JPH03236399A

JPH03236399A - ワクチン

Info

Publication number: JPH03236399A
Application number: JP2234331A
Authority: JP
Inventors: Ian George Charles; アイアン　ジョージ　チャールズ; Neil Fraser Fairweather; ネイル　フレイザー　フェアーウェザー; マイケル　アンソニー　ロマノス
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1989-09-04
Filing date: 1990-09-04
Publication date: 1991-10-22
Anticipated expiration: 2015-07-10
Also published as: EP0425082A1; EP0425082B1; US5976544A; ATE121754T1; DK0425082T3; DE69018926T2; JP3060504B2; DE69018926D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】虹飢辿り並■■に対するワクチンに関する。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　他色■ｓｉｓは、ヒトにおけ
る百日咳の病原体であるが、本病気の発生は、その関連
病原微生物　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　ａｒａ　ｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ−と関連づけられている。Ｂｏｒｄｅｔｔｅ
ｌａ　　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｉｃａは、主として動
物の病原体であるが、百日咳様症状をもつ子供から巣離
されたことがある。旦。

匹旦ｕ紅りの全細胞ワクチンでの免疫処置プログラムは
、本疾病を制御するのに比較的効果があったが、ワクチ
ン接種に関連する副作用原性のために、現在では、ある
先進諸国においての使用度は低い、子供では、１万人に
１人の割合で副作用で苦しむことが認かめられた。臨床
症状のなかには、絶えず金切声で叫び続けることや、発
熱及び局所反応がある。

副作用原性と関連して、全細胞ワクチン中に存在する収
骨を含まないが、依然として防御エピトープは含んでい
る新しいｐｅｒｔｕｓｓｉｓの非細胞性ワクチンが必要
である。防御性成分に対する探索は、多数の外膜関連抗
原に的を絞って進められた。これらの抗原には、ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ　　）キシン（ｐｔｘリンパ球増加促進因
子（ＬＰＥ））　、フィラメント状赤血球凝集素（ＰＨ
八）、細胞毒性アデニル酸シクラーゼ（ｃ’ｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ　、　Ａ
ｄｃａｓｅ）　、皮膚壊死トキシン（ｄｅｒ＋ｗｏｎｅ
ｃｒｏｔｉｃ　ｔｏｘｉｎ　、　ＤＮＴ）、気管細胞毒
素（ｔｒａｃｈｅａｌ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）　、凝集
原類（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎｓ）（Ａｇｇ　２　＊
　Ａｇｇ　３　）、　６９ｋＤａの外膜タンパク質（ｏ
＊ｐ）、（Ｐ、６９）、及びリポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）が含まれる。

ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）キシン（ＬＰＦ）については多
くの仕事がなされてきており、それは、多くの人々によ
ってへ非細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンすべてのうち
で、最も重要な部分であると信じられている（Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　＋　１９８４　、　Ｃ
ｈａｐｔｅｒ　３　。

Ｍａｎｃｌａｒｋら、Ｅｄ：Ｇｅｒ＋ｗａｉｎｅｒ）　
、ＬＰＦ／ＦＨＡワクチンについてのスエーデンにおけ
る最近の臨床試験の結果により、このようなワクチンは
、約６９％の防御しか提供しないことが示された（Ｌａ
ｎｃｅｔ土。

９９５．１９８８）。これは、全細胞ワクチンによって
提供された防御について期待された結果よりも低く、そ
の結果、ＬＰＦ／ＦＨＡワクチンは、スエーデンの厚生
省（Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｈｅａｌｔｈ　Ａｕｔｈｏｒｉｔ
ｙ）によって認可されないことになった。

ＢＰ−Ａ−０１６２６３９は、医薬として認め得るその
ための担体とともに、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣＡＰ
）に関連したタンパク質様物質を含む旦、肚ｄ用１Ｌか
ら由来した抗原調製物を含む旦、４匹お４１０−に対す
る防御のためのワクチン製剤を明らかにするものである
。分子１６９ｋＤａのＡＣＡＰが明らかになっている。

Ｐ、６９抗原と名付けられたこのＡＣＡＰのいずれの領
域が、防御のために重要であるかを特徴づけるために、
タンパク質をコードしている遺伝子のクローニングを行
い、配列を決定した（ｃｈａｒｌｅｓら、ＰＮＡＳ　、
　Ｖｏ１８６．３５５４　３５５８　、１９８９　）。

Ｂ、弘狂力穏王Ｏユから抽出されたＰ、６９は、プリカ
ーサ−９３ｋＤａ　　（Ｐ、９３）がプロセッシングを
受けた形のように思われる。

本発明は、（ａ）　　旦１世扛ｌ拝１ｌ−ＣＮ２９９２（７）Ｐ、
　６９遺伝子のヌクレオチド１８８５から１９０２によ
ってコードされるアミノ酸配列、あ）Ｂ、匹吐■５ｉｓＯ別の菌株、または、旦、　　ａ
ｒａ−ｅｒｔｕｓｓｉｓ　、または旦、ｂｒｏｎｃｈｉ
ｓｅ　ｔｉｃａの菌株の相当するアミノ酸配列；または
（ｃ）　　改変された配列が、該配列（ａ）またはい）
の抗原性と実質的に同じ抗原性を持つように改変された
該配列（ａ）または（ロ）を含むエピトープを提出する
ワクチンにおいて使用されるのに適したあるポリペプチ
ドを提供している。該ポリペプチドは、５゜こ未満のア
ミノ酸残基の長さであるか、キャリヤータンパク質の配
列と、該エピトープの該配列を含む５０こ未満のアミノ
酸の外来配列からなるアミノ酸配列をもつキメラ状のタ
ンパク質である。

本発明のポリペプチドは、明確化された抗原的に効果を
もつ配列をもつ。この配列は、Ｃｈａｒｌｅｓら（１９
８９）によって明らかにされた、旦。

肚旦■江５ＣＮ２９９２のＰ、６９遺伝子配列と、アミ
ノ酸に対する１文字コード（Ｅｕｒ＋Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋。

１該．９−３７．１９８４）を用いることに基いたＰＧ
ＰＱＰＰである。それゆえ、配列は、旦。

弘圧幻４１匈−ＣＮ２９９２のＰ、６９タンパク質の５
４７番目から５５２番目のアミノ酸残基から威立ってい
る。旦０匹匹［吐りの他の菌株及び、旦。

ａｒａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ及びＢ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ
　ｔｉｃａの菌株についての相当する配列は、Ｃｈａｒ
ｌｅｓら（１９８９）によって示されたＰ、６９抗原と
Ｐ、７０抗原またはＰ、６８抗原を、それぞれ並べあわ
せることによって容易に決定することが出来る。

より好ましくは、エピトープは、（ａｔ　）　Ｂ　　ｅｒｔｕｓｓｉｓ　ＣＮ２９９２の
Ｐ、６９遺伝子のヌクレオチド１８７６から１９４４迄
によってコードされるアミノ酸配列、（ｂ１）ｓ−匹色吐１Ｌの別棟、または、１゜ａｒａ　
ｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢ　　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔ
ｉｃａの菌株の相当するアごノ酸配列：または（ｃ１）改変された配列が該配列（ａ１）または（ｂｌ
　）の抗原性と実質的に同じ抗原性をもつように改変さ
れた該配列（ａ１）または（ｂｌ　）のを含む。

配列（ａ１）は、それゆえ：ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰであ
る。

本配列は、旦１匹ｄ魁紅５ＣＮ２９９２のＰ。

６９タンパク質の５４４番目から５６６番目の残基を示
す。本配列と旦、蝕王耳Ｊ」±４０−のＰ、７０抗原と
旦、紅並はｎ飢且聾の抗原Ｐ、６８に対する相当する配
列（ｂ１）は、以下のように並べあわせることができる
。　ＰＧＰＱＰＰのエピトープは、下線がひいである。

