JPH03232898A

JPH03232898A - Functional polypeptide

Info

Publication number: JPH03232898A
Application number: JP2024469A
Authority: JP
Inventors: Yasuaki Kawase; 川瀬　靖聡; Yoichi Odate; 大館　洋一; Yuki Taguchi; 田口　由起; Fusao Kimizuka; 君塚　房夫; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1990-02-05
Filing date: 1990-02-05
Publication date: 1991-10-16
Anticipated expiration: 2014-03-08
Also published as: JP2866134B2

Abstract

NEW MATERIAL:A functional peptide of formula I (C277 is a sequence of formula II exhibiting a 277 amino acid polypeptide residue corresponding to the Pro<1239>-Ser<1515> of the cell adhesion domain of human fibronectin; X is methionyl- alanine residue; (n) is 1, 0; EGF is a sequence of formula III exhibiting the amino acid residue of human epidermal growth factor). USE:A wound and ulcer curing agent having a cell adhesion activity and a cell growth acceleration activity. PREPARATION:For example, a DNA coding a polypeptide of formula II having the cell adhesion activity of human fibronectin(FN) and a polypeptide of formula III having the cell growth acceleration activity of human epidermal growth factor(FGF), respectively, are prepared and then combined with a suitable vector to form a recombined plasmid, which is inserted into a host such as Escherichia coli. The transformed host is cultured to prepare the polypeptide.

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規ポリペプチドに関し、更に詳しくはヒト
フィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプチドと、
ヒト上皮成長因子とが共有結合した新規な機能性ポリペ
プチドに関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a novel polypeptide, and more particularly to a cell adhesion domain polypeptide of human fibronectin;
This invention relates to a novel functional polypeptide covalently bound to human epidermal growth factor.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

フィブロネクチン（以下、ＦＮと表示する）は血漿や細
胞外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機
能を持つことが知られている〔アニュアル　レビュー　
オブ　バイオケミス　ト　リ　−　　（八ｎｎｕａｌ　
　Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　、第５７巻、第３７５〜４１３頁（１９８８））。Fibronectin (hereinafter referred to as FN) is a glycoprotein present in plasma and extracellular matrix, and is known to have a variety of functions [Annual Review
Of Biochemistry - (8annual
Review of Biochemistry
), Vol. 57, pp. 375-413 (1988)).

天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利
用する試みがなされているが、血液から採取するために
供給に制限があること、コスト高であること、また、病
原性の細菌やウィルス等による汚染の可能性があるなど
の理由により、実用化されていない。また、天然のＦＮ
の機能ドメインを取出して利用することも同様の理由か
ら実用化されていない。Attempts have been made to use natural FN for wound healing, medicines such as eye drops, and cosmetics, but there are limited supplies because it is collected from blood, high costs, and the risk of pathogenic bacteria and cosmetics. It has not been put into practical use due to the possibility of contamination by viruses, etc. Also, natural FN
For the same reason, extracting and using the functional domain of the system has not been put to practical use.

そこで本発明者らは、ヒ）ＦＮの細胞接着ドメインをコ
ードするｃＤＮＡ断片を発現ベクターに接続して大腸菌
に導入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及び
その製造方法を開発し、特許出願した（特開平１−２０
６９９８号）。Therefore, the present inventors developed a cell adhesion active polypeptide and its production method by connecting a cDNA fragment encoding the cell adhesion domain of human FN to an expression vector and introducing it into E. coli, and filed a patent application ( Japanese Patent Publication No. 1-20
No. 6998).

一方、上皮成長因子（以下ＥＧＦと表示する）は、上皮
細胞をはじめとする種々の細胞の増殖と分化の促進、オ
ルニチン脱炭酸酵素活性の元通とプトレッシンの蓄積、
胃酸分泌抑制、核酸、タンパク合成の促進、低分子物質
の細胞内輸送の促進、解糖の促進、ホルモン分泌・合成
の促進などの多彩な生物作用を示すポリペプチドであり
〔アニュアル　レビュー　オブ　バイオケミ　ス　ト　
リ　−　（Ａｎｎｕａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４８巻、第１９３〜２１
６頁（１９７９））、その細胞増殖促進活性から、創傷
治癒、潰瘍治癒等の効果が認められている。On the other hand, epidermal growth factor (hereinafter referred to as EGF) promotes the proliferation and differentiation of various cells including epithelial cells, restores ornithine decarboxylase activity, and accumulates putrescine.
It is a polypeptide that exhibits a variety of biological effects such as suppressing gastric acid secretion, promoting nucleic acid and protein synthesis, promoting intracellular transport of low-molecular-weight substances, promoting glycolysis, and promoting hormone secretion and synthesis [Annual Review of Biochemistry] to
Annual Review of
Biochemistry) Volume 48, Nos. 193-21
6 (1979)), and its cell proliferation-promoting activity has been recognized to have effects on wound healing, ulcer healing, etc.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problem to be solved by the invention]

前記したごとく、ＥＧＦにはその細胞増殖促進作用から
創傷治癒効果が認められているが、これに細胞接着活性
を合せ持たせられれば、°細胞への親和性を高めること
ができ、局所への到達（ドラッグデリバリ−）システム
や、徐放性薬剤の開発等、ＥＧＦの利用上非常に有効で
ある。As mentioned above, EGF has been shown to have a wound healing effect due to its cell proliferation-promoting effect, but if it can also have cell adhesion activity, it would be possible to increase its affinity for cells and provide local therapy. This is very effective for the use of EGF, such as in the development of drug delivery systems and sustained release drugs.

すなわち本発明の目的は、細胞接着活性と、細胞増殖促
進活性とを同時に兼ね備えた新規なポリペプチドを開発
し、更にその製造方法を提供することにある。That is, an object of the present invention is to develop a novel polypeptide that simultaneously has cell adhesion activity and cell proliferation promoting activity, and to provide a method for producing the same.

〔課題を解決するための手段〕[Means to solve the problem]

本発明を概説すれば、本発明は機能性ポリペプチドであ
って、細胞接着活性と、細胞増殖促進活性とを合せ持つ
新規なポリペプチドに関する。To summarize the present invention, the present invention relates to a novel polypeptide that is a functional polypeptide and has both cell adhesion activity and cell proliferation promoting activity.

本発明者らは、ＦＮの細胞接着活性と、ＥＧＦの細胞増
殖促進活性を兼ね備えた新規ポリペプチドの構築、及び
その製造方法について研究し、ヒトＦＮの細胞接着ドメ
インと、ヒトＥＧＦが直接又はリンカ−ペプチドを介し
て結合した新規な機能性ポリペプチドを遺伝子工学的に
作製した。The present inventors researched the construction of a novel polypeptide that has both the cell adhesion activity of FN and the cell proliferation promoting activity of EGF, and a method for producing the same. - Genetically engineered a novel functional polypeptide linked via a peptide.

この新規な機能性ポリペプチドの生物活性を調べた結果
、細胞接着活性と、細胞増殖促進活性の両方の活性を有
することを見出した。As a result of examining the biological activities of this novel functional polypeptide, it was found that it has both cell adhesion activity and cell growth promoting activity.

以下、本発明を具体的に説明する。The present invention will be explained in detail below.

