JPH03252556A - 白血球分類方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、臨床検査分野における血液の分類測定法に関
するものであり、さらに詳しくは、血液中の白血球を分
類、識別、計数する方法および試薬に関するものである
。

（従来の技術） 健常人の末梢血液の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の種類がある。好中球、好酸球、
好塩基球をまとめて顆粒球と呼ぶ、これらは各々その機
能が異っており、血液中の白血球を種類別に計数するこ
とによって、病気の診断に貢献することができる。たと
えば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病などに
みられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、再生不良性
貧血、無顆粒球症などにみられる。好酸球の増加は、寄
生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみられる。

単球の増加は感染症の回復期、単球性白血病などにみら
れる。

上記、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球はい
わゆる正常細胞と言われるものであるが、これらの他に
、ある種の血液疾患の場合の末梢血中には異常細胞が出
現することがある。たとえば、白血病などの患者の末梢
血液中には芽球が見られることがある。この異常細胞に
も種々あるが、その種類を分類し、各異常細胞集団の細
胞数を求めることも臨床上大きな意味のあることである
。

白血球を分類・計数するために従来から最も良〈実施さ
れている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼ば
れるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれの血液であるかを判定し、分類・計数するもので
ある。このとき、−ｍの検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率（％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の煩雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類・計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこととのために、測定者に大きな負
担をかけるものとなりている、さらに、計数する白血球
数が少ない上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
測定値を出すことは難しい。

このために、白血球の分類・計数が自動的に行える方法
が強く求められており、現在のところ大きく分けて二種
類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピュータによる処理では分類
できない血球も多く、完全には視算法にとってかわるも
のとなっていない。

また、装置が複雑で大型になり、価格が高くなるという
問題もある。

白血球を自動的に分類・計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈液中に浮遊させた試料を用い血球が一個ずつ細い
検出器中を通過するようにこの試料を流し、このとき検
出器で発生する信号を分析することにより白血球を分類
するものである。このフローシステムを利用した方法は
、さらに、二つの方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。

このとき細孔部に高周波電流を印加しておき、血球が細
孔部を通過する際に細孔部で生ずる誘電率の変化を検出
する方法を特にＲＦ法と呼んでおり、その基礎となる原
理は、日本特許第５０８７８９号および米国特許第３３
９０３２６号に開示されている。このＲＦ法によれば、
血球の大きさ情報に加えて血球の構造および血球を構成
する材料の性質による情報も得ることができる、 一方、第１の方法において、細孔部に直流電流を印加し
ておき、血球が細孔部を通過する際に細孔部で生ずる導
電率の変化を検出する方法を特にＤＣ法と呼んでおり、
日本特許箱２１７に）４７号および米国特許第２６５６
５０８号に開示されている。このＤＣ法においては、検
出される信号の大きさは、はぼ血球の体積に比例してい
る。

上記ＲＦ法とＤＣ法とを組み合わせて、同一懸濁液中の
異なる種類の粒子の集団を分類する装置が日本特許第７
８５８５９号および米国特許第３５０２９７４号に開示
されている。しかし、この特許においては、白血球の異
なる種類の集団を分類計数する可能性については何ら示
されていない。

フローシステムを利用した第２の方法は、光源と、試料
中の細胞が一個ずつ細い流路を流れるようにしたフロー
セルと、細胞から発せられた光を検出する測光部と、検
出信号を解析する解析装置とを備えたフローサイトメー
タを使用するものである。この方法では、血球を染色し
、染色された血球を光で照射し、そのとき血球から発す
る蛍光および場合によっては散乱光を一緒に検出し、検
出信号の強度によって白血球を分類しようとするもので
ある。

この第２の方法には、複雑な染色過程が必要であったり
、光学系を含んだ装置が複雑で高価なものとなる等の実
用上の問題がある。

一方、第１の方法に使用される細胞溶解剤としてはサポ
ニンや第４級アンモニウム塩等が公知であるが、サポニ
ンは溶血力が不安定であり、第４級アンモニウム塩は溶
血力が強すぎ白血球に大きな損傷を与えてしまうため白
血球をぜいぜい３分類′しかできない等の問題があった
。

本出願人は、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ８８１００５１
４において、細胞溶解剤としてサポニンもしくは第４級
アンモニウム塩を使用せず、溶血力の安定したポリオキ
シエチレン系ノニオンもしくはポリオキシエチレン系ア
ニオン界面活性剤を使用して赤血球を溶血させ、がっ、
白血球を短時間に適度に損傷させ、上述した第１の方法
のＲＦ法とＤＣ法とを組み合わせて分析することにより
、正常白血球を５分類する方法および異常細胞を分類す
る方法等を提供した。

一方、本出願人は特開昭６３−１３４９５７号公報（欧
州特許出願公開２５９８３３号）において、酸性で低浸
透圧の第１液にて赤血球を溶血させ、第２液にて第１液
の酸を中和させ浸透圧を調整したのち、フローサイ、ト
メータで白血球を測定し、白血球を分類する方法（上記
第２の方法に属する）を開示した。

また、特表千１−５０２９３１号公報（国際特許出願Ｐ
ＣＴ／ＵＳ８８１００７６２）には、同じく酸性で低浸
透圧の第１液にて赤血球を溶血させ、第２液にて第１液
の酸を中和させ浸透圧を調整したのち前述のＲＦ法とＤ
Ｃ法との組み自わせの測定法にても白血球を分類・計数
できる方法が開示されている。

しかし、これら二つの方法のように酸性かつ低浸透圧溶
液で溶血させるのみでは赤血球のゴーストが充分に小さ
くならない。その結果、ＲＦ法およびＤＣ法を用いて測
定する場合、赤血球ゴーストとリンパ球の検出信号強度
が一部重なり、明瞭に弁別できない、また、これら二つ
の方法では、いずれも試薬を２液構成とする必要があり
、自動血液分析装置として実現する場合に、装置構成が
複雑になるという問題もある。

（発明が解決しようとする課題） ところで、血液像鑑定による白血球分類のための塗抹標
本作製は、採血後４時間以内にしなければならないと記
されている（金魚出版　臨床検査ＭＯＯＫ増刊１　検体
検査の前処理３８頁）が、検査センター等一部の施設に
おいては、採血径長時間経過した後に行われることがあ
る。その場合、採血後の時間とともに白血球の損傷は大
きくなり、特に好中球、単球にそれが著しくみられる。

したがって、例えば採血後２４時間経過した血液の白血
球分類値は採血後速やかに行った場合の白血球分類値と
は大きく異なる。

そこで、採血径長時間経過した血液においても正確な白
血球分類値が得られる方法が求められていた。

本発明は、細胞溶解剤としてサポニンもしくは第４級ア
ンモニウム塩を使用せず、溶血力の安定した細胞溶解剤
を使用して赤血球を溶血させ、かつ、白血球を短時間に
安定させ、さらに、赤血球ゴーストとリンパ球とを明瞭
に弁別できるようにし、ＲＦ法とＤＣ法とを組み合わせ
て白血球を分析することにより、正常白血球の５分類お
よび異常細胞の分類を実現し、さらに、採血径長時間経
過した血液においても正確な白血球分類値が得られる方
法およびそのための試薬を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は下記のような試薬及び該試薬を使用した白血球
分類方法を提供することにより上述の課題を解決した。

（１）　赤血球を溶解し、白血球に作用して白血球を分
類・計数可能とする白血球分類用試薬であって、 ｐＨが１．５〜５．０、浸透圧が１０〜１２０ｍＯｓ＋
＊／に、であり、 一般式 ％式％） （ここで、Ｒ３−は炭素数１２〜２２のアルキルまたは
アルケニルまたはアルキニル基；−Ｒ２−は−０−１で
表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を含
有することを特徴とする試薬。

（２）上記（１）に記載の試薬を第１液とし、この第１
液と、第１液へ添加される第２液とからなり、第２液添
加後の液のｐＨが５．０〜１２．０、浸透圧が１５０〜
２０００ｍＯｓ＋ｅ／ｋｇとなる試薬。

（３）第２液に 一般式 ％式％） （ここで、Ｒ１−は炭素数１２〜２２のアルキルまたは
アルクニルまたはアルキニル基；−Ｒ２−は−０−１で
表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を含
有する上記（２）に記載の試薬。

（４）　第２液に下記５つのグループからなる群から選
ばれる少なくとも１種の可溶化剤を含有する上記（２）
に記載の試薬。

第１グループの可溶化剤（尿素）： 尿素　　　　　　　　　千オ尿素 １．１−ジメチルウレア　エチレン尿素メチルウレタン
　　　　１．３−ジメチル尿素ウレタン（Ｈ２Ｎ　ＣＯ
ＯＣ２８ｓ　）第２グループの可溶化剤・ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコシド ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート） ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−クロルアミドプロピル）ジ
メチルアンモニオゴー２−ヒドラキシ１−プロパンスル
ホネート） ＭＥＧＡ８，９．１０（オクタノイル−、ノナノイル−
またはデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド） シュークロースモノカプレート Ｎ−ホルミルメチルロイシルアラニン 第３グループの可溶化剤（グアニジン類）：チオシアン
酸グアニジン　グアニルグアニジングアニジン塩酸塩　
　　　グアニジンロダン塩グアニジン硝酸塩　　１，１
，３．３−テトラグアニジングアニジン炭酸塩 グアニジンリン酸塩 グアニジン硫酸塩 第４グループの可溶化剤（胆汁酸塩）：デオキシコール
酸ナトリウム タウロコール酸 コール酸 第５グループの可溶化剤（ハロゲン置換酢酸）ニトリク
ロロ酢酸ナトリウム トリブロモ酢酸ナトリウム ジクロロ酢酸ナトリウム ジブロモ酢酸ナトリウム モノクロロ酢酸ナトリウム モノブロモ酢酸ナトリウム （５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の試薬を使
用し、ＲＦ法およびＤＣ法なる粒子分析方法により白血
球を少なくともリンパ球、単球、顆粒球の３つに分類す
る方法。

（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の試薬を使
用し、ＲＦ法およびＤＣ法なる粒子分析方法により異常
細胞を検出する方法。

低浸透圧溶液中で赤血球が溶血することは、周知のこと
であるが、本発明は低浸透圧（１０〜１２０ｍｏｓｓ／
ｋｙ）、酸性条件下で、かつ、ノニオン界面活性剤を含
有する溶液中にて、赤血球を溶血させることを特徴とす
る。

仮にこの溶液を中性にした場合、白血球への損傷が大き
くなりすぎ、また、赤血球ゴーストが充分に小さくなら
ない、仮にこの溶液をアルカリ性とした場合も同様に白
血球への損傷が大きすぎる。

したがって、酸性条件下で赤血球を溶血させることが本
発明にとって必須である。

前述の通り、酸性かつ低浸透圧溶液中で溶血させるのみ
では赤血球のゴーストは充分に小さくならない。

（実施例） 以下に本発明を説明するために実施例を示す。

豊」コＩ 塩化カリウム／塩酸緩衝剤にて溶液のｐＨを２．０に保
ち、浸透圧を８０ｍ０５ｍ１ｋｇに調整した試薬を使用
して赤血球を溶血させ、白血球を測定した。

この結果を第６図に示す、第６図に示す二次元分布図の
横軸はＤＣ法で測定したときの相対信号強度を表し、縦
軸はＲＦ法で測定したときの相対信号強度を表す、第６
図中の各点は、それぞれのＤＣ信号強度とＲＦ信号強度
とを示した各細胞に対応している０図中の符号ａないし
ｄは次の意味を有する。

ａ：！ｉ１粒球　　　ｂ：単球 Ｃ：リンパ球　　ｄ：赤血球ゴースト なお、他の図面における縦軸１横軸、符号の意味は第６
図と同じであるので以下説明を緑り返えさない 第６図は採血直後の血液を測定した場合の結果であるが
、赤血球ゴーストｄとリンパ球Ｃとの分布の重なりがあ
り、顆粒球ａ、単球す、リンパ球Ｃの各分布間の分離も
悪い。

第７図は第６図と同様の試薬条件下で採血後２４時間経
過した血液を測定したときの結果であるが、各白血球膜
の分布が一層判りにくくなっている。

大差１ 本発明の請求項（１）に記載の試薬を用いて採血直後の
血液を測定したときの結果を第１図に示す。

溶液のｐＨは２．０、浸透圧は８０　ｓｏ　ｓ＋＊／　
ｋｙであり、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤
とじて第一工業製薬株式会社） を１．５９／１使用した。赤血球ゴーストｄとリンパ球
Ｃどの分布には重なりがなく明瞭にわがれており、顆粒
球ａ、単球す、リンパ球Ｃの各分布間の分離も良好であ
る。

夾１阻１− 第１図のときと同じ試薬を用いて採血後２４時間経過し
た血液を測定したときの結果を第２図に示す、各白血球
膜の分布および赤血球ゴーストの分布は互いに良く分離
されている。

このように、本発明の請求項（１）に記載の試薬を用い
れば赤血球ゴーストを充分に小さくさせ、かつ、採血後
置時間経過した血液を測定したときでも安定に白血球を
分類・計数できることが示された。

ところで、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤と
してエマルジット９の代わりに、アクチノールＬ　１０
（Ｃ，２Ｈ２５−０−（ＣＨ２ＣＨ２０）　＋。−Ｈ；
松本油脂製薬株式会社）を用いて、第１図の測定のとき
と同一の血液を測定した結果を第８図に示す、このとき
は、赤血球のみならず白血球も強く損傷を受は細胞が殆
ど破壊されてしまったか著しく収縮されてしまったため
、白血球の分類・計数は不可能となっている。

ポリオキシエチレンの付加モル数ｎが小さいはど溶血力
は強くなることが知られており、上記アクチノールＬＩ
Ｏの場合にはｎが１０であるため白血球も破壊もしくは
収縮されてしまったのである。

反対にポリオキシエチレンの付加モル数ｎが大きいはど
溶血力は弱くなり、あるいは溶血力が無くなる。溶血力
が弱いので白血球への損傷も非常に小さくなり、採血後
置時間経過した血液を測定したときでも安定に白血球の
分類・計数が可能となる。

一方、溶血力が弱いと赤血球ゴーストが充分に小さくな
らず赤血球ゴーストとリンパ球との弁別が悪くなるとい
う問題が生じかねない、しかし、驚くべきことに、本発
明の請求項（１）に記載されるようにポリオキシエチレ
ンの付加モル数ｎが２０〜１００であるノニオン界面活
性剤を使用すれば、白血球には大きすぎる損傷を与える
となく赤血球のゴーストは充分に小さくできることを本
発明者は見い出したのである。

また、本発明者は、この界面活性剤は白血球膜に対する
保護作用を有し、かつ、白血球の３つの集団：顆粒球ａ
、単球す、リンパ球Ｃを二次元分布上で明瞭に分ける作
用を有することをも見い出した。

白血球膜に対する保護作用を示す一例を上げる。

酸性かつ低浸透圧の溶液で溶血させた場合、白血球は５
分程度で損傷を受は収縮してしまうが、ポリオキシエチ
レンの付加モル数ｎが２０〜１００であるノニオン界面
活性剤を添加した場合には白血球は２０分経過しても収
縮しない。

以上の例に示したように請求項（１）に記載の発明は基
本的に１液の構成で実施することができる。

１液構成の方が、従来例のいくっかにある２液楕成のも
のよりも、自動血液分析装置へ適用する際に装置構成が
簡単になり、装置のコストが安くできるというメリット
がある。

しかし、本発明は１液構成の試薬にのみ限定されるもの
ではない。次に、本発明の試薬を２液楕成とした請求項
（２）〜（４）に記載の試薬について述べる。

２液構成の試薬の第１液は、請求項（１）に記載の試薬
と同じものであり、第１液を血液と反応させることによ
り、前述の通り、赤血球は酸性低張溶血され、白血球は
損傷を受ける。第２液は、この第１液と血液とが反応し
た溶液に添加されるものであり、第２液の添加によって
溶液は中性付近（ｐＨ５，０〜１２．０）に、かつ、浸
透圧は等浸透圧ないし高浸透圧（１５０〜２０００論Ｏ
ｓ論／　ｋｙ）に調整される。このように第２液は基本
的に溶液のｐＨおよび浸透圧を調整する作用をするもの
である。

このようにすると、リンパ球、単球、顆粒球の各集団の
分離が一層改善され、二次元分布をコンピュータ等で解
析し、各集団へ分画する処理がやりやすくなる。

なお、第２液に、請求項（３）に記載したポリオキシエ
チレン系ノニオン界面活性剤または請求項（４）に記載
した可溶化剤を含有させると、上記集団の分離がさらに
改善される。

え１匠１ 以下に、２液反応の実施例を詳細に述べる。

第１液の調整 塩化カリウム／塩酸緩衝剤にて溶液のｐＨを２．０に保
ち、浸透圧を８０　ｅｉｏ　ＳＳ／　ｋｙに調整した溶
液１１に、エマルジット９を１．５ｇ添加する。

第２液の調整 ホルマリン１００ｇにリン酸−ナトリウム／リン酸二ナ
トリウム緩衝剤２１を加え、ｐＨを７．５に浸透圧を１
１００ｍ０５ｍ／ｋｇに調整後、防腐剤であるβ−フェ
ネチルアルコール２．５ｇ、抗酸化剤であるトリエタノ
ールアミン１０ｇ、赤血球ゴースト収縮剤（ポリオキシ
エチレン系ノニオン界面活性剤）であるエマルゲン４２
０（ＣＨ。

（ＣＨｚ）ｔｃＨ＝ｃＨ（ＣＨｚ）ｓ　　Ｏ（ＣＨ２Ｃ
ＨｚＯ）＋ｓＨ花王株式会社）０．０２５．を加える。

反応条件 第１液５ＩＩｌに血液６０μｌを添加し、３３℃で３０
秒間反応させる。

次に、第２液１０ｍ１を添加し、３３℃で３０秒間反応
させる。

二段階の反応後の、血球の二次元分布図を第３図に示す
、符号ｇは血小板凝集の集団を表す、第３図に示される
通り、赤血球ゴーストｄは充分に小さくなっており、顆
粒球ａ、単球す、リンパ球Ｃの分離も非常に良い。

第３図は採血直後の血液を測定したときの結果を示すも
のであるが、第４図は同じ血液を採血後２４時間経過し
たときに上記と同じ手順で測定したときの結果を示すも
のである。このように、採血後２４時間経過した血液を
測定しても、第３図と同様な二次元分布が得られており
、本発明の試薬が採血後長時間経過した血液をも安定に
（白血球を安定化させて）測定できることを示している
。

上記手順にて白血球を３分画し、さらに、ＰＣＴ／ＪＰ
８８１００５１４に記載されたように、好酸球測定用試
料および好塩基球測定用試料を作製して好酸球数および
好塩基球数を求めると、白血球をリンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の５つに分類して計数することが
でき、各白血球種の個数および比率が求められる。この
方法で２０検体の血液を測定し、これを１検体につき２
００個細胞を観察した場合の視算法と比較したときの、
５種の白血球比率についての相関計数を第１表に示す。

第」ｊ（ リンパ球　　　　　０．９８７ 単球　　　　　　０．９００ 好中球　　　　　０．９８５ 好酸球　　　　　０．９７９ 好塩基球　　　　０．５２５ 同じく上記手順にて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の
血液を測定したときの二次元分布を第５図に示す、符号
Ｃは白血病細胞を、符号ｆは有核赤血球を表す。白血病
細胞等の異常細胞が、第３図や第４図には存在していな
い位置に出現していることがわかる。このように本発明
によれば正常白血球細胞のみならず異常細胞も検出する
ことができる。

（発明の効果） 本発明の試薬および方法によれば、溶血力の安定した細
胞溶解剤を使用して赤血球を溶血させ、かつ、白血球を
短時間に安定させ、さらに、赤血球ゴーストとリンパ球
とを明瞭に弁別できるようにすることができ、ＲＦ法と
ＤＣ法とを組み合わせて白血球を分析することにより、
正常白血球の５分類および異常細胞の分類が実現でき、
さらに、採血後長時間経過した血液においても正確な白
血球分類値が得られるという効果が奏せられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１液楕成の試薬による実施例における採血直後
の血液の測定結果を示す分布図である。 第２図は１液楕成の試薬による実施例における採血後２
４時間経過後の血液の測定結果を示す分布図である。 第３図は２液楕成の試薬による実施例における採血直後
の血液の測定結果を示す分布図である。 第４図は２液構成の試薬による実施例における採血後２
４時間経過後の血液の測定結果を示す分布図である。 第５図は２液構成の試薬による実施例における急性骨髄
性白血病（Ａ　Ｍ　Ｌ　）患者の血液の測定結果を示す
分布図である。 第６図および第７図は血液を単に酸性低張溶血させた試
料の測定結果を参考として示す分布図であり、第６図は
採血直後の血液を、第７図は採血後２４時間経過後の血
液を測定した場合の結果を示す。 第８図はポリオキシエチレンの付加モル数ｎが本発明の
範囲より小さい場合（すなわちｎ−１０）の測定結果を
参考として示す分布図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）赤血球を溶解し、白血球に作用して白血球を分類
   ・計数可能とする白血球分類用試薬であつて、 ｐＨが１．５〜５．０、浸透圧が１０〜１２０ｍＯｓｍ
   ／ｋｇであり、 一般式 Ｒ＿１−Ｒ＿２−（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｈ（こ
   こで、Ｒ＿１−は炭素数１２〜２２のアルキルまたはア
   ルケニルまたはアルキニル基；−Ｒ＿２−は−Ｏ−、▲
   数式、化学式、表等があります▼−または−ＣＯＯ−；
   ｎは２０〜１００の整数）で表されるポリオキシエチレ
   ン系ノニオン界面活性剤を含有することを特徴とする試
   薬。
2. （２）請求項（１）に記載の試薬を第１液とし、この第
   １液と、第１液へ添加される第２液とからなり、第２液
   添加後の液のｐＨが５．０〜１２．０、浸透圧が１５０
   〜２０００ｍＯｓｍ／ｋｇとなる試薬。
3. （３）第２液に 一般式 Ｒ＿１−Ｒ＿２−（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｈ（こ
   こで、Ｒ＿１−は炭素数１２〜２２のアルキルまたはア
   ルケニルまたはアルキニル基；−Ｒ＿２−は−Ｏ−、▲
   数式、化学式、表等があります▼−または−ＣＯＯ−；
   ｎは２０〜１００の整数）で表されるポリオキシエチレ
   ン系ノニオン界面活性剤を含有する請求項（２）に記載
   の試薬。
4. （４）第２液に下記５つのグループからなる群から選ば
   れる少なくとも１種の可溶化剤を含有する請求項（２）
   に記載の試薬。 第１グループの可溶化剤（尿素）： 尿素　チオ尿素 １，１−ジメチルウレア　エチレン尿素 メチルウレタン　１，３−ジメチル尿素 ウレタン（Ｈ＿２ＮＣＯＯＣ＿２Ｈ＿５） 第２グループの可溶化剤： ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコシド ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメ
   チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート） ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−クロルアミドプロピル）ジ
   メチルアンモニオ］−２−ヒドラキシ−１−プロパンス
   ルホネート） ＭＥＧＡ８，９，１０（オクタノイル−、ノナノイル−
   またはデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド） シュークロースモノカプレート Ｎ−ホルミルメチルロイシルアラニン 第３グループの可溶化剤（グアニジン類）：チオシアン
   酸グアニジン　グアニルグアニジングアニジン塩酸塩　
   グアニジンロダン塩 グアニジン硝酸塩　１，１，３，３−テトラグアニジン
   グアニジン炭酸塩 グアニジンリン酸塩 グアニジン硫酸塩 第４グループの可溶化剤（胆汁酸塩）： デオキシコール酸ナトリウム タウロコール酸 コール酸 第５グループの可溶化剤（ハロゲン置換酢酸）：トリク
   ロロ酢酸ナトリウム トリブロモ酢酸ナトリウム ジクロロ酢酸ナトリウム ジブロモ酢酸ナトリウム モノクロロ酢酸ナトリウム モノブロモ酢酸ナトリウム
5. （５）請求項（１）〜（４）のいずれかに記載の試薬を
   使用し、ＲＦ法およびＤＣ法なる粒子分析方法により白
   血球を少なくともリンパ球、単球、顆粒球の３つに分類
   する方法。（６）請求項（１）〜（４）のいずれかに記
   載の試薬を使用し、ＲＦ法およびＤＣ法なる粒子分析方
   法により異常細胞を検出する方法。