JPH0335800A - ヘテロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヘテロ二重特異性抗体の製造法に関する。

従来の技術 ヘテロ二重特異性抗体またはへテロニ官能性抗体は、２
つの異なる抗原結合個所を有する、すなわち２つの異な
るエピトープとは反対方向に向いている抗体である。ヘ
テロ三官能性抗体は、疾病の治療に使用することができ
る。従って、二重特異性抗体は、例えば癌腫細胞の細胞
表面の抗原に対する１つの抗原結合個所および特定の医
薬に対する１つの抗原結合個所を有することができる。

更に、・この方法で、癌腫細胞に対する治療剤が特異的
に惹起される。もう１つの別の変種は、１つの抗原結合
個所がＴ−細胞一表面一抗原とは反対方向に向いており
かつ別の抗原結合個所がビールスの抗原決定因子とは反
対方向に向いている二重特異性抗体である。

この種の抗体は、意図的に血液中のビールスを破壊する
ことができるものとされている。

二重特異性抗体の製造法は、既に公知である、すなわち
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ｔｌｓＡ
、８３　（１９８６）、４４７９−４４８３およびＥｕ
ｒ　、　Ｊ　。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１７　　（１９８７）　　、　５７
　１〜５７４には、スペーサーの使用下で２つの異なる
抗体を化学的に互いに結合させる方法が記載されている
。しかし、この方法は、費用がかかりかつ抗体の新規の
トポロジカルな形勢を生じる。

更に、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳ
Ａ、８３　（１９８６）、１４５３〜１４５７の記載か
ら、それぞれ異なる抗体を分泌する２つの細胞系を互い
に融合させる方法は、公知である。この場合には、二重
の染色体の組みを含有するハイブリドーマ細胞が生じ、
望ましいヘテロ三官能性抗体が生産される。この方法の
欠点は、得られた細胞系列が屡々不安定であり、したが
って工業的規模でのへテロニ官能性抗体の生産には不適
当であることにある。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は、二重特異性抗体を良好な収量
で得ることができかつ工業的規模で実施することができ
る１つの方法を提供することであった。

課題を解決するための手段 この課題は、望ましい特異性を有する抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、軽鎖およ
び重鎮の可変部分に対して単離し、真核プラスミドベク
ター中に挿入し、この表現ベクターを第２の望ましい特
異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
移入し、この細胞系を培養し、抗体を取得し、二重特異
性抗体を分離することを特徴とする、二重特異性モノク
ローナル抗体を製造する方法によって解決される。

意外なことに、本発明方法によれば、二重特異性抗体を
高い収量で得ることに成功する。本発明により使用され
る移入されたノ・イブリドーマ細胞系は、ハイブリドー
マ細胞系のゲノムならびに表現ベクターによってコード
化されているホモ官能性抗体を表現し、ならびにハイブ
リドーマ宿主細胞の抗原結合個所および移入されたベク
ターの抗原結合個所を有する、２つの抗体の遺伝子から
形成されたヘテロ三官能性抗体を表現する。意外なこと
に、このヘテロ三官能性抗体の収量は極めて高い。ヘテ
ロ三官能性抗体は、２つのホモ官能性抗体とともに簡単
な方法で、例えば固体の担体に固定されている抗原の１
つに結合させ、かつ標識化されかつ可溶性で使用される
別の抗原に結合させることによって測定される。

二重特異性抗体を本発明により製造するために、真核表
現ベクターは、ハイブリドーマ細胞系中に導入される。

真核表現ベクターは、本質的な要素として選択可能なマ
ーカー、強力なプロモーターおよび完全または不完全な
抗体を表現するための遺伝子を含有する。免疫グロブリ
ン遺伝子を挿入するために、当業者に知られている多数
の種々の真核プラズミドベクターが適当である。適当な
のは、例えば次のベクターである： ａ）ホスホトランスフェラーゼを新たに表現するベクタ
ー　この場合形質転換細胞の選択は、抗生物質Ｇ４１８
を用いて行なわれる。このベクターは、Ｐ、５ｏｕｔｈ
ｅｒｎおよびＰ、Ｂｅｒｇｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅ
ｎｅｔ、ｌ　　（１９８２）　、３２７〜３４１に記載
されている。

ｂ）エシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）キサンチン−
グアニン−ホスホリボシル−転移酵素を表現するベクタ
ー　この場合形質転換細胞の選択は、マイコフェノール
酸耐性に対して行なわれる。このベクターは、Ｒ，Ｍｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＰ、Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７８　（１
９８１）　、２０７２〜２０７６に記載されている。

Ｃ）“条桑耐性（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅ）”遺伝子を表現するベクター　この場合、選
択は、例えばコルキシン、ビンブラスチン、アドリアマ
イシンまたはアドリアマイシンＤのような薬剤を用いて
行なわれる。このベクターは、Ｓ、Ｅ。

Ｋａｎｅ、Ｂ、Ｒ，Ｔｒｏｅｎ、Ｓ、Ｇａｌ　、に、Ｋ
ｉｄａ、　１．Ｐａ５ｔａｎおよびＭ、Ｍ、Ｇｏｔｔａ
ｓｍａｎ、Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
８　（１９８８）、３３１６〜３３２１ならびにり、Ｗ
、５ｈｏｕ、＾、Ｆｏｉｏ、１．Ｂ、Ｒｏｎｉｎｓｏｎ
、Ｊ、Ｅ、Ｃｈｉｎ、Ｒ，Ｓｏｆｆｉｒ−１、Ｐａ５Ｌ
ａｎ８よびＭ、Ｍ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｍｏ１．　ａ
ｎ−ｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６　（１９８６）、４０
３９〜４０４４に記載されている。

ｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素またはメトトレキセートに対
して減少された親和力を有する突然変異体を表現するベ
クター。形質転換細胞の選択は、メトトレキセート含有
媒体中での成長によって行なわれる。ベクターは、Ｒ，
ＫａｕｆｍａｎおよびＰ、Ａ、５ｈａｒｐ、Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、　ｌ　５９　（１９８２）、６０１〜
６２１およびＣ，Ｃ，Ｓｉｍｏｎｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵＳＡ８０　、（１９
８３）　、２４９５〜２４９９に記載されている。

これらのベクターは、全部が既に選択可能なマーカーを
有する。出発ベクターとしては、例えばグラス２ビ９ ことができる。

ベクター中には、少なくとも望ましい特異性の抗体の可
変部分およびｃＨ１領域または完全な抗体をコード化す
る免疫グロブリン遺伝子が自体公知の方法で挿入される
。この場合には、望ましい特異性の抗体を生産するハイ
ブリドーマから相応するＤＮＡを取得しかつベクター中
に結合することができるか、或いは望ましい免疫グロブ
リン遺伝子のゲノムＤＮＡを使用することできる（Ｂｕ
ｃｋｅｌ他、Ｇｅｎｅ　５　１　　（　１　９’８　０
）１３〜１９参照）。

免疫グロブリン遺伝子としては、少なくとも軽鎖に対す
る遺伝子、重鎮の可変部分に対する遺伝子および望まし
い抗体のｃＨ１領域に対する遺伝子が使用される。

軽鎖のだめの遺伝子は、に−鎖またはλ−鎖のための遺
伝子であることができる。それぞれ完全な遺伝子が使用
される。所望の抗体の種類に依存して、重鎮のための遺
伝子は選択される。

抗体の種類に応じて、遺伝子は、μ、γ１　γ２γ３　
γ４　α１　α２　ａまたはε−鎖から選択される。こ
の°場合には、全ての情報を重鎮に対して使用すること
ができるか、または重鎮に対してコード化されているＤ
ＮＡの一部のみを使用することができる。必要に応じて
、Ｃ　Ｈ　２　−Ｃ　Ｈ　３−ならびに場合によっては
Ｃ　）（　４領域は、得るべき抗体の望ましい種類に依
存してならびに使用されるハイブリドーマ細胞系に依存
して選択される。本発明により製造された二重特異性抗
体が人体での治療的処置に定められている場合には、ヒ
トの免疫グロブリンのＣ　Ｈ　１　−Ｃ　Ｈ　２　−　
　ｃ　Ｈ３−および場合によってはＣ　Ｈ　４領域を使
用することは、有利である。

本発明による方法の１つの実施態様の場合には、軽鎖に
対するに一遺転子およびマウス抗体またはヒト抗体の７
１−遺伝子を含有する表現ベクターが使用されている。

真核表現ベクターの１つの好ましい成分は、１つの強い
プロモーターである。高い生産率を生じるプロモーター
は、当業者に知られている。例えば、ＳＶ４　０の早期
または遅早プロモーター、軽鎖および重鎮に対する免疫
グロブリンブロモ−ター、サイトメガリエ（　Ｃｙｔｏ
ｍｅｇａｌ　ｉｅ）ービールスープロモーターならびに
メタロチオナイン（Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）
−プロモーターが適当である。全く同様に、別の構成ビ
ールス性または細胞性プロモーターは適当である。

こうして構成されｔ；真核表現ベクターは、抗原結合個
所Ａを有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
移入される。このためには、望ましい結合個所を有する
抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が適当である。有
利には、製造すべき抗体に由来する種類の抗体を生じる
ハイブリドーマ細胞系が使用される。殊に、マウスハイ
ブリドーマ細胞系またはヒトハイブリドーマ細胞系が適
当である。

表現ベクターのトランスフェクションは、自体公知の方
法で行なわれる。有利にトランスフェクションは、電気
泳動によって実施される（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ．１　５　（１　９　８７）　１　３　１　１
〜１　３　２　６　；Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６
　（１　９　８　８）　７４２〜７５１）。

こうして得られた移入された細胞系は、相応するマーカ
ー上に向かって選択され、培養され、次に抗体は、自体
公知の方法で得られる（例えば、Ａ　−Ｙ　−Ｌ　ｒ　
ｕ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
８４（１９８７）　　３４３９　；　Ｓ、Ｌ、Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ＵＳＡ　
　８　１　　（１９８４）　　６　８　５　１　）−移
入された細胞系は、宿主−ハイブリドーマ細胞系を分泌
するホモ三官能性抗体ならびに真核表現ベクターにより
コード化されるホモ三官能性抗体、ならびに２つの異な
る抗原結合個所を有するヘテロ三官能性抗体を生産する
。移入された表現ベクターが、抗原結合個所Ｂを有する
抗体の可変領域に対する情報のみを含有する場合には、
特異性Ｂを有する半抗体として、−定の部分が宿主細胞
によってコード化された抗体に相当するものが形成され
、シｔ；がって２つの半抗体を組み合わせた場合には、
抗原−結合個所ＡおよびＢならびに宿主ハイブリドーマ
細胞によって形成された抗体の一定部分を有する二重特
異性抗体が生じる。

しかし、ヘテロ三官能性抗体の形成の前記解釈は、別の
予想される結合方法を排除するものではなく、説明のた
めの試験のみを表わすものである。

ヘテロ三官能性抗体は、意外にも高い収量で分泌される
。望ましい抗体の形成は、それ自体免疫グロブリンを全
く生産し得ないハイブリドーマ宿主細胞に比して１０倍
だけ高いことが見い出された。このことは、本発明によ
り得られた細胞系がＩＯ倍だけ高められた抗体生産率を
示すことを意味する。

１０個の異なる抗体種の混合物（２つの抗体の軽鎖およ
び重鎮の全ての可能な組合せ物）を含有する培養上澄み
液から被検抗体は、公知方法で分離することができる。

有利には、望ましい抗体は、免疫吸着によって分離され
る。特に有利な実施態様の場合、二官能性抗体の分離は
２段階で行なわれる。まず、全部の抗体種を含有する溶
液を抗原結合個所へと結合可能な抗原と結合させ、この
場合抗体ＡおよびＡＢは吸着される。結合した抗体の溶
離後、第２段階で一宮能性抗体および二官能性抗体を含
有する溶液から、抗原結合個所Ｂと結合可能な抗原の吸
着によってヘテロ三官能性抗体は、選択的にホモ二官能
性抗体Ａと分離される。ヘテロ三官能性抗体は、溶離に
よって高い純度で得ることができる。

本発明によれば、顕著な収率でヘテロ三官能性抗体を得
ることができる方法が提供される。

この抗体は、なかんずく癌腫またはビールスによって惹
起される疾病の治療への使用に適当である。使用目的に
応じて、望ましい抗原決定因子を選択することができる
。従って、当該医師には第２の抗原決定因子のそれぞれ
有利な組合せ物を見い出すために幅広い領域が残されて
いる。更に、なお種々の生理学的方法に役立つ抗体のＦ
ｃ部分を変える可能性が存在する。

プ５スミ）’ｐＢＭｓ１　　（ＤＳＭ５２２９）および
ｐ　ＢＭＳ　２　（ＤＳＭ５２３０）ならびに微生物エ
シェリキア・コリＨＢ　ｌ　０１　（ＤＳＭＩ６０７）
は、ドイチェン・ザムルング・フォノ・ミクロオルガニ
スメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓａｍ＋ａｌｕｎｇｖｏ
ｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ）に寄託されている
。ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ３３は、番号ＥＣＡＣＣ
８８０９１４１０でヨーロッピアン・コレクション・オ
ブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１
ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）に寄託されている。

実施例 例１ 免疫グロプリシ遺伝子の単離 サブリツキー（Ｆ、５ａｂｌｉｔｚｋｙ）、ヴイルトナ
ー（Ｇ、Ｗｉｌｄｎｅｒ）８よびライエフスキー（Ｋ、
Ｒａｊｅｗｓｋｉ）、ＥＭＢＯＪ、４　（１９８５）３
４５〜３５０ならびにコックス（Ｃｈｒ、Ｋｏｃｋｓ）
およびライエフスキー（Ｋ、Ｒａｊｅｗｓｋｉ）、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８８）　８５．８２０６〜８２１
０に記載の方法により、マウス−ハイブリドーマ系Ａ２
０／４４から、モノクロナールマウスλ、γ２ａ抗ニト
ロフェノール抗体とは反対方向に向いている抗イデイオ
タイプ抗体（抗体Ｂ）を分泌させ、モノクロナール抗体
のに〜遺伝子お上びγ、−；貴伝子を転子した７ 活性遺伝子１ｎｓａｌｌ−リンカ−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧ
）を備えさせ、かつｐＵｃ１８またはｐＢＲ３２２にサ
ブクローン化した。軽鎖に対する遺伝子を５．５ｋｂ断
片によってコード化し、重鎮に対する遺伝子を９．２５
ｋｂ断片によってコード化した。

例２ 免疫グロブリン遺伝子の表現ベクターの構築出発プラズ
ミドとして、ｐＭＴＯＩＯ／Ａ＋を使用した（ＤＮＡ５
　（１９８６）５２９〜５３７）。このブラズミドは、
後接したポリアデニル化個所（Ａｎ）を有するヒツジ金
属チオネインプロモーター（ｐＭＴ）　、ＳＶ４０の早
期プロモーターの制御下でのマウス−ジヒドロ葉酸還元
酵素遺伝子のための表現カセット、ＳＶ４０の早期プロ
モーターの制御下での新しいホスホ転移酵素のだめの表
現カセット、細菌複製源およびアンピシリン耐性をコー
ド化する１つの遺伝子を含有する。属するポリアデニル
化個所を有するヒツジ金属チオネインプロモーターをＥ
ｃｏＲＩおよび５ａｌＩでのプラズミドの分解によって
切断し、断片をヌクレアーゼＳ１で処理し、第１図に点
線で示された断片を低溶融性のアガロースゲルから単離
した。引続き、５ａｌｌリンカ−をリゲートし、５ａｌ
ｌで後切断し、リンカ−を有する断片を低溶融性のアガ
ロースゲル上で単離し、再すゲートしくＴ４−リガーゼ
）、エシェリキア・コリＨＢＩＯＩ（ＤＳＭ１６０７）
中に移入し、かつアンピシリン耐性コロニーを単離した
。プラズミドｐＭＴを制限分析によって特徴付けた（Ｈ
ｉｎｄＩＩ［を用いる分解により、２つの断片２．８ｋ
ｂおよび４．６５ｋｂが得られた）。末端に５ａｌＩ切
断個所を備えた、ハイブリドーマ系Ａ２０／４４からの
に一遺転子をプラズミドｐ　Ｍ　ＴのＳａ１工中にリゲ
ートした。生じたプラズミドを部分的に５ａｌｌで分解
し、ハイブリドーマ細胞量ｐ　Ａ　２０　／　４４から
のγ１−遺伝子を９．２５ｋｂ　　Ｓａｌ断片としてリ
ゲートした。

この場合、プラズミドｐＢＭｓ１ｊ；よびｐｓＭＳ２は
、に−遺伝子に関連してγ１−遺伝子の異なる配向に相
応して生皮された（第２図）。

プラズミドｐＢＭｓｌを旧ｎｄＩ［ｒで分解することに
より、８．６ｋｂ；６．６ｋｂ；４．２ｋｂおよび２．
８ｋｂの断片が生じ、１９７２１９８ＭＳ２を旧ｎｄＩ
［Ｉで分解することにより、１１゜５ｋｂ　；６．６ｋ
ｂ　；２．８ｋｂおよび１．３ｋｂの断片が生じた。

例３ 免疫グロブリン遺伝子のための表現構造を有するハイブ
リドーマ生産細胞系の移入 プラズミドｐＢＭｓ１８よびｐＢＭＳ　２を電気泳動法
（ＥｌｅｋｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎＸＢｉｏ−Ｒａｄの
遺伝子パルサー）によって、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　ｌ　５（１９８７）１３１１−１３２６
ないしはＢｉ。

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６　（１９８８）　７４２〜７
５１に記載の方法により、クレアチンキナーゼの千単位
Ｍとは反対方向に向いた抗体（抗体Ａ）を分泌するバラ
ケル（Ｂｕｃｋｅｔ）他、Ｇｅｎｅ５１　（１９８０）
１３〜’ｌ　９に記載のハイブリドーマ系ＭＡＫ３３　
（ＥＣＡＣＣ８８０９１３０４）中に導入した。１回の
パルスあたりプラダミド−ＤＮＡ　Ｉ　Ｏｐｙ　ｈヨび
細胞ｌＸ１０６を使用シに　。

遠心分離後、細胞を冷たいＨｅＢ５緩衝液で洗浄しくＨ
ＥＰＥＳ２０ミリモル、ｐＨ７，５ＮａＣＱｆ３７ミリ
モル、ＫＣ０５ミリモル、Ｎａ２ＨＰＯ４０−７ミリモ
ル、デキストロース６ミリモル）、ＨｅＢ５緩衝液と一
緒に再懸濁させ、細胞１０６／ｍ１２の濃度に調節し、
かつ氷上においｔ；。プラズミド添加の後、パルス処理
した（条件：容量５００μＦおよび電圧範囲２４０〜３
５０Ｖまたは１６０μＦおよび２００〜２６０　Ｖ）。

細胞をパルス処理の後に約ＩＯ分間氷上に便持し、引続
き媒体Ｉ　（ＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清１０％、
グルタミン２ミリモル／　Ｑ；、ビル゛ビン酸ナトリウ
ム１ミリモル／ｆｆ、非必須アミノ酸０１モル１０中で
３７°Ｃでインキュベートした。

安定な形質転換細胞の選択は、媒体１ｍ（２あたりＧ４
１８　８００μ９の濃度の際にＧ４１８含有媒体上にイ
ンキュベートすることによって行なわれた。

安定な形質転換細胞を約１４日後に確認し、“限定希釈
”　ｌ：よって単離し、かつ媒体Ｉ中での大量培養で繁
殖させる。

例４ 上澄み液中での免疫反応性蛋白質の測定測定をＧｅｎｅ
５６　（１９８７）２０５〜２１６の記載と同様にＥＬ
　Ｉ　ＳＡ試験を用いて実施した。に−鎖の測定のため
に、マイクロ滴定板をヒツジからの抗マウス−１ｇＧｅ
ｎｅ５６（１，９８７）２０５〜２１６抗体で被覆し、
かつ移入された細胞からの上澄み液と一緒にインキュベ
ートした。洗浄後、標識化のためにペルオキシダーゼと
、マウス−Ｆａｂ断片（ＩｇＧ）とは反対方向を向いた
ヒツジ抗体（ＩｇＧ）のＦａｂ断片との接合体を添加し
た。引続き、ペルオキシダーゼの基質としてＡＢＴＳ（
２，２−アジノージ−［３−エチル−ベンズチアゾリン
−スルホネート（６）］）を添加し、呈色を４０５　ｎ
　ｍで溶液中に存在するに一鎖の量に対する尺度して測
定した。