ヒ）ＦＮのタンパク質の一次構造については、ジ　エン
ボ　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、
第４巻、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）に記載さ
れている。まｔこ、その細胞接着ドメインをコードする
ｃＤＮＡクローン（ｐＬＦ５）についてはバイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２５巻、第４９
３６〜４９４１頁（１９８６）に記載されている。本発
明者らは、ｐＬＦ５から、細胞接着ドメインに対するｃ
　ＤＮＡ断片を取出し、これを発現ベクターに接続して
大腸菌に導入することにより、細胞接着活性ポリペプチ
ド及びその製造方法を開発し特許出願しｊこ（特開平↑
−２０６９９８号）。本発明で必要とされる細胞接着ド
メインのｃＤＮＡは、特開平１−２０６９９８号公報に
記載されている組換え体プラスミドｐＴＦ７０２１を用
いることができる。ｐＴＦ７０２１はＦＮのｐｒｏ＋２
３９−Ｍｅｔ１５１７（２７９アミノ酸残基）を発現す
るプラスミドである。ｐＴＦ７０２１の翻訳領域のＣ末
端の終止コドンの直前にクローニングサイト、例えばＮ
ｃｏＩサイトを導入することにより、細胞接着ドメイン
のｃＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡを連
結させることができる。h) For the primary structure of the FN protein, see The EMBOJournal,
4, pp. 1755-1759 (1985). Regarding the cDNA clone (pLF5) encoding the cell adhesion domain, see Biochemistry Vol. 25, No. 49.
36-4941 (1986). From pLF5, we found that c
By extracting a DNA fragment, connecting it to an expression vector, and introducing it into Escherichia coli, we developed a cell adhesion active polypeptide and a method for its production, and filed a patent application (Unexamined Japanese Patent Publication No.
-206998). As the cDNA of the cell adhesion domain required in the present invention, recombinant plasmid pTF7021 described in JP-A-1-206998 can be used. pTF7021 is FN pro+2
This is a plasmid expressing 39-Met1517 (279 amino acid residues). A cloning site, e.g. N
By introducing a coI site, the cDNA of the cell adhesion domain and the DNA encoding another polypeptide can be linked.

本発明による新規な機能性ポリペプチドは、下記一般式
Ｉ：Ｃ２，、−（Ｘ）、、−ＢＧＦ　　　・・−ＣＩ　〕〔
式中、Ｃ２７７はヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメ
インのｐｒ０１２３９−Ｓｅｒｌ！ｉ＋５に相当する２
７７アミノ酸ポリペプチド残基を示し、下記式■：Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　ＴｈｒＰｒｏ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒＶａｌ　　Ａｒｇ　　ＴｙｒＡｓｐ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ八ｓｐ　　八ｓｎ　　八１ａＰｒｏ　　Ｇａｙ　　ＴｈｒＳｅｒ　　Ｖａｌ　　ＴｙｒＬｅｕ　　Ａｒｇ　　ＧｌｙＭｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ１１ｅ　　Ａｓｐ　　ＬｅｕＳｅｒ　　Ｐｒｏ　　ＶａｌＧｌｕ　　Ｌｅｕ　　５ｅｒＶａｌ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＧｌｕ　　Ｔｙｒ　　ＶａｌＧｌｕ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ八ｒｇ　　Ｇｌｎ　　ＬｙｓＴｈｒ　　Ｔｒｐ　　ＡｌａＴｈｒ　　Ａｓｎ　　ＰｈｅＬｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ１１ｅ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。The novel functional polypeptide according to the present invention has the following general formula I: C2,, -(X),, -BGF...-CI] [
In the formula, C277 is pr01239-Serl! of the cell adhesion domain of human fibronectin. 2 corresponding to i+5
The 77 amino acid polypeptide residues are represented by the following formula ■: Pro Asp Thr Pro Pro 5er Val Arg Tyr Asp Val Ala 8sp 8sn 81a Pro Gay Thr Ser Val Tyr Leu Arg Gly Met Arg Val 11e Asp Leu Ser Pro Val Glu Leu 5er Val Val Leu Glu Tyr Val Glu Gln His 8rg Gln Lys Thr Trp Ala Thr Asn Phe Lys Asn Glu 11e Ser Pr.

Ｔｈｒ　　八ｓｎ　　ＬｅｕＶａｌ　　Ｓｅｒ　　ＶａｌＧｉｌｌ　　−Ｓｅｒ　　ＴｈｒＴｈｒ　　Ｇｌｙ　　ＬｅｕＰｒ。Thr 8 sn Leu Val　Ser　Val Gill-Ser Thr Thr Gly Leu Pr.

ＬｅｕＧｌｕＳｅｒＬｅｕＳｅｒＰｒ。Leu Glu Ser Leu Ser Pr.

ＡｓｐＳｅｒＴｈｒ八１ａＩＩｅＡｒｇ八ｒｇＰｒ。Asp Ser Thr 81a IIe Arg 8rg Pr.

八１ａし８ｕＶａｌＴｈｒＡｌａ１ｅＰｒ。81a Shi8u Val Thr Ala 1e Pr.

しｙｓＰｒ。Yes Pr.

ＡｌａＳｅｒＴｈｒＰｒ。Ala Ser Thr Pr.

１ａＰｒ。1a Pr.

ＡｒｇＰｒ。Arg Pr.

八ｓｎ１ｙしｅｕ１ｅＰｒ。Eight sns 1y Seu 1e Pr.

Ｐｒ。Pr.

ＴｈｒＶａｌＳｅｒＧａｙＶａｌＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｓｎＡｒｇ旧ＳＡｒｇＳｅｒＴｈｒＡｓｎ１ｙＡｒｇＴｈｒＡｌａＴｙｒＧｌｎＴｈｒＶａｌＴｈｒしｙｓＩＩｅ１ｙＳｅｒ八１ａｆｌｉｓＧｌｕ１ｅＧｌｕ１ｙＧｉｎＡｓｐＳｅｒＶａｌＧａｙＧｌｕ八１ａＡｓｐ１ｙＰｒ。Thr Val Ser Gay Val Ser Glu Thr Asn Arg Old S Arg Ser Thr Asn 1y Arg Thr Ala Tyr Gln Thr Val Thr Yes IIe 1y Ser 81a flis Glu 1e Glu 1y Gin Asp Ser Val Gay Glu 81a Asp 1y Pr.

Ａｓｐ１ｅＰｈｅＴｈｒＰｒ。Asp 1e Phe Thr Pr.

ＡｓｐＴｈｒＴｙｒＡｒｇＧｉｎＬｅｕＬｅｕＴｈｒＧｌｕＰｈｅＴｈｒＴｙｒＡｒｇＩＩｅＬｙｓＡｓｐＴｈｒＩＩｅＧｌｕＡｒｇＬｅｕＶａｌＧｌｕＳｅｒＧｌｕＬｅｕＶａｌＴｈｒＴｈｒ１ｅＴｈｒＧａｙＳｅｒＰｒ。Asp Thr Tyr Arg Gin Leu Leu Thr Glu Phe Thr Tyr Arg IIe Lys Asp Thr IIe Glu Arg Leu Val Glu Ser Glu Leu Val Thr Thr 1e Thr Gay Ser Pr.

Ｐｈｅ　　５ｅｒＶａｌ　　ＨｉｓＴｈｒ　　ＧｌｙＨｉｓ　ＰｈｅＶａｌ　　Ｐｒ。Phe 5er Val　His Thr　Gly His Phe Val　Pr.

Ｔｈｒ　　八５ｎＶａｌ　　５ｅｒＧｌｕ　　５ｅｒＴｈｒ　　ＶａｌＶａｌ　　Ｖａｌ１１ｅ　　Ｓｅｒ八ｒｇ　ＴｙｒＧｌｙ　　ＧｌｙＶａｌ　　Ｐｒ。Thr 85n Val 5er Glu 5er Thr　Val Val　Val 11e Ser 8rg Tyr Gly Gly Val　Pr.

Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ１１ｅ　　Ｔｈｒ八ｓｐ　　５ｅｒ１１ｅ　　八ｓｎＳｅｒ八ｓｐ　　ＩＩｅＴｒｐ　　ｌ１ｅＴｙｒ　　ＡｒｇＳｅｒ　　Ｇａｙｆｌｉｓ　　５ｅｒＬｅｕ　　ＴｈｒＩｃｅ　　ＶａｌＰｒｏ　　ＬｅｕＳｅｒ　　八５ｐＡｌａ　　八１ａＴｒｐ　　ＡｓｐＴｙｒ　　ＡｒｇＡｓｎ　　５ｅｒＧａｙ　　５ｅｒＬｅｕ　　１ｙｓＶａｌ　　ＴｙｒＰｒｏ　　ＡｌａＴｙｒ　　八ｒｇ［’ｌｌＩ］で表される配列を有し、Ｘはメチオニル−アラニン残基
（Ｍｅｔ−Ａｌａ）を示し、ｎは１又は零の数を示し、
ＥＧＦはヒト上皮成長因子のアミノ酸残基を示し、下記
式■：Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｔｌｉｓ八ｓｐへ　Ｇｌｙ　　
Ｔｙｒ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　）ｌｉｓ　　Ａｓｐ　
　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　ＣｙｓＭｅｔ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　
ＡｌａＣｙｓ　　八ｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｔ　　Ｖａ
ｌ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌ
ｕ八ｒへ　　Ｃｙｓ　　Ｇｉｎ　　Ｔｙｒ　　八ｒｇ　
　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｔｒｐ　　ＴｒｐＧ
ｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　　　　　　　・・・［：ＩＩＩ
］で表される配列を有する〕で表されることを特徴とす
る機能性ポリペプチドである。Ser Gly 11e Thr 8sp 5er 11e 8sn Ser 8sp IIe Trp l1e Tyr Arg Ser Gay flis 5er Leu Thr Ice Val Pro Leu Ser 85p Ala 81a Trp Asp Tyr Arg Asn 5er Gay 5er Leu 1ys Val Tyr Pro Ala Tyr 八rg['llI], X represents a methionyl-alanine residue (Met-Ala), n represents the number of 1 or zero,
EGF represents the amino acid residue of human epidermal growth factor, and has the following formula: Asn Ser Asp Ser Glu Cys P
ro Leu Ser tlis to 8sp Gly
Tyr Cys Leu )lis Asp
Gly Val CysMet Tyr Ile
Glu Ala Leu Asp Lys Tyr
AlaCys 8sn Cys Vat Va
l Gly Tyr Ile Gly Gl
To u8r Cys Gin Tyr 8rg
Asp Leu Lys Trp TrpG
lu Leu Arg...[:III
] It is a functional polypeptide characterized by having a sequence represented by ].

なお、本明細書において、アミノ酸に付された頁数字は
、ＥＭＢ　Ｌ　　データバンク（ＢＭＢＬＤＡＴＡ　Ｂ
へＮＫ）中のＦＮのｃＤＮＡ配列を翻訳して得られるア
ミノ酸配列に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す
。In addition, in this specification, the page numbers assigned to amino acids are from the EMB L Data Bank (BMBLDATA B
The number of amino acid residues from the N-terminus added to the amino acid sequence obtained by translating the cDNA sequence of FN in NK) is shown.

ヒ）ＥＧＦについては、そのアミノ酸配列が明らかとな
っており〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５７巻、
第３２５〜３２７頁（１９７５）　：］０そのアミノ酸残基数は５３である。このヒトＥＧＦをコ
ードするＤＮＡについては、そのアミノ酸配列に基づい
て設計したＤＮＡを化学合成するこ舌により得るこ七が
できる。この化学合成によって得られたヒ）　ＥＧＦを
コードするＤＮＡを、前記ｐＴＦ７０２１から誘導され
たプラスミドｐＴＦ７５２０の翻訳領域の３′末端Ｎｃ
ｏＩサイ１−に接続することにより、ＦＮの細胞接着ド
メインとヒトＥＧＦとが連結したポリペプチドを発現す
る組換え体プラスミドが得られる（第１図及び第２図参
照）。h) Regarding EGF, its amino acid sequence has been clarified [Nature, Vol. 257,
Pages 325-327 (1975):]0 The number of amino acid residues is 53. The DNA encoding human EGF can be obtained by chemically synthesizing DNA designed based on its amino acid sequence. The human EGF-encoding DNA obtained by this chemical synthesis was inserted into the 3'-terminus Nc of the translated region of plasmid pTF7520 derived from pTF7021.
By connecting to oIcy1-, a recombinant plasmid expressing a polypeptide in which the cell adhesion domain of FN and human EGF are linked can be obtained (see FIGS. 1 and 2).

前記プラスミドにおける連結部には、Ｎｃ。At the junction in the plasmid, there is Nc.

Ｉザイトに由来するメチオニルアラニン残基（前記１式
においてＸと表記）がリンカ−として含まれる。リンカ
−の有無は、本発明の効果を左右するものではないが、
必要とあれば部位特異的変異の手法により、容易に除去
することができる。A methionylalanine residue (denoted as X in the above formula 1) derived from Izyte is included as a linker. Although the presence or absence of a linker does not affect the effects of the present invention,
If necessary, it can be easily removed by site-directed mutagenesis.

得られたプラスミドを大腸菌に導入し、適当な条件下に
培養することにより、目的ポリペプ１チドが大腸菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブ
ロッティングが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タン
パク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し
た後、泳動パターンをニトロセルロース膜に移し取る。By introducing the obtained plasmid into E. coli and culturing it under appropriate conditions, the target polypeptide is accumulated in E. coli. Immunoblotting is used to confirm expression. After the total cell proteins of the recombinant E. coli are separated by 5DS-polyacrylamide electrophoresis, the migration pattern is transferred to a nitrocellulose membrane.

ＦＮの細胞接着ドメインを認識するモノクローナル抗体
（ＦＮ１２−８、宝酒造）及びヒトＥＧＦを認識するモ
ノクローナル抗体（湧永製薬）で検出されるバンドが目
的のポリペプチドである。The target polypeptide is the band detected with a monoclonal antibody that recognizes the cell adhesion domain of FN (FN12-8, Takara Shuzo) and a monoclonal antibody that recognizes human EGF (Yunaga Pharmaceutical).

目的ポリペプチドは、大腸菌菌体内で不溶化し、いわゆ
る封入体を形成する。このため、目的ポリペプチドの精
製は、例えば次のように行う。The target polypeptide is insolubilized within the E. coli cells to form so-called inclusion bodies. Therefore, the target polypeptide is purified, for example, as follows.

組換え大腸菌をＬ−ブロスなどの培地に培養し、集菌し
た後、超音波処理により菌体破砕液を得、これを遠心分
離して目的ポリペプチドを含む封入体の沈殿を得る。こ
の沈殿を種々の界面活性剤〔例えばトリ１−ン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）　Ｘ　−１００等］を含む緩衝液に懸濁、遠心
分離を繰返すことにより、沈殿を洗浄する。この沈殿を
尿素及２びジチオスレイトールを含む緩衝液に溶解する。After culturing the recombinant E. coli in a medium such as L-broth and collecting the bacteria, a bacterial cell disruption solution is obtained by ultrasonication, and this is centrifuged to obtain a precipitate of inclusion bodies containing the target polypeptide. This precipitate was treated with various surfactants [e.g.
The precipitate is washed by repeating suspension in a buffer containing 100 ton) X-100, etc. and centrifugation. This precipitate is dissolved in a buffer containing urea and dithiothreitol.

次いでこの可溶化液をＤＥＡＥイオン交換体のカラムク
ロマトグラフィーにより精製した後、透析法等による方
法でリフォールディングを行う。以上の操作により、目
的のポリペプチドを精製することができる。Next, this solubilized solution is purified by DEAE ion exchanger column chromatography, and then refolded by a method such as dialysis. By the above operations, the polypeptide of interest can be purified.

得られたポリペプチドは、ＢＨＫやＮＨＫ細胞に対する
細胞接着活性の測定に用いられる。The obtained polypeptide is used to measure cell adhesion activity against BHK and NHK cells.

