JPH0321158B2

JPH0321158B2 -

Info

Publication number: JPH0321158B2
Application number: JP17244282A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Okumura; Nobuo Nagato; Masahiro Oonishi; Rokuro Okamoto; Tomoyuki Ishikura
Original assignee: MERUSHAN KK
Current assignee: MERUSHAN KK
Priority date: 1982-09-29
Filing date: 1982-09-29
Publication date: 1991-03-22
Also published as: JPS5959198A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗生物質ネオビリドグリゼインの
新規な製造方法に関し、更に詳しくは、式式中、Ｒは水素原子又は水酸基を表わす、で示される抗生物質ネオビリドグリゼイン類中、
Ｒが水素原子であるネオビリドグリゼインを生
産する能力を有するストレプトマイセスsp.G−
89菌株を栄養培地中に培養し、培養物中に蓄積さ
れた該抗生物質を採取することを特徴とする抗生
物質ネオビリドグリゼインの生産の選択性を高
めた製造方法に関する。従来、抗生物質ネオビリドグリゼイン類（以下
「ネオビリドグリゼイン類」と称す。）は、本発明
者等の一部によつストレプトマイセス
（Streptomyces）sp.P8648（FERM−3562）を栄
養培地に培養することによつて、ネオビリドグリ
ゼイン，，及びを同時に生産し、必要に
より各組成物を分離採取する方法が提供されてい
る（例えば、特公昭55−3339号公報参照）。この公知の方法によれば、前記式（）のＲが
水酸基であるネオビリドグリゼインが主成分と
して得られ、より抗菌活性の高いネオビリドグリ
ゼインの蓄積量が少く、これらの組成比を変化
させるためには、プロリルハイドロキシレースの
阻害剤、例えば、亜鉛イオン（Zn〓）の存在下
に培養すること等が必要であつた。本発明者等は、上記技術的課題の解決手段とし
て、ネオビリドグリゼイン類の生産菌自体のプロ
リルハイドロキシレース活性の欠損株を見い出す
べく研究した結果、該生産菌にそれ自体公知の変
異処理を施すことによつてプロリルハイドロキシ
レース活性は欠損するが、ネオビリドグリゼイン
の生合成系に関与する酵素系には変化をきたさ
ない変異菌株の取得に成功し、本発明を完成し
た。しかして、本発明によれば、培地中にトランス
−４−ハイドロキシ−Ｌ−プロリンが存在しない
か又は微量の場合には、選択的にネオビリドグリ
ゼインを製造することができ、ネオビリドグリ
ゼインの生産は認められないか、又は極めて微
量に製造されるにすぎず、培地の効率的利用が果
たせる。本発明に用いられる微生物は、ストレプトマイ
セスsp.P8648（FERM−p3562）を変異すること
により得たストレプトマイセスsp.G−89である。このストレプトマイセスsp.G−89は下記の菌
学的特徴を示す。この菌株は良く分枝した単純分枝の基生菌糸か
ら、短かい無色の気中菌糸を伸長し、その先端に
ゆるい螺旋状の胞子連鎖を形成する。その胞子の
表面は平滑であり。輪生体および子のう胞子の形
成は認められない。各種培地における本菌株の培養的特徴は次の通
りである。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地生育：わずかに生育気中菌糸：白色の気中菌糸を処々に薄く形成基生菌糸：無色〜灰白色可溶性色素：なし (2) グルコース・アスパラギン寒天培地生育：良好気中菌糸：ほとんど形成せず、形成すれば白
色基生菌糸：淡黄白色〜明黄色（2db〜2fb）可溶性色素：なし (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：中程度気中菌糸：殆んど形成せず、形成すれば白色基生菌糸：淡黄色〜灰黄色（2db〜2dc〜
3ec）可溶性色素：なし (4) イースト麦芽寒天培地生育：良好気中菌糸：白色〜やゝ灰色を帯びた白色基生菌糸：明るい黄色（2fb）であるが培
養後期には褐灰色（3li）となる。可溶性色素：ないか、時には僅かに褐色を
呈す。 (5) スターチ寒天培地生育：中程度気中菌糸：殆んど形成しないや、形成すれば
白色基生菌糸：淡黄色（2db）、コロニー中心部
は明るい灰黄褐色（3ge）を呈す可溶性色素：なし澱粉の分解：僅かに分解する (6) チロシン寒天培地生育：中程度気中菌糸：殆んど形成しないや、稀に白色気
中菌糸の点在を認める。基生菌糸：灰黄色（3ec）〜明灰黄褐色
（3ge）可溶性色素：培養初期には薄紫色〜淡赤褐色
色素を生成するが、約10日培養で淡褐色となり、
その後薄くなる（メラニン色素を僅かに生成す
る） (7) 栄養寒天培地生育：良好気中菌糸：薄く白色の気中菌糸を形成する基生菌糸：淡黄色（2db）可溶性色素：なし (8) オートミール寒天培地生育：良好気中菌糸：白色〜灰白色基生菌糸：灰黄色（3ec）〜明灰赤褐色
（4ge）可溶性色素：なし本菌株は25〜33℃を最適温度範囲として生育す
るが、20℃または37℃でも生育不良ながら生育出
来る。しかし、52℃以上では生育出来ない。本菌
株は、グルコース、ペプトン、ゼラチン培地上で
ゼラチンを液化し、無機塩、澱粉寒天培地上で、
弱いながら澱粉を加水分解する。本菌株は脱脂乳
をペプトン化する。但し凝固は認められない。本
菌株は、ペプトン・イースト・鉄・寒天培地およ
びトリプトン・イースト液体培地中では、メラニ
ン様色素を生成しないが、チロシン寒天培地中で
は時々生成する。本菌株はプリドハム・ゴツトリ
ーブ寒天培地上において、Ｄ−キシロ−ス、Ｄ−
グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノー
ス、Ｄ−マンニツトを利用し、Ｌ−アラビノー
ス、ｉ−イノシトール、ラフイノースを利用せ
ず、シユクロースを僅かに利用する。この菌株は形態的分類ではＳ（Spirales）セク
シヨンに属し、イースト・麦芽寒天培地において
白色〜明灰白色の気中菌糸を着生し、Ｌ−アラビ
ノースを利用しない。本菌株は、昭和57年９目20日付で通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、微工
研条寄第184号（FERM−BP−184）により寄託
されている。次に上記のストレプトマイセスsp.G−89菌株
を用いて本発明の抗生物質を製造する方法を述べ
る。上記の菌株を生産に適した栄養培地に接種
し、これを18℃ないし37℃で２日ないし14日間好
気的に培養生産し、その培養物中より抽出単離精
製する。培地成分としては、通常のストレプトマイセス
培養に用いられている公知のものが使用出来る。
例えば炭素源としてグリコース、グリセリ、澱
粉、デキストリン、オートミール、糖蜜、油脂、
脂肪などが使用出来、窒素源としては、大豆粉、
綿実粉、ペプトン、乾燥酵母、コーンステイーブ
リカー、酵母エキス、カゼイン、カゼイン加水分
解物などの有機物ならびに硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウムなどの無機物が使用出来る。また
必要に応じて、炭酸カルシウム、食塩、塩化カリ
ウム、リん酸塩、硫酸マグネシウム、その他微量
金属塩などの無機塩類を添加するほか、本菌の生
育をたすけ、抗生物質ネオビリドグリゼインの生
産を促進するアミノ酸、ビタミンなどの有機物お
よび無機物を適宜添加することが出来る。また、
本菌株によりネオビリドグリゼインと同時にネ
オビリドグリゼインを製造するには、かかる培
地組成の他に、トランス−４−ハイドロキシ−Ｌ
−プロリン又はその含有物、例えば魚粉、肉エキ
ス等を添加するのがよい。培養方法は、一般に抗生物質の生産に用いられ
ている振盪培養、タンク培養などによる液体培養
法が利用されるが、工業的生産にはタンク内深部
培養法が最も適している。この培養は好気条件で行なわれることが望まし
く、培養温度は25〜33℃が望ましい。この方法で
本抗生物質類の生産は振盪培養、タンク培養とも
２ないし10日で最高濃度に達する。培地の種類に
よつて、培養中にpHが酸性またはアルカリ性に
大きく傾く場合があるが、この場合合には培養中
のpHを６乃至９に保つようにすることが望まし
い。培養の始発時のpHは6.5乃至8.5に調節すること
が望ましい。培養液中に主成分として蓄積したネオビリドグ
リゼインはデプシペプタイドを単離するための
公知の方法および、本物質の物性に基づく各種の
精製方法により純品として回収単離することが出
来る。また、必要に応じてネオビリドグリゼイン
類の混合物またはこれらとグリゼオビリデリンと
の混合物としても回収することが出来る。本抗生物質を飼料添加剤または動物薬として調
製する場合には、特に単離することなく用いるこ
とが経済的に有利である。培養液中に存在する抗生物質ネオビリドグリゼ
イン類は酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼン、ト
ルエン、ｎ−ブタノール、メチレンクロライド、
クロロホルム、メチルイソブチルケトンなどの難
水溶性有機溶媒により抽出される。ネオビリドグリゼイン類は培養菌体中には殆ん
ど存在しないので、培養菌体を過または遠心分
離により、予め除去洗浄し、その洗液を含めた培
養液から本抗生物質を抽出するのが菌体中の脂
溶性不純分を除去出来るので望ましい。有機溶媒
による抽出法のほか、活性炭、アンバライト−
XAD（ローム・アンド・ハース社製）などによる
吸脱着、アンバライトIR−120（ローム・アン
ド・ハース社製）、ダウエツクス50W−X₂（ダ
ウ・ケミカル社製）などの陽イオン交換樹脂によ
る吸着、溶出、セフアデツクスLH−20（フアル
マシア社製）などによるゲル過、アルミナ、シ
リカゲルなどによる吸着クロマトなどを、カラム
法または薄層法により適宜組合せて使用し、場合
によつては適当な溶媒を用いた向流分配法などを
併用して、本抗生物質を回収することが出来る。以下に本発明を実施例により、更に詳細に述べ
る。実施例１溶性澱粉２％、大豆粉0.5％、りん酸第二カリ
ウム0.1％、食塩0.1％、硫酸マグネシウム0.05％
（pH6.5に調整）からなる培地25mlを250ml溶三角
フラスコに入れ、殺菌後、ストレプトマイセス
sp.G−89を接種し、28℃で48時間ロータリー振
盪培養を行いこれを種母とした。溶性澱粉２％、Ｌ−アスパラギン0.5％、りん
酸第二カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.001％
（pH6.5）からなる培地50mlを500ml容三角フラス
コに入れ、殺菌後種母を２mlずつ接種し、28℃で
144時間ロータリー振盪培養（200rpm×７cm）を
行つた。培養液５mlをベンゼン１mlで抽出し、ベンゼン
層をシリカゲルプレート（メルク社製シリカゲル
プレートF₂₅₄）にスポツトしクロロホルム：メタ
ノール＝30：１の混合溶媒を用いて薄層クロマト
グラフイーを行い展開後島津製作所製クロマトス
キヤナーCS−910を用いて定量した。ネオビリド
グリゼイン類の生産量は下表１に示すとおりであ
つた。又、同様に培養したストレプトマイセス
sp.p8648（FERM Ｐ−3562）のネオビリドグリゼ
イン類の生産量を下表１に併記する。

