JPH03201979A - 安定性の高い組換えガンマインターフエロン - Google Patents
安定性の高い組換えガンマインターフエロンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[発明の分野]
本発明は、組換えDNA技術の領域に係り、安定性の高
い組換えがンマインターフェロンの製造に前記の如き技
術を利用する手段及び方法、前記インターフェロンの産
生並びに産生される種々の産物及びそれらの用途に係る
。
い組換えがンマインターフェロンの製造に前記の如き技
術を利用する手段及び方法、前記インターフェロンの産
生並びに産生される種々の産物及びそれらの用途に係る
。
[発明の背景]
本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明細書中に包含し、
便宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、本明細書
末尾に目録として添附した。本文中では参考文献を参照
番号で示す。
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明細書中に包含し、
便宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、本明細書
末尾に目録として添附した。本文中では参考文献を参照
番号で示す。
ヒトインターフェロンは、抗原性、生物学的特性及び生
化学的特性の違いに基いて3種のグループに分類し得る
。第1のグループは、通常ウィルスによって誘発された
ヒト血液構成細胞が主として産生ずる白血球インターフ
ェロン類である。これらのインターフェロンは、既に微
生物によって産生され、生物学的に活性であることが知
見されている(参考文献1.2及び3参照)。このイン
ターフェロンは、その生物学的特性故に、ウィルス感染
症及び悪性腫瘍状態の治療薬としての臨床使用が0論ま
れている(4)。
化学的特性の違いに基いて3種のグループに分類し得る
。第1のグループは、通常ウィルスによって誘発された
ヒト血液構成細胞が主として産生ずる白血球インターフ
ェロン類である。これらのインターフェロンは、既に微
生物によって産生され、生物学的に活性であることが知
見されている(参考文献1.2及び3参照)。このイン
ターフェロンは、その生物学的特性故に、ウィルス感染
症及び悪性腫瘍状態の治療薬としての臨床使用が0論ま
れている(4)。
第2のグループのヒト繊維芽細胞インターフェロンは、
通常、ウィルスに誘発された繊維芽細胞によって産生さ
れる。これらのインターフェロンも同じく既に微生物に
よって産生されており、広範な生物学的活性を示すこと
が知られている(5)。
通常、ウィルスに誘発された繊維芽細胞によって産生さ
れる。これらのインターフェロンも同じく既に微生物に
よって産生されており、広範な生物学的活性を示すこと
が知られている(5)。
臨床試験においてもこれらのインターフェロンの潜在的
治療価値が示唆されている。白血球インターフェロンと
線維非細胞インターフェロンは、アミノ酸レベルでの相
同(homeloN)の程度が比較的低いにもかかわら
ず、生物学的特性が極めて類似している。又、これらの
グループのインターフェロンはいずれも、約165乃至
約166個のアミノ酸を含み且つ酸に対して安定なタン
パクである。
治療価値が示唆されている。白血球インターフェロンと
線維非細胞インターフェロンは、アミノ酸レベルでの相
同(homeloN)の程度が比較的低いにもかかわら
ず、生物学的特性が極めて類似している。又、これらの
グループのインターフェロンはいずれも、約165乃至
約166個のアミノ酸を含み且つ酸に対して安定なタン
パクである。
ヒトガンマインターフェロン(免疫インターフェロン、
γ−インターフェロン、11F又はIFN−γともいう
)は、前記インターフェロンの抗ウイルス特性及び抗細
胞増殖特性を示すが、白血球インターフェロン及び線維
非細胞インターフェロンとは対照的に1182で不安定
である。これらガンマインターフェロンは、組換えDN
A技術によって産生される以前には主としてリンパ球の
マイトゲン誘発によって産生されていた。ヒトガンマイ
ンターフェロンは、白血球インターフェロン及び線維非
細胞インターフェロンとは抗原的に明らかに異なってい
る。G rB、 G ocddel等は組換えガンマイ
ンターフェロンの発現を最初に報告しており(6)、こ
れによってヒトガンマインターフェロンに特有な性質即
ち982での不安定性と共に抗ウィルス活性及び抗細胞
増殖活性を示すことが確められた。大腸菌(E 、 c
oli)中で産生されたGrH及びG ocddelの
組換えがンマインターフェロンは 146個のアミノ酸
から成り、この分子ノN末端部は配列CYS−TYR−
CYS−で始まっていた。続いて、D eBnck等が
、同じN末端を有し且つ1個のアミノ酸が置換されてい
る別の組換えガンマインターフェロンを報告した(7)
が、おそらくこのポリペプチドはそれより前に参考文献
(6) に報告されたインターフェロンの対立変異型(
411elic y*ri1+l)であろう。更に、他
の研究者等によって別の組換えガンマインターフェロン
の産生についての報告がなされており、彼らによって産
生された組換えガンマインターフェロンでは、GrH及
びG oeddelが最初に開示したアミノ酸配列(6
)のうち 1個又はそれ以上のアミノ酸が置換されてい
ると報告されている。
γ−インターフェロン、11F又はIFN−γともいう
)は、前記インターフェロンの抗ウイルス特性及び抗細
胞増殖特性を示すが、白血球インターフェロン及び線維
非細胞インターフェロンとは対照的に1182で不安定
である。これらガンマインターフェロンは、組換えDN
A技術によって産生される以前には主としてリンパ球の
マイトゲン誘発によって産生されていた。ヒトガンマイ
ンターフェロンは、白血球インターフェロン及び線維非
細胞インターフェロンとは抗原的に明らかに異なってい
る。G rB、 G ocddel等は組換えガンマイ
ンターフェロンの発現を最初に報告しており(6)、こ
れによってヒトガンマインターフェロンに特有な性質即
ち982での不安定性と共に抗ウィルス活性及び抗細胞
増殖活性を示すことが確められた。大腸菌(E 、 c
oli)中で産生されたGrH及びG ocddelの
組換えがンマインターフェロンは 146個のアミノ酸
から成り、この分子ノN末端部は配列CYS−TYR−
CYS−で始まっていた。続いて、D eBnck等が
、同じN末端を有し且つ1個のアミノ酸が置換されてい
る別の組換えガンマインターフェロンを報告した(7)
が、おそらくこのポリペプチドはそれより前に参考文献
(6) に報告されたインターフェロンの対立変異型(
411elic y*ri1+l)であろう。更に、他
の研究者等によって別の組換えガンマインターフェロン
の産生についての報告がなされており、彼らによって産
生された組換えガンマインターフェロンでは、GrH及
びG oeddelが最初に開示したアミノ酸配列(6
)のうち 1個又はそれ以上のアミノ酸が置換されてい
ると報告されている。
例えば、A Non等は、Grs7等のガンマインター
フェロン(6)の81番目のアミノ酸を 1つ置換した
一連のIFN−γを報告している(17)が、得られた
rFN−γは70%(相対基準)の活性しか有しておら
ず、さらにこのIFN−γの 1.2.3番目のCYS
−TYR−CYSを欠失させると、相対活性が更に低下
し、G rs7等のガンマインターフェロン(6)の4
9%の活性しか有していないIFN−γとなる。
フェロン(6)の81番目のアミノ酸を 1つ置換した
一連のIFN−γを報告している(17)が、得られた
rFN−γは70%(相対基準)の活性しか有しておら
ず、さらにこのIFN−γの 1.2.3番目のCYS
−TYR−CYSを欠失させると、相対活性が更に低下
し、G rs7等のガンマインターフェロン(6)の4
9%の活性しか有していないIFN−γとなる。
本発明者等の研究によって、N末端アミノ酸配列にシス
ティン残基を含む組換えガンマインターフェロンは、1
個又はそれ以上のシスティン残基のスルフヒドリル基が
ジスルフィド結合形成に関与するオリゴマー化という見
地から問題を醸し出すことが確認された。本発明者等の
研究に於いてこれらの推定ジスルフィド結合を完全に還
元することができなかったことから、問題はより複雑で
あり、おそらくはシスティンと結合したチロシン残基の
ヒドロキシル官能基を介する反応が含まれると思われる
。又、これらの組換えインターフェロンは多少不安定で
あり、不安定性のためかその他の原因によるかは明らか
でないが、最適な効果が得られないことが判明した。
ティン残基を含む組換えガンマインターフェロンは、1
個又はそれ以上のシスティン残基のスルフヒドリル基が
ジスルフィド結合形成に関与するオリゴマー化という見
地から問題を醸し出すことが確認された。本発明者等の
研究に於いてこれらの推定ジスルフィド結合を完全に還
元することができなかったことから、問題はより複雑で
あり、おそらくはシスティンと結合したチロシン残基の
ヒドロキシル官能基を介する反応が含まれると思われる
。又、これらの組換えインターフェロンは多少不安定で
あり、不安定性のためかその他の原因によるかは明らか
でないが、最適な効果が得られないことが判明した。
[発明の大要]
本発明は、安定性及び活性が優れた組換えガンマインタ
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、N末端から
伸延して続く下記アミノ酸配列(以下、「完全配列」と
いう)を有する組換えガンマインターフェロン、及び前
記配列のカルボキシ末端の特定部位を欠く種々のインタ
ーフェロンアナログ(類似体)が提供される。
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、N末端から
伸延して続く下記アミノ酸配列(以下、「完全配列」と
いう)を有する組換えガンマインターフェロン、及び前
記配列のカルボキシ末端の特定部位を欠く種々のインタ
ーフェロンアナログ(類似体)が提供される。
3G
137
38
3g
1.411
+41
42
ここで、Xはメチオニン残基又は水素であり、Yは、グ
ルタミン残基であるか、又はXが水素であるときはグル
タミン残基若しくはピログルタミン酸残基である。本発
明はまた、対応するクローン化遺伝子、これらを含む発
現ベクター及び本発明のインターフェロンの組換えDN
A技術による産生に有用な形質転換体を提供する。本発
明の好ましい組換えがンマインターフェロンは、(文献
中に既に記載されているインターフェロンと比較して)
天然ガンマインターフェロンの真のアミノ酸配列に最も
近似していると思われる。この天然ガンマインターフェ
ロンは本発明者等が天然起源から精製し充分に特性を明
らかにしたものである。
ルタミン残基であるか、又はXが水素であるときはグル
タミン残基若しくはピログルタミン酸残基である。本発
明はまた、対応するクローン化遺伝子、これらを含む発
現ベクター及び本発明のインターフェロンの組換えDN