細胞接着活性の測定は、例えばルオスラティ　（Ｒｕｏ
ｓｌａｈｔｉ）等の方法（メソッズ　イン　エンザイモ
ロジー（ＭｅｔｈｏｄＳｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
、第８２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）］に準じ
て行う。すなわち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロ
ッキングしたマイクロタイタープレートに、ＢＨＫ又は
ＮＲＫ細胞の懸濁液を添加し、３７℃で約１時間インキ
ュベートした後、未吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリ
ン固定し、伸展した細胞の割合を顕微鏡下に測定するこ
とにより、細胞接着の強さを測定することができる。Measurement of cell adhesion activity can be performed, for example, using Ruo
slahti) etc. (Methods in Enzymology)
, Vol. 82, pp. 803-831 (1981)]. That is, after coating the sample, a suspension of BHK or NRK cells was added to a microtiter plate blocked with BSA, incubated at 37°C for about 1 hour, and unadsorbed cells were washed, followed by formalin fixation. However, the strength of cell adhesion can be measured by measuring the proportion of cells that have spread under a microscope.

一方、ＥＧＦ活性は、細胞増殖促進の指標と３なる３１１−チミジンの取込み活性を測定することによ
り測定可能であり、例えば、カーペンタ−（Ｃａｒｐｅ
ｎｔｅｒ）等の方法〔ジャーナル　オブ　セル　フィジ
オロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｙ）、第８８巻、第２２７〜２３７頁（１９
７６）〕に準じて測定することができる。On the other hand, EGF activity can be measured by measuring the uptake activity of 311-thymidine, which is an indicator of cell proliferation promotion.
[Journal of Cell Physiology (Journal of Cell Physiology)
iology), Vol. 88, pp. 227-237 (19
76)].

すなわぢ、試料を添加した培地中でＮＲＫ細胞を１８時
間培養した後、３Ｈ−チミジンを加え、更に６時間培養
する。細胞をガラスフィルターに吸着させ、液体シンチ
レーションカウンターにより細胞に取込まれた３Ｈ−チ
ミジン測定し、ＥＧＦとしての細胞増殖活性を測定する
ことができる。That is, after culturing NRK cells in a medium supplemented with the sample for 18 hours, 3H-thymidine is added and the cells are further cultured for 6 hours. Cells are adsorbed onto a glass filter, 3H-thymidine incorporated into the cells is measured using a liquid scintillation counter, and cell proliferation activity as EGF can be measured.

〔実施例〕〔Example〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

実施例１．ＦＮの細胞接着ドメインと、ヒ）ＥＧＦが結
合したポリペプチドをコードするプラスミドの構築（１−１）細胞接着ドメインｐｒ０１２３９−Ｓｅｒ１
５１５４（２７７アミノ酸残基）をコードするプラスミドの構築特開平１−２０６９９８号公報に記載されている組換え
体プラスミドｐＴＦ７０２１の翻訳領域の終止コドンの
直前に部位特異的変異の手法により、ＮｃｏＩサイトを
導入したプラスミドを構築した。ｐＴＦ７０２１へのＮ
ｃ　ｏｆサイトの導入は、オリゴヌクレオチドｄ　［ｐ
ＣＴＡＴＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＧコを合
成し、サイト−ダイレクチイド　ミュークジェネシス　
システム　ミュータン−Ｋ　（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔ
ａｎ−Ｋ）　［全酒造］を用いて行った。このＮｃｏＩ
サイトの導入に伴い細胞接着ドメインのＣ末端のＧ１ｎ
１５＋６１ｅｔｌＳ＋’７はＭｅｔＩ５１６−ｖａ１１
５１７に置き変わっている。得られたプラスミドをｐＴ
Ｆ７５２０と命名した。Example 1. Construction of a plasmid encoding a polypeptide bound to the cell adhesion domain of FN and human EGF (1-1) Cell adhesion domain pr01239-Ser1
Construction of a plasmid encoding 5154 (277 amino acid residues) An NcoI site was created by site-directed mutagenesis just before the stop codon in the translation region of the recombinant plasmid pTF7021 described in JP-A-1-206998. The introduced plasmid was constructed. N to pTF7021
The introduction of the c of site is performed using the oligonucleotide d[p
Synthesize CTATTACACCATGGATGGTTTG and generate cyto-directed mucgenesis.
System Mutan-K (Site-direct
ed mutagenesis system Mut
an-K) [Zen Shuzo]. This NcoI
G1n at the C-terminus of the cell adhesion domain due to the introduction of the site
15+61etlS+'7 is MetI516-va11
It has been replaced by 517. The obtained plasmid is pT
It was named F7520.

（１−２）ヒトＥＧＦをコードする合成りＮＡの調製ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列は、そのアミ
ノ酸配列に基づいて設計した。ＥＧＦ５のＮ東側、Ｃ末側２つの部分に分け、Ｎ東側センス鎮、
ＥＧＦ−１，８４ｍａｒ、Ｎ東側アンチセンス釦、ＥＧ
Ｆ−２，３６ｍａｒ、Ｃ東側センス鎖、ＥＧＦ−３，８
８ｍａｒ、Ｃ東側アンチセンス鎖、ＥＧＦ−４，８６ｍ
ｅｒ、（配列は第１図参照）の４本のＤＮＡをアプライ
ド　バイオシステムズ社のＤＮＡ合成機を用いて合成し
た。(1-2) Preparation of synthetic NA encoding human EGF The base sequence of DNA encoding human EGF was designed based on its amino acid sequence. EGF5 is divided into two parts, N east side and C terminal side, N east side Sensu town,
EGF-1, 84mar, N east side antisense button, EG
F-2,36mar, C east sense strand, EGF-3,8
8mar, C east antisense strand, EGF-4, 86m
er, (see Figure 1 for the sequence) were synthesized using an Applied Biosystems DNA synthesizer.

ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３についてはＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｔ４　　ＰＮＫ）を用いて５′末端をリン
酸化した後、アニーリング操作により二重鎖とした。す
なわち、１．５μｇのＥＧＦ−２，１，５μｇのＥＧＦ
−３をそれぞれＴ４　　ＰＮＫ用バッファー［５０ｍＭ
トリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣＩ　、ｐＨ７，６，１０ｍＭ　
ＭｇＣｌ□、１０ｍＭＤＴＴ］、１　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ及
び５ユニツトのＴ４　　ＰＮＫを含む１８μｌの溶液中
で３７℃、１時間インキュベートし、６５℃、１０分の
処理で反応を停止した。リン酸化の後、ＥＧＦ−１とＥ
ＧＦ−２、ＥＧＦ−３とＥＧＦ−４をそれぞれ等景況ぜ
て７０℃に２０分間保持した後、徐々に室温に戻６した。EGF-2 and EGF-3 were phosphorylated at their 5' ends using T4 polynucleotide kinase (T4 PNK), and then made into double strands by annealing. That is, 1.5 μg of EGF-2, 1.5 μg of EGF
-3 and T4 PNK buffer [50mM
Tris HCI, pH 7, 6, 10mM
MgCl□, 10 mM DTT], 1 mM TP, and 5 units of T4 PNK were incubated at 37°C for 1 hour, and the reaction was stopped by treatment at 65°C for 10 minutes. After phosphorylation, EGF-1 and E
GF-2, EGF-3, and EGF-4 were each kept at 70° C. for 20 minutes, and then gradually returned to room temperature.