Ｐ、７０　　ＡＰＱＰＧＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰ
ＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＲＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰ、６８　
ＡＰ（ＩＰＧＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＰ−−−
−−−ＰＱＲＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰ、６９　ＡＰＱ剋月
ＩＰ−ＰＱＰＰＱＰＰ−−−−−−−一−−−−−−Ｑ
ＰＥＡＰＡＰＱＰ本配列は、改変を加えた配列が、未改
変の配列と実質的に同じ抗原性を示すように改変するこ
とができる。したがって、改変配列は相当する未改変配
列と同じか、より大きい程度の効果をＫｅｎｄｒｉｃｋ
試験において示すべきである。改変配列は、未改変配列
と実質的に同じアミノ酸配列をもつが、１こ以上のアミ
ノ酸の置換、挿入または消去を含んでいる。

上記の如く、配列（ａ）、　　（ａｔ　）　、　（ｂ）
または（ｂ１）は、エピトープの抗原性に影響すること
なく、１こ以上の他のアミノ酸残基によって置換するこ
とができる。その結果、荷！密度、親水性／親油性、大
きさと立体配置によって物理化学的性質を保ち、したが
って、免疫学的構造を保持する１こ以上の別のアミノ酸
によって置換することができる。候補となる置換は、Ｇ
の代りにＡ及びＡの代りにＧ；ｖの代りにＡ、Ｌまたは
Ｇ；にの代りにＲ；Ｓの代りにＴ及びＴの代りに５ＡＤ
Ｏ代りにＥそしてＥの代りにＤ：そして、Ｑの代りにＮ
及びＮの代りにＱである。

本発明によれば、第１の型のポリペプチドは、上記の如
くエピトープを提出するところの、例えば４０まで、ま
たは３０まで、または２０までの、５０までのアミノ酸
から構成されている。それゆえ、エピトープの両端にさ
らにアミノ酸を加えることができる。１，２．３または
４つの追加残基を定義づけられたエピトープのＮ末端、
またはＣ末端または両端において、加えることができる
。

さらに、追加の残基がエピトープのいずれかの末端か両
端に加えられる場合には、これらは、天然の残基である
方が望ましい。これらは、旦、鱈お…■ＬのＰ、６９抗
原の配列、旦、肚旦４■山＋５ｓｉｓ−のＰ、７０抗原
または旦、垣」担魁ｌ狙−ｔｉｃａのＰ、６３抗原の配
列から導き出すことができる。それゆえ、エピトープの
ためのより好ましい隣接配列は、例えば、Ｐ、６９．Ｐ
、７０またはＰ、６８のタンパク質の全体の配列におい
て、場合によりエピトープ配列のいずれかの側に存在す
る自然の隣接配列であってよい、またシスティン残基は
、Ｎ−末端またはＣ−末端に加えられてよい、特にシス
ティン残基は、Ｃ−末端のみに加えられてよい。これは
、キャリヤーの結合を容易にし、そして／または、ポリ
ペプチドの免疫原性を増強するためである。

ポリペプチドは、Ｃ−末端遊離カルボキシル基をもって
いてよい。代替として、Ｃ−末端アミドの形であってよ
い、医薬的に容認できるポリペプチドの塩が使用される
ことができる。ポリペプチドは、抗原性的に活性である
抗原を創出すために、キャリヤーに結合することができ
る。適切な生理学的に容認できるキャリヤーならどれで
も使用できる。ポリペプチドとキャリヤーの間の結合体
を形成することができる。キャリヤーは、例えば、ウシ
血清アルブミン、チグロプリンオボアルブミン、キーホ
ールリンベット（カサガイの１種、Ｆｉｓｓｕｒｅｌｌ
ａ属）のヘモシアニン（ＫＬＨ）または肝炎Ｂのコア抗
原であってよい。

本発明による２番目の型のペプチドは、定義づけられた
エピトープを提供するところのキメラ状タンパク質であ
る。キメラ状タンパク質は、典型的には、望まれるエピ
トープの配列を含むところの５０までのアごノ酸の外来
配列を、そのアミノ酸配列が含むように改変されたキャ
リヤータンパク質である。タンパク質のあるアミノ酸配
列によって置換されることができる。代替として、外来
アミノ酸はタンパク質に融合される。例えば、５こまで
のアミノ酸でもよい、１０こまでのアミノ酸の介在リン
ガ−は、エピトープとキャリヤーの間に供給されること
がある。外来アミノ酸配列は、本発明によれば、第１の
ポリペプチドについて記述されたように、長さにおいて
変動することがある。

エピトープは、それが免疫系に提出されるように、キメ
ラ状のタンパク質の表面に露出される。

キメラ状のタンパク質は、粒子の形または粒子が凝集し
た形をとることがある。このような凝集は、キメラタン
パク賞の複数を含むか、そして／またはウィルスの粒子
であることがある。エピトープを含む外来アミノ酸配列
が、融合していることがあるタンパク質は、Ｂ型肝炎表
面抗原（ＨＢｓＡｇ　。

ＥＰ−Ａ−０１７５２６１）またはＢ型肝炎コアー抗原
（ＨＢｃＡｇ　、　ＴＰ−Ａ−６３１９６２９９）のよ
うな粒子形成タンパク質であってよい。外来配列は、ウ
ィルス（ＧＢ−Ａ−２１２５０６５）の表面上に露出し
たウィルスタンパク質の配列に挿入されることがある。

ウィルスタンパク質は、ウィルスのキャプシドタンパク
質であることがある。

配列は、それゆえ、ポリオウィルス（ＥＰ−Ａ−０３０
２８０１）のようなピコルナ料のウィルスの抗原部位の
１つにおいて供給されることがある。本エピトープは、
１型ポリオウイルスの弱毒化株のキャプシドタンパク賃
上の、例えば、１．２または３の抗原部位の１つにおい
て、または２型、もしくは３型ポリオウイルスの抗原部
位において提供されることがある０例えば、ウシエンテ
ロウィルス属のような、適切に改変された他のピコルナ
ウイルスが使用されることがある。

ピコルナウィルスの抗原部位のアミノ酸配列は、外来ア
ミノ酸配列によって完全に、もしくは部分的に置換える
ことがある。外来アミノ酸配列は、ｌ型ポリオウィルス
の弱毒化株の抗原部位１の若干またはすべての代りに提
供されることがより好ましい。弱毒化株は典型的には、
５ａｂｉｎ　１ワクチン株である。１型ポリオウイルス
の抗原部位の１はＶＰＩキャプシドタンパク質の９１番
目から１０２番目のアミノ酸残基から威立っている。

本発明のポリペプチドは、合成ポリペプチドである。そ
れらは、特に５０こまでのアミノ酸残基の長さをもつ最
初の型のポリペプチドは、合成によって調製することが
できる。固相または溶液法ペプチド合成を用いることが
できる。それゆえ、ポリペプチドは、単独アミノ酸そし
て／または、でき上ったペプチドまたは２こ以上のアミ
ノ酸を、発明のポリペプチド中でアごノ酸の存在する順
序にしたがって縮合することからなる工程によって構築
することができる０本ポリペプチドは、遊離のＣ−末端
カルボキシル基またはＣ末端アミド基をもつように合成
することができる。望ましければ、ポリペプチドは医薬
として容認できる塩に変換することができる。

固相合成においては、望むポリペプチドのアミノ酸配列
は、不溶の樹脂に結合しているＣ−末端アミノ酸から順
番に構築される。望むポリペプチドができ上ったときは
、それは、樹脂から開裂される。溶液相合成法が使用さ
れるときは、ポリペプチドは、Ｃ−末端アミノ酸から再
び合成することができる。この酸のカルボキシル基は、
適切な保護基によって、全体を通じて保護されたままで
あり、合成の終りに除去される。

固相または溶液相のいずれの技術が使用されるにせよ、
反応系に与えられる各アミノ酸は、保護されたα−アご
ノ基と活性化されたカルボキシル基をもっている。アミ
ノ基は、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｐ
ｓ＋ｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基
によって保護することができる。カルボキシル基は、ペ
ンタフルオロフェニルまたは１−オキソ−２−ハイドロ
キシ−ジヒドロベンゾトリアジンエステルとして活性化
できる。各縮合段階は、ダイサイクロへキシルカルボジ
イミドまたは１−ハイドロキシトリアゾールの存在にお
いて行うことができる。