A技術による産生に有用な形質転換体を提供する。本発
明の好ましい組換えがンマインターフェロンは、(文献
中に既に記載されているインターフェロンと比較して)
天然ガンマインターフェロンの真のアミノ酸配列に最も
近似していると思われる。この天然ガンマインターフェ
ロンは本発明者等が天然起源から精製し充分に特性を明
らかにしたものである。
本発明の好ましい態様のインターフェロンは、文献中に
既に記載されているインターフェロンに比べて大幅に改
良された安定性と活性を示す。
既に記載されているインターフェロンに比べて大幅に改
良された安定性と活性を示す。
本発明の前記及び他の目的を達成する様相は、以下の詳
細な説明及び添附の図面の記載から明らかになるであろ
う。
細な説明及び添附の図面の記載から明らかになるであろ
う。
第1図は、本発明の組換えガンマインターフェロンのア
ミノ酸1−143、並びにシグナル配列が先行している
該アミノ酸配列をコードしており且つ非翻訳DNAから
なる5′−及び3゛−フランキング領域を有するDNA
配列を示す。
ミノ酸1−143、並びにシグナル配列が先行している
該アミノ酸配列をコードしており且つ非翻訳DNAから
なる5′−及び3゛−フランキング領域を有するDNA
配列を示す。
第2図は、E、 coliによる本発明の組換えガンマ
インターフェロンの直接合成のための情報をコードして
いるプラスミド及びその調製法を示す模式図である。
インターフェロンの直接合成のための情報をコードして
いるプラスミド及びその調製法を示す模式図である。
第3図は、本発明によって調製されたガンマインターフ
ェロンの優れた安定性を示すデータである。
ェロンの優れた安定性を示すデータである。
[詳細な説明〕
本発明者等は、天然ヒトガンマインターフェロン(即ち
、ヒト末梢血リンパ球のマイトゲン誘発によって産生さ
れて精製されたもの)が、Gr*1等が組換えガンマイ
ンターフェロンと指称し参考文献(6)に示した配列を
有するポリペプチドのN末端CYS−TYR−CYSを
欠くポリペプチドであることを解明した。本発明者等の
研究に係る高度に精製した天然がンマインターフェロン
をトリプシン消化して得られる物質中には、GrB等の
組換えガンマインターフェロン(6)のN末端部にほぼ
相当するアミノ酸組成を有するが、但しCYS−TYR
−CYSを欠く配列が含有されていた。天然ガンマイン
ターフェロンのアミノ酸配列解析をN末端から行なうこ
とはできなかったので、この分子のN末端のα−アミノ
酸は保護されていると推定された。G rs7等(6)
によるとeDNAがコードしている 2つ目のシスティ
ンの次の第1アミノ酸はGLN (グルタミン)である
ので、GLN残基が環化してピログルタミン酸に代りそ
の結果N末端がブロックされていると推測された。ピロ
グルタミン酸アミノペプチダーゼによってピログルタミ
ン酸を除去すると、次にコードされているアミノ酸すな
わちASPのα−アミノ基が遊離し、配列解析が続行で
きるようになり、その結果天然のヒトガンマインターフ
ェロンの最初に報告されたものと同じ結果が得られた。
、ヒト末梢血リンパ球のマイトゲン誘発によって産生さ
れて精製されたもの)が、Gr*1等が組換えガンマイ
ンターフェロンと指称し参考文献(6)に示した配列を
有するポリペプチドのN末端CYS−TYR−CYSを
欠くポリペプチドであることを解明した。本発明者等の
研究に係る高度に精製した天然がンマインターフェロン
をトリプシン消化して得られる物質中には、GrB等の
組換えガンマインターフェロン(6)のN末端部にほぼ
相当するアミノ酸組成を有するが、但しCYS−TYR
−CYSを欠く配列が含有されていた。天然ガンマイン
ターフェロンのアミノ酸配列解析をN末端から行なうこ
とはできなかったので、この分子のN末端のα−アミノ
酸は保護されていると推定された。G rs7等(6)
によるとeDNAがコードしている 2つ目のシスティ
ンの次の第1アミノ酸はGLN (グルタミン)である
ので、GLN残基が環化してピログルタミン酸に代りそ
の結果N末端がブロックされていると推測された。ピロ
グルタミン酸アミノペプチダーゼによってピログルタミ
ン酸を除去すると、次にコードされているアミノ酸すな
わちASPのα−アミノ基が遊離し、配列解析が続行で
きるようになり、その結果天然のヒトガンマインターフ
ェロンの最初に報告されたものと同じ結果が得られた。
CYS−TYR−CYSを含有する組換えヒトガンマイ
ンターフェロンのcDNAを適当に改造することにより
、上記の完全配列(但し、XはMETであり、YはGL
Nである)を有するタンパクをコードしている cDN
Aから新規な組換えガンマインターフェロンをE、 c
oli中で直接発現させることが可能になった。N末端
のメチオニンはmRN Aの翻訳“開始”シグナルAU
Gによってコードされている人為構造であり、例示した
旦。
ンターフェロンのcDNAを適当に改造することにより
、上記の完全配列(但し、XはMETであり、YはGL
Nである)を有するタンパクをコードしている cDN
Aから新規な組換えガンマインターフェロンをE、 c
oli中で直接発現させることが可能になった。N末端
のメチオニンはmRN Aの翻訳“開始”シグナルAU
Gによってコードされている人為構造であり、例示した
旦。
coliによる発現という特定の場合には宿主系により
除去処理されない。他の微生物系、例えばシュードモナ
ス(pseadomon*s)では、メチオニンが除去
され得る。いずれにせよ活性に必要であるとは思われな
い。メチオニンが除去されると、使用する系に応じて、
GLN残基がピログルタミン酸の形態に環化し得るがこ
の場合も活性が損われることはない。
除去処理されない。他の微生物系、例えばシュードモナ
ス(pseadomon*s)では、メチオニンが除去
され得る。いずれにせよ活性に必要であるとは思われな
い。メチオニンが除去されると、使用する系に応じて、
GLN残基がピログルタミン酸の形態に環化し得るがこ
の場合も活性が損われることはない。
本発明者等の研究によると、GrB等により以前に報告
されたCYS−TYR−CYSを含有する組換えがンマ
インターフェロンは、ヒト血清アルブミンを用いて処方
することで安定化し得た。
されたCYS−TYR−CYSを含有する組換えがンマ
インターフェロンは、ヒト血清アルブミンを用いて処方
することで安定化し得た。
しかしながら、最終凍結乾燥産物中に血清アルブミンが
存在する場合は、最終産物に対してではなく凍結乾燥に
先立って成る種の品質調整処理を行なう必要がある。一
方、本発明の新規な組換えガンマインターフェロンの場
合には、凍結乾燥状態の物質は、血清アルブミンを含有
しなくとも充分に安定であることが判明した。しかしな
がら、所望であれば、本発明のガンマインターフェロン
を薬剤上許容される程度のヒト血清アルブミンと調合し
てもよい。
存在する場合は、最終産物に対してではなく凍結乾燥に
先立って成る種の品質調整処理を行なう必要がある。一
方、本発明の新規な組換えガンマインターフェロンの場
合には、凍結乾燥状態の物質は、血清アルブミンを含有
しなくとも充分に安定であることが判明した。しかしな
がら、所望であれば、本発明のガンマインターフェロン
を薬剤上許容される程度のヒト血清アルブミンと調合し
てもよい。
更に、本発明のCYS−TYR−CYSを欠く組換えヒ
トガンマインターフェロンは、細胞変性阻害試験に於い
て、抗ウィルス剤としてCYSTYR−CYS含有アナ
ログよりも顕著な活性を示すように思われる。活性は通
常、マイクロタイタープレート上でヒト肺癌由来の細胞
株A349に対する脳心筋炎ウィルスの細胞変性効果(
CP E)の阻害によりアッセイされる(12)。
トガンマインターフェロンは、細胞変性阻害試験に於い
て、抗ウィルス剤としてCYSTYR−CYS含有アナ
ログよりも顕著な活性を示すように思われる。活性は通
常、マイクロタイタープレート上でヒト肺癌由来の細胞
株A349に対する脳心筋炎ウィルスの細胞変性効果(
CP E)の阻害によりアッセイされる(12)。
本発明の組換えガンマインターフェロンは、前記完全配
列のアミノ酸1〜約126を含有するインターフェロン
を全て包含する。完全配列に対してカルボキシ末端部を
種々切り取ったガンマインターフェロンは、アミノ酸1
〜約126が存在する限り、成る場合に多少レベルが低
下するとしても、依然としてヒトガンマインターフェロ
ンに特有の性質を示す。実際、 (7)に報告されたC
YSTYR−CYS含有アナログを用いた実験で、アミ
ノ酸132(本発明の番号付けによる)に続くアミノ酸
配列を、活性を損失することなく他の配列(exlzn
eous seq*eaees)で置換された例が示さ
れた(例えば、 (8)参照)。本発明者等の予備的デ
ータは、アミノ酸lから121i (THR)付近ま
での配列は比較的強固に結合して活性と関連すると思わ
れる三次元立体配置をとっているが、完全配列の残りの
アミノ酸は比較的構造上の制限が緩くタンパク分解に比
較的敏感であるという仮説を支持している。制限条件下
でのトリプシン消化によって、アミノ酸126より下流
の配列は種々の部分が除去されるがこれより上流は除去
されない。
列のアミノ酸1〜約126を含有するインターフェロン
を全て包含する。完全配列に対してカルボキシ末端部を
種々切り取ったガンマインターフェロンは、アミノ酸1
〜約126が存在する限り、成る場合に多少レベルが低
下するとしても、依然としてヒトガンマインターフェロ
ンに特有の性質を示す。実際、 (7)に報告されたC
YSTYR−CYS含有アナログを用いた実験で、アミ
ノ酸132(本発明の番号付けによる)に続くアミノ酸
配列を、活性を損失することなく他の配列(exlzn
eous seq*eaees)で置換された例が示さ
れた(例えば、 (8)参照)。本発明者等の予備的デ
ータは、アミノ酸lから121i (THR)付近ま
での配列は比較的強固に結合して活性と関連すると思わ
れる三次元立体配置をとっているが、完全配列の残りの
アミノ酸は比較的構造上の制限が緩くタンパク分解に比
較的敏感であるという仮説を支持している。制限条件下
でのトリプシン消化によって、アミノ酸126より下流
の配列は種々の部分が除去されるがこれより上流は除去
されない。
本発明者等が研究した天然ガンマインターフェロンは、
アミノ酸 127. 128. 129. 130.
132及び!34にわたる種々の分子を含む。本発明者
等は、メチオニンに続くアミノ酸配列が(METの後の
)アミノ酸1〜約139及び1〜約131の種々のもの
から成る完全に活性な組換えガンマインターフェロンを
発見した。後者のアミノ酸l〜約131は、組換えガン
マインターフェロンをトリプシンで制限消化しその後配
列確認することによって得られた。(METより先の)
アミノ酸約128及び129に末端を有する同様のトリ
プシン消化断片は、実質的に低下しているとはいっても
活性を保持していた。一方、126番目のスレオニンと
それに続くアミノ酸を消化して除去した(N末端メチオ
ニンに加えて)125個のアミノ酸を有する物質は、C
PE阻害アッセイに於いて未消化物の活性の1%未満の
活性しか示さなかった。
アミノ酸 127. 128. 129. 130.