得られた二重鎖ＤＮＡのうちＥＧＦ−１十ＥＧＦ−２の
２．０μｇ　、ＥＧＦ−３＋ＥＧＦ−４の２．０μｇを
ライゲーション反応液（６６ｍＭト　リ　ス　ＨＣＩ　
　、　ｐ）１７．６　　、６．６　　ｍＭ　　ＭｇＣ１
，、０，５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ）　、４５
　Ｑユニ７トのＴ４　　ＤＮＡＩＪガーゼを含む８０μ
ｌの溶液中で１６℃、３０分間インキュベートした。６
５℃、１０分の処理で反応を停止した後、アガロースゲ
ル電気泳動を行い、目的の１？２ｂｐのＤＮＡ断片を回
収した。Of the double-stranded DNA obtained, 2.0 μg of EGF-1 + EGF-2 and 2.0 μg of EGF-3 + EGF-4 were added to a ligation reaction solution (66 mM Tris-HCI).
, p) 17.6, 6.6 mM MgCl
, 0,5mM ATP, 10mM DTT), 45
80μ containing T4 DNAIJ gauze from QUnit7
The cells were incubated for 30 minutes at 16° C. in a solution of 1 ml. 6
After stopping the reaction at 5° C. for 10 minutes, agarose gel electrophoresis was performed to recover the desired 1-2 bp DNA fragment.

（１−３）ｐＵｃ１１８ＮＴの構築分泌型発現ベクターｐＩＮ　ｍ−ｏｍｐＡｌ　　［ジ　
ェンボ　ジャーナル、第３巻、第２４３７〜２４４２頁
（１９８４））　ｌμｇをＢａｍ）Ｉ　Ｉ及び５ａｌＩ
で分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、ｌｐｐター
ミネータ−配列を含む０．９５ｋｂのＢａｍ旧Ｓａｌ　
Ｉ断片を回収した。この断片３０ｎｇをあらかじめＢａ
ｍＨＩ及び５ａｌＩで分解して脱リン酸したプラスミド
ル旧１８Ｎ〔フェブス　レターズ（ＰＨ１０ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　、第２２３巻、第１７４〜１
８０頁（１９８７）１３０ｎｇとライゲーションした後
、大腸菌ＨＢＩＯ１を形質転換し、１ｐｐターミネータ
−配列をもつプラスミドを得、ｐ［Ｉｃ１１８ＮＴと命
名した。(1-3) Construction of pUc118NT Secretory expression vector pIN m-ompAl [di
Embo Journal, Vol. 3, pp. 2437-2442 (1984)) lμg Bam) II and 5alI
and subjected to agarose gel electrophoresis to generate a 0.95 kb Bam old Sal containing the lpp terminator sequence.
The I fragment was recovered. 30 ng of this fragment was preliminarily
Plasmid old 18N degraded and dephosphorylated with mHI and 5alI [PH10 BS Letters, Vol. 223, No. 174-1
After ligation with 130 ng of p. 80 (1987), E. coli HBIO1 was transformed to obtain a plasmid with a 1 pp terminator sequence, which was named p[Ic118NT.

（１−４）　　ヒトＥＧＦをコートする合成りＮＡのｐ
Ｕｃ１１８ＮＴへのクローニング（１−２）で得た１７２ｂｆｌのＤＮＡ断片１．０μｇ
を前述の方法に従いリン酸化した。一方（１−３）で得
たｐＵｃ１１８ＮＴ　　Ｉ　Ｊ−Ｌ　ｇをＮｃｏＩ及び
ＥｃｏＲＩで分解し、アガロースゲル電気泳動によりＤ
ＮＡ断片を回収した。得られたｐＵＣ１１８ＮＴ断片と
１？２ｂｐ断片とを前述の方法に従いライゲーションし
、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。(1-4) Synthetic NA p coating human EGF
1.0μg of 172bfl DNA fragment obtained by cloning (1-2) into Uc118NT
was phosphorylated according to the method described above. On the other hand, pUc118NT I J-Lg obtained in (1-3) was digested with NcoI and EcoRI, and D
NA fragments were collected. The obtained pUC118NT fragment and 1-2 bp fragment were ligated according to the method described above, and E. coli HB101 was transformed.

（１−５）形質転換体中のプラスミドの分析（１−４）
で得られた形質転換体　１４クローンについてプラスミ
ドの分析を行った。すなわち、ラピッド法でプラスミド
を調製し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで分解し、アガロー
スゲル８電気泳動にかけ、予想されるＮｃｏＩ−Ｅｃ。(1-5) Analysis of plasmids in transformants (1-4)
Plasmid analysis was performed on 14 clones of the transformants obtained. That is, a plasmid was prepared by the rapid method, digested with NcoI and EcoRI, and subjected to agarose gel 8 electrophoresis to obtain the expected NcoI-Ec.

ＲＩ断片１７２ｂ１１の生成を調べた。しかし、目的の
バンドが生成するクローンはなかったため、うち２クロ
ーンについてジデオキシ法により、塩基配列の解析を行
ったところ、ＮＣＯ■サイトの上流６塩基目から８０塩
基対、すなわち、５　′　−八ＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧ
ＣＴＡＡＴＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴ
ＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴ
ＧＡＴＧＧＣＧＴＡＴＧＣＡＴＧＴＡ［ニー３’の配列
の欠失が認められた。このプラスミドをｐ［ＪＣ１１８
ＮＴ−Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ｃ）と命名した。The production of RI fragment 172b11 was investigated. However, since none of the clones produced the desired band, the base sequences of two of the clones were analyzed by the dideoxy method, and it was found that 80 base pairs from the 6th base upstream of the NCO site, that is, 5'-8ACAGACCATGG
CTAATAGCGATTCTGAGTGCCCACT
GTCTCACGACGGTTACTGTCTGCAT
GATGGCGTATGCATGTA [knee 3' sequence deletion was observed. This plasmid was p[JC118
It was named NT-EGF (C).

（１−６）欠失部分のＤＮＡ断片の調製ＥＧＦ遺伝子の
Ｎ末の欠失部分を再構築するため、センス鎖としてＥＧ
Ｆ　　Ｓ　　５６ｍｅｒ。(1-6) Preparation of DNA fragment of the deleted part In order to reconstruct the deleted part of the N-terminus of the EGF gene, we
FS 56mer.

アンチセンス鎖としてＥＧＦ　　Ａ　　５８ｍａｒの２
本のＤＮＡ　（配列は第２図参照）を（１−２）と同様
にして合成し、アニーリング操作を行った後、フレノウ
酵素を用いて二重鎖ＤＮＡとした。すなわち、ＥＧＦ−
３２，０８ｇ、ＥＧＦＡ２．０μｇを９５μｌのフレノ
ウ酵素用バッファ　　　　　［７ｍＭ　　　　）　　リ
　ス　ＨＣＩ　　、　ｐＨ７，５、２０ｍＭ　　ＮａＣ
１９７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１ｍＭＥＤＴＡ：Ｉに溶解し
、７０℃に２０分間保持した後、徐々に室温に戻し、各
２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ。EGF A 58mar 2 as antisense strand
Book DNA (see Figure 2 for the sequence) was synthesized in the same manner as in (1-2), annealed, and then converted into double-stranded DNA using Frenow enzyme. That is, EGF-
32.08g, EGFA 2.0μg and 95μl of Frenau enzyme buffer [7mM] Lis HCI, pH 7.5, 20mM NaC
19 7mM MgCl2. Dissolved in 0.1mM EDTA:I, kept at 70°C for 20 minutes, and then gradually returned to room temperature. 20μM each of dATP, dGTP, and dCTP.

ＴＴＰと１ユニツトのフレノウ酵素を加え、室温で２０
分インキュベートした。６５℃、１０分の処理で反応を
停止した後、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｃｌＩＩＩで分解し、
アガロースゲル電気泳動によりＮ　ｃ　ｏ　Ｉ　−１（
ｉｎｄｌｌｌ断片７８　ｂｐ　３．０８ｇを得た。Add TTP and 1 unit of Freneau enzyme and incubate for 20 minutes at room temperature.
Incubated for minutes. After stopping the reaction at 65°C for 10 minutes, decomposition with NcoI and HinclIII,
Nco I-1 (
3.08 g of indlll fragment 78 bp was obtained.

