JPH0335800A - ヘテロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法 - Google Patents
ヘテロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヘテロ二重特異性抗体の製造法に関する。
従来の技術
ヘテロ二重特異性抗体またはへテロニ官能性抗体は、2
つの異なる抗原結合個所を有する、すなわち2つの異な
るエピトープとは反対方向に向いている抗体である。ヘ
テロ三官能性抗体は、疾病の治療に使用することができ
る。従って、二重特異性抗体は、例えば癌腫細胞の細胞
表面の抗原に対する1つの抗原結合個所および特定の医
薬に対する1つの抗原結合個所を有することができる。
つの異なる抗原結合個所を有する、すなわち2つの異な
るエピトープとは反対方向に向いている抗体である。ヘ
テロ三官能性抗体は、疾病の治療に使用することができ
る。従って、二重特異性抗体は、例えば癌腫細胞の細胞
表面の抗原に対する1つの抗原結合個所および特定の医
薬に対する1つの抗原結合個所を有することができる。
更に、・この方法で、癌腫細胞に対する治療剤が特異的
に惹起される。もう1つの別の変種は、1つの抗原結合
個所がT−細胞一表面一抗原とは反対方向に向いており
かつ別の抗原結合個所がビールスの抗原決定因子とは反
対方向に向いている二重特異性抗体である。
に惹起される。もう1つの別の変種は、1つの抗原結合
個所がT−細胞一表面一抗原とは反対方向に向いており
かつ別の抗原結合個所がビールスの抗原決定因子とは反
対方向に向いている二重特異性抗体である。
この種の抗体は、意図的に血液中のビールスを破壊する
ことができるものとされている。
ことができるものとされている。
二重特異性抗体の製造法は、既に公知である、すなわち
、Proc、Natl、Acad、Sci、、tlsA
、83 (1986)、4479−4483およびEu
r 、 J 。
、Proc、Natl、Acad、Sci、、tlsA
、83 (1986)、4479−4483およびEu
r 、 J 。
Immunol、、17 (1987) 、 57
1〜574には、スペーサーの使用下で2つの異なる
抗体を化学的に互いに結合させる方法が記載されている
。しかし、この方法は、費用がかかりかつ抗体の新規の
トポロジカルな形勢を生じる。
1〜574には、スペーサーの使用下で2つの異なる
抗体を化学的に互いに結合させる方法が記載されている
。しかし、この方法は、費用がかかりかつ抗体の新規の
トポロジカルな形勢を生じる。
更に、Proc、Natl、Acad、Sci、、US
A、83 (1986)、1453〜1457の記載か
ら、それぞれ異なる抗体を分泌する2つの細胞系を互い
に融合させる方法は、公知である。この場合には、二重
の染色体の組みを含有するハイブリドーマ細胞が生じ、
望ましいヘテロ三官能性抗体が生産される。この方法の
欠点は、得られた細胞系列が屡々不安定であり、したが
って工業的規模でのへテロニ官能性抗体の生産には不適
当であることにある。
A、83 (1986)、1453〜1457の記載か
ら、それぞれ異なる抗体を分泌する2つの細胞系を互い
に融合させる方法は、公知である。この場合には、二重
の染色体の組みを含有するハイブリドーマ細胞が生じ、
望ましいヘテロ三官能性抗体が生産される。この方法の
欠点は、得られた細胞系列が屡々不安定であり、したが
って工業的規模でのへテロニ官能性抗体の生産には不適
当であることにある。
発明が解決しようとする課題
従って、本発明の課題は、二重特異性抗体を良好な収量
で得ることができかつ工業的規模で実施することができ
る1つの方法を提供することであった。
で得ることができかつ工業的規模で実施することができ
る1つの方法を提供することであった。
課題を解決するための手段
この課題は、望ましい特異性を有する抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、軽鎖およ
び重鎮の可変部分に対して単離し、真核プラスミドベク
ター中に挿入し、この表現ベクターを第2の望ましい特
異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
移入し、この細胞系を培養し、抗体を取得し、二重特異
性抗体を分離することを特徴とする、二重特異性モノク
ローナル抗体を製造する方法によって解決される。
イブリドーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、軽鎖およ
び重鎮の可変部分に対して単離し、真核プラスミドベク
ター中に挿入し、この表現ベクターを第2の望ましい特
異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
移入し、この細胞系を培養し、抗体を取得し、二重特異
性抗体を分離することを特徴とする、二重特異性モノク
ローナル抗体を製造する方法によって解決される。
意外なことに、本発明方法によれば、二重特異性抗体を
高い収量で得ることに成功する。本発明により使用され
る移入されたノ・イブリドーマ細胞系は、ハイブリドー
マ細胞系のゲノムならびに表現ベクターによってコード
化されているホモ官能性抗体を表現し、ならびにハイブ
リドーマ宿主細胞の抗原結合個所および移入されたベク
ターの抗原結合個所を有する、2つの抗体の遺伝子から
形成されたヘテロ三官能性抗体を表現する。意外なこと
に、このヘテロ三官能性抗体の収量は極めて高い。ヘテ
ロ三官能性抗体は、2つのホモ官能性抗体とともに簡単
な方法で、例えば固体の担体に固定されている抗原の1
つに結合させ、かつ標識化されかつ可溶性で使用される
別の抗原に結合させることによって測定される。
高い収量で得ることに成功する。本発明により使用され
る移入されたノ・イブリドーマ細胞系は、ハイブリドー
マ細胞系のゲノムならびに表現ベクターによってコード
化されているホモ官能性抗体を表現し、ならびにハイブ
リドーマ宿主細胞の抗原結合個所および移入されたベク
ターの抗原結合個所を有する、2つの抗体の遺伝子から
形成されたヘテロ三官能性抗体を表現する。意外なこと
に、このヘテロ三官能性抗体の収量は極めて高い。ヘテ
ロ三官能性抗体は、2つのホモ官能性抗体とともに簡単
な方法で、例えば固体の担体に固定されている抗原の1
つに結合させ、かつ標識化されかつ可溶性で使用される
別の抗原に結合させることによって測定される。
二重特異性抗体を本発明により製造するために、真核表
現ベクターは、ハイブリドーマ細胞系中に導入される。
