JPH032194A - バイオマス懸濁物から塩を減少せしめる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バイオマスを含有する懸濁液、特にタンパク
質取得用の細胞断片含有液 （Ｚｅｌｌｂｒｕｃｈｓｔｉｉｃｋ−ｈａｌｔｉｇｅｎ
　ＦＩＵｓｓｉｇｋｅｉｔｅｎ）から塩を減少せしめる
方法に関する。

細胞内タンパク質を取得する場合には、細胞を予め可溶
化した後に、細胞断片（Ｚｅｌ　１ｂｒｕｃｈｓ　ｔｉ
ｉｃｋｅ）をタンパク質から分離しそしてタンパク質を
濃縮するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）お
よび塩（リン酸塩、硫酸塩またはクエン酸塩）よりなる
水性相系が使用される。重合体および塩（例えば、　　
１，０００〜１０．０００の分子量を有するＰＥＧおよ
びリン酸カリウム）の水溶液は、水性相中で限界濃度以
上では分解する。これらの相中では、組形成物質たるタ
ンパク賞、細胞および細胞断片の濃度にそれぞれ従って
種々に分布される。かくして。

相系を適当に選択することによって、所望のタンパク質
から細胞断片を分離しそしてこのタンパク質を更に精製
することができる〔クラら、アドヴアンセス・オプ・バ
イオケミカル・エンジニアリング、第２４巻第７３〜１
１Ｂ頁（Ｍ、　Ｒ，Ｋｕｌａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｄｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅｎｇ、２４．７３−１
１８）またはドイツ特許第２．６３９．１２９号参照）
。

その際、廃物として、細胞断片を含有する概して粘稠な
懸濁液が得られ、その中には高分子量の核酸、可溶性お
よび不溶性のタンパク質と共に。

１０ないし２５％（ｗ／ｗ）の塩が溶解している。費用
を低減せしめそしてまた環境汚染を最小限にするために
、このバイオマス含有懸濁液より上記の塩を回収しなけ
ればならない。

細胞断片は、一方では０．０５ないし５μｍ（下限は不
確定的）の粒子径を有しかつ周囲の液体に対する密度の
差が小さ（、そして他方では高い粘度をもたらすので、
塩を機械的に分離することは困難である。公知の方法と
して、マイクロ濾過、電気透析または下相の熱アグロメ
レーションが提案されているが、これらの実施は、十分
に満足すべきものではない。

マイクロ濾過の場合５粒子径が小さいことを考慮して、
１バールの膜介在（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）圧力
差および５ｍ／ｓの溢流速度においてさえ、約２５１　
／ｍ２の最大流量しか達成されないような、極めて僅少
な有効分離能力を有する膜が用いられる。

そのような懸濁物の電気透析の場合には、膜の希釈剤側
への細胞断片よりの表面層の形成によって限界電流密度
が著しく低下するので、連続的操作が技術的に実現でき
ない。

加熱アグロメレーションおよびアグロメレートの分離も
また少なからぬ困難に遭遇するので、この方法の導入も
同様にほとんど期待されない。

従って１本発明の目的は、バイオマスを含有する懸濁物
、特に細胞可溶化後の細胞内タンパク質の水性２相冨化
による塩含有下相から塩を減少せしめる方法であって、
しかも困難なく工業的にも使用されうる方法を提供する
ことである。

この目的で開発された本発明による方法は、アルコール
を用いて塩含有アルコール性上相の形成下に上記懸、濁
物または液体から塩を抽出することを特徴とする。

知見によれば、一定の組成において水溶性のアルコール
のアルコール−水−塩基は、２相に解離し、その際細胞
断片は、下相に残留する。塩は。

下相と上相の間に分布し、そして少なくともその処理が
なんらの問題をもたらさない限り、１つまたはそれ以上
の段階においてバイオマス含有下相から分離されうる。

その際、水と混和しうるがそれ自体塩に対する溶解能を
有しないアルコールが使用されうる。

特に下記のアルコールが検討されたニ ーメタノール エタノール １−プロパツール ＝２−プロパツール 第三−ブタノール すなわち、　（メタノールは、その沸点が低いことおよ
び２相系を形成するための濃度が比較的高いことならび
に上記のアルコール群のうちで蒸発熱が最も高いという
ことから実用上の意義がより小さかったので論外として
）上記のアルコールについて、概ねタンパク質取得の際
に使用される塩としてｐＨ７のリン酸カリウム（にＨ２
ＰＯ４とＫＪＰＯ４との混合物）の使用の下に２５℃に
おいて三角図が描かれた（第１〜４図参照）。他の塩に
ついての本方法の有用性が硫酸ナトリウムおよびクエン
酸ナトリウムを例として示された（第５および６図参照
）。

第三−ブタノールは有毒でありそして比較的高い融点（
２５，５”Ｃ）を有しており、またイソプロパツールは
比較的高価であるので、特に１−プロパツールおよびエ
タノール、特に後者が広範囲に検討された。

２相範囲において臨界点の付近において上相および下相
の組成がほとんど等しくなる混合物を用いることによっ
て最も有利に操作しうる。

エタノールを使用した場合の本方法の有利な操作範囲は
、バイオマス含有含有モデル系：ニス・セレヴイシエ（
Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　２０％（鍔へ）。