例えば、リジンの側鎖アミノ基、スレオニンの側鎖ハイ
ドロキシル基またはシスティンのＳＨ基（スルフヒドリ
ル基）のような側鎖の官能基も典型的に保護される０合
成における各段階の後、αアミノ保護基は除去される。

しかし、一般に側鎖の保護基は、必要であれば保持され
るが合成の終りにおいてのみ除去される。

ポリペプチドは、望まれるように、Ｃ−末端カルボキシ
ルまたはアミド基をもった状態で調製される。固相ペプ
チド合成においては、これはＣ−末端が樹脂支持体にど
のように結合されているか、そして／または、最終ペプ
チドが樹脂からどのように開裂されるかによって決定さ
れることとなる。

典型的には、樹脂は、スチレン、そして／またはジウイ
ニルベンゼンボリマーである。Ｃ−末端ア５ノ酸は、ト
リフルオロ酢酸中のＨＢｒまたはＨＦのような強酸によ
って開裂することができ、Ｃ−末端カルボキシル基を与
えることができるところのエステル結合によって樹脂に
結合することができる。アンモニア分解によって、その
代りに相当するアミドを与えることができる。

固相合成によって、ポリペプチドアミドを得る代替法は
、ポリペプチドのＣ−末端アミノ基が、ペプチドアミノ
ベンツヒドリル結合を介して、樹脂に結合されるよう処
置をとることである。これは、ダイサイクロへキシルカ
ルボジイミドでカップリングを行うことによって形成す
ることができる。そして、ＩＦで典型的には低温で開裂
することができる。溶液相合成については、Ｃ−末端カ
ルボキシル基またはアミド基が存在するかどうかは、Ｃ
−末端アミノ酸のカルボキシル基がいかに保護されてお
り、そして合成の終了時に保護基がいかに取除かれるか
によることがある。Ｃ−末端カルボキシル基をもったポ
リペプチドは、Ｃ−末端アミド基をもったポリペプチド
に交換することができ、その逆も行うことができる。

本発明による両方の型のポリペプチドは、組換え体ＤＮ
Ａ方法論によって、特に（ｉ）該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込
み、適当な宿主中に提供されたとき、該ポリペプチドを
発現することができる発現ベクターを調製し、そして、（ｉｉ　）　Ｅ’Ｓポリペプチドの発現が起ることがで
きるようにする該宿主において、該ベクターを供給する
ことによって調製することができる。

このようにして、望むポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列が提供される０問題のＤＮＡ配列を組込み、適切な
宿主に提供されるとき、問題のポリペプチドを発現する
ことができるところの発現ベクターが調製される。問題
のＤＮＡ配列は、ベクター中において翻訳開始部位と停
止部位の間に存在する。適切な転写及び翻訳調節要素、
特にそのＤＮＡ配列のためのプロモーターと転写停止部
位も提供される０問題のＤＮＡ配列は、ポリペプチドの
発現がベクターと適合性の宿主中で起ることができるよ
うにするような正しい枠組みにおいて提供される。

キメラ状のタンパク質の場合は、外来のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ断片は、問題のエピトープが、タンパ
ク質の表面上に露出したキメラ状タンパク質の部分とし
て発現されることができるようにする位置において挿入
される。そうすれば、キメラ状のタンパク質が発現され
る。ベクターを宿している細胞は、発現が起るよう培養
される。

キメラ状タンパク質の型によって、タンパク質は、粒子
となって自ら集合することがある。

適切な宿主−ベクター系は、すべて使用することができ
る。ベクターは、プラスミドであってよい。その場合は
、例えばＥ、　ｃｏｌｉや−３，ｃｅｒｅｖｉｓｉ−肚
のようなバクテリアや酵母を使用することができる。代
替として、ベクターはウィルスベクターであってもよい
。これは、ポリペプチドの発現を起させるために、ＣＨ
Ｏ細胞のような哺乳動物の細胞系の細胞を形質転換する
のに使用される。

本発明にしたがうエピトープは、１こ以上のヘルパーＴ
細胞（Ｔｈ−細胞）のエピトープに結合させることがで
きる。Ｔｈ−細胞エピトープは、抗体産生のための援助
を引出すことができる部位である。　Ｔｈ−細胞のエピ
トープは、宿主抗原提示細胞の表面において、クラス■
の主要組織適合（ＭＨＣ）分子と結合することができ、
その後、Ｂ−細胞は、Ｂ−細胞の分化と増殖を誘発する
ために、Ｔ−細胞の受容体と３分子複合体の形で相互作
用する。

Ｔｈ−細胞エピトープは、本発明のポリペプチドの最初
の型と、種々の方法で結合することができる。グルタル
アルデヒド重合を使用することができる。そして、その
中では、発明のポリペプチドは、それらのアミノ基を介
して、Ｔｈ−細胞エピトープを提供するポリペプチドと
共重合される。本発明のポリペプチド及びＴｈ−細胞エ
ピトープを提示するポリペプチドは、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ハイドロキシーサクシリミドエステル（
ＭＢＳ）のようなヘテロ２官能性架橋結合剤を介して、
−緒に結合させることができる。

本発明のポリペプチドは、代替策として、ペプチド結合
を介してＴｈ−細胞エピトープを提示するポリペプチド
に対して、そのＣ−末端またはＮ−末端において結合さ
せてよい。これは、本発明のポリペプチドとＴｈ−細胞
エピトープを提出するポリペプチドとの共直線状合成ま
たは２つのポリペプチドが、−緒に融合している融合タ
ンパク質を発現するために、上記の如くの組換え体ＤＮ
Ａの技術を使用することによって達成される。いずれの
方法においても、適切なＴｈ−細胞エピトープは、いず
れも使用することができる。

Ｔｂ−細胞エピトープを提供するより好ましいポリペプ
チドは、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。

本発明の最初の型のポリペプチドは、Ｉ（ＢｃＡｇに化
学的に結合させることができる。そのアミノ末端に、本
発明のポリペプチドが結合しているＨＢｃＡｇを含むと
ころの本発明の２番目の型のポリペプチドにしたがって
、融合タンパク質を作るためには、組換え体ＤＮＡ技術
を使用することができる。問題のエピトープは、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端に直接融合することができる。代替と
して、その配列は、介在リンカ−を介してＨＢｃＡｇに
融合させることができる。このようなリンカ−は、１こ
以上、例えば１０こまでのアミノ酸残基から構成するこ
とができる。

本発明のポリペプチドは、−迂−１４１懸互ロー、ｆｌ
。

ａｒａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢ　　ｂｒｏｎｃｈｉ
ｓｅ　ｔｉｃａに対するワクチンとして有用である。ポ
リペプチドの効果的な量が、ワクチン接種が必要なとき
に、宿主に投与される。ポリペプチドは、経口または非
経口、例えば、皮下または筋肉注射で投与されることが
できる。本ポリペプチドは、ＦＨＡとともに与えてもよ
い。この方法で、百日咳に対する免疫は、ヒトにおいて
誘導することができる。

Ｂ　　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｉｃａに対する免疫は、
哺乳動物において誘導することができる。

典型的には、ポリペプチドは、投与あたり１乃至１００
０μｇの量、より好ましくは、投与あたり１０から１０
０μｇの量において、経口または非経口投与される。単
回投与を行うことができ、または複数投与量を、ある期
間にわたって投与することもできる。ＦＨＡが投与され
るときは、それは、投与あたり２０から７５μｇの量に
おいて使用することができる。ＦＨＡは、典型的な場合
には、本発明のポリペプチドと同じワクチン製剤として
投与される。