現ベクターは、ハイブリドーマ細胞系中に導入される。
真核表現ベクターは、本質的な要素として選択可能なマ
ーカー、強力なプロモーターおよび完全または不完全な
抗体を表現するための遺伝子を含有する。免疫グロブリ
ン遺伝子を挿入するために、当業者に知られている多数
の種々の真核プラズミドベクターが適当である。適当な
のは、例えば次のベクターである: a)ホスホトランスフェラーゼを新たに表現するベクタ
ー この場合形質転換細胞の選択は、抗生物質G418
を用いて行なわれる。このベクターは、P、5outh
ernおよびP、Bergj、Mo1.Appl、Ge
net、l (1982) 、327〜341に記載
されている。
ーカー、強力なプロモーターおよび完全または不完全な
抗体を表現するための遺伝子を含有する。免疫グロブリ
ン遺伝子を挿入するために、当業者に知られている多数
の種々の真核プラズミドベクターが適当である。適当な
のは、例えば次のベクターである: a)ホスホトランスフェラーゼを新たに表現するベクタ
ー この場合形質転換細胞の選択は、抗生物質G418
を用いて行なわれる。このベクターは、P、5outh
ernおよびP、Bergj、Mo1.Appl、Ge
net、l (1982) 、327〜341に記載
されている。
b)エシェリキア・コリ(E、coli)キサンチン−
グアニン−ホスホリボシル−転移酵素を表現するベクタ
ー この場合形質転換細胞の選択は、マイコフェノール
酸耐性に対して行なわれる。このベクターは、R,Mu
lliganおよびP、Berg、Proc。
グアニン−ホスホリボシル−転移酵素を表現するベクタ
ー この場合形質転換細胞の選択は、マイコフェノール
酸耐性に対して行なわれる。このベクターは、R,Mu
lliganおよびP、Berg、Proc。
Natl、Acad、Sci、、USA、 78 (1
981) 、2072〜2076に記載されている。
981) 、2072〜2076に記載されている。
C)“条桑耐性(multi−drug resist
ance)”遺伝子を表現するベクター この場合、選
択は、例えばコルキシン、ビンブラスチン、アドリアマ
イシンまたはアドリアマイシンDのような薬剤を用いて
行なわれる。このベクターは、S、E。
ance)”遺伝子を表現するベクター この場合、選
択は、例えばコルキシン、ビンブラスチン、アドリアマ
イシンまたはアドリアマイシンDのような薬剤を用いて
行なわれる。このベクターは、S、E。
Kane、B、R,Troen、S、Gal 、に、K
ida、 1.Pa5tanおよびM、M、Gotta
sman、Mo1. and Ce11. Biol、
8 (1988)、3316〜3321ならびにり、W
、5hou、^、Foio、1.B、Roninson
、J、E、Chin、R,Soffir−1、Pa5L
an8よびM、M、Gottesman、Mo1. a
n−d Ce1l Biol、6 (1986)、40
39〜4044に記載されている。
ida、 1.Pa5tanおよびM、M、Gotta
sman、Mo1. and Ce11. Biol、
8 (1988)、3316〜3321ならびにり、W
、5hou、^、Foio、1.B、Roninson
、J、E、Chin、R,Soffir−1、Pa5L
an8よびM、M、Gottesman、Mo1. a
n−d Ce1l Biol、6 (1986)、40
39〜4044に記載されている。
d)ジヒドロ葉酸還元酵素またはメトトレキセートに対
して減少された親和力を有する突然変異体を表現するベ
クター。形質転換細胞の選択は、メトトレキセート含有
媒体中での成長によって行なわれる。ベクターは、R,
KaufmanおよびP、A、5harp、J、 Mo
1. Biol、 l 59 (1982)、601〜
621およびC,C,Simonson他、Proc、
Natl、Acad、sci、、USA80 、(19
83) 、2495〜2499に記載されている。
して減少された親和力を有する突然変異体を表現するベ
クター。形質転換細胞の選択は、メトトレキセート含有
媒体中での成長によって行なわれる。ベクターは、R,
KaufmanおよびP、A、5harp、J、 Mo
1. Biol、 l 59 (1982)、601〜
621およびC,C,Simonson他、Proc、
Natl、Acad、sci、、USA80 、(19
83) 、2495〜2499に記載されている。
これらのベクターは、全部が既に選択可能なマーカーを
有する。出発ベクターとしては、例えばグラス2ビ9 ことができる。
有する。出発ベクターとしては、例えばグラス2ビ9 ことができる。
ベクター中には、少なくとも望ましい特異性の抗体の可
変部分およびcH1領域または完全な抗体をコード化す
る免疫グロブリン遺伝子が自体公知の方法で挿入される
。この場合には、望ましい特異性の抗体を生産するハイ
ブリドーマから相応するDNAを取得しかつベクター中
に結合することができるか、或いは望ましい免疫グロブ
リン遺伝子のゲノムDNAを使用することできる(Bu
ckel他、Gene 5 1 ( 1 9’8 0
)13〜19参照)。
変部分およびcH1領域または完全な抗体をコード化す
る免疫グロブリン遺伝子が自体公知の方法で挿入される
。この場合には、望ましい特異性の抗体を生産するハイ
ブリドーマから相応するDNAを取得しかつベクター中
に結合することができるか、或いは望ましい免疫グロブ
リン遺伝子のゲノムDNAを使用することできる(Bu
ckel他、Gene 5 1 ( 1 9’8 0
)13〜19参照)。
免疫グロブリン遺伝子としては、少なくとも軽鎖に対す
る遺伝子、重鎮の可変部分に対する遺伝子および望まし
い抗体のcH1領域に対する遺伝子が使用される。
る遺伝子、重鎮の可変部分に対する遺伝子および望まし
い抗体のcH1領域に対する遺伝子が使用される。
軽鎖のだめの遺伝子は、に−鎖またはλ−鎖のための遺
伝子であることができる。それぞれ完全な遺伝子が使用
される。所望の抗体の種類に依存して、重鎮のための遺
伝子は選択される。
伝子であることができる。それぞれ完全な遺伝子が使用
される。所望の抗体の種類に依存して、重鎮のための遺
伝子は選択される。
抗体の種類に応じて、遺伝子は、μ、γ1 γ2γ3
γ4 α1 α2 aまたはε−鎖から選択される。こ
の°場合には、全ての情報を重鎮に対して使用すること
ができるか、または重鎮に対してコード化されているD
NAの一部のみを使用することができる。必要に応じて
、C H 2 −C H 3−ならびに場合によっては
C )( 4領域は、得るべき抗体の望ましい種類に依