【表】実施例２溶性澱粉２％、ぶどう糖0.2％、大豆粉0.5％、
トリプトン（デイフコ社製）0.4％、酵母エキス
0.2％、りん酸第二カリウム0.1％、食塩0.1％、硫
酸マグネシウム0.05％（pH6.5）の培地50mlを500
ml容三角フラスコに入れ120℃15分間殺菌後スト
レプトマイセスsp.G−89の胞子を斜面培養より
接種し、25℃にて３日間振盪培養し、これを種母
培養とした。とうもろこし澱粉10％、大豆粉５％、りん酸第
一カリウム0.1％、食塩0.1％、硫酸マグネシウム
0.05％、塩化マンガン0.1％、硫酸亜鉛0.01％
（pH6.5）から成る培地50mlを500ml容三角フラス
コに入れ、殺菌後、上記種母培養を２％宛、接種
し、28℃に振盪培養した。接種から５日間培養し経時的に培養液中のネオ
ビリドグリゼイン類を薄層クロマトグラフイーで
分離定量した。ストレプトマイセスsp.p8648
（（FERM Ｐ−3562）を同様に培養し、両者のネ
オビリドグリゼイン類生産量を下表２に併記す
る。

【表】以上の如く、本発明は抗生物質ネオビリドグリ
ゼイン＆の生産の選択性を高めた製造法であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１ストレプトマイセスsp.G−89（微工研条寄第
184号）を栄養培地中に培養し、培養物中に蓄積
された式で示される抗生物質ネオビリドグリゼインを採
取することを特徴とする抗生物質ネオビリドグリ
ゼインの製造方法。