（１−７）　ｐＵＣ１１８ＮＴ−Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ｃ）の
ＥＧＦＣ末断片のｐＴＦ７５２０へのクローニング（１−５）で得たｐＵＣ１１８ＮＴ−Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ｃ
）をＨｉｎｄｌＩＩ及び５ａｌＩで分解し、アガロース
ゲル電気泳動により、ＨｉｎｄＩＩＩ　−５ａｉｌ断片
１．　Ｏｋｂを得た。(1-7) Cloning of the EGFC-terminal fragment of pUC118NT-E GF (C) into pTF7520 (1-5) pUC118NT-E GF (C)
) was digested with HindIII and 5alI, and the HindIII-5ail fragment 1. Got Okb.

一方、ｐＴＦ７５２０をｌ１ｉｎｄＩＩＩ及び５ａｌｌ
で分解し、アガロケースゲル電気泳動によりＨｉｎｄＩ
ＩＩＳａｉｌ断片４．０ｋｂを回収した。この断片と、
先のＨｉｎｄＩ［ｌ−３ａｉｌ　１．Ｏｋ　ｂ断片をラ
イゲーションし、大腸菌１（ＢＩＯＩを形質転換した。On the other hand, pTF7520 was added to l1indIII and 5all
and HindI by agarocase gel electrophoresis.
An IISail fragment of 4.0 kb was recovered. This fragment and
Previous HindI[l-3ail 1. The Ok b fragment was ligated and transformed into E. coli 1 (BIOI).

得られた形質転換体についてプラスミドの分析を行い、
目的の０プラスミドをｐＴＦ　７５２０−ＥＧＦ　（Ｃ）と命名
した。Plasmid analysis was performed on the obtained transformants,
The desired 0 plasmid was named pTF7520-EGF (C).

（１−８）発現プラスミドの構築と確認（１−７＞で得
られたｐＴＦ７５２０−ＥＧＦ　（Ｃ）をＮｃｏＩ及び
ＨｉｎｄＩ［Ｉで分解し、アガロースゲル電気泳動によ
り、５．０ｋｂの断片を回収した。これと、（１−６）
で得たＮｃｏＩＨｉｎｄＩＩ［断片をライゲーションし
、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られた形質転換
体についてプラスミドを調製し、ＮＣ０Ｉ及びＥｃｏＲ
Ｉで分解し、アガロースゲル電気泳動により１７２ｂｐ
の断片が生成することを確認し、更にジデオキシ法によ
り、塩基配列の解析を行い、目的の配列を含むことを確
認した。この組換え体プラスミドをｐｃＥ１０２と命名
した。このｐＣＥ１０２によって発現されるポリペプチ
ドの細胞接着ドメインとＥＧＦの間にはＭｅｔ　　Ａｌ
ａが付加されている。このＭｅｔ−Ａｌａに対応する配
列（ＡＴＧＧＣＴ）を以下に述べるごとく、部位特異的
変異の手法により除去した。オリゴヌク２ルオチドｄ　［ＡＡＴＣＧＣＴＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴ
Ｇ）を合成し、サイト−ダイレクチイド　ミュークジェ
ネシス　システム　ミュータン−Ｋを用いて行った。そ
の結果、細胞接着ドメイン（前記式■）とＥＧＦ　（前
記式■）が直接結合したポリペプチドを発現するプラス
ミドを得、ｐｃＥ１０３と命名した。(1-8) Construction and confirmation of expression plasmid (pTF7520-EGF (C) obtained in 1-7> was digested with NcoI and HindI[I, and a 5.0 kb fragment was recovered by agarose gel electrophoresis. .This and (1-6)
The NcoIHindII fragment obtained was ligated and transformed into E. coli HBIOI. A plasmid was prepared for the obtained transformant, and NCOI and EcoR
172bp by agarose gel electrophoresis.
It was confirmed that a fragment was generated, and the base sequence was further analyzed by the dideoxy method, and it was confirmed that the target sequence was contained. This recombinant plasmid was named pcE102. There is MetAl between the cell adhesion domain of the polypeptide expressed by pCE102 and EGF.
a is added. The sequence (ATGGCT) corresponding to this Met-Ala was removed by site-directed mutagenesis as described below. Oligonuc 2 luotide d [AATCGCTATTGGATGGTTT
G) was synthesized using the cytodirected mukgenesis system Mutan-K. As a result, a plasmid expressing a polypeptide in which the cell adhesion domain (formula 2 above) and EGF (formula 2 above) were directly bound was obtained and named pcE103.

ｐＣＥ　１０２を保持する大腸菌１１８１０１をＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／ｐＣＥ　
１０２と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託した〔微工研菌寄第１１２２６号（ＦＥＲＭＰ−１１
２２６））。Esc. coli 118101 harboring pCE 102
herichia coli HB 101/pCE
102 and has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology [FERMP-11
226)).

実施例２　組換え体からのポリペプチドの精製（１−８
）で得た口５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＨＢ　
１０１／ｐＣＥ　１０２を５０ｇｇ／ｍ１のアンピシリ
ンを添加した５ｍｌのし一ブロスを含む試験管で３７℃
、−夜振とう培養した。これを５００艷の同培地を含む
２ｊ２の三角フラスコ４本に接種し、１００　ｒｐｍで
培養を続けた。６６０ｎｍの吸光度が０．３の時点でＩ
ＰＴＧ（イソプロピル２ β−Ｄ−ヂオガラクトシド）を２ｍＭになるよう添加し
、１６時間後に集菌した。菌体の一部を用いてイムノブ
ロッティングを行った。すなわち、全菌体タンパク質を
５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動
）で分離し、泳動パターンをニトロセルロースメンプラ
ンに転写した後、ＦＮの細胞接着ドメインを特異的に認
識するモノクローナル抗体［：ＦＮ１２−８、全酒造〕
、また一方ではヒ）ＥＧＦを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体〔湧水製薬〕を作用させ、次いでパーオキシ
ダーゼ標識第２抗体を作用させた。結合した第２抗体の
パーオキシダーゼ活性により４−クロロ−１−ナフトー
ルと過酸化水素の存在下で発色させ、いずれのモノクロ
ーナル抗体の場合でも、３７ｋＤ付近に目的のペプチド
が生産されていることを確認した。Example 2 Purification of polypeptide from recombinant (1-8
) Obtained from Cherichia coli HB
101/pCE 102 at 37°C in a test tube containing 5 ml of Shiichi broth supplemented with 50 gg/ml of ampicillin.
, - overnight shaking culture. This was inoculated into four 2J2 Erlenmeyer flasks containing 500 cells of the same medium, and culture was continued at 100 rpm. When the absorbance at 660 nm is 0.3, I
PTG (isopropyl 2 β-D-diogalactoside) was added to a concentration of 2 mM, and bacteria were collected 16 hours later. Immunoblotting was performed using a portion of the bacterial cells. That is, after separating all bacterial cell proteins by 5DS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) and transferring the migration pattern to nitrocellulose membrane, a monoclonal antibody that specifically recognizes the cell adhesion domain of FN [:FN12- 8. Zenshuzo]
On the other hand, a monoclonal antibody [Yusui Pharmaceutical Co., Ltd.] that specifically recognizes human EGF was applied, and then a peroxidase-labeled second antibody was applied. Color was developed in the presence of 4-chloro-1-naphthol and hydrogen peroxide due to the peroxidase activity of the bound second antibody, and it was confirmed that the target peptide around 37 kD was produced with either monoclonal antibody. did.