存してならびに使用されるハイブリドーマ細胞系に依存
して選択される。本発明により製造された二重特異性抗
体が人体での治療的処置に定められている場合には、ヒ
トの免疫グロブリンのC H 1 −C H 2 −
c H3−および場合によってはC H 4領域を使
用することは、有利である。
γ4 α1 α2 aまたはε−鎖から選択される。こ
の°場合には、全ての情報を重鎮に対して使用すること
ができるか、または重鎮に対してコード化されているD
NAの一部のみを使用することができる。必要に応じて
、C H 2 −C H 3−ならびに場合によっては
C )( 4領域は、得るべき抗体の望ましい種類に依
存してならびに使用されるハイブリドーマ細胞系に依存
して選択される。本発明により製造された二重特異性抗
体が人体での治療的処置に定められている場合には、ヒ
トの免疫グロブリンのC H 1 −C H 2 −
c H3−および場合によってはC H 4領域を使
用することは、有利である。
本発明による方法の1つの実施態様の場合には、軽鎖に
対するに一遺転子およびマウス抗体またはヒト抗体の7
1−遺伝子を含有する表現ベクターが使用されている。
対するに一遺転子およびマウス抗体またはヒト抗体の7
1−遺伝子を含有する表現ベクターが使用されている。
真核表現ベクターの1つの好ましい成分は、1つの強い
プロモーターである。高い生産率を生じるプロモーター
は、当業者に知られている。例えば、SV4 0の早期
または遅早プロモーター、軽鎖および重鎮に対する免疫
グロブリンブロモ−ター、サイトメガリエ( Cyto
megal ie)ービールスープロモーターならびに
メタロチオナイン(Metallothionein)
−プロモーターが適当である。全く同様に、別の構成ビ
ールス性または細胞性プロモーターは適当である。
プロモーターである。高い生産率を生じるプロモーター
は、当業者に知られている。例えば、SV4 0の早期
または遅早プロモーター、軽鎖および重鎮に対する免疫
グロブリンブロモ−ター、サイトメガリエ( Cyto
megal ie)ービールスープロモーターならびに
メタロチオナイン(Metallothionein)
−プロモーターが適当である。全く同様に、別の構成ビ
ールス性または細胞性プロモーターは適当である。
こうして構成されt;真核表現ベクターは、抗原結合個
所Aを有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
移入される。このためには、望ましい結合個所を有する
抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が適当である。有
利には、製造すべき抗体に由来する種類の抗体を生じる
ハイブリドーマ細胞系が使用される。殊に、マウスハイ
ブリドーマ細胞系またはヒトハイブリドーマ細胞系が適
当である。
所Aを有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
移入される。このためには、望ましい結合個所を有する
抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が適当である。有
利には、製造すべき抗体に由来する種類の抗体を生じる
ハイブリドーマ細胞系が使用される。殊に、マウスハイ
ブリドーマ細胞系またはヒトハイブリドーマ細胞系が適
当である。
表現ベクターのトランスフェクションは、自体公知の方
法で行なわれる。有利にトランスフェクションは、電気
泳動によって実施される(Nucleic Ac1ds
Res.1 5 (1 9 87) 1 3 1 1
〜1 3 2 6 ;Bio Techniques6
(1 9 8 8) 742〜751)。
法で行なわれる。有利にトランスフェクションは、電気
泳動によって実施される(Nucleic Ac1ds
Res.1 5 (1 9 87) 1 3 1 1
〜1 3 2 6 ;Bio Techniques6
(1 9 8 8) 742〜751)。
こうして得られた移入された細胞系は、相応するマーカ
ー上に向かって選択され、培養され、次に抗体は、自体
公知の方法で得られる(例えば、A −Y −L r
u他、Proc、Natl、Acad、Sci、USA
84(1987) 3439 ; S、L、Morr
ison他、Proc、Natl、Acad、USA
8 1 (1984) 6 8 5 1 )−移
入された細胞系は、宿主−ハイブリドーマ細胞系を分泌
するホモ三官能性抗体ならびに真核表現ベクターにより
コード化されるホモ三官能性抗体、ならびに2つの異な
る抗原結合個所を有するヘテロ三官能性抗体を生産する
。移入された表現ベクターが、抗原結合個所Bを有する
抗体の可変領域に対する情報のみを含有する場合には、
特異性Bを有する半抗体として、−定の部分が宿主細胞
によってコード化された抗体に相当するものが形成され
、シt;がって2つの半抗体を組み合わせた場合には、
抗原−結合個所AおよびBならびに宿主ハイブリドーマ
細胞によって形成された抗体の一定部分を有する二重特
異性抗体が生じる。
ー上に向かって選択され、培養され、次に抗体は、自体
公知の方法で得られる(例えば、A −Y −L r
u他、Proc、Natl、Acad、Sci、USA
84(1987) 3439 ; S、L、Morr
ison他、Proc、Natl、Acad、USA
8 1 (1984) 6 8 5 1 )−移
入された細胞系は、宿主−ハイブリドーマ細胞系を分泌
するホモ三官能性抗体ならびに真核表現ベクターにより
コード化されるホモ三官能性抗体、ならびに2つの異な
る抗原結合個所を有するヘテロ三官能性抗体を生産する
。移入された表現ベクターが、抗原結合個所Bを有する
抗体の可変領域に対する情報のみを含有する場合には、
特異性Bを有する半抗体として、−定の部分が宿主細胞
によってコード化された抗体に相当するものが形成され
、シt;がって2つの半抗体を組み合わせた場合には、
抗原−結合個所AおよびBならびに宿主ハイブリドーマ
細胞によって形成された抗体の一定部分を有する二重特
異性抗体が生じる。
しかし、ヘテロ三官能性抗体の形成の前記解釈は、別の
予想される結合方法を排除するものではなく、説明のた
めの試験のみを表わすものである。
予想される結合方法を排除するものではなく、説明のた
めの試験のみを表わすものである。
ヘテロ三官能性抗体は、意外にも高い収量で分泌される
。望ましい抗体の形成は、それ自体免疫グロブリンを全
く生産し得ないハイブリドーマ宿主細胞に比して10倍
だけ高いことが見い出された。このことは、本発明によ