132及び!34にわたる種々の分子を含む。本発明者
等は、メチオニンに続くアミノ酸配列が(METの後の
)アミノ酸1〜約139及び1〜約131の種々のもの
から成る完全に活性な組換えガンマインターフェロンを
発見した。後者のアミノ酸l〜約131は、組換えガン
マインターフェロンをトリプシンで制限消化しその後配
列確認することによって得られた。(METより先の)
アミノ酸約128及び129に末端を有する同様のトリ
プシン消化断片は、実質的に低下しているとはいっても
活性を保持していた。一方、126番目のスレオニンと
それに続くアミノ酸を消化して除去した(N末端メチオ
ニンに加えて)125個のアミノ酸を有する物質は、C
PE阻害アッセイに於いて未消化物の活性の1%未満の
活性しか示さなかった。
組換えによって誘導されたガンマインターフェロンは、
メチニオンが細胞内では開裂されないような宿主内で産
生された場合に先頭メチオニンを有するのに加えて、1
39個のアミノ酸(第■図の番号付による)を有するも
のが多量で143個のアミノ酸を有するものが少量であ
ると考えられる。
メチニオンが細胞内では開裂されないような宿主内で産
生された場合に先頭メチオニンを有するのに加えて、1
39個のアミノ酸(第■図の番号付による)を有するも
のが多量で143個のアミノ酸を有するものが少量であ
ると考えられる。
この2種の組成はアミノ酸H9個の種が約95%より多
く、最も好ましくは°約97%より多い。制限条件下の
トリプシン消化はまた、アミノ酸12G付近から下流の
種々の部分の配列を除去する。本発明者等の研究に係る
組換えガンマインターフェロンのこのような制限トリプ
シン消化物は、アミノ酸125(先頭メチオニンを含め
ると126)、 129゜131及び134にわたる
種々の種を含む。これらの種は、アミノ酸12S付近か
ら 129付近に伸びる場合、実質的に低下するとして
も活性を保持している。少なくともほぼ129個のアミ
ノ酸、特に少なくとも 131個のアミノ酸を有する種
、すなわち約129〜143個のアミノ酸を有する種が
本質的、又機能的に完全な活性を保持している。
く、最も好ましくは°約97%より多い。制限条件下の
トリプシン消化はまた、アミノ酸12G付近から下流の
種々の部分の配列を除去する。本発明者等の研究に係る
組換えガンマインターフェロンのこのような制限トリプ
シン消化物は、アミノ酸125(先頭メチオニンを含め
ると126)、 129゜131及び134にわたる
種々の種を含む。これらの種は、アミノ酸12S付近か
ら 129付近に伸びる場合、実質的に低下するとして
も活性を保持している。少なくともほぼ129個のアミ
ノ酸、特に少なくとも 131個のアミノ酸を有する種
、すなわち約129〜143個のアミノ酸を有する種が
本質的、又機能的に完全な活性を保持している。
以上のことから明らかなように、本発明は、上記の完全
配列を有する組換えガンマインターフェロンだけでなく
、アミノ酸143を欠くか又はZ→アミノ酸 143の
アミノ酸配列(但し、Zはアミノ酸 127. 128
. 129. 130. N1. H2,133゜
134、 135. 136,137,H8,139
,14fl。
配列を有する組換えガンマインターフェロンだけでなく
、アミノ酸143を欠くか又はZ→アミノ酸 143の
アミノ酸配列(但し、Zはアミノ酸 127. 128
. 129. 130. N1. H2,133゜
134、 135. 136,137,H8,139
,14fl。
141又は142である)を欠く種々の組換えがンマイ
ンターフェロン及びこれらの混合物をも含む。
ンターフェロン及びこれらの混合物をも含む。
本発明の組換えがンマインターフェロンをコードしてい
る二本鎖DNA配列が、上記の完全配列をコードしてい
るDNA配列だけでなく、上記した種々のカルボキシ末
端を切り取ったアナログのみをコードしている配列をも
含むことも同様に明らかであろう。この種々のカルボキ
シ末端を切断した場合には次に続くコドンが翻訳終了シ
グナルをコードする。
る二本鎖DNA配列が、上記の完全配列をコードしてい
るDNA配列だけでなく、上記した種々のカルボキシ末
端を切り取ったアナログのみをコードしている配列をも
含むことも同様に明らかであろう。この種々のカルボキ
シ末端を切断した場合には次に続くコドンが翻訳終了シ
グナルをコードする。
本明細書中、1組換えガンマインターフェロンjとは、
組換えDNA技術によって得られる複製可能な発現ベヒ
クルから形質転換細胞中で発現されるポリペプチド(こ
れを産生ずる細胞によってグリコジル化されているかい
ないかにかかわらず)を意味する。本発明のポリペプチ
ドは、天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性質即
ち、程度の差はあれ多少ともヒトに於ける抗ウィルス活
性及び抗細胞増殖活性並びにpH2に於ける不安定性を
示す。
組換えDNA技術によって得られる複製可能な発現ベヒ
クルから形質転換細胞中で発現されるポリペプチド(こ
れを産生ずる細胞によってグリコジル化されているかい
ないかにかかわらず)を意味する。本発明のポリペプチ
ドは、天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性質即
ち、程度の差はあれ多少ともヒトに於ける抗ウィルス活
性及び抗細胞増殖活性並びにpH2に於ける不安定性を
示す。
本明細書に記載した組換えガンマインターフェロンは、
本発明の目的として少なくとも l〜約126のアミノ
酸を各々有する前記の如きポリペプチドの2個の組合せ
(各ポリペプチドは同数又は異なる数のアミノ酸を有し
得る)として定義される「二量体」を形成すると考えら
れる。化学結合形成機構に関する性質は充分には解明さ
れていないが、共有結合以外の結合であると思われる。
本発明の目的として少なくとも l〜約126のアミノ
酸を各々有する前記の如きポリペプチドの2個の組合せ
(各ポリペプチドは同数又は異なる数のアミノ酸を有し
得る)として定義される「二量体」を形成すると考えら
れる。化学結合形成機構に関する性質は充分には解明さ
れていないが、共有結合以外の結合であると思われる。
二量体を生ずる結合は自然に起こるようであり、本明細
書に記載する系では不可避であると思われる。
書に記載する系では不可避であると思われる。
従って、本発明の組換えガンマインターフェロンを投与
するときには、通常二量体の形態であろう。
するときには、通常二量体の形態であろう。
更に、別に特徴づけられた組換えガンマインターフェロ
ンに関する文献(it、 9)の開示と同様に、本明細
書中に開示した組換えガンマインターフェロン中、アミ
ノ酸126付近の上流若しくは下流又はC末端部分で、
保有するインターフェロン活性を損うことがなければ、
アミノ酸の置換又は付加、特に 1個のアミノ酸の置換
及び複数のアミノ酸の付加又は置換が可能であると理解
すべきである。
ンに関する文献(it、 9)の開示と同様に、本明細
書中に開示した組換えガンマインターフェロン中、アミ
ノ酸126付近の上流若しくは下流又はC末端部分で、
保有するインターフェロン活性を損うことがなければ、
アミノ酸の置換又は付加、特に 1個のアミノ酸の置換
及び複数のアミノ酸の付加又は置換が可能であると理解
すべきである。
本発明の範囲を超えることなく、前記の如き置換もしく
は付加をなし得ることは当業者には明らかであると思わ
れる。さらに本発明の組換えガンマインターフェロンは
完全配列(第1図参照)の改変槽及び対立変異種であっ
て完全配列のものと同等、あるいはそれ以上の生物学的
活性を持つ種を包含する。
は付加をなし得ることは当業者には明らかであると思わ
れる。さらに本発明の組換えガンマインターフェロンは
完全配列(第1図参照)の改変槽及び対立変異種であっ
て完全配列のものと同等、あるいはそれ以上の生物学的
活性を持つ種を包含する。
本発明の特徴として、精製した組換えガンマインターフ
ェロンは実質的にヒト由来の他のタンパクを含まないで
あろうし、この特徴によって、今まで入手可能であった
天然のヒトガンマインターフェロン組成物とは区別され
るであろう。
ェロンは実質的にヒト由来の他のタンパクを含まないで
あろうし、この特徴によって、今まで入手可能であった
天然のヒトガンマインターフェロン組成物とは区別され
るであろう。
本発明は、(処方前に)約95%より高純度、好ましく
は約98%より高純度の組換えガンマインターフェロン
組成物を包含し、このため、該組成物は今までに入手可
能であった天然のガンマインターフェロンと区別される
。
は約98%より高純度の組換えガンマインターフェロン
組成物を包含し、このため、該組成物は今までに入手可
能であった天然のガンマインターフェロンと区別される
。
同様に、N末端アミノ酸残基がメチオニンである本発明
の具体例の 1つの組換えガンマインターフェロンはヒ
トの体内で産生されるガンマインタ−フエロンと区別さ
れ、CYS−TYR−CYSの欠失以外にも同様な理由
で、G ri7等 (6)が報告した配列を有するイン
ターフェロンとは区別されるであろう。
の具体例の 1つの組換えガンマインターフェロンはヒ
トの体内で産生されるガンマインタ−フエロンと区別さ
れ、CYS−TYR−CYSの欠失以外にも同様な理由
で、G ri7等 (6)が報告した配列を有するイン
ターフェロンとは区別されるであろう。
本明細書中、複製可能な発現ベヒクルとは、二本鎖DN
A、好ましくはプラスミドを意味し、これは、複製開始
領域、プロモーター又はプロモーター−オペレーター、
リポソーム結合部位をコードする配列、翻訳開始シグナ
ルコドン及びこれらと適切な解読相にあり所望の組換え
ガンマインターフェロンをコードしている遺伝子、更に
これに続く翻訳終了コドンから成る。現在では、組換え
DNA技術の一般的技術及び用語は当業者には充分理解
されており、いずれにせよ当業者は、本発明の全ての具
体例及び合法的に均等であると認識される例の実施に関
するバックグラウンド情報として必要な変更を加えて(
11)を参照できるであろう。
A、好ましくはプラスミドを意味し、これは、複製開始
領域、プロモーター又はプロモーター−オペレーター、
リポソーム結合部位をコードする配列、翻訳開始シグナ
ルコドン及びこれらと適切な解読相にあり所望の組換え
ガンマインターフェロンをコードしている遺伝子、更に
これに続く翻訳終了コドンから成る。現在では、組換え
DNA技術の一般的技術及び用語は当業者には充分理解
されており、いずれにせよ当業者は、本発明の全ての具
体例及び合法的に均等であると認識される例の実施に関
するバックグラウンド情報として必要な変更を加えて(
11)を参照できるであろう。
実施例
A、クローニング
参考文献(6)及び特開昭58−90514号公報の記
載に従い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメツセンジ
ャーRNAを用いて、ガンマインターフェロンcDNA
配列を有する組換えDNAクローンを調製した。クロー
ンp67のDNA配列を第1図に示す。5′−非翻訳領
域に続いて、23個のアミノ酸から成る前駆体即ちシグ
ナルペプチドをコードしている69個のヌクレオチド、
143個のアミノ酸から成る成熟インターフェロンポリ
ペプチドをコードしている 429個のヌクレオチド及
び3′−非翻訳配列を形成する 587個のヌクレオチ
ドがある。
載に従い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメツセンジ
ャーRNAを用いて、ガンマインターフェロンcDNA
配列を有する組換えDNAクローンを調製した。クロー
ンp67のDNA配列を第1図に示す。5′−非翻訳領
域に続いて、23個のアミノ酸から成る前駆体即ちシグ
ナルペプチドをコードしている69個のヌクレオチド、
143個のアミノ酸から成る成熟インターフェロンポリ
ペプチドをコードしている 429個のヌクレオチド及
び3′−非翻訳配列を形成する 587個のヌクレオチ
ドがある。
B1発現
1、 E、 coliによる例
E、 coli中で組換えIFN−γを高レベルで発現
させるためには、シグナルペプチドのATG(アミノ酸
Sl)ではなく、成熟ポリペプチドのグルタミンコドン
(アミノ酸l)の直前のATGコドンからタンパク合成
を開始すべきである(第1図参照) 。E、coli中
で直接に967のeDNAインサートを発現させるため
にとった手順の概略を第2図に示す。GrH等 (6)
のeDNAインサートをE、 coli中で発現するた
めに使用したアプローチと同様のアプローチをとった。
させるためには、シグナルペプチドのATG(アミノ酸
Sl)ではなく、成熟ポリペプチドのグルタミンコドン
(アミノ酸l)の直前のATGコドンからタンパク合成
を開始すべきである(第1図参照) 。E、coli中
で直接に967のeDNAインサートを発現させるため
にとった手順の概略を第2図に示す。GrH等 (6)
のeDNAインサートをE、 coli中で発現するた
めに使用したアプローチと同様のアプローチをとった。
シグナルペプチドコード領域を除去するために、推定成
熟コード配列のコドン2に位置するAマ1■制限部位を
用いた。2種の合成デオキシオリゴヌクレオチドを、ア
ミノ酸1及び2のコドンを再生し、ATG翻訳開始コド
ンを組み込み且つXbtl粘着性末端を作成するように
デザインした。これらの 2種のオリゴマーを、 cD
NAインサートの残りに結合して、 144個のアミノ
酸から成るポリペプチドをコードし且つ両端にXbll
及びPt11部位を有する1063塩基対の合成−天然
ハイブリッド遺伝子を組み立てた。この遺伝子をプラス
ミドpLe I FA25 (10)のXbsI及び
Pt11部位の間に挿入して、発現プラスミドpγ−C
YC5を作製した。このプラス−ミドでE、 col
i W3110株(F 、 λ 、原栄養株pr
olropNc) (A T CCN o、 273
25)を形質転換して、宿主−ベクター系E、 eol
i W311(1/ P7−CYC5を得た。
熟コード配列のコドン2に位置するAマ1■制限部位を
用いた。2種の合成デオキシオリゴヌクレオチドを、ア
ミノ酸1及び2のコドンを再生し、ATG翻訳開始コド
ンを組み込み且つXbtl粘着性末端を作成するように
デザインした。これらの 2種のオリゴマーを、 cD
NAインサートの残りに結合して、 144個のアミノ
酸から成るポリペプチドをコードし且つ両端にXbll
及びPt11部位を有する1063塩基対の合成−天然
ハイブリッド遺伝子を組み立てた。この遺伝子をプラス
ミドpLe I FA25 (10)のXbsI及び
Pt11部位の間に挿入して、発現プラスミドpγ−C
YC5を作製した。このプラス−ミドでE、 col
i W3110株(F 、 λ 、原栄養株pr
olropNc) (A T CCN o、 273
25)を形質転換して、宿主−ベクター系E、 eol
i W311(1/ P7−CYC5を得た。
2、培養細胞の例
第1図に示したまうなN末端アミノ酸を含む成熟がンマ
インターフェロン遺伝子からの産物であることを確認す
るために、第1図に示したようなシグナルペプチド及び
ガンマインターフェロンの双方をコードしている遺伝子
を、放射活性標識システィン及びメチオニンの存在下で
CO3−7細胞(16)中で発現させた( E 、 c
oliによる発現の場合と異り、ここに例示したような
哺乳動物細胞系の発現産物はN末端メチオニンを欠いて
いる)。
インターフェロン遺伝子からの産物であることを確認す
るために、第1図に示したようなシグナルペプチド及び
ガンマインターフェロンの双方をコードしている遺伝子
を、放射活性標識システィン及びメチオニンの存在下で
CO3−7細胞(16)中で発現させた( E 、 c
oliによる発現の場合と異り、ここに例示したような
哺乳動物細胞系の発現産物はN末端メチオニンを欠いて
いる)。
60−ペトリ皿中のC09−7細胞の集密単層(con
flaeal monolBet)に、改良DEAE
−デキストラン法を使用してDNAをトランスフェクト
したものを2組調製した。DNA添加の3日後、培地を
除去した。各プレートに、100μC1535−メチオ
ニン又は535−システィンを添加したDMEM2ml
を加えた。放射活性標識アミノ酸の存在下で16時間イ
ンキュベートした後、培地を除去し、抗ガンマインター
フェロンモノクローナル抗体又は抗HBsAgモノクロ
ーナル抗体を第1抗体としウサギ抗マウスIgG抗体(
C1ppcllInc、)を第2抗体として 5[10
dの免疫沈降を実施した。前記抗体との反応及びその後
のスタフィロコッカス(S l*phlycocc++
s) A細胞(Cglbiochcmlへの結合は、P
、 Bcr*ga等によっで記述されている(18)
。サンプルをSDSメルカプトエタノール中に再懸濁し
、10%5DS−PAGEゲル上で電気泳動にかけた。
flaeal monolBet)に、改良DEAE
−デキストラン法を使用してDNAをトランスフェクト
したものを2組調製した。DNA添加の3日後、培地を
除去した。各プレートに、100μC1535−メチオ
ニン又は535−システィンを添加したDMEM2ml
を加えた。放射活性標識アミノ酸の存在下で16時間イ
ンキュベートした後、培地を除去し、抗ガンマインター
フェロンモノクローナル抗体又は抗HBsAgモノクロ
ーナル抗体を第1抗体としウサギ抗マウスIgG抗体(
C1ppcllInc、)を第2抗体として 5[10
dの免疫沈降を実施した。前記抗体との反応及びその後
のスタフィロコッカス(S l*phlycocc++
s) A細胞(Cglbiochcmlへの結合は、P
、 Bcr*ga等によっで記述されている(18)
。サンプルをSDSメルカプトエタノール中に再懸濁し
、10%5DS−PAGEゲル上で電気泳動にかけた。
ゲルをエタノール中7%酢酸で固定し、E nh8nc
c (N evE Bltnd N mclest)
螢光溶液に浸し、乾燥し、K odrk A R5フ
イルム及び増感スクリーン(D Ipen+>を使用し
て2週間露光させた。
c (N evE Bltnd N mclest)
螢光溶液に浸し、乾燥し、K odrk A R5フ
イルム及び増感スクリーン(D Ipen+>を使用し
て2週間露光させた。
本研究に使用したプラスミドはpSVγ69(111、
pDL RI (19) (B型肝炎ウィルス表面抗
原発現ベクター、 pSvγ69の前駆体)及び11D
LR17Stw(psVγG9(11)ノ830bp
5ea3A断片を含有するポリシストロンプラスミド
であり、pDL RTのEcoR[部位に挿入された
ガンマインターフェロンをコードしている全配列を含む
もの)であった。後者のプラスミドはガンマインターフ
ェロン及び)iBsAg双方のコード領域を含む転写産
物を産生ずる。
pDL RI (19) (B型肝炎ウィルス表面抗
原発現ベクター、 pSvγ69の前駆体)及び11D
LR17Stw(psVγG9(11)ノ830bp
5ea3A断片を含有するポリシストロンプラスミド
であり、pDL RTのEcoR[部位に挿入された
ガンマインターフェロンをコードしている全配列を含む
もの)であった。後者のプラスミドはガンマインターフ
ェロン及び)iBsAg双方のコード領域を含む転写産
物を産生ずる。
抗ガンマインターフェロン抗体(A)又は抗HBsAg
抗体(B)と反応する835〜システイン及び535−
メチオニン標識タンパクを比較すると、 pDL R
1−γ 5I11でトランスフェクトし535−システ
ィンで標識した細胞では、抗ガンマインターフェロン抗
体を使用して特異的に免疫沈降する物質は、グリコジル
化物(M W 29.000)の位置に移動するものも
モノグリコジル化物(MW 18.000)の位置に移
動するものもないのに対し、これとは対照的に、535
−メチオニン標識細胞ではガンマインターフェロンの免
疫沈降が生じた。
抗体(B)と反応する835〜システイン及び535−
メチオニン標識タンパクを比較すると、 pDL R
1−γ 5I11でトランスフェクトし535−システ
ィンで標識した細胞では、抗ガンマインターフェロン抗
体を使用して特異的に免疫沈降する物質は、グリコジル
化物(M W 29.000)の位置に移動するものも
モノグリコジル化物(MW 18.000)の位置に移
動するものもないのに対し、これとは対照的に、535
−メチオニン標識細胞ではガンマインターフェロンの免
疫沈降が生じた。
C0発酵生産
旦、 coい−W3110/ pγ−cycsを用いる
組換えヒトインターフェロン−ガンマ(+IFN−γ)
の産生は、容量IO乃至+0111)lの範囲のバッチ
で実施する。発酵後、インターフェロンを含有するE、
coli細胞をブロスから回収し、rlFN−γを単
離精製する。以下に発酵及び細胞回収方法を記載する。
組換えヒトインターフェロン−ガンマ(+IFN−γ)
の産生は、容量IO乃至+0111)lの範囲のバッチ
で実施する。発酵後、インターフェロンを含有するE、
coli細胞をブロスから回収し、rlFN−γを単
離精製する。以下に発酵及び細胞回収方法を記載する。
l)ストックカルチャーの調製及び維持次の組成;
バクトドリブトン Log/ L酵母抽出
物 5t/L塩化ナトリウム
5〜1llet/ Lを有する無菌培地150〜
500 mLを含有する無菌のバッフル板付培養フラ
スコ中で、ストックカルチャーを調製する。
物 5t/L塩化ナトリウム
5〜1llet/ Lを有する無菌培地150〜
500 mLを含有する無菌のバッフル板付培養フラ
スコ中で、ストックカルチャーを調製する。
次に、E、coli WHIO/ p7−CYC5の
一次培養物を培地に接種する。
一次培養物を培地に接種する。
次いで、550fi−に於ける吸光度が約1.0になる
まで、接種したフラスコを振盪器上25〜37℃でイン
キュベートする。30%(v/v)のジメチルスルホキ
サイド約5G%(V/V)をブロスに添加する。直ちに
lsLのアリコートを無菌バイアルに分与し、ふたを閉
める。バイアルは一60℃以下で保存する。各々の発酵
は、接種用複製ストックカルチャーを用いて開始する。
まで、接種したフラスコを振盪器上25〜37℃でイン
キュベートする。30%(v/v)のジメチルスルホキ
サイド約5G%(V/V)をブロスに添加する。直ちに
lsLのアリコートを無菌バイアルに分与し、ふたを閉
める。バイアルは一60℃以下で保存する。各々の発酵
は、接種用複製ストックカルチャーを用いて開始する。
2)接種物の調製
接種物を振盪フラスコ又は小型ファーメンタ−内で前記
の培地(LBプロス)を用いて調製する。
の培地(LBプロス)を用いて調製する。
約37℃で約8時間インキュベートした後、接種物を7
アーメンターに移す。接種物の容量は、発酵容量の2乃
至10%である。
アーメンターに移す。接種物の容量は、発酵容量の2乃
至10%である。
3)発酵
組換えインターフェロン−ガンマの産生は、約10乃至