本発明のワクチンは、発明のポリペプチド、随意に添加
してもよいＦＨＡ及び医薬的に容認し得るキャリヤーま
たは希釈剤から戒っている。担体または希釈剤は、例え
ば、等侵食塩水溶液のような抗原を患者に導入する媒体
として使用するのに適した液体媒体ならなんでもあって
もよし〕、また、ポリペプチドは、免疫応答を刺戟し、
その際、ワクチンの効果を増強するためのアジュバント
とともに提供されることができる。適切な生理学的に容
認できるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリ
ン酸アルミニウムである。

ワクチン製剤は、抗原性ポリペプチドの０．０１から５
■／ｍｌ、望ましくは、０．０３から２■／ｍｌ、最も
望ましくは、０．３■／ａｉｌ範囲内における最終濃度
を含むように提供されるのが便利である。製剤化後、ワ
クチンは無菌容器に入れ、容器を封じ、低温、たとえば
、４℃で貯蔵することもあれば、あるいは凍結乾燥する
こともある。

このような製剤の１つ以上の用量を免疫を誘導するため
に宿主に投与することができる。各投与量は、０．１か
ら０．２−２、好ましくは、０．２から１■２１最も好
ましくは、約０．５ｍｊ！のワクチンであることが推奨
される。それゆえ、ワクチン製剤の効果的な量の投与に
よって免疫を誘導することができる。

以下の例は、本発明を具体的に説明する。それらに付随
している図においては：第１図は、ベクターｐＷＹＧ７の構築を示す。

第２図は、ＧＡＬ７プロモーター領域のヌクレオチド配
列を示す。合成されたプロモーターは、ＸｈｏｌからＢ
ａｇ　Ｈ１断片に相当する、Ｂａ−旧の下流の領域は、
ＲＮＡの開始部位（↓）とイニシエイティングＡＴＧ　
（下線が引いである）を含む天然のＧＡＬＴ中に存在し
ている。Ｂａｇ　ＩＩ部位を与えるために変更された２
つの塩基対に下線が引いである。

第３図（その１．２及び３）は、ｐ−χＧ７ＨＢＰの構
築を示す。

第４図（その１）は、ＧＡＬ７の翻訳されないリーダー
配列とＨＢｃＡｇ遺伝子の５゛領域を含む合成オリゴＡ
のヌクレオチド配列を示す。

第４図（その２）は、想定されたＢＢＯ５のエビドーム
をコードしている合成オリゴＢのヌクレオチド配列を示
す。

第５図は、（１）ｐＨＹＧ７ｔｌＢＦ　（Ｆ　Ｍ　Ｄペ
プチド−ＨＢｃＡｇ融合を発現する）　、（２）ＰＷＹ
Ｇ７ＨＢＦ、（３）プラスミドなし、及び（４）ｐＷＹ
Ｇ７ＨＢＣ（ＨＢｃＡｇを発現する）で形質転換された
誘導酵母細胞からの例２（６）における可溶性タンパク
賞のウェスターンプロットの結果を示す。プロットは、
ウサギ抗−ＨＢｃＡｇ血清とヒツジ抗ラビットＩｇＧと
ペルオキシダーゼ結合体を用いて展開した。ゲル中に、
３０に、２１．５に、及び１４．３　Ｋ　Ｄ　ａＯサイ
ズマーカーの位置が示されている。

第６図は、例２（７）中のＨＢＰ融合タンパク質の蔗糖
密度勾配遠心分離の後のドツトプロット分析の結果を示
しである０分画１は最底部の分画であり、分画２０が最
高部の分画である。抗−ＨＢｃＡｇ血清と反応する物質
はすべて、真中の分画にあり、ＨＢＰが完全に粒子とし
て集合していることを示している。

第７図は、ＨＢＰ融合タンパク賞によって提供されたペ
プチド６８３．６８４と６８５及びエピトープが、そこ
から由来しているところのＰ、６９の領域を示す。ＢＢ
Ｏ５／コアーは、ＢＢＯ５と結合する。ペプチド６８３
は、ＢＢＯ５，ＢＢＯ７。

Ｅ４Ａ８とＥ４Ｄ７と結合する。ペプチド６８４：は結
合しない。ペプチド６８５は、ＰＢＥ３と結合する。ア
ミノ酸配列の番号づけは、成熟した（すなわち、シグナ
ル配列がプロセッシングを受けた後の）Ｐ、６９の残基
を指している。

第８図は、旦、４■１υｓｉｓユのＰ、６９タンパク賞
の残基５０５から６０３をカバーしているペプチドのモ
ノクローナル抗体での分析を示している。

１：ペブチ゛の− 以下に示すペプチドは、Ｈｕｎｇｈｔｅｎ　（Ｈｕｎｇ
ｈｔｅｎ　。

ＰＮＡＳ　、□、５１３１−５１３５．１９８５）によ
って記述されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ　。

ＪＡＣ３，８５，２１４９−２１５４，１９６３）の変
法を使用して台底された。

ペプチド６８３：ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰＡ
ＧＲＥＬＳＣ（本発明のペプチド）ペプチド６８４：ＡＧＲＥＬＳＡＡＡＮＡＡＶＮＴＧＧＶＧＬＡＳＴＬＷ
ＹＡＥＣペプチド６８５：ＴＬＷＹＡＥＳＮＡＬＳＫＲＬＧＥＬＲＬＮＰＤＡＧＧ
ＡＷＧＲＧＣペプチド６８３は、Ｐ、６９遺伝子のヌク
レオチド１８７６から１９６２によってコードされてい
るア短ノ酸で構成されていて、カルボキシル末端に１つ
の追加の非天然システィン残基をもっている。ペプチド
６８４は、Ｐ、６９遺伝子のヌクレオチド１９４８から
２０３１によってコードされているアミノ酸で構成され
ている。そして、カルボキシル末端に１つの追加の非天
然システィン残基をもっている。ペプチド６８５は、Ｐ
、６９遺伝子の２０１４から２１００のヌクレオチドに
よってコードされたアミノ酸で構成されていて、カルボ
キシル末端に、１つの追加の非天然システィン残基をも
っている。

各ペプチドは、ｐ−メチル−ベンツヒドリルアミンジビ
ニルベンゼン樹脂上で台底された。各アミノ酸上のα−
アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で
あった、各カップリングのサイクルは、以下の通りであ
る：１、ジクロロメタンで樹脂を１０分間洗う。

２．５％ジイソプロピルエチルアミンを含むジクロロメ
タンで２分間ずつ３回洗う。

３、ジクロロメタンで１分間ずつ２回洗う。

４、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸のジクロロメタン
溶液を、０．３Ｍジイソプロビルカルボジイξドで６０
分間カップリングを行わせる。ＮとＱについては、カッ
プリングは、ジメチルホルムアミド中で、０．３　Ｍジ
イソプロピルカルボジイミドと、０．１２５　Ｍ　）リ
ハイドロキシベンゾトリアゾールによって行った。

５．３と同じ。

６、ジクロロメタン中５０％トリフルオロ酢酸で脱保護
基を２０分かけて行う。

７、ジクロロメタン洗滌１分間を６回。

８．２に戻る。

カップリングのサイクルが完了したときは、ペプチドは
、スカベンジャーとしてのアニソールの１０％の存在下
で、１時間、弗化水素処理して、レジンから開裂させて
遊離とした。この方法では、ペプチドは、カルボキシ末
端がアミド基として得られた。それは、次にエーテルで
洗い、乾燥し、１５％酢酸に溶かして凍結乾燥した。

１、総論Ｐ、６９の遺伝子のヌクレオチド１８５５から１９４４
に相当するアミノ酸配列を、ＨＢｃＡｇのアミノ−末端
に遺伝的に融合させた。その結果得られた融合タンパク
賞は、酵母において効率的に発現され、Ｂ　　ｂｒｏｎ
ｃｈ’ｓｅ　ｔｉｃａの６８ｋＤａのタンパク質に対し
て作られたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）　Ｂ　Ｂ　Ｏ
５と反応したが、−比一王彰１替互崩−のＰ、６９と交
差反応する。融合タンパク質は、コアー粒子の中に集合
し、ＦＨＡと一緒にして使用したとき、Ｋｅｎｄｒｉｃ
ｋ試験における一色一」髪りぢ刷１ｕ−による誘発に対
して保護を与えた。

２　　　　　ベタ　−ＷＹＧ７の調節されているＧＡＬ７プロモーターを担っていた複数
コピーベクターｐｗｙｃ７から、Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍ
　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、融合タンパ
ク質が発現された。Ｗｅｌ　ｌｃｏｍｅにおいて構築さ
れたベクターｐＷＹＧ７は、ＨＢＰ、すなわち、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端に融合した主要エピトープからなる融
合タンパク質の発現のために使用された。ベクターｐＷ
ＹＧ７は、カナマイシン抵抗性マーカー（Ｋａｎ’　）
及び酵母ガラクトース調節性ＧＡＬ７プロモーターを含
むように改変された２μベクターｐ　ＪＤＢ２１９　（
Ｂｅｇｇｓ　、　Ｎａｔｕｒｅ２７５．１０４−１０９
　、１９７８）から誘導されている。

ｐＷＹＧ７の構築は、第１図中に概要がまとめられであ
る。まず、Ｋａｎ’マーカー（ｐＵＣ４ＫからのＨｉｎ
ｃＩＩ断片；　Ｖｉｅｉｒａ　　とＭｅｓｓｉｎｇ　、
　Ｇｅｎｅエエ。

２５９．１９８２）をｐＪＤＢ２１９の独特な５Ｉｌａ
　　１部位につなげ、Ｋａｎ　’虱ｒベクターｐＪＤ８
２１９Ｋを与えた。第２に、合成ＧＡＬ１プロモーター
断片（Ｘｈｏ　ｌ−Ｂａ−旧断片、配列が第２図に示し
である）が、ｐＪＤ８２１９にの独特なＳａｔ　ＩとＢ
ａｓ＋旧部位にクローニングされた。

その結果得られたベクター、ｐＷＹＧ７は、酵母２μプ
ラス逅ドのＦＬＰ遺伝子転写ターミネータ−（Ｓｕｔｔ
ｏｎとＢｒｏａｃｈ　、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、　ｉ、　２７７０−２７８０　、１９８５　）の上流
に独特なりａｇ　ＨＩとＢｃｌＩＩ部位をもったＧＡＬ
７プロモーターをもっている。

ｐＷＹＧ７から発現されるべき外来遺伝子は、Ｂａ１１
旧とＢｃｌ　１部位の間に挿入される。ＧＡＬ７プロモ
ーター断片のデザインは、以下に論議されている。

完全なプロモーター活性を示すＧＡＬ７遺伝子のＤＮＡ
上流の最小の断片は、欠失地図作成（Ｔａ　ｊ　ｉｎ＋
ａら、Ｙｅａｓｔ　　１，６フー７７．１９８５）によ
って明確化された。この知識に基いて、２６０ｂｐのＧ
ＡＬ７プロモーター断片が合成された（配列については
第２図参照）。２６０ｂｐプロモーターは、４つの重な
り合ったオリゴヌクレオチドとして、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　（プロトコルは、
Ｐｈａｒｍａｃｉａから提供された）を使用して合成さ
れた。これらのオリゴヌクレオチドは、標準的技術を使
用して、リン酸化され、アニーリングを行ってからＸｈ
ｏ　ｌ−Ｂａｌ１ｌ旧で切断したｐＩＣ−２０Ｈ（Ｍａ
ｒｓｈ　　ら、Ｇｅｎｅ３２．　４８１−４８５．１９
８４）につなげた。陽性のクローンを同定し、それらの
ＤＮＡは、ユニバーサル及びリバースシーケンシングプ
ライ？　−（ｌｏｎｇ　、　Ｂｉｏｓｃｉ　、　Ｒｅｐ
ｏｒｔ　２　＋９０７．１９８２）を用いた２重鎖ＤＮ
Ａ配列決定法を使用して決定された。ＧＡＬ７挿入部分
の配列が確認され、そして、次に、Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｂａ
ｇ　ＨＩＧＡＬ７挿入部が切出され、上述の如＜ＰＴ、
ＤＢ２１９の中へクローニングされた。

ｐＷＹＧ７中のＧＡＬ７プロモーター断片のデザインは
、ＧＡＬ７メツセンジヤーＲＮＡの開始部位の上流にＢ
ａ１１旧クロ一ニング部位を作るために、天然のＧＡＬ
ＴＤＮＡ配列が、僅かに修正（２ｂｐ改変された）され
たものである。発現されるべき合成りＮＡは次にＧＡＬ
７上流の非翻訳配列とともにＧＡＬ７ｍＲＮＡ開始部位
が導入されるようにＢａｇ　Ｈ１部位へ、合成ＤＮＡで
連結される。

このようにして、プロモーターの下流の最初の非酵母Ｄ
ＮＡは、外来遺伝子のイニシエイティングＡＴＧのコド
ンであり、生産された転写体は、翻訳の効率を減少する
可能性がある外来のリーダーよりも、むしろ酵母のＧＡ
ＬＴリーダーをもつ。

ＨＢＰについてのＢａ−旧−Ｂａｇ　ＩＩ発現ユニット
は、中間体ベクターｐＫＧＣ−６９に中に組立てられた
。イニシエーターＡＴＧコドンの上流にＧＡＬ７配列を
含むこのベクターは、最初に、イニシエータ−ＡＴＧに
おいて、遺伝子操作したＮｃｏ　Ｉ　（ｃＣＡＴＧＧ）
部位でＨＢｃＡｇベクター、　ｐＫＧＣを構築すること
によって造られた。予知されたＢ−剋り罰８七Ｌエピト
ープをコードしているＤＮＡは、次に合ｔｃＮｃｏ　Ｉ
　−Ｎｅｏ　Ｉオリゴヌクレオチドリンカーとして挿入
された。ＰＫＧＣとｐＫＧＣ−６９Ｋ、そして最終的発
現ベクターｐＷＹＧ７ＨＢＰの構築についての全体的ス
キームは、第３図（そのｌ。

２及び３）において示されている。

（ｉ）　　ＫＧＣ（７）４染ＨＢｃＡｇの３°末端配列（ＡＶａ１部位から停止コド
ンまで）を含むＳａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　リンカ−が
、ｐｕｃ１８のＳａｌ　ＩとＥｃｏＲＩ部位（Ｖｉｅｉ
ｒａとＭｉｓｓｉｎｇ　＋１９８２）の間でつながれ、
プラスもドｐＫＧＦを与えた。　ＨＢｃＡｇ遺伝子の残
りは、次に、ｐＫＧｐにおいて、３方向の連絡において
組立てられた。

ｐＫＧＦの２．７　Ｋ　ｂのＩ（ｉｎｄ［［−Ａｖａ　
Ｉ断片が単離され、（ｉ）酵母のＧＡＬＴの上流配列と
ＨＢｃＡｇ遺伝子の５”末端を含んでいる８７ｂｐの合
成（リン酸化された）　ＨｉｎｄＩ［［−Ｍａｅ　ｍ断
片（オリゴＡ。

第４図（その１））、そして、（ｉｉ）遺伝子の中心部
分の多くを含んでいるｐ　ＥＢ　２０８　（ｃ１ａｒｋ
ら、Ｎａｔｕｒｅ１１血、　　該１−該４．　１９８７
）からの５００　ｂｐ　ＭａｅＩ［−Ａｖａ　Ｉ断片へ
と連結された。

その結果生じたプラスミド、ｐＫＧＣは、ｐＷＹＧ７か
らのＨＢｃＡｇの発現のための中間体ベクターである。

ｐＫＧＣの台底された領域の配列は、ユニバーサル及び
リバースシーケンシングプライマーでの２重鎮法を用い
て確認された（Ｈｏｎｇ。

１９Ｂ２）。

ｉｉ　　　ＫＧＣ−６９にのｐＫＧＣ中のｌ（ＢｃＡｇ遺伝子は、イニシエターＡＴ
Ｇにおいて、特異なＮｃｏ　Ｉ　（ｃＣＡＴＧＧ）部位
をもつように改変された。それゆえ、Ｎ末端ペプチド融
合は、この部位にＮｃｏ　Ｉ　−Ｎｃｏ　Ｉ　　ＤＮＡ
断片を挿入することによって作ることができた。Ｐ。

