロノイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）の抗原である、上記第６８または６９項記載の方法。 ７２、ＤＮＡ配列はＥ．ｃｏｌｉのｌａｃオベロンのプロモーターの制御下に発 現される、上記第６８項記載の方法。 ７３、ＤＮＡ配列はＥ．ｃｏｌｌのｌａｃオベロンのプロモーターの制御下に発 現される、上記第６９項記載の方法。 ７４、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５１９を割り当 てられたチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）である、上記第７３項 記載の方法。 ７５、ＤＮＡ配列はｔａｃプロモーターの制御下に発現される、上記第６８項記 載の方法。 ７６、ＤＮＡ配列はｔａｃプロモーターの制御下に発現される、上記第６９項記 載の方法。 ７７、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２１を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）である、上 記第７６事記載の方法。 ７８、ＤＮＡ配列はバクテリオファージラムダの左側プロモーターの制御下に発 現される、上記第６８項記載の方法。 ７９、ＤＮＡ配列はバクテリオファージラムダの左側プロモーターの制御下に発 現される、上記第６９項記載の方法。 ８０、バクテリアはＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号６７５２０を割り当 てられた腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉ５）である、上 記第７９項記載の方法。 ８１、ＤＮＡ配列はバクテリオファージラムダの右側プロモーターの制御下に発 現される、上記第６８または６９項記載の方法。 ８２、マラリア寄生虫は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）である、上記第６８または６９項記載の方法。 ８３、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ ）である、上記第６８項記載の方法。 ８４、マラリア寄生虫は卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ） である、上記第６８項記載の方法。 ８５、マラリア寄生虫は四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒ ｉａｅ）である、上記第６８項記載の方法。 ８６、マラリア寄生虫はプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｂｅｒｇｈｅｉ）である、上記第６８または６９項記載の方法。 ８７、マラリア寄生虫はプラスモディウム・エリイイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　 ｙｏｅｌｉｉ）である、上記第６８項記載の方法。 ８８、マラリア寄生虫はブラスモディウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　 Ｋｎｏｗｌｅｓｉ）である、上記第６８項記載の方法。 ８９、マラリア寄生虫は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｃｙｎｏｍ ｏｌｇｉ）である、上記第６８項記載の方法。