次に、全菌体ペレットを緩衝液［５０ｍＭ）ＵスＨＣＩ
、ｐＨＢ、　０．２５％ショ糖、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ：
］５０−に懸濁し、２　ｍｇ　／　艷！Ｉゾチーム溶液
を２誦添加した。０℃、３０分放置後、超音波処理３することにより菌体を破砕した。この菌体破砕液に、Ｉ
　Ｍ　ＭｇＣｌ２を１５０μβ、及び６０，０００ユニ
ツト／艷デオキシリボヌクレアーゼＩ　　（ＤＮａｓｅ
Ｉ）を１２５μｆｔそれぞれ添加し、３７℃、３０分イ
ンキュベートした。次いで、０．２Ｍ　　ＮａＣ１，１
％デオキシコール酸、１％ノニデッ　トＰ−４０を含む
２０ｍＭ）　　リス　ＨＣＩ、ｐＨ１７，５緩衝液１０
ｍｆｆを添加し、１２．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離し、上澄みを捨てた。沈殿を緩衝液　（５０ｍＭ）
　　リス　ＨＣＩ、ｐＨ８，ｏ、　１０ｍＭＥＤＴＡ、
　　１　０　０　　ｍＭ　　ＮａＣ１，０，５％　ト　
リ　ト　ンＸ　　−１００）４０−に懸濁し、１４．０
００．ｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄みを捨てた。こ
の沈殿を次いで２０％エチレングリコール水溶液４０ｍ
１に懸濁し、１４、　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離
した。得られた沈殿を更に２％ノニデッ）Ｐ−４０水溶
液４０艷に懸濁し、１４．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠
心分離し上澄みを捨てることにより精製された封入体４
５０ｍｇ（湿重量）のペレットを得た。Next, the whole bacterial pellet was diluted with buffer [50mM] US HCI.
, pHB, 0.25% sucrose, 1mM EDTA:
]50-, suspended in 2 mg/艷! Isozyme solution was added twice. After being left at 0°C for 30 minutes, the bacterial cells were disrupted by ultrasonication 3. In this bacterial cell disruption solution, I
150μβ of MgCl2 and 60,000 units/deoxyribonuclease I (DNase
125 μft of each of I) was added and incubated at 37° C. for 30 minutes. Then 0.2M NaCl,1
% deoxycholic acid, 20mM containing 1% Nonidet P-40) Squirrel HCI, pH 17,5 buffer 10
mff was added, centrifuged at 12.00 Orpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. Precipitate with buffer solution (50mM)
Squirrel HCI, pH 8, o, 10mMEDTA,
100 mM NaCl 1.0.5%
Suspended in Liton X-100) 40-, 14.0
00. Centrifugation was performed at rpm for 10 minutes and the supernatant was discarded. This precipitate was then washed with 40ml of 20% ethylene glycol aqueous solution.
1 and centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes. The resulting precipitate was further suspended in 40 2% Nonidet P-40 aqueous solution, centrifuged at 14.00 Orpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded to obtain purified inclusion bodies 4.
A pellet of 50 mg (wet weight) was obtained.

この封入体を２０ｍＭ）リスＨＣＬ　ｐｉ（８，０，２
５０４ｍＭＤＴＴ、６Ｍ尿素液２５ｍ１に溶解した。This inclusion body was mixed with 20mM) squirrel HCL pi (8,0,2
504 mM DTT was dissolved in 25 ml of 6M urea solution.

これを、２０ｍＭ）リス　ＨＣＩ　ｐＨ８，０，１０ｍ
ＭＤＴＴで平衡化したＤＥＡＥ−）ヨパール６５０Ｓ（
東ソー）１５−のカラムに通した。同一バッファーで非
吸着画分を除いた後、０２０ｍＭ）リスＩＩｃＩ、ｐＨ
８，０，１０ｎ＋ＭＤＴＴ、　１００ｍＭ　ＮａＣ１、
次いで０２０ｍＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ８，０，１０ｍＭ
ＤＴＴ、　２００ｍＭ　ＮａＣ１更に０２０ｍＭ）リス
　ＨＣＩ、ｐＨ８，０，１０ｍＭＤＴＴ、　３００　ｍ
Ｍ　ＮａＣ１で段階的に溶出し、分画した。溶出液につ
いてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ
、■の溶出画分において、電気泳動的にほぼ単一な目的
ポリペプチドを確δ忍した。Add this to 20mM) Squirrel HCI pH8,0,10m
DEAE-) Yopal 650S (DEAE-) equilibrated with MDTT
Tosoh) 15- column. After removing the non-adsorbed fraction with the same buffer, 020 mM) Lis IIcI, pH
8,0,10n+MDTT, 100mM NaCl,
then 020mM) Lis HCI, pH 8,0,10mM
DTT, 200mM NaCl plus 020mM) Lis HCI, pH 8,0,10mM DTT, 300 m
Stepwise elution and fractionation were performed with M NaCl. When the eluate was subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis, the target polypeptide, which was electrophoretically homogeneous, was confirmed to be present in the eluted fraction (■).

この両分を、１ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸
化型グルタチオンを含む２０ｍＭトリス）ＩＣＩ、ｐＨ
７，５緩衝液中で４℃、二昼夜透析することにより、ポ
リペプチドのりフォールディングを行った。この透析内
液をＰＢＳ　（！Ｊン酸緩衝化生理食塩水）に透析し、
目的ポリペプチド１２ｍｇを得た。Both parts were mixed with 20mM Tris) ICI containing 1mM reduced glutathione and 0.1mM oxidized glutathione, pH
Polypeptide glue folding was performed by dialysis in 7,5 buffer at 4°C for two days and nights. This dialyzed fluid was dialyzed against PBS (!J acid buffered saline),
12 mg of the target polypeptide was obtained.

５本ポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸配列を、アプラ
イドバイオシステムズ社のペプチドシーケンサ−４７７
Ａ／１２ＯＡを用いて調べたところ、Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ
　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ｐｈｅ　−Ｔｈｒ
の配列が認められ、目的ポリペプチドの配列と一致した
。以下、本ポリペプチドをＣ−ＥＧＦと称する。5 The amino acid sequence from the N-terminus of this polypeptide was analyzed using Applied Biosystems' Peptide Sequencer-477.
When investigated using A/12OA, Pro-Thr
-Asp -Leu -Arg -Phe -Thr
The sequence was found to match that of the target polypeptide. Hereinafter, this polypeptide will be referred to as C-EGF.

実施例３　生物活性の測定前記実施例２で得られたポリペプチドＣ−ＥＧＦを用い
て、細胞接着活性及び細胞増殖促進活性を測定した。Example 3 Measurement of biological activity Using the polypeptide C-EGF obtained in Example 2, cell adhesion activity and cell growth promoting activity were measured.

（３−１）細胞接着活性の測定細胞接着活性は、ルオスラティらの方法〔メンツズ　イ
ン　エンザイモロジー、第８２巻、第８０３〜８３１頁
（１９８１）　）に準じて測定した。試料を蒸留水、Ｐ
ＢＳ　（！Ｊン酸緩衝化生理食塩水）等に溶かし、９６
穴マイクロプレートに注入した。４℃、２時間インキュ
ベートして、試料をプレート上に吸着させた（５０μβ
／ウエル）。３％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）６を含むＰＢＳ溶液を１００μｍ／ウェル加え、３７℃、
１時間インキュベートしてプレートをブロックした。Ｐ
ＢＳでプレートを洗浄後、あらかじめダルベツコ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ・Ｓ）イーグル最小栄養培地（口ＭＢＭ）
に５Ｘ１０５細胞／ｍｌ！となるように懸濁させたベビ
ーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１）を１００μβ／ウ
ェル分注し、３７℃、１時間インキュベートした。なお
使用したＢＨＫ−２１細胞は、凍結保存した株を総代培
養後、トリプシン処理（３７℃、５分）したものを用い
た。ＰＢＳでプレートを洗浄後、３％ホルマリン溶液で
細胞をプレート上に固定した。(3-1) Measurement of cell adhesion activity Cell adhesion activity was measured according to the method of Luoslati et al. [Men's in Enzymology, Vol. 82, pp. 803-831 (1981)]. Distilled water, P
Dissolve in BS (!J acid buffered saline) etc.
injected into a well microplate. The sample was adsorbed onto the plate by incubation at 4°C for 2 hours (50 μβ
/well). Add 100 μm/well of PBS solution containing 3% BSA (bovine serum albumin) and incubate at 37°C.
Plates were blocked by incubating for 1 hour. P
After washing the plate with BS, use Dulbecco (Dulbecco) in advance.
lbecco・S) Eagle minimal nutrient medium (MBM)
5X105 cells/ml! Baby hamster kidney cells (BHK-21) were suspended at 100 μβ/well and incubated at 37° C. for 1 hour. The BHK-21 cells used were cryopreserved strains that were cultured and then treated with trypsin (37°C, 5 minutes). After washing the plate with PBS, cells were fixed on the plate with a 3% formalin solution.

