JPH03201979A

JPH03201979A - 安定性の高い組換えガンマインターフエロン

Info

Publication number: JPH03201979A
Application number: JP2239776A
Authority: JP
Inventors: Patrick W Gray; パトリク・ウイリアム・グレイ; Ernst H Rinderknecht; エルンスト・ハインリッヒ・リンダークネヒト
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1983-12-16
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 1991-09-03
Anticipated expiration: 2010-10-11
Also published as: ES8801553A1; DE3486424T3; HU202278B; JPH0789935B2; IE72494B1; EP0146354B2; JP2886145B2; FI91884B; ATE135405T1; KR850004273A; IL73803A; JPH10210985A; PT79691A; MY102899A; US6497871B1; JPH08151399A; JP2545206B2; FI91884C; NO178789B; ES538620A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の分野］本発明は、組換えＤＮＡ技術の領域に係り、安定性の高
い組換えがンマインターフェロンの製造に前記の如き技
術を利用する手段及び方法、前記インターフェロンの産
生並びに産生される種々の産物及びそれらの用途に係る
。

［発明の背景］本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明細書中に包含し、
便宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、本明細書
末尾に目録として添附した。本文中では参考文献を参照
番号で示す。

ヒトインターフェロンは、抗原性、生物学的特性及び生
化学的特性の違いに基いて３種のグループに分類し得る
。第１のグループは、通常ウィルスによって誘発された
ヒト血液構成細胞が主として産生ずる白血球インターフ
ェロン類である。これらのインターフェロンは、既に微
生物によって産生され、生物学的に活性であることが知
見されている（参考文献１．２及び３参照）。このイン
ターフェロンは、その生物学的特性故に、ウィルス感染
症及び悪性腫瘍状態の治療薬としての臨床使用が０論ま
れている（４）。

第２のグループのヒト繊維芽細胞インターフェロンは、
通常、ウィルスに誘発された繊維芽細胞によって産生さ
れる。これらのインターフェロンも同じく既に微生物に
よって産生されており、広範な生物学的活性を示すこと
が知られている（５）。

臨床試験においてもこれらのインターフェロンの潜在的
治療価値が示唆されている。白血球インターフェロンと
線維非細胞インターフェロンは、アミノ酸レベルでの相
同（ｈｏｍｅｌｏＮ）の程度が比較的低いにもかかわら
ず、生物学的特性が極めて類似している。又、これらの
グループのインターフェロンはいずれも、約１６５乃至
約１６６個のアミノ酸を含み且つ酸に対して安定なタン
パクである。

ヒトガンマインターフェロン（免疫インターフェロン、
γ−インターフェロン、１１Ｆ又はＩＦＮ−γともいう
）は、前記インターフェロンの抗ウイルス特性及び抗細
胞増殖特性を示すが、白血球インターフェロン及び線維
非細胞インターフェロンとは対照的に１１８２で不安定
である。これらガンマインターフェロンは、組換えＤＮ
Ａ技術によって産生される以前には主としてリンパ球の
マイトゲン誘発によって産生されていた。ヒトガンマイ
ンターフェロンは、白血球インターフェロン及び線維非
細胞インターフェロンとは抗原的に明らかに異なってい
る。Ｇ　ｒＢ、　Ｇ　ｏｃｄｄｅｌ等は組換えガンマイ
ンターフェロンの発現を最初に報告しており（６）、こ
れによってヒトガンマインターフェロンに特有な性質即
ち９８２での不安定性と共に抗ウィルス活性及び抗細胞
増殖活性を示すことが確められた。大腸菌（Ｅ　、　ｃ
ｏｌｉ）中で産生されたＧｒＨ及びＧ　ｏｃｄｄｅｌの
組換えがンマインターフェロンは　１４６個のアミノ酸
から成り、この分子ノＮ末端部は配列ＣＹＳ−ＴＹＲ−
ＣＹＳ−で始まっていた。続いて、Ｄ　ｅＢｎｃｋ等が
、同じＮ末端を有し且つ１個のアミノ酸が置換されてい
る別の組換えガンマインターフェロンを報告した（７）
が、おそらくこのポリペプチドはそれより前に参考文献
（６）　に報告されたインターフェロンの対立変異型（
４１１ｅｌｉｃ　ｙ＊ｒｉ１＋ｌ）であろう。更に、他
の研究者等によって別の組換えガンマインターフェロン
の産生についての報告がなされており、彼らによって産
生された組換えガンマインターフェロンでは、ＧｒＨ及
びＧ　ｏｅｄｄｅｌが最初に開示したアミノ酸配列（６
）のうち　１個又はそれ以上のアミノ酸が置換されてい
ると報告されている。

例えば、Ａ　Ｎｏｎ等は、Ｇｒｓ７等のガンマインター
フェロン（６）の８１番目のアミノ酸を　１つ置換した
一連のＩＦＮ−γを報告している（１７）が、得られた
ｒＦＮ−γは７０％（相対基準）の活性しか有しておら
ず、さらにこのＩＦＮ−γの　１．２．３番目のＣＹＳ
−ＴＹＲ−ＣＹＳを欠失させると、相対活性が更に低下
し、Ｇ　ｒｓ７等のガンマインターフェロン（６）の４
９％の活性しか有していないＩＦＮ−γとなる。

本発明者等の研究によって、Ｎ末端アミノ酸配列にシス
ティン残基を含む組換えガンマインターフェロンは、１
個又はそれ以上のシスティン残基のスルフヒドリル基が
ジスルフィド結合形成に関与するオリゴマー化という見
地から問題を醸し出すことが確認された。本発明者等の
研究に於いてこれらの推定ジスルフィド結合を完全に還
元することができなかったことから、問題はより複雑で
あり、おそらくはシスティンと結合したチロシン残基の
ヒドロキシル官能基を介する反応が含まれると思われる
。又、これらの組換えインターフェロンは多少不安定で
あり、不安定性のためかその他の原因によるかは明らか
でないが、最適な効果が得られないことが判明した。

［発明の大要］本発明は、安定性及び活性が優れた組換えガンマインタ
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、Ｎ末端から
伸延して続く下記アミノ酸配列（以下、「完全配列」と
いう）を有する組換えガンマインターフェロン、及び前
記配列のカルボキシ末端の特定部位を欠く種々のインタ
ーフェロンアナログ（類似体）が提供される。

３Ｇ１３７３８３ｇ１．４１１＋４１４２ここで、Ｘはメチオニン残基又は水素であり、Ｙは、グ
ルタミン残基であるか、又はＸが水素であるときはグル
タミン残基若しくはピログルタミン酸残基である。本発
明はまた、対応するクローン化遺伝子、これらを含む発
現ベクター及び本発明のインターフェロンの組換えＤＮ
Ａ技術による産生に有用な形質転換体を提供する。本発
明の好ましい組換えがンマインターフェロンは、（文献
中に既に記載されているインターフェロンと比較して）
天然ガンマインターフェロンの真のアミノ酸配列に最も
近似していると思われる。この天然ガンマインターフェ
ロンは本発明者等が天然起源から精製し充分に特性を明
らかにしたものである。

本発明の好ましい態様のインターフェロンは、文献中に
既に記載されているインターフェロンに比べて大幅に改
良された安定性と活性を示す。

本発明の前記及び他の目的を達成する様相は、以下の詳
細な説明及び添附の図面の記載から明らかになるであろ
う。

第１図は、本発明の組換えガンマインターフェロンのア
ミノ酸１−１４３、並びにシグナル配列が先行している
該アミノ酸配列をコードしており且つ非翻訳ＤＮＡから
なる５′−及び３゛−フランキング領域を有するＤＮＡ
配列を示す。

第２図は、Ｅ、　ｃｏｌｉによる本発明の組換えガンマ
インターフェロンの直接合成のための情報をコードして
いるプラスミド及びその調製法を示す模式図である。

第３図は、本発明によって調製されたガンマインターフ
ェロンの優れた安定性を示すデータである。

［詳細な説明〕本発明者等は、天然ヒトガンマインターフェロン（即ち
、ヒト末梢血リンパ球のマイトゲン誘発によって産生さ
れて精製されたもの）が、Ｇｒ＊１等が組換えガンマイ
ンターフェロンと指称し参考文献（６）に示した配列を
有するポリペプチドのＮ末端ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを
欠くポリペプチドであることを解明した。本発明者等の
研究に係る高度に精製した天然がンマインターフェロン
をトリプシン消化して得られる物質中には、ＧｒＢ等の
組換えガンマインターフェロン（６）のＮ末端部にほぼ
相当するアミノ酸組成を有するが、但しＣＹＳ−ＴＹＲ
−ＣＹＳを欠く配列が含有されていた。天然ガンマイン
ターフェロンのアミノ酸配列解析をＮ末端から行なうこ
とはできなかったので、この分子のＮ末端のα−アミノ
酸は保護されていると推定された。Ｇ　ｒｓ７等（６）
によるとｅＤＮＡがコードしている　２つ目のシスティ
ンの次の第１アミノ酸はＧＬＮ　（グルタミン）である
ので、ＧＬＮ残基が環化してピログルタミン酸に代りそ
の結果Ｎ末端がブロックされていると推測された。ピロ
グルタミン酸アミノペプチダーゼによってピログルタミ
ン酸を除去すると、次にコードされているアミノ酸すな
わちＡＳＰのα−アミノ基が遊離し、配列解析が続行で
きるようになり、その結果天然のヒトガンマインターフ
ェロンの最初に報告されたものと同じ結果が得られた。

ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する組換えヒトガンマイ
ンターフェロンのｃＤＮＡを適当に改造することにより
、上記の完全配列（但し、ＸはＭＥＴであり、ＹはＧＬ
Ｎである）を有するタンパクをコードしている　ｃＤＮ
Ａから新規な組換えガンマインターフェロンをＥ、　ｃ
ｏｌｉ中で直接発現させることが可能になった。Ｎ末端
のメチオニンはｍＲＮ　Ａの翻訳“開始”シグナルＡＵ
Ｇによってコードされている人為構造であり、例示した
旦。

ｃｏｌｉによる発現という特定の場合には宿主系により
除去処理されない。他の微生物系、例えばシュードモナ
ス（ｐｓｅａｄｏｍｏｎ＊ｓ）では、メチオニンが除去
され得る。いずれにせよ活性に必要であるとは思われな
い。メチオニンが除去されると、使用する系に応じて、
ＧＬＮ残基がピログルタミン酸の形態に環化し得るがこ
の場合も活性が損われることはない。

本発明者等の研究によると、ＧｒＢ等により以前に報告
されたＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する組換えがンマ
インターフェロンは、ヒト血清アルブミンを用いて処方
することで安定化し得た。

しかしながら、最終凍結乾燥産物中に血清アルブミンが
存在する場合は、最終産物に対してではなく凍結乾燥に
先立って成る種の品質調整処理を行なう必要がある。一
方、本発明の新規な組換えガンマインターフェロンの場
合には、凍結乾燥状態の物質は、血清アルブミンを含有
しなくとも充分に安定であることが判明した。しかしな
がら、所望であれば、本発明のガンマインターフェロン
を薬剤上許容される程度のヒト血清アルブミンと調合し
てもよい。

更に、本発明のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを欠く組換えヒ
トガンマインターフェロンは、細胞変性阻害試験に於い
て、抗ウィルス剤としてＣＹＳＴＹＲ−ＣＹＳ含有アナ
ログよりも顕著な活性を示すように思われる。活性は通
常、マイクロタイタープレート上でヒト肺癌由来の細胞
株Ａ３４９に対する脳心筋炎ウィルスの細胞変性効果（
ＣＰ　Ｅ）の阻害によりアッセイされる（１２）。

本発明の組換えガンマインターフェロンは、前記完全配
列のアミノ酸１〜約１２６を含有するインターフェロン
を全て包含する。完全配列に対してカルボキシ末端部を
種々切り取ったガンマインターフェロンは、アミノ酸１
〜約１２６が存在する限り、成る場合に多少レベルが低
下するとしても、依然としてヒトガンマインターフェロ
ンに特有の性質を示す。実際、　（７）に報告されたＣ
ＹＳＴＹＲ−ＣＹＳ含有アナログを用いた実験で、アミ
ノ酸１３２（本発明の番号付けによる）に続くアミノ酸
配列を、活性を損失することなく他の配列（ｅｘｌｚｎ
ｅｏｕｓ　ｓｅｑ＊ｅａｅｅｓ）で置換された例が示さ
れた（例えば、　（８）参照）。本発明者等の予備的デ
ータは、アミノ酸ｌから１２１ｉ　　（ＴＨＲ）付近ま
での配列は比較的強固に結合して活性と関連すると思わ
れる三次元立体配置をとっているが、完全配列の残りの
アミノ酸は比較的構造上の制限が緩くタンパク分解に比
較的敏感であるという仮説を支持している。制限条件下
でのトリプシン消化によって、アミノ酸１２６より下流
の配列は種々の部分が除去されるがこれより上流は除去
されない。

本発明者等が研究した天然ガンマインターフェロンは、
アミノ酸　１２７．　１２８．　１２９．　１３０．　
１３２及び！３４にわたる種々の分子を含む。本発明者
等は、メチオニンに続くアミノ酸配列が（ＭＥＴの後の
）アミノ酸１〜約１３９及び１〜約１３１の種々のもの
から成る完全に活性な組換えガンマインターフェロンを
発見した。後者のアミノ酸ｌ〜約１３１は、組換えガン
マインターフェロンをトリプシンで制限消化しその後配
列確認することによって得られた。（ＭＥＴより先の）
アミノ酸約１２８及び１２９に末端を有する同様のトリ
プシン消化断片は、実質的に低下しているとはいっても
活性を保持していた。一方、１２６番目のスレオニンと
それに続くアミノ酸を消化して除去した（Ｎ末端メチオ
ニンに加えて）１２５個のアミノ酸を有する物質は、Ｃ
ＰＥ阻害アッセイに於いて未消化物の活性の１％未満の
活性しか示さなかった。

組換えによって誘導されたガンマインターフェロンは、
メチニオンが細胞内では開裂されないような宿主内で産
生された場合に先頭メチオニンを有するのに加えて、１
３９個のアミノ酸（第■図の番号付による）を有するも
のが多量で１４３個のアミノ酸を有するものが少量であ
ると考えられる。

この２種の組成はアミノ酸Ｈ９個の種が約９５％より多
く、最も好ましくは°約９７％より多い。制限条件下の
トリプシン消化はまた、アミノ酸１２Ｇ付近から下流の
種々の部分の配列を除去する。本発明者等の研究に係る
組換えガンマインターフェロンのこのような制限トリプ
シン消化物は、アミノ酸１２５（先頭メチオニンを含め
ると１２６）、　　１２９゜１３１及び１３４にわたる
種々の種を含む。これらの種は、アミノ酸１２Ｓ付近か
ら　１２９付近に伸びる場合、実質的に低下するとして
も活性を保持している。少なくともほぼ１２９個のアミ
ノ酸、特に少なくとも　１３１個のアミノ酸を有する種
、すなわち約１２９〜１４３個のアミノ酸を有する種が
本質的、又機能的に完全な活性を保持している。

以上のことから明らかなように、本発明は、上記の完全
配列を有する組換えガンマインターフェロンだけでなく
、アミノ酸１４３を欠くか又はＺ→アミノ酸　１４３の
アミノ酸配列（但し、Ｚはアミノ酸　１２７．　１２８
．　１２９．　１３０．　　Ｎ１．　　Ｈ２，１３３゜
１３４、　１３５．　　１３６，１３７，Ｈ８，１３９
，１４ｆｌ。

１４１又は１４２である）を欠く種々の組換えがンマイ
ンターフェロン及びこれらの混合物をも含む。

本発明の組換えがンマインターフェロンをコードしてい
る二本鎖ＤＮＡ配列が、上記の完全配列をコードしてい
るＤＮＡ配列だけでなく、上記した種々のカルボキシ末
端を切り取ったアナログのみをコードしている配列をも
含むことも同様に明らかであろう。この種々のカルボキ
シ末端を切断した場合には次に続くコドンが翻訳終了シ
グナルをコードする。

本明細書中、１組換えガンマインターフェロンｊとは、
組換えＤＮＡ技術によって得られる複製可能な発現ベヒ
クルから形質転換細胞中で発現されるポリペプチド（こ
れを産生ずる細胞によってグリコジル化されているかい
ないかにかかわらず）を意味する。本発明のポリペプチ
ドは、天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性質即
ち、程度の差はあれ多少ともヒトに於ける抗ウィルス活
性及び抗細胞増殖活性並びにｐＨ２に於ける不安定性を
示す。

本明細書に記載した組換えガンマインターフェロンは、
本発明の目的として少なくとも　ｌ〜約１２６のアミノ
酸を各々有する前記の如きポリペプチドの２個の組合せ
（各ポリペプチドは同数又は異なる数のアミノ酸を有し
得る）として定義される「二量体」を形成すると考えら
れる。化学結合形成機構に関する性質は充分には解明さ
れていないが、共有結合以外の結合であると思われる。

二量体を生ずる結合は自然に起こるようであり、本明細
書に記載する系では不可避であると思われる。

従って、本発明の組換えガンマインターフェロンを投与
するときには、通常二量体の形態であろう。

更に、別に特徴づけられた組換えガンマインターフェロ
ンに関する文献（ｉｔ、　９）の開示と同様に、本明細
書中に開示した組換えガンマインターフェロン中、アミ
ノ酸１２６付近の上流若しくは下流又はＣ末端部分で、
保有するインターフェロン活性を損うことがなければ、
アミノ酸の置換又は付加、特に　１個のアミノ酸の置換
及び複数のアミノ酸の付加又は置換が可能であると理解
すべきである。

本発明の範囲を超えることなく、前記の如き置換もしく
は付加をなし得ることは当業者には明らかであると思わ
れる。さらに本発明の組換えガンマインターフェロンは
完全配列（第１図参照）の改変槽及び対立変異種であっ
て完全配列のものと同等、あるいはそれ以上の生物学的
活性を持つ種を包含する。

本発明の特徴として、精製した組換えガンマインターフ
ェロンは実質的にヒト由来の他のタンパクを含まないで
あろうし、この特徴によって、今まで入手可能であった
天然のヒトガンマインターフェロン組成物とは区別され
るであろう。

本発明は、（処方前に）約９５％より高純度、好ましく
は約９８％より高純度の組換えガンマインターフェロン
組成物を包含し、このため、該組成物は今までに入手可
能であった天然のガンマインターフェロンと区別される
。

同様に、Ｎ末端アミノ酸残基がメチオニンである本発明
の具体例の　１つの組換えガンマインターフェロンはヒ
トの体内で産生されるガンマインタ−フエロンと区別さ
れ、ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳの欠失以外にも同様な理由
で、Ｇ　ｒｉ７等　（６）が報告した配列を有するイン
ターフェロンとは区別されるであろう。

本明細書中、複製可能な発現ベヒクルとは、二本鎖ＤＮ
Ａ、好ましくはプラスミドを意味し、これは、複製開始
領域、プロモーター又はプロモーター−オペレーター、
リポソーム結合部位をコードする配列、翻訳開始シグナ
ルコドン及びこれらと適切な解読相にあり所望の組換え
ガンマインターフェロンをコードしている遺伝子、更に
これに続く翻訳終了コドンから成る。現在では、組換え
ＤＮＡ技術の一般的技術及び用語は当業者には充分理解
されており、いずれにせよ当業者は、本発明の全ての具
体例及び合法的に均等であると認識される例の実施に関
するバックグラウンド情報として必要な変更を加えて（
１１）を参照できるであろう。

実施例Ａ、クローニング参考文献（６）及び特開昭５８−９０５１４号公報の記
載に従い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメツセンジ
ャーＲＮＡを用いて、ガンマインターフェロンｃＤＮＡ
配列を有する組換えＤＮＡクローンを調製した。クロー
ンｐ６７のＤＮＡ配列を第１図に示す。５′−非翻訳領
域に続いて、２３個のアミノ酸から成る前駆体即ちシグ
ナルペプチドをコードしている６９個のヌクレオチド、
１４３個のアミノ酸から成る成熟インターフェロンポリ
ペプチドをコードしている　４２９個のヌクレオチド及
び３′−非翻訳配列を形成する　５８７個のヌクレオチ
ドがある。

Ｂ１発現１、　　Ｅ、　ｃｏｌｉによる例Ｅ、　ｃｏｌｉ中で組換えＩＦＮ−γを高レベルで発現
させるためには、シグナルペプチドのＡＴＧ（アミノ酸
Ｓｌ）ではなく、成熟ポリペプチドのグルタミンコドン
（アミノ酸ｌ）の直前のＡＴＧコドンからタンパク合成
を開始すべきである（第１図参照）　。Ｅ、ｃｏｌｉ中
で直接に９６７のｅＤＮＡインサートを発現させるため
にとった手順の概略を第２図に示す。ＧｒＨ等　（６）
のｅＤＮＡインサートをＥ、　ｃｏｌｉ中で発現するた
めに使用したアプローチと同様のアプローチをとった。

シグナルペプチドコード領域を除去するために、推定成
熟コード配列のコドン２に位置するＡマ１■制限部位を
用いた。２種の合成デオキシオリゴヌクレオチドを、ア
ミノ酸１及び２のコドンを再生し、ＡＴＧ翻訳開始コド
ンを組み込み且つＸｂｔｌ粘着性末端を作成するように
デザインした。これらの　２種のオリゴマーを、　ｃＤ
ＮＡインサートの残りに結合して、　１４４個のアミノ
酸から成るポリペプチドをコードし且つ両端にＸｂｌｌ
及びＰｔ１１部位を有する１０６３塩基対の合成−天然
ハイブリッド遺伝子を組み立てた。この遺伝子をプラス
ミドｐＬｅ　　Ｉ　ＦＡ２５　（１０）のＸｂｓＩ及び
Ｐｔ１１部位の間に挿入して、発現プラスミドｐγ−Ｃ
ＹＣ５を作製した。このプラス−ミドでＥ、　　ｃｏｌ
ｉ　　Ｗ３１１０株（Ｆ　　、　　λ　、原栄養株ｐｒ
ｏｌｒｏｐＮｃ）　　（Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　ｏ、　２７３
２５）を形質転換して、宿主−ベクター系Ｅ、　ｅｏｌ
ｉ　　Ｗ３１１（１／　Ｐ７−ＣＹＣ５を得た。

２、培養細胞の例第１図に示したまうなＮ末端アミノ酸を含む成熟がンマ
インターフェロン遺伝子からの産物であることを確認す
るために、第１図に示したようなシグナルペプチド及び
ガンマインターフェロンの双方をコードしている遺伝子
を、放射活性標識システィン及びメチオニンの存在下で
ＣＯ３−７細胞（１６）中で発現させた（　Ｅ　、　ｃ
ｏｌｉによる発現の場合と異り、ここに例示したような
哺乳動物細胞系の発現産物はＮ末端メチオニンを欠いて
いる）。

６０−ペトリ皿中のＣ０９−７細胞の集密単層（ｃｏｎ
ｆｌａｅａｌ　　ｍｏｎｏｌＢｅｔ）に、改良ＤＥＡＥ
−デキストラン法を使用してＤＮＡをトランスフェクト
したものを２組調製した。ＤＮＡ添加の３日後、培地を
除去した。各プレートに、１００μＣ１５３５−メチオ
ニン又は５３５−システィンを添加したＤＭＥＭ２ｍｌ
を加えた。放射活性標識アミノ酸の存在下で１６時間イ
ンキュベートした後、培地を除去し、抗ガンマインター
フェロンモノクローナル抗体又は抗ＨＢｓＡｇモノクロ
ーナル抗体を第１抗体としウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（
Ｃ１ｐｐｃｌｌＩｎｃ、）を第２抗体として　５［１０
ｄの免疫沈降を実施した。前記抗体との反応及びその後
のスタフィロコッカス（Ｓ　ｌ＊ｐｈｌｙｃｏｃｃ＋＋
ｓ）　Ａ細胞（Ｃｇｌｂｉｏｃｈｃｍｌへの結合は、Ｐ
、　　Ｂｃｒ＊ｇａ等によっで記述されている（１８）
。サンプルをＳＤＳメルカプトエタノール中に再懸濁し
、１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけた。

ゲルをエタノール中７％酢酸で固定し、Ｅ　ｎｈ８ｎｃ
ｃ　（Ｎ　ｅｖＥ　Ｂｌｔｎｄ　　Ｎ　ｍｃｌｅｓｔ）
螢光溶液に浸し、乾燥し、Ｋ　ｏｄｒｋ　　Ａ　Ｒ５フ
イルム及び増感スクリーン（Ｄ　Ｉｐｅｎ＋＞を使用し
て２週間露光させた。

本研究に使用したプラスミドはｐＳＶγ６９（１１１、
ｐＤＬ　　ＲＩ　（１９）　（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗
原発現ベクター、　ｐＳｖγ６９の前駆体）及び１１Ｄ
ＬＲ１７Ｓｔｗ（ｐｓＶγＧ９（１１）ノ８３０ｂｐ　
　５ｅａ３Ａ断片を含有するポリシストロンプラスミド
であり、ｐＤＬ　　ＲＴのＥｃｏＲ［部位に挿入された
ガンマインターフェロンをコードしている全配列を含む
もの）であった。後者のプラスミドはガンマインターフ
ェロン及び）ｉＢｓＡｇ双方のコード領域を含む転写産
物を産生ずる。

抗ガンマインターフェロン抗体（Ａ）又は抗ＨＢｓＡｇ
抗体（Ｂ）と反応する８３５〜システイン及び５３５−
メチオニン標識タンパクを比較すると、　ｐＤＬ　　Ｒ
１−γ　５Ｉ１１でトランスフェクトし５３５−システ
ィンで標識した細胞では、抗ガンマインターフェロン抗
体を使用して特異的に免疫沈降する物質は、グリコジル
化物（Ｍ　Ｗ　２９．０００）の位置に移動するものも
モノグリコジル化物（ＭＷ　１８．０００）の位置に移
動するものもないのに対し、これとは対照的に、５３５
−メチオニン標識細胞ではガンマインターフェロンの免
疫沈降が生じた。

Ｃ０発酵生産旦、　ｃｏい−Ｗ３１１０／　ｐγ−ｃｙｃｓを用いる
組換えヒトインターフェロン−ガンマ（＋ＩＦＮ−γ）
の産生は、容量ＩＯ乃至＋０１１１）ｌの範囲のバッチ
で実施する。発酵後、インターフェロンを含有するＥ、
　ｃｏｌｉ細胞をブロスから回収し、ｒｌＦＮ−γを単
離精製する。以下に発酵及び細胞回収方法を記載する。

ｌ）ストックカルチャーの調製及び維持次の組成；バクトドリブトン　　　　　　　Ｌｏｇ／　Ｌ酵母抽出
物　　　　　　　　　　５ｔ／Ｌ塩化ナトリウム　　　
　　　５〜１ｌｌｅｔ／　Ｌを有する無菌培地１５０〜
５００　　ｍＬを含有する無菌のバッフル板付培養フラ
スコ中で、ストックカルチャーを調製する。

次に、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＷＨＩＯ／　ｐ７−ＣＹＣ５の
一次培養物を培地に接種する。

次いで、５５０ｆｉ−に於ける吸光度が約１．０になる
まで、接種したフラスコを振盪器上２５〜３７℃でイン
キュベートする。３０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキ
サイド約５Ｇ％（Ｖ／Ｖ）をブロスに添加する。直ちに
ｌｓＬのアリコートを無菌バイアルに分与し、ふたを閉
める。バイアルは一６０℃以下で保存する。各々の発酵
は、接種用複製ストックカルチャーを用いて開始する。

２）接種物の調製接種物を振盪フラスコ又は小型ファーメンタ−内で前記
の培地（ＬＢプロス）を用いて調製する。

約３７℃で約８時間インキュベートした後、接種物を７
アーメンターに移す。接種物の容量は、発酵容量の２乃
至１０％である。

３）発酵組換えインターフェロン−ガンマの産生は、約１０乃至
１００［１１の作用容積を有するファーメンタ−内で行
なう。発酵培地は、１１当り次の組成を有する。

グルコース（ネ）　　　　　　　５０　　−１００ｇ硫
酸アンモニウム　　　　　　４．０−８、Ｏｆ−塩基性
リン酸カリウム　　　３．０　−　ｓ、ｏｇ５．０Ｏ１５０，５０，５０、ＧＤ３０．００１Ｇ、００＋− ウムニ水塩０．００１Ｇ、００１０．００１０．００１０．００００１０．１２．０二塩基性リン酸カリウム硫酸マグネンウム七水塩クエン酸ナトリウムニ水塩Ｕ　ＣＯＮ　　Ｌ　Ｂ　−６２５塩化第二鉄六水塩硫酸亜鉛上水塩塩化コバルト六水塩モリブデン酸ナトリ８．０ｇ５．１ｇ２．０ｇ２、（ｌｅＬＯ，１５ｇｏ、＋ｓｇＯ，ｏｏｓｇ硫酸第二銅五本塩ホウ酸硫酸マンガン−水塩塩酸チアミン−ＨＣｌテトラサイクリン−ＨＣＩＬ−トリプトファン（＊）酵母抽出物０．００５ｔ０．００５ｇ０．００５ｇ０．００５ｇ１、Ｏａ＋ＬＯ，Ｉｇ０．０１ｇＧ、５゜８．０ｇ３−β インドールアクリル酸０．０２−　０．１０ｇ（＊）グ
ルコース及びトリプトファンは一部を最初にファーメン
タ−に入れ、残部は発酵中に供給する。

培地中の成分は、発酵に使用する前に、熱処理又は濾過
により殺菌する。

発酵は２５〜４０℃で行う。他の操作条件は次の通りで
ある；攪拌（＋ｐｍ）１００〜１０００通気（ママ００．５〜１．５（必要なときには酸素を補充）９１３６，５〜　７．５（水酸化アンモニウムの添加により調節）４）精　製ｌ）組換えガンマインターフェロンの抽出塩及びｐ１３
６乃至９、好ましくは約９の適当なせる。ガラリン（Ｇ
！ｔ＋ｌｉｎ　）　ミルの如き高圧コロイドミル中で細
胞懸濁液をホモゲナイズして組換えガンマインターフェ
ロンを抽出する。充分なポリエチレンイミンを前記溶液
に添加して、０．１乃至１％（Ｗ／Ｖ）の溶液に調製す
る。上溝にガンマインターフェロンが含まれている。

ｐ１３６乃至９の範囲の適当な塩溶液で洗浄して不純物
を除去したシリカをベースとする吸着剤に上記（１）の
上溝を吸着させる。０．５乃至１．０Ｍの塩化テトラメ
チルアンモニウムを含有する溶液を用いて組換えがンマ
インターフェロンを溶出する。

本工程の全操作はｐ１３７乃至９で行なう。

緩衝液を含有する培地中にＥ、　ｃｏｌｉ細胞を懸濁さ
Ｃ）アニオン交換クロマトグラフィーによる組の全操作
は、ｐ１３７乃至９で実施する。

上記（ｂｌ　の溶出液を透析し、アニオン交換クロマト
グラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除
去する。増大する塩勾配で組換えガンマインターフェロ
ンを溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交換
樹脂には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエチ
ルセルロースがある。全操作はｐ１３７乃至９で行なう
。

上記（ｄ）の溶出物を透析し、アニオン交換りａマドグ
ラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去
する。アニオン交換媒体から塩濃度を増大する勾配で組
換えガンマインターフェロンを溶出する。典型的なアニ
オン交換クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチル
セルロース及びスルホエチルセルロースである。

本工程の全操作はｐ１３７乃至９で実施する。

分精製上記（ｃｌ　の溶出物をリン酸カルシウム媒体に吸着さ
せ、次いで洗浄して不純物を除去する。

リン酸塩濃度勾配中で塩濃度を増加させて組換えがンマ
インターフェロンを溶出する。本工程分、精製上記（ｅ）の溶出物をゲルパーミェーション媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。

組換えガンマインターフェロンを含有する適当な画分を
プールして、精製バルクを得る。本工程の全操作はｐ）
Ｉ　　７乃至９で行なう。

ｇ）　Ｃ末端アミノ酸配列Ｃ末端配列を決定するために、サンプルを７０％蟻酸中
に透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをＡ
　ｌｉｓ！Ｕ　Ｈｒ＊５ｐｈｅｒｅ　　Ｃ８逆相ＨＰＬ
Ｃカラムで分離した。ピークを集め、アミノ酸及びその
配列解析を行った。検知されたＣ末端ペプチドは、−Ｌ
ＥＵ−ＰＩ（Ｅ−ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＲＧ　（残基［３
５〜Ｉ３９、第１図）であり、ある場合には他のペプチ
ドが追加されており、その配列は−ＬＥＤ−ＰＨＥ−Ａ
ＲＧ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−３ＥＲ−ＧＬ
Ｎ　（残基１３５〜Ｉ４３、第１図）であった。

これらの２種のペプチドの割合を決定するために、（ア
ミノ酸分析により）既知の量を逆相ＨＰＬＣカラムにか
け、それぞれのピークの高さを測定した。３回の産生に
おいて長鎖のペプチド（１３５〜１４３．第１図）の含
有量はそれぞれ約２％未満であり、残りは５量体（アミ
ノ酸５個のもの）であった。このデータは、旦、江見に
よる　Ｈ９個のアミノ酸含有及び１４３個のアミノ酸含
有のガンマインターフェロン（いずれの場合も存在する
Ｎ末端メチオニンを含まない）の混合物の産生と一致す
るものであり、それぞれの相対比率は約９８＝２％であ
る。

５）製剤化前記工程に従い製造した組換えガンマインターフェロン
を、次表の好ましい非経口投与用の製剤にする。

バイアル１本当りの量組換えヒトインターフェロン−γ マンニトールコハク酸二ナトリウム六水塩グリシン塩化ナトリウムポリソルベート２０コハク酸（１〉　　注射用にはバイアルを２．５Ｉｉの無菌水で
再構成する。

（〕　注射用にはバイアルを２．０ｍの無菌水で再構成
する。

本発明のインターフェロンは、医学的に適切な投与量範
囲、例えば体表面積１Ｍ２当り　１．Ｇ−ｇで使用し得
る。

カルボキシ末端の違った種々のガンマインターフェロン
の活性を決定するために、上記のＥ。

ｃｏｌｉの例に記述したように調製したガンマインター
フェロンを種々の程度にトリプシン消化し、前述のＡ３
４９細胞を用いるＣＰＥアッセイによって試験した。

前述のように調製した組換えガンマインター７エ０ン（
ｒ−Ｈｗ　ＩＦＮ−７）の試料（６，５＊）をＳ　ｅｐ
ｈｒｄｅｘ　Ｇ　−２５モレキユラーシープ小カラム（
Ｐ　Ｄ　−Ｉｌｌ、　　Ｐ　ｈｓｒｓＩｃ目）により　
ＰＨ８，５の０．１０Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液中に
脱塩し、最終タンパク濃度２．１■／ｍｌとした。希釈
トリプシン溶液（ＷｏｒｌｂｉＢｌｏｅ　Ｔ　Ｐ　ＣＫ
　　トリプシン、　　０．００１Ｍ　　ＨＣＩ中１中略
０略／ｌ、　１６ｍ）をｔ−ＨｕｌＦＮγ溶液の　１．
９ｎｌ　（４，０■）に加え、混合して室温でインキュ
ベートした（トリプシン；タンパク質＝　　ｌ　：　２
５．０００）。インキュベート混合物から、１時間後、
３．５時間後、５．７５時間後、８時間後及び１０．２
５時間後にそれぞれ試料を取り出した。８時間臼に１５
Ｘ（１５０ｎｇ）の希釈トリプシン溶液を再度加えて１
０．２５時間後の最終試料採取のための反応を促進した
。

各時点の試料の各成分への分画化はＢｉｏＲｅｄＢ　１
ｏｌｅｌ　ＨＰ　ＨＴカラムを使用するＷ　ｓ　ｌ　６
　目ＨＰＬＣシステムで行なった。重炭酸緩衝液中の各
時点でのアリコートは試料採取時にカラムに直接（手操
作による注入により）入れた。０．０１Ｍリン酸ナトリ
ウム、　　ｐｔｉ　８．［１，３ｆｌμＭ塩化カルシウ
ムによりカラムを平衡化し、平衡化緩衝液の直線勾配及
び０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐｉ（８，Ｇ。

０．６μＭ塩化カルシウムを使用してタンパクをカラム
から溶出した。

２１４ｖｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度により検出し
たタンパクのピークを分取し、分析に使用するまで４℃
で密閉保存した。選択されたピークに対する典型的な分
析は以下のものを含む。

１、ヒト肺癌由来の細胞Ａ３４９／ＥＭＣウィルスアッ
セイシステムにおける抗ウィルス活性（１３）。

２、　　Ｌ　ｗｅｍｍロゲルシステムを使用する標準法
によるＳＤＳ／ＰＡＧＥ分画化（１４）。

３、市販の色素（Ｐ　１ｅｒｃｅ　Ｃｂｅｓ＋１ｃｘｌ
　Ｃｏ、　。

Ｒｏｃｋｆｏ＋ｄ　　　Ｉ　Ｌ、　）結合法によるタン
パク濃度決定。

４、臭化シアンによるタンパク開裂とそれに続くペプチ
ド同定のためのＨＰＬＣ分析（１５）。

タンパクの試料は７０％蟻酸に対して一晩透析（１２，
０００−１４，０００Ｍ　Ｗカットオフ）し、ロータリ
ーエバボレーシランにより乾燥し　５ｏｏＩＪ１の７０
％蟻酸に再度懸濁した。１２Ｘ７５ｍｍガラス管中の各
サンプルに固体臭化シアンを加え、密封して溶解するま
で混合し、アルミホイルをかけ、通気のよい場所で室温
において一晩インキユベートした。

開裂の後、試料をロータリーエバポレーションにより乾
燥し、０２５ｍ１の水に再懸濁し、再度乾燥した。ＨＰ
ＬＣによる分画化に先立ち、試料を５０％蟻酸中に再溶
解してタンパク濃度約１■／ｍｌとした。

Ａ　ｆｌｅｗ　　Ｕ　ｌＩｒ５ｓｐｈｅｒｅ　　Ｏｃ１
７１カラム及びトリフルオロ酢酸／水−トリフルオロ酢
酸／アセトニトリル直線溶出勾配を使用するＷｚｌ！ｒ
ｔ　ＨＰ　Ｌ　Ｃシステムにより、ペプチドを分画化し
た。可能な場合はアミノ酸分析によりペプチドを同定し
た。

短縮された形態の　ｔ−ＨｗｌＦＮ−γの比較データを
表１に示した（１１はアミノ酸を表わす）。

１３１■ ２９１１１２５ｓ＊ネ表　　１ＡＡＫＴＧＫＲＫＲＡＡＫＴＧＫＲＡＫ０−５０ −９約ｌ第１図の番号付けによるが、それぞれにおいて存在する
Ｎ末端メチオニンは除く。

Ｈ−文字の略記号はアミノ酸残基の常用の略記号である
。

Ａ＝アラニンＦ＝フェニルアラニンＧ＝ニブリシン＝リジンＬ＝ロイシンＲ；アルギニンＴ＝スレオニン１２６０〜＋４３ｓ＊の範囲（Ｎ末端メチオニンは含ま
ない）の任意の長さのがンマインターフェロンは適切に
末端調整された遺伝子から発現されることがわかるであ
ろう。例えば第１図に示された遺伝子１１・　　　　１
２３　　　＋２４Ａｌｔ　　　Ａｌｔ（Ｘは　１個以上のアミノ酸をコードする）はＦｎｕ４
Ｈと扛■でプラスミドを消化した後に前記例示のＥ、　
ｅｏｌｉ発現ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了コ
ドンは下記のようになる。

終了限の後に、“終了”コドンの付いた所望の配列をコード
する合成オリゴヌクレオチド及び発現プラスミド中で使
用可能な制限部位に適合するリンカ−をガンマインター
フェロン遺伝子の前部に結合することができる。例えば
、配列：Ａ　　　ＧＣＴ　　　ＡＡＡ　　　ＡＣＡ　　　　　　
ＴＡ（Ｘ）ＣＧＡ　　　ＴＴＴ　　　ＴＧＴ　　　　　　ＡＴＣＴ
ＡＧ旦ｇｉｎＥ、アッセイ、細胞変性阻害１、テスト方法Ｅｓ１ｌｅＩ　ＭＥＭ中に４Ｘ　１０５細胞／ｍｌの含
有量に調整したヒト肺癌由来（Ａ　５４９）細胞（ＡＴ
ＣＣＮｏ、ＣＣＬ　　１８５）ＣＤ懸濁液１００ｄを各
ウェルに加える。

プレートを３７℃で約１８時間インキュベートする。

１８〜２４時間インキュベートした後、第１列目の各ウ
ェルに培地８０ＪＩｉを追加する。

インターフェロン活性を測定する試料２０成を第１列目
のウェルに加える。

第１列の各ウェルの内容物ｔｏｏｍをそれぞれの横の第
２列目のウェルに移す。

ウェルの内容物ｔｏｏｍを次列へ移し、これを全部で１
０回繰り返して、第１１列目まで移す。

２４時間インキュベートした後、セルコントロールを除
き全てのウェルに編心筋炎ウィルス５０ｕ１を感染させ
、感染後２４時間後の細胞変性効果が１００％となるよ
う感染を繰り返す。

トレイをふたで覆い３７℃で２４時間インキュベートす
る。

全てのウェルから液体を抜き、５〜１５分間１５％クリ
スタルバイオレットで染色する。

細胞の生存能力を染色細胞を観察することにより測定す
る。

試料のタイターは、５０％生存可能細胞が残存する希釈
度の逆数である。

２、計算全ての試料の活性を、下記により計算されるＲ　ｅｌｅ
＋ｅｎｃｅ　　Ｕ　ｎ１ｔｓ　　Ｃｏｎｗｅ１５ｉｏｎ
　Ｆ　ＩＣｌ０＋によって規格化する。

＝ＲＵＣＦ３、比活性ＮＩＨによるＩＦＮ−γ基準物質により標準化されたＡ
　５４９／Ｅ　Ｍ　ＣＶバイオアッセイシステムを使用
すると、組換えヒトＩＦＮ−γの抗ウイルス比活性は、
Ｎ末端に３つの付加アミノ酸（ｃｙｓ−ＴＹＲ−ＣＹＳ
）のついた改変ｒｌＦＮ−７分子の活性より約３倍高い
。

４、安定性上記の生物学的活性の測定（Ａ５４９／ＥＭＣＶ）によ
ると、調合後バイアル中に保存しであるｌＦＮ γは、生産後３ケ月間（４℃で貯蔵）安定である（生物学的活性の損失はない）。

ｌ、材料及び方法＋ＩＦＮ−７：溶液形態のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ−欠
失組換えインターフェロン γ　（２０ｍＭコハク酸ナトリウム。

０、Ｉ５ＭＮ＊　Ｃｆ１．　　ｐ１３６）。前記のＥ、
ｃｏｌｉの例に依る方法で調製した。比活性は　２．７
Ｘ１０７１Ｕ／■タンパクであった。

ＣＴＣ−＋Ｉ　ＦＮ−７：溶液形態の、分子のＮ末端に “ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ”構造を有する組換えインターフェロン一γ（２０ｍＭコハク酸ナトリウム。

０．１５Ｍ　　Ｎ！　Ｃ１，ｐ１３６）。比活性は　１
．３ｘ１０７１０／■タンパクであった。

ＨｕｌＦＮ　〜β　：ヒト二倍体***線維芽細胞内で産生されたヒト繊維芽細胞インターフェロンの凍結乾燥物で、比活性は　ｌＸｌＯ７ＴＵ／■タンパクより高く、Ｔ　ｏｔＢ　　Ｉ　ｃｄ、、　Ｉ　ｎｃ、により
調製されたもの。バイアル中にＨｕｌＦＮ−β３ＸｌＯ’ｌＵ及びヒト血清アルブミン３■を含む。

ＨｕｌＦＮＤＩ　　、　　Ｋ、　ＣＩｆｅｌｌ、　　Ｃｃａｌｒ＊
ＩＰ　ｕｂｌｉｃ　Ｈｅ＊ｌｌｈ　Ｌ　５ｂｏｒｘｌｏ
Ｂ　。

Ｈｃｌｓｉｎｋｉ　、　　Ｆ　１ｎｔｌｄより供与され
た溶液形態のヒト天然白血球インターフェロンで、比活性は４× １０６１Ｕ／■タンパクである。

コントロール：ヒト血清アルブミン３■を含有するプラシーボ。

地：Ｈｅ　Ｌｘ　、　ＫＢ、　ＨＭＶ−１゜ＦＬ及びＪ
−１１１細胞については、ｌＯ％熱半熱不活化初乳前子牛血清（ＰＮＣ８）及び２催ＭＬ−グルタミンを添加したＥ　ｘｇｌｅ’　ｓ最少必須培地を使
用した。Ａ３４９細胞にはＩＯ％熱不活化ＰＮＣ８，１００層／耐カナマイシン及び２ｍＭ　　Ｌグルタミンを含有するＤ　ｕｌｂｅｃｅ。

最少必須培地を使用した。表２に挙げた残りのヒト細胞には熱不活化ＰＮＣ３及び１００／Ｉｇ／ｍｌカナマイシンを添加
したＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４Ｇ培地を使用した。

２、抗細胞増殖活性の評価培養培地に懸濁した試験細胞をプラスチック組織培養プ
レートに５Ｘ　１０３細胞１０．５ｍｌ／ウェルの濃度
で接種した。続いて対応する培地（０，５ｍ１）に溶解
した種々の量のインターフェロンを添加した（０日）。

培養は３７℃において５％ｃｏ２．９５％空気の湿潤大
気中で行った。浮遊増殖型細胞については、６日目に培
養培地を除去し、懸濁培養液中の細胞をＣｏｕｌｌｅ＋
カウンターでの細胞計数のために直接Ｔ　５ｏｔｏｎ　
１１　（Ｃｏｕｌｔｅ＋　　Ｅ　１ｅｃｌ＋ｏｎｉｃｓ
［ｎＣ，）中に懸濁した。プラスチック容器中でシート
を形成する細胞は、測定に際し、ｒ　５ｏｔｏｎ　１１
中での単一細胞懸濁物を調製するために０．０５％トリ
プシン−００２％ＥＤＴＡで前処理した。インターフェ
ロンの抗細胞増殖活性は、コントロール培養物（インタ
ーフェロンなし）と比較して細胞数を５０％減少するの
に要する抗ウイルス単位数として表わした（ｒｃ　　、
　　目Ｕ／ｍｌ）。

０表２　他種インターフェロンと比較した＋ＩＦＮ−γの
抗細胞増殖活性試験細胞の組織学的細胞　　　タイプ又は起源Ｃｓｏ　（ＩＵ／　ｍ１ｌｒｌＦＮ−７ＣＴＣ−ｒｌＦＮ−７ＨｕｌＦＮ−β　Ｈ
ａｌＦＮ−αＮＡＴＯ−Ｉ　　胃癌Ｓｉｌｌｅｌ−ｒｉ
ｎｇ細胞ＭＫＮ−１胃扁平上皮癌ＭＫｌｌ−２８高分化型胃腺癌ＭＫＮ−４５低分化型肺腺癌ＭＫＮ−７４高分化型胃腺癌ＨｓＬ暑　　子宮頚癌に８　　　　　鼻咽腔癌＋１ＭＶ−１無メラニン性悪性黒色腫ＳＥｌ［Ｉ−Ｆ　　　悪性黒色腫ＦＬ　　　　　羊膜（非悪性腫瘍起源）ＰＣ−８低分化
型肺腺癌ＰＣ−１２肺腺癌Ａ３４９　　　　肺胞癌ＱＧ−５６肺扁平上皮癌ＱＧ−９０未分化型肺中細胞癌Ｄ■ｄｉ　　　Ｂａ＋ｋｉｌｌ　リンパ腫Ｎａ＋ｕｌｎ
　　Ｂｕｋｉｔｆ　　リンパ腫１−１１１　　　単球性
白血病７０４表に示した通り、　＋ＩＦＮ−γの抗細胞増殖活性はヒ
ト細胞種により著しく異っていた。この場合、ＫＡＴＯ
−ｎＩすなわち胃癌５ｉ（ｌｅｔ−＋ｉＢ細胞は高度に
敏感で１．２ｆＵ／＋ｍｌのＩＣ５Ｇを示すが、Ｄａｃ
ｄｉ細胞すなわちＢ　ｕｒｋｉＮリンパ腫はＩ型インタ
ーフェロン（Ｈｕ　　Ｉ　ＦＮ−ａ、Ｈａ　　ＩＦＮ−
β）に対しては高度に敏感であるのに対して、＋ＩＦＮ
−γを含む■型インターフェロンに対しては非感受性で
あった。肺腺癌（ＰＣ−８，ＰＣｌ３）は試験した全て
のインターフェロンに対して非感受性であった。　ｒｌ
ＦＮ−γとＣＴＣＴＩＦＮ−７間の抗細胞スペクトルは
殆んど同一であるが、−射的に　ｒＴＦＮ−γの抗細胞
増殖効果はＣＴＣ−＋ＩＦＮ−γのそれよりも優れてい
るようである。４つのインターフェロンを比較した場合
、Ｄ　Ｉｕｄｉ細胞を除いて＋ＩＦＮ−γにおいて最も
高い効果が得られた。

Ｇ、ｉｎマ１ｌｒｏの種々の液中における　ｒｌＦＮ−
γ１０■ヒト血清アルブミン、リン酸緩衝液及び等張量
のＮｈＣ９をそれぞれ含有している、前記のＥ、　ｃｏ
ｌｉの例に従って調製したｒＥＦＮ−γの凍結乾燥物ｌ
Ｘ１Ｏ’ｌＵ／バイアル及びＮ末端に“ＣＹＳ−ＴＹＲ
−ＣＹＳ”構造を有する＋ＩＦＮ−７の凍結乾燥物ｌＸ
ｌ０’　　ＩＵ／バイアルを蒸留水で溶解し、濃度を４
Ｘ１０’　　Ｉ　Ｕ／ｍｌに調整した。

インターフェロンの１ｎ　　マｉｌ＋ｏにおける安定性
は、種々の液体中における残存抗ウィルス活性を測定す
ることによって評価した。上記のインターフェロン溶液
を、３７℃又は４℃の水浴インキュベーターで１０分間
ブレインキュベートした９倍容量のウサギ血清、ヒト血
清あるいはＥ＊ｇｌｓ’　ｓ　ＭＥＭに加えることによ
ってインキュベートを開始した。　０．　０．２５．　
０．５．　　Ｉ、　　４．　８．　２４．　７２及び１
４４時間後にアリコートを採取し、９倍容量のＥ　ａｇ
ｌｅ’　ＩＭ　Ｅ　Ｍと混合した。試料は、インターフ
ェロンタイターの測定まで、ディープフリーザー中にお
いて一８０℃で凍結保存した。インターフェロンタイタ
ーは、５ｉｎｄｂ目ウイルスを感染させたヒト羊膜細胞
（ＦＬ細胞）を使用するＣＰＥ５゜法により測定した。

結果は初期タイターに対する残存タイターのパーセンテ
ージとして第３図に示した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ及びＣＯ３−７細胞中で発現させる好ま
しい具体例を参照して本発明を例示したが、本発明の組
換えガンマインターフェロンが他の細菌株、酵母及び組
織培養系の如き他の系内に於いても産生され得ることは
明らかである。特開昭５８−９０５１４号公報及び参考
文献（６）参照。即ち、本発明は最も好ましい具体例に
限定されず、むしろ前記特許請求の範囲の全ての適法範
囲の均等物に亙る。

参　　考　　文　　献り、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｌ　ｉｌ、、Ｎ＆１ｕｒｅ、
　２８７．４１１（１９８０）Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｌ　ｇｌ、　Ｎｔｌａ＋ｅ　
２９０．２０（１９８＋）Ｅ、　Ｙｅｌｙｅ＋ｔｏｎ　ｅｔ　＆１．　Ｎｕｃｌｃ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅｘ＋ｃｈ、　９．７３１　（
１９８１）Ｇｕｊｌｅｒｍｔｎ　　ｅｌ　　ｇｌ　　　
Ａｎｎｚｌｓ　　ｏｆ　　　Ｉｎｔ、　　Ｍｅｄ。

９３、３９９　（１９８０）Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｃｌ　＊１．、Ｎａｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　８．４０５７　（１
９８０）Ｐ、　　　ＧｒＢ　　ｅｌ　　！１．．　　　
Ｎｚｔａ＋ｅ、　　　２９５．　　　５０３−５０８（
１９８２）Ｒ、Ｄ　　ｅＢｏｃｋ　　ｅｆ　　＊１．、Ｎ　　ａｃ
ｌｅｉｃ　　　Ａ　　ｃｉｄｓＲｅｓｅ＆＋ｃｈ、　１
０．３６０５　（１９ｇ２）Ｌ　　Ｒ，Ｄｅｒ７ｎｅｋ
　　ｅｌ　　ｓｌ、、　Ｉ　ｎ（ｅｒｌｅｔｏｎ　　５
ｅｉｅｎ目１ｉｃ　Ｍｅｍｏｒ＊ｎｄｘ、　　Ａｕｇｕ
Ｎ　１９ｇ２．　Ｍｅｍｏ　＝１　−　Ａ　１１９３／
２９、　　Ｒ，Ｄｅｒ７ｎｃｋ　　ｅｌ　　１１゜”　Ｅ
　ｘｐｒｅｓ＋ｉｏｎ　　ｏｆＨｕｓｘｎ　　　Ｉ　　
ｎ１ｅｒｆｅｒｏａ　　Ｇｔｓｍｒ　　ｉｎ　　Ｈｃｌ
ｅ＋ｏｌ。

ｇｏｕＪ　　Ｓ　７ｓｌｅｍｓ　　　Ｊｎ　　Ｅ　ｘｐ
ｅｒｌｔｓｅｎＩｓＩ　Ｍｓ−ｎｉｐｕｌ＊１ｉｏｎ　
ｏｌ　Ｇ　ｅｎｅ　Ｅ　ｘｐ＋ｅｓ＋１ｏ１１Ａ　ｅｓ
ｄｅｍｅ　　Ｐ　ｒｅ目、　　Ｉ　ｎｃ、　　２４７　
（１９８３）１０、　　Ｄ、　　Ｇｏｓｄｄｅｌ　　ｅ
ｔ　　ｘｌ、、Ｎｒｌｕｒｅ、　　２８７．　４１１４
１６　　（１９８０）Ｉｌ、　　Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｌ　Ｊｌ、、　　
欧州特許出願公開第０、０７７、６７０号１２、　　Ｗ、　　Ｅ、　　５ｌｅｖｉｒｌ　　　１１
、　　”Ｔｈｅ　　　Ｉｎ１ｅｔｌｅｒｏｎ　　Ｓ　７
ｓｌｅｉ　　　、　　Ｓ　ｐ「ｉｍｅｒ　Ｖ　ｅ＋ｌ＆
ｇ（Ｎｅｗ　　Ｙｏｌｋ　　）ｐｐ、１３−２６　（１
９７９）１３、　８＋ｅｖ＊ｔ１．　　”Ｉｎ（ｅｒｔ
ｔｔｏｎ　　Ｓ７ｔｌｓｍｓ　　　’Ｅｄ、二Ｓ　１ｅ
ｖｓ＋ｌ、　　ｐ、　１３．　　Ｓ　ｐ＋ｉｎｇｅ＋−
Ｄ　ｅｒｌｒｇ　、　　Ｎ　ｅｗＹ　ｏｒｋ　　（１９
７９）Ｌ　　＊ｅｍｍｌｉ、　　　Ｎ　［ａｒｓ、　　　　２
２７．　　６８０　　（１９７０）１５、　　Ｇ　ｒｏ
目、　　ｓｌ　　ｇｌ。　Ｍ　ｅｌｈｏｄ＋　ｉｎ　Ｅ
　ｎｘｙ＋ｎ。

ｌｏｇ７．　　Ｘ　Ｉ　、　　２３８Ｇ　　１１！１１１１．　　Ｃｅｌｆ、　　　２３．　
１７５　　（１９８１）１７、　　Ａ　　１ｌｏ１　　
ｅｌ　　　ｔｌ、、　　　　“　Ｐ　　＋ｏｄａｃｔｉ
ｏｎ　　。

Ｃｈｘ＋＊ｅｌｅｒｉ目目ｏｎ　　ｌｄ　　Ｂ　１ｏｌ
ｏｔｉｃ＊Ｅ　　Ｉｔｅｃｌｓ　　ｏｆ　　Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎ＊ｎｌ　　　Ｄ　　Ｎ　　ＡＤ　　ｅｄｉｔｅｄ
　　　８１１１１！１１　　　Ｉ　　Ｆ　　Ｎ　　−＊
１ｐｈｘ　　ｇｌＩｄｌ　　ＦＮ−ｇ＊ｍｍ＊　　Ａｎ
ａｌｏｇｓ　　　、　　Ｔｈｅ　　　Ｂｉｏｌｏｇ７ｏ
ｆ　　ｔｈｅ　　Ｉｎ＋ｅｒｌｓｒｏｎ　　Ｓｙｓｔｅ
ｍ、　　　Ｄｅ　　Ｍｘｅ７ｅ＋【４６８９１ｎｄ　　Ｓ　　ｅｈｅｌｌｅｋｅａｓ　　　Ｅ　　ｄ
ｓ、　　　　　Ｅ　　ｔｔｅｌｒｉｅｒＳ　　ｃｉｅｎ
ｃｅ　　　Ｐ　　ｕｂｌ、　　　（１９８３）Ｂｅ＋ｍ
＊ｏ　　ｅｌ　　　ａｌ、　　　　　５ｃｉｅｎｃｅ、
　　２２２　　、　５２４（１９８３）Ｓ　Ｉｒａｏｎｓｅｎ　　ｅｌ　　　ｓｌ。　　Ｍｏｌ
、　　Ｃｅｌｆ、　　　Ｂ　＋ｏ１３、　２２５０　　
（１９８３１

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の組換えガンマインターフェロン遺伝
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図であり、第２図は本発明によって直接合成される組換えガンマイ
ンターフェロンをコードしているプラスミドの調製法を
示す説明図であり、第３図は本発明のガンマインターフェロンの優れた安定
性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）Ｎ末端から伸延する下記アミノ酸配列（但
し、Ｘはメチオニン残基又は水素であり、Ｙは、グルタ
ミン残基であるか、又はＸが水素であるときはグルタミ
ン残基若しくはピログルタミン酸残基である）を含有す
る組換えガンマインターフェロンポリペプチド；又は、（ｂ）（ａ）のガンマインターフェロンポリペプチドの
改変種で同等の性質を有するものを含む薬剤投与に適し
た組成物：【遺伝子配列があります】
（２）Ｘがメチオニン残基であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の組成物。
（３）前記ポリペプチドがＸの後に伸延する１２６＋ｎ
個（ｎは０又は１乃至１７の整数である）のアミノ酸を
有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
組成物。
（４）ｎ個のアミノ酸が、【アミノ酸配列があります】であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の
組成物。
（５）ポリペプチドが、前記ポリペプチドのアナログで
アミノ酸１４３を欠くか又はアミノ酸配列Ｚ→アミノ酸
１４３（但し、Ｚはアミノ酸１２７、１２８、１２９、
１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１
３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１又は１
４２である）を欠くポリペプチドから成るグループから
選択されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
第３項に記載の組成物。
（６）Ｚがアミノ酸１２７であることを特徴とする特許
請求の範囲第５項に記載の組成物。
（７）Ｚがアミノ酸１２８であることを特徴とする特許
請求の範囲第５項に記載の組成物。
（８）Ｚがアミノ酸１２９であることを特徴とする特許
請求の範囲第５項に記載の組成物。
（９）Ｚがアミノ酸１３０であることを特徴とする特許
請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１０）Ｚがアミノ酸１３１であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１１）Ｚがアミノ酸１３２であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１２）Ｚがアミノ酸１３３であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１３）Ｚがアミノ酸１３４であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１４）Ｚがアミノ酸１３５であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１５）Ｚがアミノ酸１３６であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１６）Ｚがアミノ酸１３７であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１７）Ｚがアミノ酸１３８であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１８）Ｚがアミノ酸１３９であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（１９）Ｚがアミノ酸１４０であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（２０）Ｚがアミノ酸１４１であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（２１）Ｚがアミノ酸１４２であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（２２）アミノ酸１４３だけを欠くことを特徴とする特
許請求の範囲第５項に記載の組成物。
（２３）ポリペプチドが、細胞変性阻害マイクロタイタ
ーアッセイに於いて、下記アミノ酸配列（但し、Ｘは水
素であり、ＡはＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳである）を有す
る組換えガンマインターフェロンの活性と少なくともほ
ぼ等しい活性を示すことを特徴とする特許請求の範囲第
１項乃至第２２項のいずれかに記載の組成物：【アミノ酸配列があります】
（２４）細胞変性阻害マイクロタイターアッセイに於い
て、下記アミノ酸配列（但し、Ｘは水素であり、ＡはＣ
ＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳである）を有する組換えガンマイ
ンターフェロンの活性の少なくとも約２倍の活性を示す
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第２２項の
いずれかに記載の組成物：【アミノ酸配列があります】【アミノ酸配列があります】
（２５）形質転換された細胞中で、Ｎ末端から伸延する
下記アミノ酸配列（但し、Ｘはメチオニン残基又は水素
であり、Ｙは、グルタミン残基であるか、又はＸが水素
であるときはグルタミン残基若しくはピログルタミン酸
残基である）を含有するポリペプチドを発現し得る複製
可能な発現ベヒクルによって形質転換された宿主細胞か
らなる形質転換細胞：【アミノ酸配列があります】
（２６）Ｘがメチオニン残基であることを特徴とする特
許請求の範囲第２５項に記載の形質転換細胞。
（２７）前記ポリペプチドがＸの後に伸延する１２６＋
ｎ個（ｎは０又は１乃至１７の整数である）のアミノ酸
を有することを特徴とする特許請求の範囲第２６項に記
載の形質転換細胞。
（２８）ｎ個のアミノ酸が、【アミノ酸配列があります】であることを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載
の形質転換細胞。
（２９）前記ポリペプチドが、アミノ酸１４３を欠くか
又はアミノ酸配列Ｚ→アミノ酸１４３（但し、Ｚはアミ
ノ酸１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２
、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、
１３９、１４０、１４１又は１４２である）を欠く特許
請求の範囲第２８項に記載のポリペプチドのアナログか
ら成るグループから選択されることを特徴とする特許請
求の範囲第２８項に記載の形質転換細胞。
（３０）微生物であることを特徴とする特許請求の範囲
第２５項乃至第２９項のいずれかに記載の形質転換細胞
。
（３１）細菌であることを特徴とする特許請求の範囲第
２５項乃至第２９項のいずれかに記載の形質転換細胞。
（３２）前記ポリペプチドの発現がこれに結合したシグ
ナルペプチドの形成を全く伴わないことを特徴とする特
許請求の範囲第２５項乃至第２９項のいずれかに記載の
形質転換細胞。
（３３）天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性質
を示し、少なくとも特許請求の範囲第１項に記載のアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチド。
（３４）アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が【アミノ酸配列があります】であることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載
のポリペプチド。
（３５）アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が【アミノ酸配列があります】であることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載
のポリペプチド。
（３６）アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が【アミノ酸配列があります】であることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載
のポリペプチド。
（３７）アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が【アミノ酸配列があります】であることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載
のポリペプチド。
（３８）アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が【アミノ酸配列があります】（但し、Ｚ′は水素又は下記アミノ酸若しくはアミノ酸
配列である）であることを特徴とする特許請求の範囲第
３３項に記載のポリペプチド：【アミノ酸配列がありま
す】；又は【アミノ酸配列があります】
（３９）アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が【アミノ酸配列があります】（但し、Ｚ′は水素又は下記アミノ酸若しくはアミノ酸
配列である）であることを特徴とする特許請求の範囲第
３３項に記載のポリペプチド：【アミノ酸配列がありま
す】
（４０）特許請求の範囲第３４項及び第３５項に記載の
ポリペプチドの混合物よりなる組成物。
（４１）特許請求の範囲第３４項に記載のポリペプチド
を約９５％より多く含有することを特徴とする特許請求
の範囲第４０項に記載の組成物。
（４２）特許請求の範囲第３４項に記載のポリペプチド
を約９７％より多く含有することを特徴とする特許請求
の範囲第４０項に記載の組成物。
（４３）薬剤上許容できる程度のヒト血清アルブミンを
含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の組成物。