100[11の作用容積を有するファーメンタ−内で行
なう。発酵培地は、11当り次の組成を有する。
100[11の作用容積を有するファーメンタ−内で行
なう。発酵培地は、11当り次の組成を有する。
グルコース(ネ) 50 −100g硫
酸アンモニウム 4.0−8、Of−塩基性
リン酸カリウム 3.0 − s、og5.0 O15 0,5 0,5 0、GD3 0.001 G、00+− ウムニ水塩 0.001 G、001 0.001 0.001 0.0 0 001 0.1 2.0 二塩基性リン酸カリウム 硫酸マグネンウム七水塩 クエン酸ナトリウムニ水塩 U CON L B −625 塩化第二鉄六水塩 硫酸亜鉛上水塩 塩化コバルト六水塩 モリブデン酸ナトリ 8.0g 5.1g 2.0g 2、(leL O,15g o、+sg O,oosg 硫酸第二銅五本塩 ホウ酸 硫酸マンガン−水塩 塩酸 チアミン−HCl テトラサイクリン−HCI L−トリプトファン(*) 酵母抽出物 0.005t 0.005g 0.005g 0.005g 1、Oa+L O,Ig 0.01g G、5゜ 8.0g 3−β インドールアクリル酸0.02− 0.10g(*)グ
ルコース及びトリプトファンは一部を最初にファーメン
タ−に入れ、残部は発酵中に供給する。
酸アンモニウム 4.0−8、Of−塩基性
リン酸カリウム 3.0 − s、og5.0 O15 0,5 0,5 0、GD3 0.001 G、00+− ウムニ水塩 0.001 G、001 0.001 0.001 0.0 0 001 0.1 2.0 二塩基性リン酸カリウム 硫酸マグネンウム七水塩 クエン酸ナトリウムニ水塩 U CON L B −625 塩化第二鉄六水塩 硫酸亜鉛上水塩 塩化コバルト六水塩 モリブデン酸ナトリ 8.0g 5.1g 2.0g 2、(leL O,15g o、+sg O,oosg 硫酸第二銅五本塩 ホウ酸 硫酸マンガン−水塩 塩酸 チアミン−HCl テトラサイクリン−HCI L−トリプトファン(*) 酵母抽出物 0.005t 0.005g 0.005g 0.005g 1、Oa+L O,Ig 0.01g G、5゜ 8.0g 3−β インドールアクリル酸0.02− 0.10g(*)グ
ルコース及びトリプトファンは一部を最初にファーメン
タ−に入れ、残部は発酵中に供給する。
培地中の成分は、発酵に使用する前に、熱処理又は濾過
により殺菌する。
により殺菌する。
発酵は25〜40℃で行う。他の操作条件は次の通りで
ある; 攪拌(+pm) 100〜1000 通気(ママ00.5〜1.5 (必要なときには酸素を補充) 9136,5〜 7.5 (水酸化アンモニウムの添加により調節)4)精 製 l)組換えガンマインターフェロンの抽出塩及びp13
6乃至9、好ましくは約9の適当なせる。ガラリン(G
!t+lin ) ミルの如き高圧コロイドミル中で細
胞懸濁液をホモゲナイズして組換えガンマインターフェ
ロンを抽出する。充分なポリエチレンイミンを前記溶液
に添加して、0.1乃至1%(W/V)の溶液に調製す
る。上溝にガンマインターフェロンが含まれている。
ある; 攪拌(+pm) 100〜1000 通気(ママ00.5〜1.5 (必要なときには酸素を補充) 9136,5〜 7.5 (水酸化アンモニウムの添加により調節)4)精 製 l)組換えガンマインターフェロンの抽出塩及びp13
6乃至9、好ましくは約9の適当なせる。ガラリン(G
!t+lin ) ミルの如き高圧コロイドミル中で細
胞懸濁液をホモゲナイズして組換えガンマインターフェ
ロンを抽出する。充分なポリエチレンイミンを前記溶液
に添加して、0.1乃至1%(W/V)の溶液に調製す
る。上溝にガンマインターフェロンが含まれている。
p136乃至9の範囲の適当な塩溶液で洗浄して不純物
を除去したシリカをベースとする吸着剤に上記(1)の
上溝を吸着させる。0.5乃至1.0Mの塩化テトラメ
チルアンモニウムを含有する溶液を用いて組換えがンマ
インターフェロンを溶出する。
を除去したシリカをベースとする吸着剤に上記(1)の
上溝を吸着させる。0.5乃至1.0Mの塩化テトラメ
チルアンモニウムを含有する溶液を用いて組換えがンマ
インターフェロンを溶出する。
本工程の全操作はp137乃至9で行なう。
緩衝液を含有する培地中にE、 coli細胞を懸濁さ
C)アニオン交換クロマトグラフィーによる組の全操作
は、p137乃至9で実施する。
C)アニオン交換クロマトグラフィーによる組の全操作
は、p137乃至9で実施する。
上記(bl の溶出液を透析し、アニオン交換クロマト
グラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除
去する。増大する塩勾配で組換えガンマインターフェロ
ンを溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交換
樹脂には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエチ
ルセルロースがある。全操作はp137乃至9で行なう
。
グラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除
去する。増大する塩勾配で組換えガンマインターフェロ
ンを溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交換
樹脂には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエチ
ルセルロースがある。全操作はp137乃至9で行なう
。
上記(d)の溶出物を透析し、アニオン交換りaマドグ
ラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去
する。アニオン交換媒体から塩濃度を増大する勾配で組
換えガンマインターフェロンを溶出する。典型的なアニ
オン交換クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチル
セルロース及びスルホエチルセルロースである。
ラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去
する。アニオン交換媒体から塩濃度を増大する勾配で組
換えガンマインターフェロンを溶出する。典型的なアニ
オン交換クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチル
セルロース及びスルホエチルセルロースである。
本工程の全操作はp137乃至9で実施する。
分精製
上記(cl の溶出物をリン酸カルシウム媒体に吸着さ
せ、次いで洗浄して不純物を除去する。
せ、次いで洗浄して不純物を除去する。
リン酸塩濃度勾配中で塩濃度を増加させて組換えがンマ
インターフェロンを溶出する。本工程分、精製 上記(e)の溶出物をゲルパーミェーション媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。
インターフェロンを溶出する。本工程分、精製 上記(e)の溶出物をゲルパーミェーション媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。
組換えガンマインターフェロンを含有する適当な画分を
プールして、精製バルクを得る。本工程の全操作はp)
I 7乃至9で行なう。
プールして、精製バルクを得る。本工程の全操作はp)
I 7乃至9で行なう。
g) C末端アミノ酸配列
C末端配列を決定するために、サンプルを70%蟻酸中
に透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをA
lis!U Hr*5phere C8逆相HPL
Cカラムで分離した。ピークを集め、アミノ酸及びその
配列解析を行った。検知されたC末端ペプチドは、−L
EU−PI(E−ARG−GLY−ARG (残基[3
5〜I39、第1図)であり、ある場合には他のペプチ
ドが追加されており、その配列は−LED−PHE−A
RG−GLY−ARG−ARG−ALA−3ER−GL
N (残基135〜I43、第1図)であった。
に透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをA
lis!U Hr*5phere C8逆相HPL
Cカラムで分離した。ピークを集め、アミノ酸及びその
配列解析を行った。検知されたC末端ペプチドは、−L
EU−PI(E−ARG−GLY−ARG (残基[3
5〜I39、第1図)であり、ある場合には他のペプチ
ドが追加されており、その配列は−LED−PHE−A
RG−GLY−ARG−ARG−ALA−3ER−GL
N (残基135〜I43、第1図)であった。
これらの2種のペプチドの割合を決定するために、(ア
ミノ酸分析により)既知の量を逆相HPLCカラムにか
け、それぞれのピークの高さを測定した。3回の産生に
おいて長鎖のペプチド(135〜143.第1図)の含
有量はそれぞれ約2%未満であり、残りは5量体(アミ
ノ酸5個のもの)であった。このデータは、旦、江見に
よる H9個のアミノ酸含有及び143個のアミノ酸含
有のガンマインターフェロン(いずれの場合も存在する
N末端メチオニンを含まない)の混合物の産生と一致す
るものであり、それぞれの相対比率は約98=2%であ
る。
ミノ酸分析により)既知の量を逆相HPLCカラムにか
け、それぞれのピークの高さを測定した。3回の産生に
おいて長鎖のペプチド(135〜143.第1図)の含
有量はそれぞれ約2%未満であり、残りは5量体(アミ
ノ酸5個のもの)であった。このデータは、旦、江見に
よる H9個のアミノ酸含有及び143個のアミノ酸含
有のガンマインターフェロン(いずれの場合も存在する
N末端メチオニンを含まない)の混合物の産生と一致す
るものであり、それぞれの相対比率は約98=2%であ
る。
5)製剤化
前記工程に従い製造した組換えガンマインターフェロン
を、次表の好ましい非経口投与用の製剤にする。
を、次表の好ましい非経口投与用の製剤にする。
バイアル1本当りの量
組換えヒトインターフェロン−γ
マンニトール
コハク酸二ナトリウム六水塩
グリシン
塩化ナトリウム
ポリソルベート20
コハク酸
(1〉 注射用にはバイアルを2.5Iiの無菌水で
再構成する。
再構成する。
(〕 注射用にはバイアルを2.0mの無菌水で再構成
する。
する。
本発明のインターフェロンは、医学的に適切な投与量範
囲、例えば体表面積1M2当り 1.G−gで使用し得
る。
囲、例えば体表面積1M2当り 1.G−gで使用し得
る。
カルボキシ末端の違った種々のガンマインターフェロン
の活性を決定するために、上記のE。
の活性を決定するために、上記のE。
coliの例に記述したように調製したガンマインター
フェロンを種々の程度にトリプシン消化し、前述のA3
49細胞を用いるCPEアッセイによって試験した。
フェロンを種々の程度にトリプシン消化し、前述のA3
49細胞を用いるCPEアッセイによって試験した。
前述のように調製した組換えガンマインター7エ0ン(
r−Hw IFN−7)の試料(6,5*)をS ep
hrdex G −25モレキユラーシープ小カラム(
P D −Ill、 P hsrsIc目)により
PH8,5の0.10M重炭酸アンモニウム緩衝液中に
脱塩し、最終タンパク濃度2.1■/mlとした。希釈
トリプシン溶液(WorlbiBloe T P CK
トリプシン、 0.001M HCI中1中略
0略/l、 16m)をt−HulFNγ溶液の 1.
9nl (4,0■)に加え、混合して室温でインキュ
ベートした(トリプシン;タンパク質= l : 2
5.000)。インキュベート混合物から、1時間後、
3.5時間後、5.75時間後、8時間後及び10.2
5時間後にそれぞれ試料を取り出した。8時間臼に15
X(150ng)の希釈トリプシン溶液を再度加えて1
0.25時間後の最終試料採取のための反応を促進した
。
r−Hw IFN−7)の試料(6,5*)をS ep
hrdex G −25モレキユラーシープ小カラム(
P D −Ill、 P hsrsIc目)により
PH8,5の0.10M重炭酸アンモニウム緩衝液中に
脱塩し、最終タンパク濃度2.1■/mlとした。希釈
トリプシン溶液(WorlbiBloe T P CK
トリプシン、 0.001M HCI中1中略
0略/l、 16m)をt−HulFNγ溶液の 1.
9nl (4,0■)に加え、混合して室温でインキュ
ベートした(トリプシン;タンパク質= l : 2
5.000)。インキュベート混合物から、1時間後、
3.5時間後、5.75時間後、8時間後及び10.2
5時間後にそれぞれ試料を取り出した。8時間臼に15
X(150ng)の希釈トリプシン溶液を再度加えて1
0.25時間後の最終試料採取のための反応を促進した
。
各時点の試料の各成分への分画化はBioRedB 1
olel HP HTカラムを使用するW s l 6
目HPLCシステムで行なった。重炭酸緩衝液中の各
時点でのアリコートは試料採取時にカラムに直接(手操
作による注入により)入れた。0.01Mリン酸ナトリ
ウム、 pti 8.[1,3flμM塩化カルシウ
ムによりカラムを平衡化し、平衡化緩衝液の直線勾配及
び0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pi(8,G。
olel HP HTカラムを使用するW s l 6
目HPLCシステムで行なった。重炭酸緩衝液中の各
時点でのアリコートは試料採取時にカラムに直接(手操
作による注入により)入れた。0.01Mリン酸ナトリ
ウム、 pti 8.[1,3flμM塩化カルシウ
ムによりカラムを平衡化し、平衡化緩衝液の直線勾配及
び0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pi(8,G。
0.6μM塩化カルシウムを使用してタンパクをカラム
から溶出した。
から溶出した。
214vm及び280nmにおける吸光度により検出し
たタンパクのピークを分取し、分析に使用するまで4℃
で密閉保存した。選択されたピークに対する典型的な分
析は以下のものを含む。
たタンパクのピークを分取し、分析に使用するまで4℃
で密閉保存した。選択されたピークに対する典型的な分
析は以下のものを含む。
1、ヒト肺癌由来の細胞A349/EMCウィルスアッ
セイシステムにおける抗ウィルス活性(13)。
セイシステムにおける抗ウィルス活性(13)。
2、 L wemmロゲルシステムを使用する標準法
によるSDS/PAGE分画化(14)。
によるSDS/PAGE分画化(14)。
3、市販の色素(P 1erce Cbes+1cxl
Co、 。
Co、 。
Rockfo+d I L、 )結合法によるタン
パク濃度決定。
パク濃度決定。
4、臭化シアンによるタンパク開裂とそれに続くペプチ
ド同定のためのHPLC分析(15)。
ド同定のためのHPLC分析(15)。
タンパクの試料は70%蟻酸に対して一晩透析(12,
000−14,000M Wカットオフ)し、ロータリ
ーエバボレーシランにより乾燥し 5ooIJ1の70
%蟻酸に再度懸濁した。12X75mmガラス管中の各
サンプルに固体臭化シアンを加え、密封して溶解するま
で混合し、アルミホイルをかけ、通気のよい場所で室温
において一晩インキユベートした。
000−14,000M Wカットオフ)し、ロータリ
ーエバボレーシランにより乾燥し 5ooIJ1の70
%蟻酸に再度懸濁した。12X75mmガラス管中の各
サンプルに固体臭化シアンを加え、密封して溶解するま
で混合し、アルミホイルをかけ、通気のよい場所で室温
において一晩インキユベートした。
開裂の後、試料をロータリーエバポレーションにより乾
燥し、025m1の水に再懸濁し、再度乾燥した。HP
LCによる分画化に先立ち、試料を50%蟻酸中に再溶
解してタンパク濃度約1■/mlとした。
燥し、025m1の水に再懸濁し、再度乾燥した。HP
LCによる分画化に先立ち、試料を50%蟻酸中に再溶
解してタンパク濃度約1■/mlとした。
A flew U lIr5sphere Oc1
71カラム及びトリフルオロ酢酸/水−トリフルオロ酢
酸/アセトニトリル直線溶出勾配を使用するWzl!r
t HP L Cシステムにより、ペプチドを分画化し
た。可能な場合はアミノ酸分析によりペプチドを同定し
た。
71カラム及びトリフルオロ酢酸/水−トリフルオロ酢
酸/アセトニトリル直線溶出勾配を使用するWzl!r
t HP L Cシステムにより、ペプチドを分画化し
た。可能な場合はアミノ酸分析によりペプチドを同定し
た。
短縮された形態の t−HwlFN−γの比較データを
表1に示した(11はアミノ酸を表わす)。
表1に示した(11はアミノ酸を表わす)。
131■
2911
125s*
ネ
表 1
AAKTGKRKR
AAKTGKR
AK
0−50
−9
約l
第1図の番号付けによるが、それぞれにおいて存在する
N末端メチオニンは除く。
N末端メチオニンは除く。
H−文字の略記号はアミノ酸残基の常用の略記号である
。
。
A=アラニン
F=フェニルアラニン
G=ニブリシ
ン=リジン
L=ロイシン
R;アルギニン
T=スレオニン
1260〜+43s*の範囲(N末端メチオニンは含ま
ない)の任意の長さのがンマインターフェロンは適切に
末端調整された遺伝子から発現されることがわかるであ
ろう。例えば第1図に示された遺伝子11・ 1
23 +24Alt Alt (Xは 1個以上のアミノ酸をコードする)はFnu4
Hと扛■でプラスミドを消化した後に前記例示のE、
eoli発現ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了コ
ドンは下記のようになる。
ない)の任意の長さのがンマインターフェロンは適切に
末端調整された遺伝子から発現されることがわかるであ
ろう。例えば第1図に示された遺伝子11・ 1
23 +24Alt Alt (Xは 1個以上のアミノ酸をコードする)はFnu4
Hと扛■でプラスミドを消化した後に前記例示のE、
eoli発現ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了コ
ドンは下記のようになる。
終了
限の後に、“終了”コドンの付いた所望の配列をコード
する合成オリゴヌクレオチド及び発現プラスミド中で使
用可能な制限部位に適合するリンカ−をガンマインター
フェロン遺伝子の前部に結合することができる。例えば
、配列: A GCT AAA ACA
TA(X) CGA TTT TGT ATCT
AG旦gin E、アッセイ、細胞変性阻害 1、テスト方法 Es1leI MEM中に4X 105細胞/mlの含
有量に調整したヒト肺癌由来(A 549)細胞(AT
CCNo、CCL 185)CD懸濁液100dを各
ウェルに加える。
する合成オリゴヌクレオチド及び発現プラスミド中で使
用可能な制限部位に適合するリンカ−をガンマインター
フェロン遺伝子の前部に結合することができる。例えば
、配列: A GCT AAA ACA
TA(X) CGA TTT TGT ATCT
AG旦gin E、アッセイ、細胞変性阻害 1、テスト方法 Es1leI MEM中に4X 105細胞/mlの含
有量に調整したヒト肺癌由来(A 549)細胞(AT
CCNo、CCL 185)CD懸濁液100dを各
ウェルに加える。
プレートを37℃で約18時間インキュベートする。
18〜24時間インキュベートした後、第1列目の各ウ
ェルに培地80JIiを追加する。
ェルに培地80JIiを追加する。
インターフェロン活性を測定する試料20成を第1列目
のウェルに加える。
のウェルに加える。
第1列の各ウェルの内容物toomをそれぞれの横の第
2列目のウェルに移す。
2列目のウェルに移す。
ウェルの内容物toomを次列へ移し、これを全部で1
0回繰り返して、第11列目まで移す。
0回繰り返して、第11列目まで移す。
24時間インキュベートした後、セルコントロールを除
き全てのウェルに編心筋炎ウィルス50u1を感染させ
、感染後24時間後の細胞変性効果が100%となるよ
う感染を繰り返す。
き全てのウェルに編心筋炎ウィルス50u1を感染させ
、感染後24時間後の細胞変性効果が100%となるよ
う感染を繰り返す。
トレイをふたで覆い37℃で24時間インキュベートす
る。
る。
全てのウェルから液体を抜き、5〜15分間15%クリ
スタルバイオレットで染色する。
スタルバイオレットで染色する。
細胞の生存能力を染色細胞を観察することにより測定す
る。
る。
試料のタイターは、50%生存可能細胞が残存する希釈
度の逆数である。
度の逆数である。
2、計算
全ての試料の活性を、下記により計算されるR ele
+ence U n1ts Conwe15ion
F ICl0+によって規格化する。
+ence U n1ts Conwe15ion
F ICl0+によって規格化する。
=RUCF
3、比活性
NIHによるIFN−γ基準物質により標準化されたA
549/E M CVバイオアッセイシステムを使用
すると、組換えヒトIFN−γの抗ウイルス比活性は、
N末端に3つの付加アミノ酸(cys−TYR−CYS
)のついた改変rlFN−7分子の活性より約3倍高い
。
549/E M CVバイオアッセイシステムを使用
すると、組換えヒトIFN−γの抗ウイルス比活性は、
N末端に3つの付加アミノ酸(cys−TYR−CYS
)のついた改変rlFN−7分子の活性より約3倍高い
。
4、安定性
上記の生物学的活性の測定(A549/EMCV)によ
ると、調合後バイアル中に保存しであるlFN γは、生産後3ケ月間(4℃で貯蔵) 安定である(生物学的活性の損失はない)。
ると、調合後バイアル中に保存しであるlFN γは、生産後3ケ月間(4℃で貯蔵) 安定である(生物学的活性の損失はない)。
l、材料及び方法
+IFN−7:溶液形態のCYS−TYR−CYS−欠
失組換えインターフェロン γ (20mMコハク酸ナトリウム。
失組換えインターフェロン γ (20mMコハク酸ナトリウム。
0、I5MN* Cf1. p136)。前記のE、
coliの例に依る方法で調製した。比活性は 2.7
X1071U/■タンパクであった。
coliの例に依る方法で調製した。比活性は 2.7
X1071U/■タンパクであった。
CTC−+I FN−7:
溶液形態の、分子のN末端に
“CYS−TYR−CYS”構造
を有する組換えインターフェロン
一γ(20mMコハク酸ナトリウム。
0.15M N! C1,p136)。比活性は 1
.3x10710/■タンパクであった。
.3x10710/■タンパクであった。
HulFN 〜β :
ヒト二倍体***線維芽細胞内で産
生されたヒト繊維芽細胞インター
フェロンの凍結乾燥物で、比活性
は lXlO7TU/■タンパクより
高く、T otB I cd、、 I nc、により
調製されたもの。バイアル中に HulFN−β3XlO’lU及び ヒト血清アルブミン3■を含む。
調製されたもの。バイアル中に HulFN−β3XlO’lU及び ヒト血清アルブミン3■を含む。
HulFN
DI 、 K、 CIfell、 Ccalr*
IP ublic He*llh L 5borxlo
B 。
IP ublic He*llh L 5borxlo
B 。
Hclsinki 、 F 1ntldより供与され
た溶液形態のヒト天然白血球イ ンターフェロンで、比活性は4× 1061U/■タンパクである。
た溶液形態のヒト天然白血球イ ンターフェロンで、比活性は4× 1061U/■タンパクである。
コントロール:
ヒト血清アルブミン3■を含有す
るプラシーボ。
地:He Lx 、 KB、 HMV−1゜FL及びJ
−111細胞については、 lO%熱半熱不活化初乳前子牛血清 (PNC8)及び2催ML−グル タミンを添加したE xgle’ s最少必須培地を使
用した。A349細胞に はIO%熱不活化PNC8,100層 /耐カナマイシン及び2mM L グルタミンを含有するD ulbece。
−111細胞については、 lO%熱半熱不活化初乳前子牛血清 (PNC8)及び2催ML−グル タミンを添加したE xgle’ s最少必須培地を使
用した。A349細胞に はIO%熱不活化PNC8,100層 /耐カナマイシン及び2mM L グルタミンを含有するD ulbece。
最少必須培地を使用した。表2に
挙げた残りのヒト細胞には熱不活
化PNC3及び100/Ig/mlカナマイシンを添加
したR P M I 164G培地を使用した。
したR P M I 164G培地を使用した。
2、抗細胞増殖活性の評価
培養培地に懸濁した試験細胞をプラスチック組織培養プ
レートに5X 103細胞10.5ml/ウェルの濃度
で接種した。続いて対応する培地(0,5m1)に溶解
した種々の量のインターフェロンを添加した(0日)。
レートに5X 103細胞10.5ml/ウェルの濃度
で接種した。続いて対応する培地(0,5m1)に溶解
した種々の量のインターフェロンを添加した(0日)。
培養は37℃において5%co2.95%空気の湿潤大
気中で行った。浮遊増殖型細胞については、6日目に培
養培地を除去し、懸濁培養液中の細胞をCoulle+
カウンターでの細胞計数のために直接T 5oton
11 (Coulte+ E 1ecl+onics
[nC,)中に懸濁した。プラスチック容器中でシート
を形成する細胞は、測定に際し、r 5oton 11
中での単一細胞懸濁物を調製するために0.05%トリ
プシン−002%EDTAで前処理した。インターフェ
ロンの抗細胞増殖活性は、コントロール培養物(インタ
ーフェロンなし)と比較して細胞数を50%減少するの
に要する抗ウイルス単位数として表わした(rc 、
目U/ml)。
気中で行った。浮遊増殖型細胞については、6日目に培
養培地を除去し、懸濁培養液中の細胞をCoulle+
カウンターでの細胞計数のために直接T 5oton
11 (Coulte+ E 1ecl+onics
[nC,)中に懸濁した。プラスチック容器中でシート
を形成する細胞は、測定に際し、r 5oton 11
中での単一細胞懸濁物を調製するために0.05%トリ
プシン−002%EDTAで前処理した。インターフェ
ロンの抗細胞増殖活性は、コントロール培養物(インタ
ーフェロンなし)と比較して細胞数を50%減少するの
に要する抗ウイルス単位数として表わした(rc 、
目U/ml)。
0
表2 他種インターフェロンと比較した+IFN−γの
抗細胞増殖活性試験細胞の組織学的 細胞 タイプ又は起源 Cso (IU/ m1l rlFN−7CTC−rlFN−7HulFN−β H
alFN−αNATO−I 胃癌Sillel−ri
ng細胞MKN−1胃扁平上皮癌 MKll−28高分化型胃腺癌 MKN−45低分化型肺腺癌 MKN−74高分化型胃腺癌 HsL暑 子宮頚癌 に8 鼻咽腔癌 +1MV−1無メラニン性悪性黒色腫 SEl[I−F 悪性黒色腫 FL 羊膜(非悪性腫瘍起源)PC−8低分化
型肺腺癌 PC−12肺腺癌 A349 肺胞癌 QG−56肺扁平上皮癌 QG−90未分化型肺中細胞癌 D■di Ba+kill リンパ腫Na+uln
Bukitf リンパ腫1−111 単球性
白血病 7 04 表に示した通り、 +IFN−γの抗細胞増殖活性はヒ
ト細胞種により著しく異っていた。この場合、KATO
−nIすなわち胃癌5i(let−+iB細胞は高度に
敏感で1.2fU/+mlのIC5Gを示すが、Dac
di細胞すなわちB urkiNリンパ腫はI型インタ
ーフェロン(Hu I FN−a、Ha IFN−
β)に対しては高度に敏感であるのに対して、+IFN
−γを含む■型インターフェロンに対しては非感受性で
あった。肺腺癌(PC−8,PCl3)は試験した全て
のインターフェロンに対して非感受性であった。 rl
FN−γとCTCTIFN−7間の抗細胞スペクトルは
殆んど同一であるが、−射的に rTFN−γの抗細胞
増殖効果はCTC−+IFN−γのそれよりも優れてい
るようである。4つのインターフェロンを比較した場合
、D Iudi細胞を除いて+IFN−γにおいて最も
高い効果が得られた。
抗細胞増殖活性試験細胞の組織学的 細胞 タイプ又は起源 Cso (IU/ m1l rlFN−7CTC−rlFN−7HulFN−β H
alFN−αNATO−I 胃癌Sillel−ri
ng細胞MKN−1胃扁平上皮癌 MKll−28高分化型胃腺癌 MKN−45低分化型肺腺癌 MKN−74高分化型胃腺癌 HsL暑 子宮頚癌 に8 鼻咽腔癌 +1MV−1無メラニン性悪性黒色腫 SEl[I−F 悪性黒色腫 FL 羊膜(非悪性腫瘍起源)PC−8低分化
型肺腺癌 PC−12肺腺癌 A349 肺胞癌 QG−56肺扁平上皮癌 QG−90未分化型肺中細胞癌 D■di Ba+kill リンパ腫Na+uln
Bukitf リンパ腫1−111 単球性
白血病 7 04 表に示した通り、 +IFN−γの抗細胞増殖活性はヒ
ト細胞種により著しく異っていた。この場合、KATO
−nIすなわち胃癌5i(let−+iB細胞は高度に
敏感で1.2fU/+mlのIC5Gを示すが、Dac
di細胞すなわちB urkiNリンパ腫はI型インタ
ーフェロン(Hu I FN−a、Ha IFN−
β)に対しては高度に敏感であるのに対して、+IFN
−γを含む■型インターフェロンに対しては非感受性で
あった。肺腺癌(PC−8,PCl3)は試験した全て
のインターフェロンに対して非感受性であった。 rl
FN−γとCTCTIFN−7間の抗細胞スペクトルは
殆んど同一であるが、−射的に rTFN−γの抗細胞
増殖効果はCTC−+IFN−γのそれよりも優れてい
るようである。4つのインターフェロンを比較した場合
、D Iudi細胞を除いて+IFN−γにおいて最も
高い効果が得られた。
G、inマ1lroの種々の液中における rlFN−
γ10■ヒト血清アルブミン、リン酸緩衝液及び等張量
のNhC9をそれぞれ含有している、前記のE、 co
liの例に従って調製したrEFN−γの凍結乾燥物l
X1O’lU/バイアル及びN末端に“CYS−TYR
−CYS”構造を有する+IFN−7の凍結乾燥物lX
l0’ IU/バイアルを蒸留水で溶解し、濃度を4
X10’ I U/mlに調整した。
γ10■ヒト血清アルブミン、リン酸緩衝液及び等張量
のNhC9をそれぞれ含有している、前記のE、 co
liの例に従って調製したrEFN−γの凍結乾燥物l
X1O’lU/バイアル及びN末端に“CYS−TYR
−CYS”構造を有する+IFN−7の凍結乾燥物lX
l0’ IU/バイアルを蒸留水で溶解し、濃度を4
X10’ I U/mlに調整した。
インターフェロンの1n マil+oにおける安定性
は、種々の液体中における残存抗ウィルス活性を測定す
ることによって評価した。上記のインターフェロン溶液
を、37℃又は4℃の水浴インキュベーターで10分間
ブレインキュベートした9倍容量のウサギ血清、ヒト血
清あるいはE*gls’ s MEMに加えることによ
ってインキュベートを開始した。 0. 0.25.
0.5. I、 4. 8. 24. 72及び1
44時間後にアリコートを採取し、9倍容量のE ag
le’ IM E Mと混合した。試料は、インターフ
ェロンタイターの測定まで、ディープフリーザー中にお
いて一80℃で凍結保存した。インターフェロンタイタ
ーは、5indb目ウイルスを感染させたヒト羊膜細胞
(FL細胞)を使用するCPE5゜法により測定した。
は、種々の液体中における残存抗ウィルス活性を測定す
ることによって評価した。上記のインターフェロン溶液
を、37℃又は4℃の水浴インキュベーターで10分間
ブレインキュベートした9倍容量のウサギ血清、ヒト血
清あるいはE*gls’ s MEMに加えることによ
ってインキュベートを開始した。 0. 0.25.
0.5. I、 4. 8. 24. 72及び1
44時間後にアリコートを採取し、9倍容量のE ag
le’ IM E Mと混合した。試料は、インターフ
ェロンタイターの測定まで、ディープフリーザー中にお
いて一80℃で凍結保存した。インターフェロンタイタ
ーは、5indb目ウイルスを感染させたヒト羊膜細胞
(FL細胞)を使用するCPE5゜法により測定した。
結果は初期タイターに対する残存タイターのパーセンテ
ージとして第3図に示した。
ージとして第3図に示した。
E、 coli及びCO3−7細胞中で発現させる好ま
しい具体例を参照して本発明を例示したが、本発明の組
換えガンマインターフェロンが他の細菌株、酵母及び組
織培養系の如き他の系内に於いても産生され得ることは
明らかである。特開昭58−90514号公報及び参考
文献(6)参照。即ち、本発明は最も好ましい具体例に
限定されず、むしろ前記特許請求の範囲の全ての適法範
囲の均等物に亙る。
しい具体例を参照して本発明を例示したが、本発明の組
換えガンマインターフェロンが他の細菌株、酵母及び組
織培養系の如き他の系内に於いても産生され得ることは
明らかである。特開昭58−90514号公報及び参考
文献(6)参照。即ち、本発明は最も好ましい具体例に
限定されず、むしろ前記特許請求の範囲の全ての適法範
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参 考 文 献
り、 Goeddel el il、、N&1ure、
287.411(1980) D、 Goeddel el gl、 Ntla+e
290.20(198+) E、 Yelye+ton et &1. Nuclc
ic Ac1dsResex+ch、 9.731 (
1981)Gujlermtn el gl
Annzls of Int、 Med。
287.411(1980) D、 Goeddel el gl、 Ntla+e
290.20(198+) E、 Yelye+ton et &1. Nuclc
ic Ac1dsResex+ch、 9.731 (
1981)Gujlermtn el gl
Annzls of Int、 Med。
93、399 (1980)
D、 Goeddel cl *1.、Nacleic
Ac1dsResearch、 8.4057 (1
980)P、 GrB el !1..
Nzta+e、 295. 503−508(
1982) R、D eBock ef *1.、N ac
leic A cidsRese&+ch、 1
0.3605 (19g2)L R,Der7nek
el sl、、 I n(erleton 5
eien目1ic Memor*ndx、 Augu
N 19g2. Memo =1 − A 1193/
2 9、 R,Der7nck el 11゜” E
xpres+ion ofHusxn I
n1erferoa Gtsmr in Hcl
e+ol。
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gouJ S 7slems Jn E xp
erltsenIsI Ms−nipul*1ion
ol G ene E xp+es+1o11A es
deme P re目、 I nc、 247
(1983)10、 D、 Gosddel e
t xl、、Nrlure、 287. 4114
16 (1980) Il、 D、 Goeddel el Jl、、
欧州特許出願公開第0、077、670号 12、 W、 E、 5levirl 11
、 ”The In1etleron S 7
slei 、 S p「imer V e+l&
g(New Yolk )pp、13−26 (1
979)13、 8+ev*t1. ”In(ert
tton S7tlsms ’Ed、二S 1e
vs+l、 p、 13. S p+inge+−
D erlrg 、 N ewY ork (19
79) L *emmli、 N [ars、 2
27. 680 (1970)15、 G ro
目、 sl gl。 M elhod+ in E
nxy+n。
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、 ”The In1etleron S 7
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G 11!1111. Celf、 23.
175 (1981)17、 A 1lo1
el tl、、 “ P +odacti
on 。
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Chx+*eleri目目on ld B 1ol
otic*E Itecls of Recom
bin*nl D N AD edited
81111!11 I F N −*
1phx glIdl FN−g*mm* An
alogs 、 The Biolog7o
f the In+erlsron Syste
m、 De Mxe7e+【4 6 8 9 1nd S ehellekeas E d
s、 E ttelrierS cien
ce P ubl、 (1983)Be+m
*o el al、 5cience、
222 、 524(1983) S Iraonsen el sl。 Mol
、 Celf、 B +o13、 2250
(19831
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222 、 524(1983) S Iraonsen el sl。 Mol
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(19831
第1図は、本発明の組換えガンマインターフェロン遺伝
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図であり、 第2図は本発明によって直接合成される組換えガンマイ
ンターフェロンをコードしているプラスミドの調製法を
示す説明図であり、 第3図は本発明のガンマインターフェロンの優れた安定
性を示すグラフである。
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図であり、 第2図は本発明によって直接合成される組換えガンマイ
ンターフェロンをコードしているプラスミドの調製法を
示す説明図であり、 第3図は本発明のガンマインターフェロンの優れた安定
性を示すグラフである。
Claims (43)
- (1)(a)N末端から伸延する下記アミノ酸配列(但
し、Xはメチオニン残基又は水素であり、Yは、グルタ
ミン残基であるか、又はXが水素であるときはグルタミ
ン残基若しくはピログルタミン酸残基である)を含有す
る組換えガンマインターフェロンポリペプチド;又は、 (b)(a)のガンマインターフェロンポリペプチドの
改変種で同等の性質を有するものを含む薬剤投与に適し
た組成物: 【遺伝子配列があります】 - (2)Xがメチオニン残基であることを特徴とする特許
請求の範囲第1項に記載の組成物。 - (3)前記ポリペプチドがXの後に伸延する126+n
個(nは0又は1乃至17の整数である)のアミノ酸を
有することを特徴とする特許請求の範囲第2項に記載の
組成物。 - (4)n個のアミノ酸が、 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第3項に記載の
組成物。 - (5)ポリペプチドが、前記ポリペプチドのアナログで
アミノ酸143を欠くか又はアミノ酸配列Z→アミノ酸
143(但し、Zはアミノ酸127、128、129、
130、131、132、133、134、135、1
36、137、138、139、140、141又は1
42である)を欠くポリペプチドから成るグループから
選択されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
第3項に記載の組成物。 - (6)Zがアミノ酸127であることを特徴とする特許
請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (7)Zがアミノ酸128であることを特徴とする特許
請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (8)Zがアミノ酸129であることを特徴とする特許
請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (9)Zがアミノ酸130であることを特徴とする特許
請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (10)Zがアミノ酸131であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (11)Zがアミノ酸132であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (12)Zがアミノ酸133であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (13)Zがアミノ酸134であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (14)Zがアミノ酸135であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (15)Zがアミノ酸136であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (16)Zがアミノ酸137であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (17)Zがアミノ酸138であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (18)Zがアミノ酸139であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (19)Zがアミノ酸140であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (20)Zがアミノ酸141であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (21)Zがアミノ酸142であることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (22)アミノ酸143だけを欠くことを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の組成物。 - (23)ポリペプチドが、細胞変性阻害マイクロタイタ
ーアッセイに於いて、下記アミノ酸配列(但し、Xは水
素であり、AはCYS−TYR−CYSである)を有す
る組換えガンマインターフェロンの活性と少なくともほ
ぼ等しい活性を示すことを特徴とする特許請求の範囲第
1項乃至第22項のいずれかに記載の組成物: 【アミノ酸配列があります】 - (24)細胞変性阻害マイクロタイターアッセイに於い
て、下記アミノ酸配列(但し、Xは水素であり、AはC
YS−TYR−CYSである)を有する組換えガンマイ
ンターフェロンの活性の少なくとも約2倍の活性を示す
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項乃至第22項の
いずれかに記載の組成物: 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 - (25)形質転換された細胞中で、N末端から伸延する
下記アミノ酸配列(但し、Xはメチオニン残基又は水素
であり、Yは、グルタミン残基であるか、又はXが水素
であるときはグルタミン残基若しくはピログルタミン酸
残基である)を含有するポリペプチドを発現し得る複製
可能な発現ベヒクルによって形質転換された宿主細胞か
らなる形質転換細胞:【アミノ酸配列があります】 - (26)Xがメチオニン残基であることを特徴とする特
許請求の範囲第25項に記載の形質転換細胞。 - (27)前記ポリペプチドがXの後に伸延する126+
n個(nは0又は1乃至17の整数である)のアミノ酸
を有することを特徴とする特許請求の範囲第26項に記
載の形質転換細胞。 - (28)n個のアミノ酸が、 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第27項に記載
の形質転換細胞。 - (29)前記ポリペプチドが、アミノ酸143を欠くか
又はアミノ酸配列Z→アミノ酸143(但し、Zはアミ
ノ酸127、128、129、130、131、132
、133、134、135、136、137、138、
139、140、141又は142である)を欠く特許
請求の範囲第28項に記載のポリペプチドのアナログか
ら成るグループから選択されることを特徴とする特許請
求の範囲第28項に記載の形質転換細胞。 - (30)微生物であることを特徴とする特許請求の範囲
第25項乃至第29項のいずれかに記載の形質転換細胞
。 - (31)細菌であることを特徴とする特許請求の範囲第
25項乃至第29項のいずれかに記載の形質転換細胞。 - (32)前記ポリペプチドの発現がこれに結合したシグ
ナルペプチドの形成を全く伴わないことを特徴とする特
許請求の範囲第25項乃至第29項のいずれかに記載の
形質転換細胞。 - (33)天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性質
を示し、少なくとも特許請求の範囲第1項に記載のアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチド。 - (34)アミノ酸配列が、126番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第33項に記載
のポリペプチド。 - (35)アミノ酸配列が、126番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第33項に記載
のポリペプチド。 - (36)アミノ酸配列が、126番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第33項に記載
のポリペプチド。 - (37)アミノ酸配列が、126番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第33項に記載
のポリペプチド。 - (38)アミノ酸配列が、126番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が 【アミノ酸配列があります】 (但し、Z′は水素又は下記アミノ酸若しくはアミノ酸
配列である)であることを特徴とする特許請求の範囲第
33項に記載のポリペプチド:【アミノ酸配列がありま
す】;又は【アミノ酸配列があります】 - (39)アミノ酸配列が、126番目のアミノ酸に続い
て伸延しており、その伸延部が 【アミノ酸配列があります】 (但し、Z′は水素又は下記アミノ酸若しくはアミノ酸
配列である)であることを特徴とする特許請求の範囲第
33項に記載のポリペプチド:【アミノ酸配列がありま
す】 - (40)特許請求の範囲第34項及び第35項に記載の
ポリペプチドの混合物よりなる組成物。 - (41)特許請求の範囲第34項に記載のポリペプチド
を約95%より多く含有することを特徴とする特許請求
の範囲第40項に記載の組成物。 - (42)特許請求の範囲第34項に記載のポリペプチド
を約97%より多く含有することを特徴とする特許請求
の範囲第40項に記載の組成物。 - (43)薬剤上許容できる程度のヒト血清アルブミンを
含有することを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載
の組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US56200983A | 1983-12-16 | 1983-12-16 | |
US562009 | 1983-12-16 | ||
US06/584,217 US4855238A (en) | 1983-12-16 | 1984-02-27 | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
US584217 | 1984-02-27 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59263699A Division JPH0789935B2 (ja) | 1983-12-16 | 1984-12-13 | 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6161166A Division JP2580491B2 (ja) | 1983-12-16 | 1994-07-13 | 組換えガンマインターフェロン組成物の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03201979A true JPH03201979A (ja) | 1991-09-03 |
JPH0794477B2 JPH0794477B2 (ja) | 1995-10-11 |
Family
ID=27072811
Family Applications (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59263699A Expired - Lifetime JPH0789935B2 (ja) | 1983-12-16 | 1984-12-13 | 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン |
JP2239776A Expired - Lifetime JPH0794477B2 (ja) | 1983-12-16 | 1990-09-10 | 安定性の高い組換えガンマインターフエロン |
JP6161166A Expired - Lifetime JP2580491B2 (ja) | 1983-12-16 | 1994-07-13 | 組換えガンマインターフェロン組成物の製造法 |
JP7111822A Expired - Lifetime JP2545206B2 (ja) | 1983-12-16 | 1995-05-10 | 組換えガンマインターフェロン |
JP8054569A Expired - Lifetime JP2719128B2 (ja) | 1983-12-16 | 1996-03-12 | 組換えガンマインターフェロン組成物 |
JP9208916A Expired - Lifetime JP2886145B2 (ja) | 1983-12-16 | 1997-08-04 | 組換えガンマインターフェロンをコードするdna |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59263699A Expired - Lifetime JPH0789935B2 (ja) | 1983-12-16 | 1984-12-13 | 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン |
Family Applications After (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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JP7111822A Expired - Lifetime JP2545206B2 (ja) | 1983-12-16 | 1995-05-10 | 組換えガンマインターフェロン |
JP8054569A Expired - Lifetime JP2719128B2 (ja) | 1983-12-16 | 1996-03-12 | 組換えガンマインターフェロン組成物 |
JP9208916A Expired - Lifetime JP2886145B2 (ja) | 1983-12-16 | 1997-08-04 | 組換えガンマインターフェロンをコードするdna |
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---|---|
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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