ＰＥＧ　１５００　１８％（ｗ／ｗ）およびｐ）１７の
リン酸カリウム７％（ｗ／ｗ）については添付の曲線図
（第７および８図参照）から明らかである。

塩の実際上の抽出については。

一分離すべき相の間の密度の差が十分に大きいこと。

一多段抽出の個々の段階における相の分離が一定の容量
比内にあること、そして −上相が透明であること。

が重要であるが、特に理論段の１段階ないし数段階後の
収量が重要である。添加されたアルコールは１通常水溶
液として系に到達する。

第７および８図から、向流的に操作しそして全系におい
てエタノール３０〜４０％（Ｗ／Ｗ）の混合比および１
５〜２５％（−八）のバイオマス含有懸濁物の割合の場
合、リン酸カリウムの９５％（ｉｙ／ｗ）の分離が３な
いし４の理論的分離段階数において可能であることが推
論される。残部は、水で形成される。

第７図は、収ｌｉ（すなわち、１つの分離段階後の塩の
全量に対する上相における塩の割合）とエタノール濃度
（上相および下相の混合物の重量％）との依存関係を示
し、その際パラメーターとして重量％で表わしたバイオ
マス含有懸濁物の割合が選択された。曲線群は、懸濁物
の割合が最も低い場合に、上相への塩の最適の移行が達
成されることを示している。しかしながら、バイオマス
の割合が減少するに従って９分離段階当りの分離されう
る塩の量が減少し、従って好ましくは少なくとも１５重
量の懸）男物の割合が使用される。

第８図は、５０重量の懸濁物含量における相分離に及ぼ
すアルコール濃度の影響を示し、それは上相対下相の質
量比および収量によって特徴づけられる。明らかに認め
られるように、全混合物において約３０重量％のエタノ
ール含量から、上相対下相のほとんど不変の質量比にお
いて明らかな相分離が達成される。

収量は、エタノール３０重量％以上では減少するので、
この濃度付近で操作することが好ましい。

これらの事情は、バイオマスの種類によって若干の影響
を受ける：すなわち、酵母含有系よりの塩抽出のために
は、バクテリア含有系の場合に比較して多少低いアルコ
ール含量が使用される。従って、細胞懸濁物の割合が１
０ないし３０％であり残部が水である場合には、一般に
３０〜５０％のアルコール含量が特に好ましい。

本発明による方法は、特に相分離による細胞内タンパク
質の取得に関連して開発された。しかしながら、それは
、比較的高い塩負荷を負ったバイオマスの液体または懸
濁物を生ずる他の分野にとってももとより同様に有用で
ある。

その際１細胞懸濁物の割合は、一方では費用を考慮する
ことにより、他方では十分な塩抽出の必要性により決定
される：細胞）脈濁物の割合が低い場合には１本方法の
コストが上昇し、一方細胞懸濁物の割合が高すぎる場合
には、十分な塩抽出がもはや不可能である。

アルコールの割合は、一般に１．塩分離の所望ノ結果に
よって決定される。すなわち、　３０％以下のアルコー
ル含量を有する特に検討された系においては十分な析出
がもはや達成されず、一方５０％以上のアルコール含量
の場合には、上相における水が少な過ぎ、従って塩の分
離がそれによって悪くなる。

第９図は１本発明によるバイオマス含有相から塩を減少
せしめる方法を実施するための工程系統を示し、その際
その上（アルコールおよび水の蒸発後に）塩溶液が得ら
れ、このものはタンパク質取得のために再循環されうる
。アルコールおよび蒸発された水の一部は、塩抽出に戻
され、その中で第一次下相（バイオマス含有懸濁物）お
よび水性アルコール溶液が向流的に３つの抽出段階を貫
いて導かれる。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は９本発明の方法において、各種アルコール
および塩としてｐＨ７のリン酸カリウムを使用した場合
の三角図であり、第５および６図は。 同じく本発明の方法において塩として硫酸ナトリウムお
よびクエン酸ナトリウムを使用した場合の三角図であり
、第７図は、収量とエタノール濃度との相関関係を示す
図表であり、第８図は、相分離に及ぼすアルコール濃度
の影響を示す図表であり、そして第９図は１本発明によ
る方法を実施するための概略工程図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バイオマスを含有する懸濁物、特にタンパク質の取
   得のための細胞断片を含有する液体から塩を減少せしめ
   る方法において、アルコールを用いて塩を含有するアル
   コール性上相の形成下に懸濁物または液体から塩を抽出
   することを特徴とする上記バイオマス懸濁物から塩を減
   少せしめる方法。 ２、アルコールとしてエタノール、プロパノール、イソ
   プロパノールまたは第三−ブタノール、特にエタノール
   を使用する請求項１に記載の方法。 ３、懸濁物または液体として細胞断片、可溶性および不
   溶性のタンパク質ならびに核酸および細胞内タンパク質
   、特に酵素の水性２相抽出の塩含有下相が処理される請
   求項１または２に記載の方法。 ４、抽出のために塩含有懸濁液または液体１０ないし３
   ０重量％を、アルコール、特にエタノール３０ないし５
   ０重量％、残部水を用いる請求項１ないし３のうちのい
   ずれかに記載の方法。 ５、抽出を数個の前後に連続した段階で、特に向流抽出
   として少なくとも３段階で実施する請求項４に記載の方
   法。 ６、下相からの上相の分離を円板型分離器またはデカン
   ターによって行う請求項１ないし５のうちのいずれかに
   記載の方法。 ７、得られた塩富有上相からアルコールを留去しそして
   塩溶液を、場合によっては、更に濃縮した後にタンパク
   質取得のために再循環せしめる請求項１ないし６のうち
   のいずれかに記載の方法。