γ−鎖を同様にして測定したが、この場合には、標識化
した受容体としてペルオキシダーゼと、マウスＦｃ−γ
（ＩＩ？Ｇ）とは反対方向に向いているヒツジからの抗
体のＦａｂ断片（ＩｙＧ）を使用した。

例５ 抗体の分離 特異性を有する抗体Ａ、ＢおよびＡＢを含有する培養上
澄み液を、抗体Ａとの結合能力を有する抗原が結合して
いるアフィニティーカラムでクロマトグラフィー処理し
た。抗体Ｂは、抗して分離することができた。抗体Ａお
よびハイブリッド抗体ＡＢを固定化抗原に結合させた。

引続き、抗体へおよびハイブリッド抗体ＡＢをグリシン
０．２モル／αの溶液、ｐＨ２，８、を用いて溶離し、
この溶出液を、抗体Ｂとの結合能力を有する抗原が固定
されているアフィニティーカラムでクロマトグラフィー
処理した。抗体Ａは、カラムから流出する液体中に存在
し、抗体ＡＢは、選択的に結合され、かつグリシン０．
２モル／Ｑの溶液、ｐＨ２，８、を用いて溶離すること
によって純粋に得ることができる。

抗体の定義 抗体Ａ： ハイブリドーマ系ＭＡＫ３３のＣＫ−ＭＭ−特異的抗体 抗体Ｂ： 例１による細胞系Ａ２０／４４からの抗イデイオタイプ
抗体 抗体ＡＢ 抗体ＡおよびＢからのハイブリッド抗体例６ ビオチニル化ＧＫ−ＭＭの製造 ＧＫ−ＭＭ（タレアチンキナーゼ、ＥＣ２，７，３，２
）をコイチル（ＫｅｕＬｅｌ）他、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｌ　５０　（１９７２）　６
４８の記載によりヒト骨格筋から単離した。燐酸カリウ
ム緩衝液３０ミリモル中のＧＫ−ＭＭ　　ｌｏｍｇ　（
０，１２マイクロモル）の溶液、ｐ　Ｈ７、１、にジメ
チルスルホキシド５０μα中のビオチニル−５−アミ７
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０
，４３マイクロモルをピペソトを用いて注入し、かつ水
浴中で６０分間インキュベートした。引続き、試薬の過
剰量をカーボネート緩衝液２ミリモル、ｐＨ８，７、に
対する透析によって除去し、かつビオチニル化されたＣ
ＫＭＭを凍結乾燥した。

例７ 培養上澄み液中でのハイブリソド抗体の特異的測定 マイクロ滴定板の凹所を熱ＲＮＡ−ストレプトアビジン
（燐酸カリウム４０ミリモル／Ｑ中の１０ｐｇ／ｍＱ、
、ｐＨ７，４（欧州特許出願公開第０２６９０９２号明
細書に記載により製造））で被覆した。緩衝液Ｉ　（Ｈ
ＥＰＥ３５０ミリモル／Ｑ、　Ｎ　ａ　ＣＱｏ　、１５
モル／Ｑ、クロティンＣ１％、ｐＨ７，０）を用いての
後被覆の後、ビオチニル化ヒトＣＫ−ＭＭ（例６により
製造）（緩衝液■中でｌμｇ／ｍＱ）を負荷した。

引続き、ハイブリッド−ＭＡＫ　　ＡＢを含有する細胞
培養上澄み液と一緒に室温で１時間インキュベートし、
引続き２回インキュベーション緩衝液（組成：ＨＥＰＥ
Ｓ５０ミリモル、ｐＨ７，０、ＮａＣｌ２０．］、５モ
ル／Ｑ、クロティンＣｉ％、酒石酸ジナトリウム０．２
モル／Ｑ、ＰＥＧ４０．ＯＯ００，７５％、プルロニッ
クＦ６８０．５％、フェノール０．０１％）で洗浄した
。その後に、抗体Ｂとは反対方向に向いた抗体（抗体Ｃ
）のＰＯＤ標識したＦａｂ断片（Ｐ○Ｄ活性１．２７　
ｍ　Ｕ／　ｍＱ）と−緒にインキュベートした。接合体
基をＨＥＰＥ３５０ミリモル／ＱＳ　ｐＨ７，ｏ、Ｎａ
Ｃｆ２０．１５ミリモル／Ｑ１　プルロニンクＦ６８０
．１％を用いる３回の洗浄によって除去した。次に、標
識化の測定のために、ＰＯＤのための基質としてＡＢＴ
Ｓ　［２，２′−アジノージ−３〜エチルベンズチアゾ
リンスルホナート１を添加し、１時間インキュベートし
、次いで４０５ｎｍでの吸光度を光度計（ＥＬＩＳＡ−
読み取り装置）を用いて測定した。較正曲線を、抗体Ａ
のＦａｂ断片で抗体Ｂを横方向に架橋することによって
得られた、モデルのハイブリッド抗体を用いて調節した
。標準の使用した濃度は、Ｏ〜１１．５　ｎｇ／ｍＱで
あった。

例８ 抗体Ｂの測定 マイクロ滴定板を抗体Ｃ（ニトロフェノールとは反対方
向を向いた）で被覆した。被覆緩衝液は、カーボネート
／ビカーボネート０．２ミリモル／Ｑ、ｐＨ９，４から
戊り立っていた。２時間の後、この板を後被覆緩衝液（
ＨＥＰＥ３５０ミリモル／Ｑ、　Ｎ　ａ　ＣＱｏ　、１
５モル／Ｌ　クロティンＣ１％、ｐＨ７，０）と−緒に
３０分間インキュベートした。全ての反応を室温で振盪
させながら実施した。較正曲線を抗体Ｂを有する標準溶
液を用いて調節した。較正試料および細胞上澄み液を媒
体■で希釈し、かつ室温で２時間インキュベートした。

凹所の吸引濾過およびインキュベーション緩衝液（ＨＥ
ＰＥＳ５０ミリモル／Ｑ１　Ｎ　ａ　ＣＱＯ，１５ミリ
モル／Ｑ。

酒石酸ジナトリウム０．２モル／Ｑ、クロティンＣ１％
、ＰＥＧ４００００　０．７５％、プルロニンクＦ６８
　０．５％、フェノール０．０１％、ｐＨ７，０）での
２回の洗浄の後、１時間の接合体インキュベーションを
行なった。そのために、抗体ＣのＦａｂ断片とＰＯＤと
の接合体を使用し、この接合体をインキュベーション緩
衝液中でＰＯＤ活性１５９ｍＵ／ｍＱに希釈した。吸引
濾過および洗浄緩衝液（ＨＥＰＥＳ５０　ミ　リ　モ　
ル／Ｑ、　　Ｎ　　ａ　　ＣＱｏ　　、１　５　　ミ　
リ　モル／ＱプルロニックＦ６８　０．１％、ｐＨ７，
０）での凹所の３回の洗浄の後、６０分間基質としての
ＡＢＴＳと反応させた。吸光度を光度計（ＥＬＩＳＡ−
読み取り装置）で４０５ｎｍの際に４９０ｎｍに対して
測定した。試料の濃度を標準較正曲線により測定した。

例９ 抗体ＡおよびＡＢの測定 熱Ｒ３Ａストレプトアビジン（ｌｏｐｇ／ｍＱ）を固体
相（９６個の凹所を有するマイクロ滴定板、Ｎｕｎｅ）
で被覆緩衝液（燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７，４）中に吸
着させた。結合していないストレプトアビジンを注意深
く除去し、非特異性結合個所を後被覆溶液（燐酸カリウ
ム緩衝液５０ミリモル／Ｑ、Ｎ　ａ　ＣＱｏ　、１５モ
ル／ＬＲ５Ａ　１％、７．５）で飽和させた。較正試料
（抗体Ａ−ＣＫ−ＭＭ特異性）および培養上澄み液を塗
布前に例６での得られたビオチニル化ＣＫ−ＭＭ　（５
００ｎｇ／ｍＱ）で１：１０で希釈した。試料の１時間
のインキュベーションノ後２回上記のインキュベーショ
ン緩衝液で洗浄した。次いで、ヤギの場合に得られた（
ＰＯＤ活性１３０ｍＵ／ｍＯ、マウス■ｇＧのＦｃ部分
とは反対方向を向いたＰＯＤ標識化ポリクロナール抗体
と一緒に１時間インキュベートした。基質ＡＢＴＳを用
いるインキュベーションの後、４０５ｎｍでの吸光度を
光度計（ＥＬＩＳＡ−読み取り装置）で測定した。

抗体Ａの含量を抗体（Ａ＋Ｂ）の濃度から抗体（Ａ　Ｂ
）の濃度を差し引くことによって測定しｔ二。

例１０ 抗体へおよびＡＢの測定 マイクロ滴定板をマウス１ｇＧのＦｃ７部分とは反対方
向に向いたヒツジ■ｇＧを用いて重炭酸塩０．２モル／
Ｑ／炭酸塩緩衝液（ｐＨ９゜５）中でＩＯμｇ／ｍＱ被
覆した。結合していない抗体を除去し、非特異性結合個
所を後被覆溶液（燐酸カリウム５０ミリモル／Ｑ、Ｎａ
ＣＱＯ，１５モル／１２．Ｒ５Ａ（牛血清アルブミン）
１％、ｐＨ７，５％）によって飽和した。全ての反応は
、室温で振盪させながら行なった。培養上澄み液を燐酸
カリウム５０ミリモル／Ｑ。

ｐＨ７，５、酒石酸ナトリウム０．２モル、Ｒ３穴１％
を用いて希釈し、かつ１時間インキュベートした。イン
キュベーション緩衝液を用いて２回の洗浄の後、インキ
ュベーションをＰＯＤと抗体Ｃ゛のＦａｂ断片との接合
体を用いて行なった（ＰＯＤ活性１３０　ｍＵ／ｍ（２
）　、洗浄の後、ＡＢＴＳと一緒にインキュベートし、
かつ６０分間の後に吸光度を光度計（ＥＬＩＳＡ−読み
取り装置）で４０５ｎｍで測定した。較正曲線を精製し
た抗体Ｂを用いて記載した。

抗体Ｂの含量は、抗体Ｂ十ＡＢの濃度から抗体ＡＢの濃
度を差し引くことによって計算した例１１ 抗体Ａ、ＢおよびＡＢの収量の比較 プラスミドル　ＢＭＳ　Ｉ　ＣＫ−ＭＭに対して特異性
の抗体Ａを生産する細胞系ＭＡＫ３３中に移入し、Ｇ４
１８耐性コロニーを単離し、かつ２４時間上澄み液中に
細胞１０６個を播種した後、次のパラメーターを記載し
たように測定した。

ａ）抗体ＡＢ ｂ）抗体Ｂ Ｃ）抗体Ａ 結果は、第１表に示しである。

第１表 同様の結果は、プラス２１９８ＭＳ２を使用した場合に
も得られた。

第１図は、表現プラスミドを構築する際の初期構造を示
す遺伝子地図であり、この場合第１図中でＸは、上から
順にＥｃｏｘＳａｌ、ヌクレア−４５１，分離指示断片
、５ａｌＩリンカ−１Ｓａｉｌレリゲートを表わし、 第２図は、表現ベクターを示す遺伝子地図である。

ＦＩＧ、１ −１ ＦＩＧ　、　２ １

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、抗原結合個所Ａおよび抗原結合個所Ｂを有するヘテ
   ロ二重特異性モノクローナル抗体を製造する方法におい
   て、抗原結合個所Ａを有する抗体を分泌するハイブリド
   ーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、重鎮の可変部分な
   らびにｃ＿Ｈ１領域を単離する軽鎖に対して真核プラス
   ミドベクター中に挿入し、この表現ベクターを抗原結合
   個所Ｂを有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中
   に移入し、この細胞系を培養し、抗体を取得し、二重特
   異性抗体を分離することを特徴とする、ヘテロ二重特異
   性モノクローナル抗体の製造法。