JPH0324197B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の利用分野〕 本発明は、新規なα−アミラーゼの生産に用い
る嫌気性細菌に係り、特にぶどう糖等の殿粉加工
ならびに繊維ののり抜きなどにおける殿粉の液化
反応に好適な耐熱性α−アミラーゼを産生する好
熱性嫌気性細菌に関する。 〔発明の背景〕 酵素は気質選択性が高く、常温、常圧下でも反
応を触媒できる特長を有するが、一般に加熱やPH
に対し極めて不安定である。最近、酵素を固定化
してバイオリアクタを組み込み、異性化糖やＬ−
アミノ酸が生産できるようになつた。これらのリ
アクタの運転に際しては、雑菌の繁殖防止や反応
速度をあげるため、常温より高い60℃以上の温度
域で行うことが望まれている。このため、旧来の
常温性酵素にかわり、加熱やPH変化にも安定な、
いわゆる耐熱性酵素の開発が進められてきた。従
来の耐熱性酵素は好気性細菌を起源として生産さ
れている。これまで、α−アミラーゼは主とし
て、代表的な好気性細菌であるバチルス属の細菌
を培養することにより製造されてきた
（Campbell et al.J.Biol Chem.、236、2952、
1961年）。そのうち、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilmis）及びバチルス・リチエニホ
ルミス（Bacillus licheniforis）を起源とするα
−アミラーゼは、すでに工業生産され、異性化糖
やぶどう糖等の殿粉加工や繊維ののり抜き処理に
使用されている。これら公知のα−アミラーゼ
は、いずれも酵素の本体であるたん白質だけでは
耐熱性を発揮できず、カルシウムイオンの存在下
ではじめて耐熱性を示す。少なくとも１ｍＭ（斎
藤：特開昭48−35083号公報）のカルシウム濃度
を必要とし、通常数ｍＭ−20ｍＭ（服部：特開昭
51−44652号公報、特開昭51−44690号公報）のカ
ルシウム塩を添加して反応を行つている。したが
つて、従来の耐熱性α−アミラーゼは、カルシウ
ムがないか１ｍＭ未満の場合には、バチルス・リ
チエニホルミス起源のα−アミラーゼの１例を第
２図中に示すように、耐熱性が著しく低下する
（曲線５；特開昭46−12946号公報のもの、曲線
６；特開昭48−35083号公報のもの）。このため、
水道水のカルシウム濃度に相当する100μM以下
の極めて希薄な濃度では、殿粉の液化反応中に失
活がおこり、高価な酵素を多量に消費する。した
がつて、通常は、数ｍＭの塩化カルシウムや酢酸
カルシウムなどの可溶性カルシウム塩を添加して
反応している。しかし、カルシウム塩を添加する
と殿粉加工の製品である異性化糖やぶどう糖を製
造する際、後工程でカルシウムを除去することが
必要となる。 一般に、α−アミラーゼの最適PHは６以上であ
り、酵性域でも活性の高いものはごくわずかしか
知られていない。例えば、酸性α−アミラーゼと
しては、バチルス・リチニホルミスのα−アミラ
ーゼが知られている（田中等：特開昭52−151970
号公報、斎藤：特開昭48−358083号公報）。とこ
ろで、殿粉を液化する際、10〜40％、通常30％の
濃度に懸濁した、いわゆる殿粉乳を原料に用いる
が、原料殿粉中に含まれる不純物の有機酸のため
PHは５以下、しばしば４以下を呈する。このた
め、上野：特開昭49−19049号公報ならびに中
島：特開昭49−55857号公報の例のように、すべ
て消石灰もしくは炭酸カルシウムでPHを６〜７に
中和し、しかるのちにα−アミラーゼを作用させ
ている。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、耐熱性にすぐれ、かつカルシ
ウム要求性が極めて低く、酸性域でも高い活性を
有する新規なα−アミラーゼを産生する微生物を
提供するにある。 〔発明の概要〕 本発明者らは、耐熱性にすぐれ、酸性域でも高
い活性を有し、かつカルシウム要求性の低いα−
アミラーゼを得ることを目的に酵素及び酵素生産
用微生物の探索を行つた。その結果、クロスツリ
ジウム属に属する偏性嫌気性細菌（クロスツリジ
ウム属細菌RS−0001、clostridium sp RS−
0001、微工研菌寄第7918号）が、酵素の特性、特
にカルシウム要求性ならびに作用PH域について従
来のα−アミラーゼとことなる新規なα−アミラ
ーゼすなわち作用好適PHが２〜６、最適PHが３〜
５、作用至適温度が60〜85℃にある耐熱性α−ア
ミラーゼを生成することを見い出し、本発明に至
つた。本発明なるクロスツリジウムは、濃厚有機
廃液の高温メタン発酵スラリーを起源として分離
したものである。本菌の分離は次のようにした行
つた。まず、メタン発酵スラリーを低速遠心分離
（1000rpm、５分間）にかけ、粗大粒子を沈降除
去した後、殺菌生理食塩水で希釈した。これを菌
液とし、殿粉粒を炭素源とする寒天平板上に窒素
雰囲気下で塗布し、60℃で嫌気的に殿粉粒を溶解
して生育するコロニーを分離した。さらに、上記
コロニーの希釈液からマイクロマニユピユレータ
により栄養細胞を単離した。寒天平板による分離
とマイクロマニユピユレータによる分離とをさら
に数回重ね、本発明なる菌を得た。本発明なるク
ロスツリジウム（Clostridium sp RS−0001）
は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託して
いる（受託番号；微工研菌寄第7918号（FERM
Ｐ−7918））。以下、本菌の菌学的性質の詳細を説
明する。 Ａ 形態的性質 (1) 栄養細胞の形態 下記の殿粉・ペプトン培地の寒天平板上、
嫌気性雰囲気中、60℃で２日間培養した場
合、栄養細胞は0.4〜0.8×２〜5μｍの大きさ
の直状の桿菌である。３日間以上の培養で
は、上記の形状の栄養細胞が単独に存在する
他、連鎖するものも生ずる。液体培養でも同
様な現象が観察される。液体培養による栄養
細胞の走査電子顕微鏡写真を第１図に示す。
また、殿粉・ペプトン培地の組成を下記に示
す。 殿粉・ペプトン培地の組成 可溶性殿粉 1.5％ ペプトン 0.5％ 酵母エキス 0.5 KH₂PO₄ 0.7％ Na₂HPO₄ 0.35％ MgSO₄・7H₂O 0.001％ 寒 天 2.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 水道水 PH6.4 (2) 胞子の有無 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養及び液
体培養で胞子の形成が認められる。 Ｂ 培養的特性 (1) コロニーの形態 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養でのコ
ロニーは、中心部がやや***した扁平な円形
となり、周縁部は全縁である。色素生成は見
られず、表面に光択を有し乳白色不透明であ
る。また、粘着性を有する。 (2) 肉汁培地の寒天平板培養及び穿刺培養生育
する。殿粉・ペプトン培地と同様のコロニー
を生ずる。 肉汁寒天培地組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ NaCl 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 寒 天 1.5％ 水道水 PH6.0 (3) 肉汁培地の穿刺培養 水素と炭酸ガスを含むガスの発生を伴つて
生育する。このため、寒天培地が２〜３個所
で分断される。 (4) 肉汁液体培養 嫌気的雰囲気下でのみ生育する。 肉汁培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ NaCl 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸溜水 PH6.0 (5) 肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ NaCl 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ ゼラチン 15％ 水道水 PH6.0 (6) リトマスミルク培養 ガス発生を伴い、固く凝固し、酸の生成に
より赤変する。 Ｃ 生理的性質 (1) 生育の温度範囲 40〜63℃で生育する。30℃では生育が認め
られず、60℃付近で良好。 (2) 生育のPH範囲 PH５〜７で生育する。5.6付近が良好。 (3) 酸素に対する態度 偏性嫌気性。 (4) Ｏ−Ｆ試験（Hugh Laifson変法） 空気雰囲気中では生育みられず陰性。流動
パラフイン重層による嫌気性条件下では菌が
生育し、酸を生成して培養物が黄変する。 培地の組成 ペプトン 0.2％ グルコース 1.0％ NaCl 0.5％ K₂HPO₄ 0.03％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ ブロムクレゾールパープル 0.002％ 寒 天 0.3％ 水道水 PH6.0 (5) 硝酸塩の還元 陰性。 (6) VP試験 陰性。 (7) MR試験 陽性、赤変化する。 (8) インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できな
い。 (9) 硫化水素の生成 Kligrer培地使用において陰性。 (10) 殿粉の加水分解 陽性。可溶性殿粉だけでなく、馬鈴薯殿粉
などの粒状殿粉も分解する。 (11) クエン酸の利用 Simmons培地使用において陰性。 (12) アンモニウム塩の利用 ペプトン水に生育しないため測定できな
い。 (13) 色素の菌体外生成 陰性。 (14) オキシダーゼ活性 陰性。 (15) カタラーゼ活性 陰性。 (16) ウレアーゼ活性 陰性。 (17) 糖の資化性 糖の資化性及びDurham管を用いたガス発
生有無の観察結果を下表に示す。