６９抗原のエピトープは、プロリンに冨んだ繰返し部分
に存在することが予知されていたので、適当なオリゴヌ
クレオチドの対が、このエピトープをコードするために
台底された。作られたオリゴヌクレオチドと相当するア
ミノ酸配列が、第４図（その２）に与えられている；　
Ｂ　　ｅｒｔｕｓｓｉｓＤＮＡは、酵母の最適コドンを
与えるために改変された。ｐＫＧＣは、Ｎｃｏ　Ｉで消
化され、アニーリングされた、リン酸化されていないオ
リゴヌクレオチドは、リンカ−ティリング法（Ｌａｔｂ
ｅら、ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ　ｆ）−、１ｓＳｕｅ　４　
、　１９８４　）を用いて、中にクローニングされた。

挿入部をもった、その結果生じたプラスミドから、必要
とされた配置をもったものを、挿入体の２重鎖配列決定
によって選択した。その結果生じたベクターｐＫＧＣ−
６９には、ｐＷＹＧ７への転移のためのＢａｍ　ＨＩ　
−Ｂａ■旧断片の源として使用することができた。

ＷＹＧ７）（ＢＰのｐＫＧＣ−６９ＫからのＢａｇ旧−Ｂａｇ　Ｈ１断片が
単離され、Ｂａｇ　ＨｒとＢｃｌ　Ｉで消化され、コウ
ジの小腸のアルカリ性ホスファターゼで処理されたとこ
ろのｐＷＹＧ７　（鉦ｍ−ＤＮＡ）ヘクローンされた。

形質転換の後、■ｎｒコロニーは、正しい方向配置の挿
入体につき試験を行い、これらのプラスミドをｐＷＹＧ
７ＨＢＰと呼んだｐＷＹＧ７ＨＢＰを含むＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＭＣ１０６１を、１９８９年７月２８日に、受入れ
番号ＮＣＩＭＢ４０１７６の下にＮａｔｉｏ−ｎａｌ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　
ａｎｄ　ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ　（ＮＣＩＭＢ
）に寄託した。

４、　ＷＹＧ７ＨＢＰでの　　のベクターｐＷＹＧ７ＨＢＦを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ　ｌ　５０−２８　（ａ
、　お狙」＝、　ｈｉｓ３　、　ｕｒａ　３　＋　江Ｌ
Ｌ、　ＭｃＣｌｅｏｄ　　ら、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ
、土９．　７７９−７８７゜１９８４）に、Ｉｔｏらの
リチウム形質変換操作（Ｊ、Ｂａｃｔ、土ｎ、１６３−
１６８．１９８３）を使用して導入した。形質変換した
酵母の細胞を、ＹＰＤブロス（ＳｈｅｒｍａＨら＋　Ｍ
ｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ　、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　。

１９８３）中、３０°Ｃで一夜インキュベート後、選択
培地上で、ブレーティングアウトを行った（ＹＰＤ＋５
００μｇ／＋／！０４１８）。これにより０４１８−抵
抗性の発現ができるようになり、形質転換頻度を増加す
る。Ｇ４１８’として出現したコロニーは、ロイシンを
欠いている最少必須培地上で、やはりｐＷＹＧ７ＨＢＰ
によっては付与されているＬｅｕ　”表数型についてチ
エツクするためにチ、ｚ７りを行った（Ｙ　Ｎ　Ｂ　＋
ｇｌｕｃｏｓｅ　＋ｈｆｓｔｉｄｉｎｅ　＋ｕｒａｃｉ
ｌ＋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　、　Ｓｈｅｒｍａｎら、１
９８３）、正の形質転換体（Ｇ４１８’＋Ｌｅｕ”　）
は、発現分析のために使用された。

５　　ＨＢＰの　　のガータ　−ス歩形質転換体は、２％ラフィノースと５００μｇ／１ｍｌ
のＧ４１８を含むＹＰ培養中で３０℃で軌道式シェーカ
ーで、中期一対数増殖期（１０７細胞／ｖａｎ）まで培
養した。４０％ガラクトースの部分量を最終濃度２％ま
で加え、さらに、４８時間インキュベートした。細胞は
、次に低速の遠心分離で収穫し、１回蒸留水で洗い、氷
冷した細胞破壊用バッファー（２０ｍＭナトリウムホス
フェートｐＨ７，０、０，１％トリートンＸｌ００．４
ｍＭフェニル、メタンスルフォニルフロオライド、４ｍ
ＭＥＧＴＡ及びそれぞれ２μｇ／ｍｌのペプスタチン、
アンチパイン、リューベプチンとキモトリプシン；２５
０■ｌの培養液からの細胞に対して５ｍＡ）中に再懸濁
した。酸で洗ったガラス球（０，４５ｍ）を加え、そし
て、細胞は、激しくＶｏｒｔｅｘ上で混和することによ
って破壊した。粗溶菌液を１５分間１０．０００ｇで遠
心分離し、澄明にした。澄明にした上清のタンパク質濃
度を、Ｂｉｏ　Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて定量
した（Ｂｉｏ　Ｒａｄ。

製造業者の使用説明にしたがって）。そして、材料は、
小部分にわけて一２０℃で保存した。

６、　　について″の誘発された酵母溶菌液中のタンパク質を、５ＯＳ−ポリ
アクリルア藁ドゲル中で分離することによって解析した
（Ｌａｅｍｓｌｉ　Ｎａｔｕｒｅ２２７　、　６８０−
６８５．１９７０）、各列毎に５０μｇの可溶性タンパ
ク質をのせ、負の対照として、誘発した５１５０−２Ｂ
の抽出物をのせた。ｐＷＹＧ７ＨＢＰ−形質転換細胞抽
出物において、２４．０００ｋ　Ｄ　ａ　（示していな
い）に移動する新しいタンパク質のバンドが、クーマシ
ーブルー染色によって検出された。このポリペプチドが
、ＨＢＰであることは、ＨＢｃＡｇまたはＢＢＯ５抗血
清でウェスターンプロット分析を行うことによって確認
した（第５図、ＨＢｃＡｇ血清での結果）　、　ＥＬＩ
Ｓ＾定量のデータにより、１０−３０％の細胞タンパク
質の発現の水準が示された。

酵母中てま作られたＨＢＰタンパク質がコアー粒子とし
て存在するかどうかを試験するため、誘発した細胞抽出
物を、１５％−４５％のｗ／ｖ蔗糖密度勾配（リン酸バ
ッファーを加えた食塩水中）の上に重ね、ベックマン５
Ｗ２８０−ター中で遠心分Ｎ　（２８，０００ｒｐ園、
４時間）した。グレーデイエンドを分画し、各分画から
のその小部分を、ニトロセルローズ格子上にスポットし
、フィルターをウェスターンプロット操作にかけること
によって、各画分を、ＨＢｃＡｇ−または−比−１４１
展１０一エヒトープ反応性物質の存在について分析した
（ドツトプロットは第６図に示しである）。

最大の反応性は、勾配の中央の分画に検出され、勾配の
頂点には、なんら検出されなかった。このことは、酵母
中で造られたＨＢＰタンパク質のすべては、会合して、
蔗糖勾配中で沈澱するところのコアー粒子を形成してい
ることを示している。

確認のため、ピークの勾配分画からの一部分が電子顕微
鏡（ホスホタングステン酸染色）検査のため送付された
。多数のウィルスコアー粒子が明らかに見られた（示さ
れていない）。

３：　゛　　−プロ　　　　バイブ例１（２■／ｓｊりにおいて調製された３つのペプチド
の水溶液と例２において調製されたＨＢＰの融合タンパ
ク質を、ドツトプロット抗体ハイブリッド形成実験に使
用した。手短かに記すと、１０μｌのペプチドまたは融
合タンパク質を、ニトロセルローズ膜に適用し、乾燥さ
せた。モノクローナル抗体でのフィルターハイブリッド
形成実験は、正常の方法によって行われた（例えば、“
＾ｎｔｉｂｏ−ｄｉ６３　、　Ｂ　１ａｂＯｒａｔｏｒ
ｙ　ｍａｎｕａｌ″ｐ、　１７　Ｂ　、　Ｅｄ、Ｅ。

Ｍａｒｌｏ−とり、Ｌａｎｅ編、　　１９８８　、　Ｃ
ｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙを参照）。

モノクローナル抗体は：且、−廿ｙ溢駄社叫１鏡からの６８ｋＤａタンパク質に
対して作られたが、Ｂ０辺■山４１Ｄ工からのＰ。

６９と交差反応するＢＢＯ５及びＢＢＯ７，そして、旦
、４■ｔｕｓｓｉｓ−に対して作られた一連の７種のモ
ノクローナル抗体であった。

その結果は、表１と第７図に示されている。第７図は、
ペプチドがその周辺から作られたＰ、６９の領域を示し
ている。３種の化学的に台底されたペプチドは、追加の
非天然カルボキシル末端システィン残基をもっている。

ＨＢＰ融合タンパク賞は、Ｎ−末端メチオニン残基をも
っている。その結果から、問題としているエピトープは
、以下の配列をもった領域にすることが確立された。

ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰ表１
゜ペプチドモノクローナル　　　　　　　　　　　　融合抗体　旦
旦１旦旦杢旦旦旦　タンパク質Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　
　　　　ＢＢＯ５＋　　　　−−＋敗並仙鎚亜且勉　　
ＢＢＯ７＋ＢＰＥ３　　　　−　　　−　　　　＋ＰＩ１８ＰＥ８Ｂｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａ　　　　　Ｄ５Ｅ９凶ｄ益鮭ｓ
　　　　　Ｆ６Ｅ５Ｅ４Ａ８　　　　　＋Ｅ４Ｄ７　十４：にｅｎｄｒｉｃｋの例１のペプチドは、Ｎ−マレイξドベンゾイルーＮ−ハ
イドロキシスルホサクシニ旦ドエステル（ＭＢＳ）を、
ヘテロ２官能性架橋−リンカ−（Ｌｉｕ　＋　Ｆ、ら＋
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ上８．　６９０．１９７９
）として使用して、付加されたＣ−末端システィン残基
を通じて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）に結合させた。手短かに述べると、透析したＫＬＨを
、室温でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＭ
ＢＳと反応させ、次にＧ−２５カラムを通す、ＫＬＨの
タンパク質ピークをプールし、遊離ペプチドに加えた。

　ｐＨは、次に７と７．５の間に調節し、室温で３時間
攪拌した後結合したペプチドを一２０℃で貯蔵した。Ｋ
ＬＨ濃度は、２０ｇ／ｍｊ！を越えてはならず、ＭＢＳ
／ＫＬＨのモル比は４０：１であり、そして、反応にお
いては、ＤＭＦの最終濃度は３０％以下であるべきであ
る。ペプチド６８３．６８４及び６８５は、５■ペプチ
ドあたり、２．５■のＫＬＨ（１：２重量／重量の比）
を使用して結合された。

２、　　−メン　　　　　　　　　ＦＨＡＦＨＡは、こ
の分野の技術においてよく知られている方法によって調
製できる（＾ｒａｃｈとＭｕｎｏｚＪ、Ｊ、　（１９７
０）　、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ　２５
７６４　７６７　；　Ａｓｈｗｏｒｔｈら（１９８２）
　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　３工　１２７８−１２８１参照）。ただ
し、以下の操作手順においては、ＦＨＡは以下のプロト
コルに従って調製された。

ヱ旦人生園盟：旦−肚旦旦虹ｓ　Ｔｏｍａｈａ　＋また
はＢＰ３５７　（ＬＰＦを分泌しないＡ、Ａ、Ｗｅｉｓ
ｓら（１９８３）のＴｈ５１−ランスボゾン変異株〕は
、６５０ｍｆのＣｏｓ　ｔａｒフラスコ中で、５ｔａｉ
ｎｅｒと５ｃｈｏｔｅの培地中で（各１５０＋＋／！を
入れる）、３７℃、５日間培養した（Ｓａｔｏら、　Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎとｌｍ５ｕ−ｎｉｔｙ土工、３１３−
３２０．１９８３）、遠心分離（３０分、６０００Ｘｇ
）の前に、タンパク加水分解阻害剤として、５０μＭの
１．１０−フェナンスロリン１加水物を培養物に加えた
。無細胞上清は、３０Ｘ１５０ｍのハイドロキシアパタ
イト（ＢＯ２）カラムに加え、順次ｐＨ８の１０ｍＭホ
スフェートバッファー、ｐＨ７，１の１００ｍＭホスフ
ェートバッファーで、基線が安定するまで洗滌した（す
べて室温、そして５００ａ＋ｆ／時間のポンプによる送
液速度を用いた）。

保持された物質は、１００ｍＭホスフェートバッファー
に加えた０、５ＭＮａＣＪｌ！で溶出し、アヒルの赤血
球細胞を凝集させるピーク分画をプールした。プールし
た分画を、４°Ｃで２５−３０倍容量（７）０．０２５
Ｍビス−トリス／塩酸バッファーに対して一夜透析した
。沈澱したＦＨＡは、遠心分離して集めた（２０分、８
０００Ｘｇ）、次ノ段階は、ＦＨＡ　（ＬＰＦと同様に
）が、４０ｍＭβ−アラニンバッファー、ｐ）［３，５
に溶解することを見出したＣｏｗｅ　１１ら（■巻の中
、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅ＋３７１−３７
９　、　Ｓｅ＋ｗｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎｓ　Ｄｉｓｅ−ａｓｅ　、　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　と
Ｆｉｅｌｄｓ＠　：　Ｔｈ１ｅｓ＋ｅ　Ｖｅｒｌａｇ　
。

Ｎｅ５ｖ　Ｙｏｒｋ　、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　＋　１
９８２　）によって示唆を受けたものであった。沈澱し
たＦＨＡは、可能な最小容量の３−アラニンバッファー
（１１，中３．５７ｇ３−アラニンと０．３５　ｇの蟻
酸）に溶解し、不溶物を遠心分離によって除去し、そし
て透明な上滑を、同じバッファーで平衡に達したＵｌｔ
ｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ３４のカラム（２５Ｘ５０ｍ）に適
用し、同じバッファーで溶出した。

赤血球凝集物質は、鋭いピークとなって現れ、続いて肩
が現れた。肩の物質は捨て、鋭いピークからの分画をプ
ールし、凍結保存し、０．０２５　Ｍビス−トリスバッ
ファーに対して透析を行うことによって再沈澱させ、さ
らに小容量の３−アラニンバッファーに溶解した。溶解
度は、約２．５■Ｆｌ（Ａ／ｓ／！である。酸性ｐＨで
凍結（−２０℃または一４０℃）した物質は、そのＥＬ
ｒＳ＾反応性と５ＤＳ−［ＩＡＧＥゲルにおける外観か
ら判断して、安定と思われた。それは１５０−１００Ｋ
Ｄに優勢に、３つの強いバインドを形成した。

３、■Ｕム吐立跋簾これは・ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンについての−、Ｈ
，Ｏ。

の必要事項にしたがって、体重１４−１６ｇのＭｌｌま
たは旧ＣＩ！、（ＯＬＡＣ，カテゴリー３゜Ｂ　　ｂｒ
ｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｉｃａをはじめとする大抵の病原菌
が含まれていない）を使用して遂行された。０．５１Ｉ
ｌの容量における抗原は、同時に腹腔内に接種され、最
高濃度の希釈液と３回の連続４倍希釈液から成っていた
。２週間後に、マウスは推奨された誘発株、１８　３２
３　（１００２００ＬＤｓ。）を用いて脳内で誘発を行
った。各群における生存者の数を、平行線プロビット解
析のプログラムを使用して、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｖａｃｃｉｎｅ６６
／８４に対する相対的力価の計算に用いた。

その結果は表２に示されている。

表−２ペプチド（μｇ）８３８４８５１０　　　１０　　　１０３．３　　　３．３　　　３．３１．１１　　１．１１　　１，１１０．３７　　０．３７　　０．３７融合タンパク質（μｇ）　＋ＦＨＡ（μｇ）１　　　　
　　２００．３３　　　　　６．６０．１１　　　　　２．２０．０３７　　　　０．７４単独（μｇ）０６６２．２０．７４１、Ｕ。

０．２５０．０８０．０２Ｂ０．００９＋ＦＨＡ（μ紛　生存マウス６／１６３／１６７／１６５／１６８／１６１１／１６４／１６１／１６３／１６２／１６３／１６１／１６生存マウス１１／１６２／１６２／１６３／１６この結果から、ＦＨＡと化学的に台底された３つのペプ
チドすべてか、またはＨＢＰの融合タンパク質との併用
は、ＦＨＡ単独よりももっと強力であることが明らかに
示されている。

１つのアミノ酸残基が重なっているにのアごノ酸からな
るペプチドが、Ｇｅｙｓｅｎら（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ８１
゜１９８４．３９９８〜４００２）によって記述された
固相のポリエチレンビン上で台底された。Ｂ−色毬±υ
エレエのＰ、６９抗原の５０５から６０３番目のアミノ
酸残基をカバーする９４種のにのアミノ酸からなるペプ
チドを台底した。ペプスキャンペブチドｌは、Ｔｈｒ（
５０５）−Ａｓｐ（５１０）であった、ペプスキャンペ
ブチド９４は、Ａｌａ（５９Ｂ）　−Ｌｅｕ（６０３）
であった。

ペプチドのモノクローナル抗体に対する反応性は、ピン
を１−２時間、または−夜抗体中でインキュベートした
後、洗滌し、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体
中でインキュベートすることによって定量した。（ｍＡ
ｂ）　ＢＢＯ５は、Ｂ　　ｂｒｏｎｃｈｎ聾且並からの
Ｐ、６８抗原に対して作られた（ＩｇＧＩ）である（Ｍ
ｏｎ　ｔａｒｅｚら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｗｕｎ。

ｉｔ、１９８５．６４４−７５１）。この−Ａｂは、旦
、１シｔｕｓｓ匈−からのＰ６６９と交差する中和ｓＡ
ｂである。

酵素活性は、ＡＢＴＳ基質溶液中（１００＊ｆのバッフ
ァ　　（０，１Ｍ　ＮａＪＰＯ４，０，０８Ｍクエン酸
、ｐＨ４，３０μｉ過酸化水素を含む）中の５０■のア
ジノージ−３−エチル−ベンツチアゾジスルホネート（
ＡＢＴＳ））でビンをインキュベートし、１０−６０分
後、溶液の＾。。をＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｃａ
ｎ　ＭＣ１１００を用いて測定することにより定量した
。ピンは、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａｔＨＰＯ＜　、　０．１
％ＳＤＳ。

０、ＯＩＭβ−メルカプトエタノール中６５℃で超音波
処理し、その後の抗体中のインキュベーションの前に結
合した抗体と染色複合体を除去した。

結果は第８図に示されている。

第８図からみることができるように、ｍＡｂ　ＢＢＯ５
は、ベプスキャンペプチド４３（配列ＰＧＰＱＰＰ）の
４゜みを認識した。これは、ペプチド６８３の認識と一致し
、ており、ＢＢＯ５エピトープを、Ｐ、６９の（Ｐｒｏ
−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ）ｓの繰返しの領域中に、その位置を
突きとめた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ベクターｐＷＹＧ７の構築を示す。第２図は、ＧＡＬ７プロモーター領域のヌクレオチド配
列を示す。第３図（その１．２及び３）はｐＷＸＧ７ＨＢＰ　１７
）構築を示す。第４図（その１）は、ＧＡＬ７の翻訳されないリーダー
配列とＨＢｃＡｇ遺伝子の５′領域を含む合成オリゴＡ
のヌクレオチド配列を示し、第４図（その２）は、合成
オリゴＢのヌクレオチド配列を示す。第５図は、ウェスターンプロット分析の結果を示す写真
である。第６図は、ドツトプロット分析の結果を示す写真である
。第７図は、Ｐ、６９領域を示す。第８図は、モノクローナル抗体によるペプチドの分析結
果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】（１）以下からなるエピトープを提供するポリペプチド
：（ａ）￥Ｂ￥．￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥ＣＮ２９９２の
Ｐ．６９遺伝子のヌクレオチド１８８５から１９０２に
よってコードされているアミノ酸配列；（ｂ）￥Ｂ￥．￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥の別の菌株、ま
たは、￥Ｂ￥．￥ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥、また
は￥Ｂ￥．￥ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ￥の菌株の
相当するアミノ酸配列；または（ｃ）該配列（ａ）または（ｂ）の抗原性と実質的に同
じ抗原性をもつように改変された（ａ）または（ｂ）の
該配列（但し、該ポリペプチドは、５０このアミノ酸残
基より長くないか、または担体タンパク質と該エピトー
プ配列を含む５０こ未満のアミノ酸残基の外来配列とか
らなるアミノ酸配列をもつキメラ状タンパク質である）
。ただし、該エピトープは、以下から成っている：（ａ＿
１）￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥のＣＮ２９９２Ｐ．６
９遺伝子ヌクレオチド１８７６から１９４４によってコ
ードされているアミノ酸配列；（ｂ＿１）￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥の別の菌株、ま
たは、￥Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥または、￥
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ￥の菌株の相当する
アミノ酸配列；または（ｃ＿１）該配列（ａ＿１）また（ｂ＿１）の抗原性と
実質的に同じ抗原性をもつように改変された（ａ＿１）
または（ｂ＿１）の該配列。（３）５０こ未満のアミノ酸で構成され、Ｎ−末端、そ
して／またはＣ−末端にシステイン残基が備っている特
許請求の範囲第１項または第２項によるポリペプチド。（４）３０こまでのアミノ酸残基から構成されている特
許請求の範囲の第１項から第４項までのいずれか１つに
よるポリペプチド。（５）そのアミノ末端に、該外来配列が連結されている
Ｂ型肝炎コアー抗原から成る融合タンパク質である特許
請求の範囲第１項または第２項によるポリペプチド。（６）アミノ酸配列ＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥＡＰＡＰＱＰＰＡ
ＧＲＥＬＳＣまたはＰＧＰＱＰＰ；またはＢ型肝炎コア
ー抗原のアミノ末端に融合したアミノ酸配列ＭＡＰＰＡＰＫＰＡＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＱＰＥ
ＡＰＡＰＱＰをもっている特許請求の範囲第１項による
ポリペプチド。（７）その製造法が、該ポリペプチド中にアミノ酸が存
在する順番に、単一アミノ酸そして／または２こ以上の
アミノ酸からなるでき上ったペプチドを縮合させること
からなる特許請求の範囲第１項に記載されたポリペプチ
ドの製造法。（８）その製造法が、（ｉ）該ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を組
込み、適切な宿主中に提供されるとき、該ポリペプチド
を発現することができる発現ベクターを調製すること；
そして、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現が起ることを可能ならし
めるような該宿主中に該ベクターを供給することからな
る特許請求の範囲第１項において記載されたポリペプチ
ドの製造法。（９）生理学的に容認できる担体に連結された特許請求
の範囲第１項において記載されたポリペプチドからなる
結合体。（１０）医薬として容認できる担体または希釈剤、特許
請求の範囲第１項において記載されたポリペプチド、そ
して、任意的に添加してもよいフィラメント状赤血球凝
集素からなるワクチン。