り得られた細胞系がIO倍だけ高められた抗体生産率を
示すことを意味する。
。望ましい抗体の形成は、それ自体免疫グロブリンを全
く生産し得ないハイブリドーマ宿主細胞に比して10倍
だけ高いことが見い出された。このことは、本発明によ
り得られた細胞系がIO倍だけ高められた抗体生産率を
示すことを意味する。
10個の異なる抗体種の混合物(2つの抗体の軽鎖およ
び重鎮の全ての可能な組合せ物)を含有する培養上澄み
液から被検抗体は、公知方法で分離することができる。
び重鎮の全ての可能な組合せ物)を含有する培養上澄み
液から被検抗体は、公知方法で分離することができる。
有利には、望ましい抗体は、免疫吸着によって分離され
る。特に有利な実施態様の場合、二官能性抗体の分離は
2段階で行なわれる。まず、全部の抗体種を含有する溶
液を抗原結合個所へと結合可能な抗原と結合させ、この
場合抗体AおよびABは吸着される。結合した抗体の溶
離後、第2段階で一宮能性抗体および二官能性抗体を含
有する溶液から、抗原結合個所Bと結合可能な抗原の吸
着によってヘテロ三官能性抗体は、選択的にホモ二官能
性抗体Aと分離される。ヘテロ三官能性抗体は、溶離に
よって高い純度で得ることができる。
る。特に有利な実施態様の場合、二官能性抗体の分離は
2段階で行なわれる。まず、全部の抗体種を含有する溶
液を抗原結合個所へと結合可能な抗原と結合させ、この
場合抗体AおよびABは吸着される。結合した抗体の溶
離後、第2段階で一宮能性抗体および二官能性抗体を含
有する溶液から、抗原結合個所Bと結合可能な抗原の吸
着によってヘテロ三官能性抗体は、選択的にホモ二官能
性抗体Aと分離される。ヘテロ三官能性抗体は、溶離に
よって高い純度で得ることができる。
本発明によれば、顕著な収率でヘテロ三官能性抗体を得
ることができる方法が提供される。
ることができる方法が提供される。
この抗体は、なかんずく癌腫またはビールスによって惹
起される疾病の治療への使用に適当である。使用目的に
応じて、望ましい抗原決定因子を選択することができる
。従って、当該医師には第2の抗原決定因子のそれぞれ
有利な組合せ物を見い出すために幅広い領域が残されて
いる。更に、なお種々の生理学的方法に役立つ抗体のF
c部分を変える可能性が存在する。
起される疾病の治療への使用に適当である。使用目的に
応じて、望ましい抗原決定因子を選択することができる
。従って、当該医師には第2の抗原決定因子のそれぞれ
有利な組合せ物を見い出すために幅広い領域が残されて
いる。更に、なお種々の生理学的方法に役立つ抗体のF
c部分を変える可能性が存在する。
プ5スミ)’pBMs1 (DSM5229)および
p BMS 2 (DSM5230)ならびに微生物エ
シェリキア・コリHB l 01 (DSMI607)
は、ドイチェン・ザムルング・フォノ・ミクロオルガニ
スメン(Deutschen Sam+alungvo
n Mikroorganisme)に寄託されている
。ハイブリドーマ細胞系MAK33は、番号ECACC
88091410でヨーロッピアン・コレクション・オ
ブ・アニマル・セル・カルチャーズ(European
Co11ection of Animal Ce1
l Cu1tures)に寄託されている。
p BMS 2 (DSM5230)ならびに微生物エ
シェリキア・コリHB l 01 (DSMI607)
は、ドイチェン・ザムルング・フォノ・ミクロオルガニ
スメン(Deutschen Sam+alungvo
n Mikroorganisme)に寄託されている
。ハイブリドーマ細胞系MAK33は、番号ECACC
88091410でヨーロッピアン・コレクション・オ
ブ・アニマル・セル・カルチャーズ(European
Co11ection of Animal Ce1
l Cu1tures)に寄託されている。
実施例
例1
免疫グロプリシ遺伝子の単離
サブリツキー(F、5ablitzky)、ヴイルトナ
ー(G、Wildner)8よびライエフスキー(K、
Rajewski)、EMBOJ、4 (1985)3
45〜350ならびにコックス(Chr、Kocks)
およびライエフスキー(K、Rajewski)、Pr
oc、Natl、Acad。
ー(G、Wildner)8よびライエフスキー(K、
Rajewski)、EMBOJ、4 (1985)3
45〜350ならびにコックス(Chr、Kocks)
およびライエフスキー(K、Rajewski)、Pr
oc、Natl、Acad。
Sci、USA(1988) 85.8206〜821
0に記載の方法により、マウス−ハイブリドーマ系A2
0/44から、モノクロナールマウスλ、γ2a抗ニト
ロフェノール抗体とは反対方向に向いている抗イデイオ
タイプ抗体(抗体B)を分泌させ、モノクロナール抗体
のに〜遺伝子お上びγ、−;貴伝子を転子した7 活性遺伝子1nsall−リンカ−CCGTCGACG
)を備えさせ、かつpUc18またはpBR322にサ
ブクローン化した。軽鎖に対する遺伝子を5.5kb断
片によってコード化し、重鎮に対する遺伝子を9.25
kb断片によってコード化した。
0に記載の方法により、マウス−ハイブリドーマ系A2
0/44から、モノクロナールマウスλ、γ2a抗ニト
ロフェノール抗体とは反対方向に向いている抗イデイオ
タイプ抗体(抗体B)を分泌させ、モノクロナール抗体
のに〜遺伝子お上びγ、−;貴伝子を転子した7 活性遺伝子1nsall−リンカ−CCGTCGACG
)を備えさせ、かつpUc18またはpBR322にサ
ブクローン化した。軽鎖に対する遺伝子を5.5kb断
片によってコード化し、重鎮に対する遺伝子を9.25
kb断片によってコード化した。
例2
免疫グロブリン遺伝子の表現ベクターの構築出発プラズ
ミドとして、pMTOIO/A+を使用した(DNA5
(1986)529〜537)。このブラズミドは、
後接したポリアデニル化個所(An)を有するヒツジ金
属チオネインプロモーター(pMT) 、SV40の早
期プロモーターの制御下でのマウス−ジヒドロ葉酸還元
酵素遺伝子のための表現カセット、SV40の早期プロ
モーターの制御下での新しいホスホ転移酵素のだめの表
現カセット、細菌複製源およびアンピシリン耐性をコー
ド化する1つの遺伝子を含有する。属するポリアデニル
化個所を有するヒツジ金属チオネインプロモーターをE
coRIおよび5alIでのプラズミドの分解によって
切断し、断片をヌクレアーゼS1で処理し、第1図に点
線で示された断片を低溶融性のアガロースゲルから単離
した。引続き、5allリンカ−をリゲートし、5al
lで後切断し、リンカ−を有する断片を低溶融性のアガ
ロースゲル上で単離し、再すゲートしくT4−リガーゼ
)、エシェリキア・コリHBIOI(DSM1607)
中に移入し、かつアンピシリン耐性コロニーを単離した
。プラズミドpMTを制限分析によって特徴付けた(H
indII[を用いる分解により、2つの断片2.8k
bおよび4.65kbが得られた)。末端に5alI切
断個所を備えた、ハイブリドーマ系A20/44からの
に一遺転子をプラズミドp M TのSa1工中にリゲ
ートした。生じたプラズミドを部分的に5allで分解
し、ハイブリドーマ細胞量p A 20 / 44から
のγ1−遺伝子を9.25kb Sal断片としてリ
ゲートした。
ミドとして、pMTOIO/A+を使用した(DNA5
(1986)529〜537)。このブラズミドは、
後接したポリアデニル化個所(An)を有するヒツジ金
属チオネインプロモーター(pMT) 、SV40の早
期プロモーターの制御下でのマウス−ジヒドロ葉酸還元
酵素遺伝子のための表現カセット、SV40の早期プロ
モーターの制御下での新しいホスホ転移酵素のだめの表
現カセット、細菌複製源およびアンピシリン耐性をコー
ド化する1つの遺伝子を含有する。属するポリアデニル
化個所を有するヒツジ金属チオネインプロモーターをE
coRIおよび5alIでのプラズミドの分解によって
切断し、断片をヌクレアーゼS1で処理し、第1図に点
線で示された断片を低溶融性のアガロースゲルから単離
した。引続き、5allリンカ−をリゲートし、5al
lで後切断し、リンカ−を有する断片を低溶融性のアガ
ロースゲル上で単離し、再すゲートしくT4−リガーゼ
)、エシェリキア・コリHBIOI(DSM1607)
中に移入し、かつアンピシリン耐性コロニーを単離した
。プラズミドpMTを制限分析によって特徴付けた(H
indII[を用いる分解により、2つの断片2.8k
bおよび4.65kbが得られた)。末端に5alI切
断個所を備えた、ハイブリドーマ系A20/44からの
に一遺転子をプラズミドp M TのSa1工中にリゲ
ートした。生じたプラズミドを部分的に5allで分解
し、ハイブリドーマ細胞量p A 20 / 44から
のγ1−遺伝子を9.25kb Sal断片としてリ
ゲートした。
この場合、プラズミドpBMs1j;よびpsMS2は
、に−遺伝子に関連してγ1−遺伝子の異なる配向に相
応して生皮された(第2図)。
、に−遺伝子に関連してγ1−遺伝子の異なる配向に相
応して生皮された(第2図)。
プラズミドpBMslを旧ndI[rで分解することに
より、8.6kb;6.6kb;4.2kbおよび2.
8kbの断片が生じ、1972198MS2を旧ndI
[Iで分解することにより、11゜5kb ;6.6k
b ;2.8kbおよび1.3kbの断片が生じた。
より、8.6kb;6.6kb;4.2kbおよび2.
8kbの断片が生じ、1972198MS2を旧ndI
[Iで分解することにより、11゜5kb ;6.6k
b ;2.8kbおよび1.3kbの断片が生じた。
例3
免疫グロブリン遺伝子のための表現構造を有するハイブ
リドーマ生産細胞系の移入 プラズミドpBMs18よびpBMS 2を電気泳動法
(ElektroporationXBio−Radの
遺伝子パルサー)によって、Nucleic Ac1d
s Res、 l 5(1987)1311−1326
ないしはBi。
リドーマ生産細胞系の移入 プラズミドpBMs18よびpBMS 2を電気泳動法
(ElektroporationXBio−Radの
遺伝子パルサー)によって、Nucleic Ac1d
s Res、 l 5(1987)1311−1326
ないしはBi。
Techniques 6 (1988) 742〜7
51に記載の方法により、クレアチンキナーゼの千単位
Mとは反対方向に向いた抗体(抗体A)を分泌するバラ
ケル(Bucket)他、Gene51 (1980)
13〜’l 9に記載のハイブリドーマ系MAK33
(ECACC88091304)中に導入した。1回の
パルスあたりプラダミド−DNA I Opy hヨび
細胞lX106を使用シに 。
51に記載の方法により、クレアチンキナーゼの千単位
Mとは反対方向に向いた抗体(抗体A)を分泌するバラ
ケル(Bucket)他、Gene51 (1980)
13〜’l 9に記載のハイブリドーマ系MAK33
(ECACC88091304)中に導入した。1回の
パルスあたりプラダミド−DNA I Opy hヨび
細胞lX106を使用シに 。
遠心分離後、細胞を冷たいHeB5緩衝液で洗浄しくH
EPES20ミリモル、pH7,5NaCQf37ミリ
モル、KC05ミリモル、Na2HPO40−7ミリモ
ル、デキストロース6ミリモル)、HeB5緩衝液と一
緒に再懸濁させ、細胞106/m12の濃度に調節し、
かつ氷上においt;。プラズミド添加の後、パルス処理
した(条件:容量500μFおよび電圧範囲240〜3
50Vまたは160μFおよび200〜260 V)。
EPES20ミリモル、pH7,5NaCQf37ミリ
モル、KC05ミリモル、Na2HPO40−7ミリモ
ル、デキストロース6ミリモル)、HeB5緩衝液と一
緒に再懸濁させ、細胞106/m12の濃度に調節し、
かつ氷上においt;。プラズミド添加の後、パルス処理
した(条件:容量500μFおよび電圧範囲240〜3
50Vまたは160μFおよび200〜260 V)。
細胞をパルス処理の後に約IO分間氷上に便持し、引続
き媒体I (RPMI1640、ウシ胎児血清10%、
グルタミン2ミリモル/ Q;、ビル゛ビン酸ナトリウ
ム1ミリモル/ff、非必須アミノ酸01モル10中で
37°Cでインキュベートした。
き媒体I (RPMI1640、ウシ胎児血清10%、
グルタミン2ミリモル/ Q;、ビル゛ビン酸ナトリウ
ム1ミリモル/ff、非必須アミノ酸01モル10中で
37°Cでインキュベートした。
安定な形質転換細胞の選択は、媒体1m(2あたりG4
18 800μ9の濃度の際にG418含有媒体上にイ
ンキュベートすることによって行なわれた。
18 800μ9の濃度の際にG418含有媒体上にイ
ンキュベートすることによって行なわれた。
安定な形質転換細胞を約14日後に確認し、“限定希釈
” l:よって単離し、かつ媒体I中での大量培養で繁
殖させる。
” l:よって単離し、かつ媒体I中での大量培養で繁
殖させる。
例4
上澄み液中での免疫反応性蛋白質の測定測定をGene
56 (1987)205〜216の記載と同様にEL
I SA試験を用いて実施した。に−鎖の測定のため
に、マイクロ滴定板をヒツジからの抗マウス−1gGe
ne56(1,987)205〜216抗体で被覆し、
かつ移入された細胞からの上澄み液と一緒にインキュベ
ートした。洗浄後、標識化のためにペルオキシダーゼと
、マウス−Fab断片(IgG)とは反対方向を向いた
ヒツジ抗体(IgG)のFab断片との接合体を添加し
た。引続き、ペルオキシダーゼの基質としてABTS(
2,2−アジノージ−[3−エチル−ベンズチアゾリン
−スルホネート(6)])を添加し、呈色を405 n
mで溶液中に存在するに一鎖の量に対する尺度して測
定した。
56 (1987)205〜216の記載と同様にEL
I SA試験を用いて実施した。に−鎖の測定のため
に、マイクロ滴定板をヒツジからの抗マウス−1gGe
ne56(1,987)205〜216抗体で被覆し、
かつ移入された細胞からの上澄み液と一緒にインキュベ
ートした。洗浄後、標識化のためにペルオキシダーゼと
、マウス−Fab断片(IgG)とは反対方向を向いた
ヒツジ抗体(IgG)のFab断片との接合体を添加し
た。引続き、ペルオキシダーゼの基質としてABTS(
2,2−アジノージ−[3−エチル−ベンズチアゾリン
−スルホネート(6)])を添加し、呈色を405 n
mで溶液中に存在するに一鎖の量に対する尺度して測
定した。
γ−鎖を同様にして測定したが、この場合には、標識化
した受容体としてペルオキシダーゼと、マウスFc−γ
(II?G)とは反対方向に向いているヒツジからの抗
体のFab断片(IyG)を使用した。
した受容体としてペルオキシダーゼと、マウスFc−γ
(II?G)とは反対方向に向いているヒツジからの抗
体のFab断片(IyG)を使用した。
例5
抗体の分離
特異性を有する抗体A、BおよびABを含有する培養上
澄み液を、抗体Aとの結合能力を有する抗原が結合して
いるアフィニティーカラムでクロマトグラフィー処理し
た。抗体Bは、抗して分離することができた。抗体Aお
よびハイブリッド抗体ABを固定化抗原に結合させた。
澄み液を、抗体Aとの結合能力を有する抗原が結合して
いるアフィニティーカラムでクロマトグラフィー処理し
た。抗体Bは、抗して分離することができた。抗体Aお
よびハイブリッド抗体ABを固定化抗原に結合させた。
引続き、抗体へおよびハイブリッド抗体ABをグリシン
0.2モル/αの溶液、pH2,8、を用いて溶離し、
この溶出液を、抗体Bとの結合能力を有する抗原が固定
されているアフィニティーカラムでクロマトグラフィー
処理した。抗体Aは、カラムから流出する液体中に存在
し、抗体ABは、選択的に結合され、かつグリシン0.
2モル/Qの溶液、pH2,8、を用いて溶離すること
によって純粋に得ることができる。
0.2モル/αの溶液、pH2,8、を用いて溶離し、
この溶出液を、抗体Bとの結合能力を有する抗原が固定
されているアフィニティーカラムでクロマトグラフィー
処理した。抗体Aは、カラムから流出する液体中に存在
し、抗体ABは、選択的に結合され、かつグリシン0.
2モル/Qの溶液、pH2,8、を用いて溶離すること
によって純粋に得ることができる。
抗体の定義
抗体A:
ハイブリドーマ系MAK33のCK−MM−特異的抗体
抗体B:
例1による細胞系A20/44からの抗イデイオタイプ
抗体 抗体AB 抗体AおよびBからのハイブリッド抗体例6 ビオチニル化GK−MMの製造 GK−MM(タレアチンキナーゼ、EC2,7,3,2
)をコイチル(KeuLel)他、Arch、Bioc
hem、Biophys、l 50 (1972) 6
48の記載によりヒト骨格筋から単離した。燐酸カリウ
ム緩衝液30ミリモル中のGK−MM lomg (
0,12マイクロモル)の溶液、p H7、1、にジメ
チルスルホキシド50μα中のビオチニル−5−アミ7
カプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル0
,43マイクロモルをピペソトを用いて注入し、かつ水
浴中で60分間インキュベートした。引続き、試薬の過
剰量をカーボネート緩衝液2ミリモル、pH8,7、に
対する透析によって除去し、かつビオチニル化されたC
KMMを凍結乾燥した。
抗体 抗体AB 抗体AおよびBからのハイブリッド抗体例6 ビオチニル化GK−MMの製造 GK−MM(タレアチンキナーゼ、EC2,7,3,2
)をコイチル(KeuLel)他、Arch、Bioc
hem、Biophys、l 50 (1972) 6
48の記載によりヒト骨格筋から単離した。燐酸カリウ
ム緩衝液30ミリモル中のGK−MM lomg (
0,12マイクロモル)の溶液、p H7、1、にジメ
チルスルホキシド50μα中のビオチニル−5−アミ7
カプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル0
,43マイクロモルをピペソトを用いて注入し、かつ水
浴中で60分間インキュベートした。引続き、試薬の過
剰量をカーボネート緩衝液2ミリモル、pH8,7、に
対する透析によって除去し、かつビオチニル化されたC
KMMを凍結乾燥した。
例7
培養上澄み液中でのハイブリソド抗体の特異的測定
マイクロ滴定板の凹所を熱RNA−ストレプトアビジン
(燐酸カリウム40ミリモル/Q中の10pg/mQ、
、pH7,4(欧州特許出願公開第0269092号明
細書に記載により製造))で被覆した。緩衝液I (H
EPE350ミリモル/Q、 N a CQo 、15
モル/Q、クロティンC1%、pH7,0)を用いての
後被覆の後、ビオチニル化ヒトCK−MM(例6により
製造)(緩衝液■中でlμg/mQ)を負荷した。
(燐酸カリウム40ミリモル/Q中の10pg/mQ、
、pH7,4(欧州特許出願公開第0269092号明
細書に記載により製造))で被覆した。緩衝液I (H
EPE350ミリモル/Q、 N a CQo 、15
モル/Q、クロティンC1%、pH7,0)を用いての
後被覆の後、ビオチニル化ヒトCK−MM(例6により
製造)(緩衝液■中でlμg/mQ)を負荷した。
引続き、ハイブリッド−MAK ABを含有する細胞
培養上澄み液と一緒に室温で1時間インキュベートし、
引続き2回インキュベーション緩衝液(組成:HEPE
S50ミリモル、pH7,0、NaCl20.]、5モ
ル/Q、クロティンCi%、酒石酸ジナトリウム0.2
モル/Q、PEG40.OO00,75%、プルロニッ
クF680.5%、フェノール0.01%)で洗浄した
。その後に、抗体Bとは反対方向に向いた抗体(抗体C
)のPOD標識したFab断片(P○D活性1.27
m U/ mQ)と−緒にインキュベートした。接合体
基をHEPE350ミリモル/QS pH7,o、Na
Cf20.15ミリモル/Q1 プルロニンクF680
.1%を用いる3回の洗浄によって除去した。次に、標
識化の測定のために、PODのための基質としてABT
S [2,2′−アジノージ−3〜エチルベンズチアゾ
リンスルホナート1を添加し、1時間インキュベートし
、次いで405nmでの吸光度を光度計(ELISA−
読み取り装置)を用いて測定した。較正曲線を、抗体A
のFab断片で抗体Bを横方向に架橋することによって
得られた、モデルのハイブリッド抗体を用いて調節した
。標準の使用した濃度は、O〜11.5 ng/mQで
あった。
培養上澄み液と一緒に室温で1時間インキュベートし、
引続き2回インキュベーション緩衝液(組成:HEPE
S50ミリモル、pH7,0、NaCl20.]、5モ
ル/Q、クロティンCi%、酒石酸ジナトリウム0.2
モル/Q、PEG40.OO00,75%、プルロニッ
クF680.5%、フェノール0.01%)で洗浄した
。その後に、抗体Bとは反対方向に向いた抗体(抗体C
)のPOD標識したFab断片(P○D活性1.27
m U/ mQ)と−緒にインキュベートした。接合体
基をHEPE350ミリモル/QS pH7,o、Na
Cf20.15ミリモル/Q1 プルロニンクF680
.1%を用いる3回の洗浄によって除去した。次に、標
識化の測定のために、PODのための基質としてABT
S [2,2′−アジノージ−3〜エチルベンズチアゾ
リンスルホナート1を添加し、1時間インキュベートし
、次いで405nmでの吸光度を光度計(ELISA−
読み取り装置)を用いて測定した。較正曲線を、抗体A
のFab断片で抗体Bを横方向に架橋することによって
得られた、モデルのハイブリッド抗体を用いて調節した
。標準の使用した濃度は、O〜11.5 ng/mQで
あった。
例8
抗体Bの測定
マイクロ滴定板を抗体C(ニトロフェノールとは反対方
向を向いた)で被覆した。被覆緩衝液は、カーボネート
/ビカーボネート0.2ミリモル/Q、pH9,4から
戊り立っていた。2時間の後、この板を後被覆緩衝液(
HEPE350ミリモル/Q、 N a CQo 、1
5モル/L クロティンC1%、pH7,0)と−緒に
30分間インキュベートした。全ての反応を室温で振盪
させながら実施した。較正曲線を抗体Bを有する標準溶
液を用いて調節した。較正試料および細胞上澄み液を媒
体■で希釈し、かつ室温で2時間インキュベートした。
向を向いた)で被覆した。被覆緩衝液は、カーボネート
/ビカーボネート0.2ミリモル/Q、pH9,4から
戊り立っていた。2時間の後、この板を後被覆緩衝液(
HEPE350ミリモル/Q、 N a CQo 、1
5モル/L クロティンC1%、pH7,0)と−緒に
30分間インキュベートした。全ての反応を室温で振盪
させながら実施した。較正曲線を抗体Bを有する標準溶
液を用いて調節した。較正試料および細胞上澄み液を媒
体■で希釈し、かつ室温で2時間インキュベートした。
凹所の吸引濾過およびインキュベーション緩衝液(HE
PES50ミリモル/Q1 N a CQO,15ミリ
モル/Q。
PES50ミリモル/Q1 N a CQO,15ミリ
モル/Q。
酒石酸ジナトリウム0.2モル/Q、クロティンC1%
、PEG40000 0.75%、プルロニンクF68
0.5%、フェノール0.01%、pH7,0)での
2回の洗浄の後、1時間の接合体インキュベーションを
行なった。そのために、抗体CのFab断片とPODと
の接合体を使用し、この接合体をインキュベーション緩
衝液中でPOD活性159mU/mQに希釈した。吸引
濾過および洗浄緩衝液(HEPES50 ミ リ モ
ル/Q、 N a CQo 、1 5 ミ
リ モル/QプルロニックF68 0.1%、pH7,
0)での凹所の3回の洗浄の後、60分間基質としての
ABTSと反応させた。吸光度を光度計(ELISA−
読み取り装置)で405nmの際に490nmに対して
測定した。試料の濃度を標準較正曲線により測定した。
、PEG40000 0.75%、プルロニンクF68
0.5%、フェノール0.01%、pH7,0)での
2回の洗浄の後、1時間の接合体インキュベーションを
行なった。そのために、抗体CのFab断片とPODと
の接合体を使用し、この接合体をインキュベーション緩
衝液中でPOD活性159mU/mQに希釈した。吸引
濾過および洗浄緩衝液(HEPES50 ミ リ モ
ル/Q、 N a CQo 、1 5 ミ
リ モル/QプルロニックF68 0.1%、pH7,
0)での凹所の3回の洗浄の後、60分間基質としての
ABTSと反応させた。吸光度を光度計(ELISA−
読み取り装置)で405nmの際に490nmに対して
測定した。試料の濃度を標準較正曲線により測定した。
例9
抗体AおよびABの測定
熱R3Aストレプトアビジン(lopg/mQ)を固体
相(96個の凹所を有するマイクロ滴定板、Nune)
で被覆緩衝液(燐酸カリウム緩衝液pH7,4)中に吸
着させた。結合していないストレプトアビジンを注意深
く除去し、非特異性結合個所を後被覆溶液(燐酸カリウ
ム緩衝液50ミリモル/Q、N a CQo 、15モ
ル/LR5A 1%、7.5)で飽和させた。較正試料
(抗体A−CK−MM特異性)および培養上澄み液を塗
布前に例6での得られたビオチニル化CK−MM (5
00ng/mQ)で1:10で希釈した。試料の1時間
のインキュベーションノ後2回上記のインキュベーショ
ン緩衝液で洗浄した。次いで、ヤギの場合に得られた(
POD活性130mU/mO、マウス■gGのFc部分
とは反対方向を向いたPOD標識化ポリクロナール抗体
と一緒に1時間インキュベートした。基質ABTSを用
いるインキュベーションの後、405nmでの吸光度を
光度計(ELISA−読み取り装置)で測定した。
相(96個の凹所を有するマイクロ滴定板、Nune)
で被覆緩衝液(燐酸カリウム緩衝液pH7,4)中に吸
着させた。結合していないストレプトアビジンを注意深
く除去し、非特異性結合個所を後被覆溶液(燐酸カリウ
ム緩衝液50ミリモル/Q、N a CQo 、15モ
ル/LR5A 1%、7.5)で飽和させた。較正試料
(抗体A−CK−MM特異性)および培養上澄み液を塗
布前に例6での得られたビオチニル化CK−MM (5
00ng/mQ)で1:10で希釈した。試料の1時間
のインキュベーションノ後2回上記のインキュベーショ
ン緩衝液で洗浄した。次いで、ヤギの場合に得られた(
POD活性130mU/mO、マウス■gGのFc部分
とは反対方向を向いたPOD標識化ポリクロナール抗体
と一緒に1時間インキュベートした。基質ABTSを用
いるインキュベーションの後、405nmでの吸光度を
光度計(ELISA−読み取り装置)で測定した。
抗体Aの含量を抗体(A+B)の濃度から抗体(A B
)の濃度を差し引くことによって測定しt二。
)の濃度を差し引くことによって測定しt二。
例10
抗体へおよびABの測定
マイクロ滴定板をマウス1gGのFc7部分とは反対方
向に向いたヒツジ■gGを用いて重炭酸塩0.2モル/
Q/炭酸塩緩衝液(pH9゜5)中でIOμg/mQ被
覆した。結合していない抗体を除去し、非特異性結合個
所を後被覆溶液(燐酸カリウム50ミリモル/Q、Na
CQO,15モル/12.R5A(牛血清アルブミン)
1%、pH7,5%)によって飽和した。全ての反応は
、室温で振盪させながら行なった。培養上澄み液を燐酸
カリウム50ミリモル/Q。
向に向いたヒツジ■gGを用いて重炭酸塩0.2モル/
Q/炭酸塩緩衝液(pH9゜5)中でIOμg/mQ被
覆した。結合していない抗体を除去し、非特異性結合個
所を後被覆溶液(燐酸カリウム50ミリモル/Q、Na
CQO,15モル/12.R5A(牛血清アルブミン)
1%、pH7,5%)によって飽和した。全ての反応は
、室温で振盪させながら行なった。培養上澄み液を燐酸
カリウム50ミリモル/Q。
pH7,5、酒石酸ナトリウム0.2モル、R3穴1%
を用いて希釈し、かつ1時間インキュベートした。イン
キュベーション緩衝液を用いて2回の洗浄の後、インキ
ュベーションをPODと抗体C゛のFab断片との接合
体を用いて行なった(POD活性130 mU/m(2
) 、洗浄の後、ABTSと一緒にインキュベートし、
かつ60分間の後に吸光度を光度計(ELISA−読み
取り装置)で405nmで測定した。較正曲線を精製し
た抗体Bを用いて記載した。
を用いて希釈し、かつ1時間インキュベートした。イン
キュベーション緩衝液を用いて2回の洗浄の後、インキ
ュベーションをPODと抗体C゛のFab断片との接合
体を用いて行なった(POD活性130 mU/m(2
) 、洗浄の後、ABTSと一緒にインキュベートし、
かつ60分間の後に吸光度を光度計(ELISA−読み
取り装置)で405nmで測定した。較正曲線を精製し
た抗体Bを用いて記載した。
抗体Bの含量は、抗体B十ABの濃度から抗体ABの濃
度を差し引くことによって計算した例11 抗体A、BおよびABの収量の比較 プラスミドル BMS I CK−MMに対して特異性
の抗体Aを生産する細胞系MAK33中に移入し、G4
18耐性コロニーを単離し、かつ24時間上澄み液中に
細胞106個を播種した後、次のパラメーターを記載し
たように測定した。
度を差し引くことによって計算した例11 抗体A、BおよびABの収量の比較 プラスミドル BMS I CK−MMに対して特異性
の抗体Aを生産する細胞系MAK33中に移入し、G4
18耐性コロニーを単離し、かつ24時間上澄み液中に
細胞106個を播種した後、次のパラメーターを記載し
たように測定した。
a)抗体AB
b)抗体B
C)抗体A
結果は、第1表に示しである。
第1表
同様の結果は、プラス2198MS2を使用した場合に
も得られた。
も得られた。
第1図は、表現プラスミドを構築する際の初期構造を示
す遺伝子地図であり、この場合第1図中でXは、上から
順にEcoxSal、ヌクレア−451,分離指示断片
、5alIリンカ−1Sailレリゲートを表わし、 第2図は、表現ベクターを示す遺伝子地図である。
す遺伝子地図であり、この場合第1図中でXは、上から
順にEcoxSal、ヌクレア−451,分離指示断片
、5alIリンカ−1Sailレリゲートを表わし、 第2図は、表現ベクターを示す遺伝子地図である。
FIG、1
−1
FIG 、 2
1
Claims (1)
- 1、抗原結合個所Aおよび抗原結合個所Bを有するヘテ
ロ二重特異性モノクローナル抗体を製造する方法におい
て、抗原結合個所Aを有する抗体を分泌するハイブリド
ーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、重鎮の可変部分な
らびにc_H1領域を単離する軽鎖に対して真核プラス
ミドベクター中に挿入し、この表現ベクターを抗原結合
個所Bを有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中
に移入し、この細胞系を培養し、抗体を取得し、二重特
異性抗体を分離することを特徴とする、ヘテロ二重特異
性モノクローナル抗体の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3909708A DE3909708A1 (de) | 1989-03-23 | 1989-03-23 | Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper |
DE3909708.0 | 1989-03-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0335800A true JPH0335800A (ja) | 1991-02-15 |
JPH0716436B2 JPH0716436B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=6377122
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2069910A Expired - Fee Related JPH0716436B2 (ja) | 1989-03-23 | 1990-03-22 | ヘテロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6060285A (ja) |
EP (1) | EP0388964B1 (ja) |
JP (1) | JPH0716436B2 (ja) |
AT (1) | ATE113659T1 (ja) |
CA (1) | CA2012631C (ja) |
DE (2) | DE3909708A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10988064B2 (en) | 2014-10-06 | 2021-04-27 | Ts Tech Co., Ltd. | Epidermis material for vehicle seat |
Families Citing this family (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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