【表】

【表】 (18) 無機塩培地への生育 生育認められず。 (19) 有機酸の生成 各種培地から生成する有機酸組成を第２表
に示す。

【表】 これらの結果よりHoldemanの嫌気性細菌分類
マニユアルに基づき、クロスツリジウム属に属す
る細菌と同定した。 次に、本発明の細菌で得られる耐熱性α−アミ
ラーゼの酵素的特性について記す。 尚、α−アミラーゼ活性の測定方法は次のよう
に行つた。 Blue value法（日本化学会編：実験化学講座
24巻、生物化学、p279、丸善書店、1969）に
よる糊精化力を測定した。本法は、殿粉の分子が
加水分解されるのに伴い、殿粉−より素complex
に基づく青色の発色量が、分子量の低下に比例し
て減少する原理を応用したものである。まず、２
mg／mlの殿粉溶液２ml及び0.1Mくえん酸緩衝液
（PH4.0）１mlを試験管に取り、60℃水溶中で５分
間振盪した。次いで、粗酸素液として培養液１
mlを加え、30分間反応させた。反応後、反応液
0.4mlを採取し、直ちに0.5M酢酸溶液２mlと混合
して酵素反応を停止させた。次のその１mlを10ml
の1/3000Ｎよう素溶液中に加え、680nｍでの吸
光度を分光光度計を用いて測定した。一方、酵素
液を加えた直後の反応液を採取して同様に発色さ
せ、吸光度を測定した。なお、殿粉としては重合
度約2000のアミロースを用いた。 α−アミラーゼ活性は次式により算出した。 α−アミラーゼ活性（単位）＝Otime反応液の
吸光度−30分反応液の吸光度／Otime反応液の吸光度×1
0 (1) 作用及び基質特異性 本発明の細菌が産生する酵素は、馬鈴しよ、
とうもろこし、甘しよ等の殿粉を加水分解する
液体型α−アミラーゼである。 (2) 至適PH 第２図に、従来公知の代表的なα−アミラー
ゼの作用PH曲線を示す。曲線４で示した小笠原
等のバチルス・ズブチリス（J.Biochem、67、
65、1970年）及び曲線６で示した斎藤等のバチ
ルス・リチエニホルミス（特開昭48−35083号
公報）を起源とするα−アミラーゼは、PH４〜
11に好適域を有する（最適PHでの活性の80％を
有するPH域とする）。従来公知の酸性α−アミ
ラーゼのうち、最も酸性側で活性の高い田中等
によるバチルス・リチエニホルミス起源α−ア
ミラーゼ（特開昭52−151970号公報、曲線３）
では、好適域が3.5〜6.3にあり、PH２で全く活
性を示さない。 これに対し、本発明に係る菌により産生され
るα−アミラーゼ（曲線１）ならびにα−ア
ミラーゼ（曲線２）の60℃における最適PH域
は、いずれも４付近にあり、かつ好適PHはそれ
ぞれ２〜5.7、２〜6.3にあつて、従来の酸性α
−アミラーゼにくらべ、さらに酸性側でも高い
活性を有する。すなわち、PH２では、従来の酸
性α−アミラーゼが全く活性を示さないのに対
し、本発明細菌によるα−アミラーゼはそれぞ
れ95％、81％の高い活性を示す。 なお、酵素反応は次の反応系を用いた。 酵素液：0.6〜1.3μｇ／ml 基質：アミロース１mg／ml クエン酸緩衝液：0.025M 上述したように、本発明細菌によるα−アミ
ラーゼは従来の酸性α−アミラーゼと作用PH域
を異にすることから、新しいα−アミラーゼで
あることは明らかである。 (3) PH安定性 本発明細菌によるα−アミラーゼ及び
を、PH２、４、６、７の各PH（0.025Mクエン
酸緩衝液）下で、60℃、30分間インキユベート
した。反応液を稀釈してPHを4.0に調整し、ア
ミロースを基質として残存活性を測定した。そ
の結果両α−アミラーゼは、上記のPH処理で完
全に活性が保持されていた。したがつて、本α
−アミラーゼは酸性域でも安定性が高い特徴を
有している。 (4) 至適温度 第３図に示す如く、本発明細菌によるα−ア
ミラーゼ（曲線１１）及び（曲線１２）の
至適PH4.0における至適温度は、いずれも80℃
付近である。好適温度（最適温度での活性の80
％を有する温度域とする）は65〜87℃である。
なお、反応にはくえん酸緩衝液0.025Mを用い
た。 (5) 熱安定性 本発明細菌によるα−アミラーゼをPH6.0
で20μM塩化カルシウムの存在下に60〜97℃に
加熱処理し、残存活性を測定した。これをもと
に各温度における活性半減期を求め、その結果
を第４図に示す。80℃及び90℃における活性半
減期（基質無添加）はそれぞれ８時間、0.5時
間であり、熱安定性にすぐれている。α−アミ
ラーゼについても90℃における活性半減期は
約0.5時間と、α−アミラーゼと同等の耐熱
性を有する。一方、従来のα−アミラーゼの例
とし、バチルス・リチエニホルミスに属するα
−アミラーゼ生産菌、及びバチルス・ズブチリ
スに属するα−アミラーゼ生産菌の培養液から
調製した部分精製α−アミラーゼ標品を用い、
カルシウム濃度20ｍＭにおいて半減期を実測し
た。その結果を第４図に付記する。反応は、ク
エン酸緩衝液を用いて、両α−アミラーゼの最
適PHである6.0で行つた。前者の80℃における
半減期は0.6時間、後者の70℃における半減期
は0.6時間である。本発明細菌によるα−アミ
ラーゼの耐熱性（曲線２１）は、従来公知のサ
ーマス属の耐熱性α−アミラーゼには及ばない
が、バチルス属のα−アミラーゼ（バチルス・
リチエニホルシスSP.を起源とする耐熱性α−
アミラーゼ、曲線２２）とくらべ遜色ない。 (6) 液熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明細菌によるα−アミラーゼの耐熱性
に及ぼす金属塩の影響を第３表に示す。α−ア
ミラーゼの水溶液に各種の金属塩を５ｍＭ濃
度になる様に添加し、加熱処理を行つて活性を
測定した。そして、加熱処理前に対する加熱処
理後の活性、すなわち残存活性を％で表示し
た。加熱処理及び活性測定は以下の条件で行つ
た。 加熱処理条件 PH6.0 加熱温度：80℃ 保持時間：30分

【表】

〔発明の実施例〕

以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説
明する。 実施例 １ 可溶性殿粉1.5％、ポリペプトン0.5％、酵母エ
キス0.5％、りん酸第１カリウム0.7％、りん酸第
２ソーダ0.35％、硫酸マグネシウム・ク水和物
0.01％、チオグリコール酸ナトリウム0.1％及び
水道水を含む液体培地（PH6.4）4.56Kgを、内容
積５の培養槽３基に1.52Kgずつ分注し、120℃
で20分間殺菌する、これに同上培地で嫌気的に培
養した本発明者等により分離せるクロスツリジウ
ム属の菌体懸濁液80ｇを各槽毎に添加した。次い
で、ガス出口に水封トラツプを付し、発酵槽内気
相部をアルゴンガスで十分置換後、嫌気条件下で
培養する。培養液のPHは6.0に自動調整し、温度
も60℃に自動調整する。46時間培養後、培養物を
合せ6000rpmで遠心分離し、菌体を除去する。こ
の上澄液は49単位／ｇの比活性を示した。 次に、上記上澄液3.5Kgをモレキユラシーブ膜
（分画分子量：20000）で過し、1.5Kgに濃縮し
た。濃縮液を２分し、0.75Kg分を架橋デキストラ
ンゲル（分画分子量：2500、フアルマシア社製）
を充填したカラム（直径100mm、長さ450mm）にチ
ヤージし、モレキユラシーブ液体クロマトグラフ
イを実施した。その際のα−アミラーゼ活性の溶
出パターンを第６図に示す。溶出は脱イオン水で
行い、100mlずつ分画した。図中に示すように、
溶出液量1.2〜２のフラクシヨンにα−アミラ
ーゼ活性がみとめられた。上記の液体クロマトグ
ラフイーをのこりの上澄液についても実施し、両
α−アミラーゼフラクシヨンを合せた。これを
40torrの減圧下で凍結乾燥し、乾燥粗粉末2.7ｇ
を得た。 本粗酵素乾燥標品の比活性は39000単位／ｇで、
上澄液の比活性に比べ約800倍に向上した。活性
収率は約60％である。上清液から粗酵素乾燥標品
調製における比活性、活性収量及び活性回収率の
変化を第４表に示した。

【表】

〔発明の効果〕

本発明なるクロスツリジウム属に属する好熱性
嫌気性細菌を培養して製造せる新しい耐熱性α−
アミラーゼを、殿粉の加水分解（液化）に用いれ
ば、水道水なみのカルシウムを含む仕込水を用い
ることができ、従来行つてきたカルシウムの添加
も不要となる。さらに、殿粉の液化、糖化両工程
での中和も不要となり、その結果、反応後の脱塩
工程への負荷を大巾に軽減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明細菌（クロスツリジウム属細菌
RS−0001）の生物形態を示す走査電子顕微鏡写
真、第２図は本発明細菌の産生する耐熱性α−ア
ミラーゼと従来の耐熱性α−アミラーゼとのα−
アミラーゼ活性（糊精化力）に及ぼすPHの影響を
示す特性図、第３図は本発明細菌の産生する耐熱
性α−アミラーゼのα−アミラーゼ活性に及ぼす
温度の影響を示す特性図、第４図は本発明細菌の
産生する耐熱性α−アミラーゼと従来の耐熱性α
−アミラーゼの各例における耐熱性を示す特性
図、第５図は本発明細菌の産生する耐熱性α−ア
ミラーゼと従来の耐熱性α−アミラーゼの各例に
おける加熱処理によるα−アミラーゼ活性に対す
るカルシウム濃度の影響を示す特性図、第６図は
本発明細菌の産生する耐熱性α−アミラーゼの架
橋デキストランゲルを用いたモレキユラシーブ液
体クロマトグラフイのα−アミラーゼ活性溶出パ
ターン図、第７図は本発明細菌の産生する耐熱性
α−アミラーゼのジエチルアミノエチル化架橋デ
キストランゲルを用いたイオン交換液体クロマト
グラフイによるα−アミラーゼ活性溶出パターン
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 作用好適PHが２〜６、最適PHが３〜５、作用
   至適温度が60〜85℃にある耐熱性α−アミラーゼ
   を産生し、クロスツリジウム属に属する微工研菌
   寄第7918号の嫌気性細菌よりなることを特徴とす
   る耐熱性α−アミラーゼを産生する好熱性嫌気性
   細菌。 ２ 基質無添加で80℃、30分間加熱処理した際
   に、0.1ｍＭ以下のカルシウム塩濃度下で、少な
   くとも70％以上のα−アミラーゼ活性を有する耐
   熱性α−アミラーゼを産生し、35〜65％で生育す
   ることができ、57〜63℃に増殖の至適温度域を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の耐熱性α−アミラーゼを産生する好熱性嫌気性
   細菌。 ３ 基質無添加で80℃、30分間加熱処理した際
   に、0.1ｍＭ〜0.1Mのカルシウム塩濃度下で100
   ％のα−アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼ
   を産生することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の耐熱性α−アミラーゼを産生する好熱性
   嫌気性細菌。