顕微鏡下でＢＨＫ−２１細胞の伸展を観察し、細胞伸展
性より細胞接着活性を測定した。The spread of BHK-21 cells was observed under a microscope, and cell adhesion activity was measured from cell spreadability.

Ｃ−ＥＧＦ、及びヒトＥＧＦ　（湧水製薬）の結果を第
１表に示す。The results for C-EGF and human EGF (Yusui Seiyaku) are shown in Table 1.

第表試料　　　　　　　細　胞（０，０５μＭ）　　　　　接着活性Ｃ−ＥＧＦ　　　　　　十＋十ＥＧＦ数値は試料をプレートに吸着させた際の濃度を示す。No. table Sample Cell (0.05 μM) Adhesion activity C-EGF 　　　　　10+10 EGF The numerical value indicates the concentration when the sample is adsorbed onto the plate.

（３−２）細胞増殖促進活性（ＤＮＡ合成促進活性）の
測定あらかじめ継代培養したＮＲＫ−４９Ｆ細胞を、１０％
の牛胎児血清を含む、ダルベツコイーグル最小栄養培地
（１０％ＦＣ３−ＤＭＥＭ）により、５Ｘ１０’細胞／
ｍｌに希釈し、２００μβずつ９６穴マイクロプレート
に分注した。(3-2) Measurement of cell proliferation promoting activity (DNA synthesis promoting activity) NRK-49F cells that had been subcultured in advance were
Dulbecco-Eagle Minimal Nutrient Medium (10% FC3-DMEM) containing fetal bovine serum
The solution was diluted to 100 ml and dispensed in 200 μβ portions into a 96-well microplate.

５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養し、ＰＢＳによ
り段階的に希釈した試料を４０μβずつ各ウェルに加え
た。３７℃にて１８時間培養し８た後、５μＣｉ／誦の３Ｈ−チミジンを２０μβずつ各
ウェルに添加し、更に、３７℃にて、６時間培養した。The cells were cultured at 37° C. for 3 days in the presence of 5% CO2, and 40 μβ of samples diluted serially with PBS were added to each well. After culturing at 37°C for 18 hours, 20 μβ of 3H-thymidine (5 μCi/ml) was added to each well, and the cells were further cultured at 37°C for 6 hours.

培地を吸い取り、ＰＢＳで２回洗浄した後、０．１％ト
リプシン溶液１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で２
時間インキュベートし、細胞がはく離していることを顕
微鏡下で確認した。セルハーベスタ−（フローラボラト
リーズ社製）にグラスフィルターをセットし、ウェル中
の細胞を吸引し、細胞を吸着させたフィルターを乾燥さ
せた後、液体シンチレーションカウンターにより３日−
チミジンの取込みを測定した。その結果、本ポリペプチ
ドにおいて、対照としたヒトＥＧＦと同等の３■−チミ
ジンの取込みが認められた。一方、負の対照とした特開
平１−２０６９９８号公報記載の２７９アミノ酸残基ポ
リペプチド（Ｃ−２７９）においては、取込みは認めら
れなかった（第２表参照）。After aspirating the medium and washing twice with PBS, 100 μl of 0.1% trypsin solution was added to each well and incubated at 37°C for 2
After incubation for an hour, it was confirmed under a microscope that the cells had detached. A glass filter was set in a cell harvester (manufactured by Flow Laboratories), and the cells in the well were aspirated. After drying the filter with the cells adsorbed, it was stored in a liquid scintillation counter for 3 days.
Thymidine incorporation was measured. As a result, the incorporation of 3■-thymidine in this polypeptide was found to be equivalent to that in human EGF used as a control. On the other hand, no incorporation was observed in the 279 amino acid residue polypeptide (C-279) described in JP-A-1-206998, which was used as a negative control (see Table 2).

９第表試料濃＆　　Ｃ−ＢＧＦ　　　ＥＩＧＦ　　　Ｃ−２７
９（μＭ）　　　３Ｈ−チミジンの取込み（Ｘ　１０３
１０３ｄｐ、５　　　　４．７　　　５．０　　　　０
．６２．３　　　　５Ｊ　　　　４．８　　　　０．４
１．１　　　　２．７　　　２．５　　　　０．２０．
５６　　　　２．５　　　２．１　　　　０．８０．２
Ｂ　　　　　１．９　　　１．８　　　　０．５〔発明
の効果〕以上述べてきたごとく、本発明により、細胞接着活性と
細胞増殖促進活性の両活性を合せ持つ機能性ポリペプチ
ドとその製造方法が提供された。9 Table Sample concentration & C-BGF EIGF C-27
9 (μM) 3H-thymidine incorporation (X 103
103dp, 5 4.7 5.0 0
．． 62.3 5J 4.8 0.4
1.1 2.7 2.5 0.20.
56 2.5 2.1 0.80.2
B 1.9 1.8 0.5 [Effects of the Invention] As described above, the present invention provides a functional polypeptide having both cell adhesion activity and cell proliferation promoting activity, and a method for producing the same. Ta.

上記ポリペプチドは、ＥＧＦと細胞との親和性を高める
ことができ、創傷治癒等などの用途において非常に有用
である。The above polypeptide can increase the affinity between EGF and cells, and is very useful in applications such as wound healing.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

０第１図はＥＧＦ遺伝子の５′側８０ｂｐが欠失したプラ
スミドｐ［Ｉ［：１１８ＮＴ−Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ｃ）を構
築するための工程図、第２図は本発明のＣ２７□−ＸＥ
ＧＦをコードするプラスミドｐｃＥ１０２を構築するだ
めの工程図である。0 Figure 1 is a process diagram for constructing the plasmid p[I[:118NT-E G
FIG. 2 is a process diagram for constructing plasmid pcE102 encoding GF.

Claims

【特許請求の範囲】１、下記一般式 I ：Ｃ＿２＿７＿７−（Ｘ）ｎ−ＥＧＦ・・・・〔 I 〕〔
式中、Ｃ＿２＿７＿７はヒトフィブロネクチンの細胞接
着ドメインのＰｒｏ＾１＾２＾３＾９＾−Ｓｅｒ＾１＾
５＾１＾５＾に相当する２７７アミノ酸ポリペプチド残
基を示し、下記式II：【遺伝子配列があります。】・・・〔II〕で表される配列を有し、Ｘはメチオニル−アラニン残基
（Ｍｅｔ−Ａｌａ）を示し、ｎは１又は零の数を示し、
ＥＧＦはヒト上皮成長因子のアミノ酸残基を示し、下記
式III：【遺伝子配列があります。】・・・・〔III〕で表される配列を有する〕で表されることを特徴とする
機能性ポリペプチド。[Claims] 1. The following general formula I: C_2_7_7-(X)n-EGF...[I][
In the formula, C_2_7_7 is Pro^1^2^3^9^-Ser^1^ of the cell adhesion domain of human fibronectin.
It shows the 277 amino acid polypeptide residues corresponding to 5^1^5^, and has the following formula II: [There is a gene sequence. ] ... [II] It has a sequence represented by
EGF indicates the amino acid residue of human epidermal growth factor, and has the following formula III: [Gene sequence is available. ] ...[III] A functional polypeptide characterized by having a sequence represented by: