JPH03198772A - 外在的なペプチド配列を用いた処理による生物学的に活性なポリペプチドの製造方法およびそのポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は生物学的に活性なポリペプチドの製造に関する
。本発明はまた生物学的に活性なポリペプチドに関する
。本発明はポリペプチドの適切な折りたたみのための分
子間触媒として、外在的なペプチド配列を使用する。外
在的なペプチドをトランスに加えると、不活性タンパク
買が適切に折りたたまれる。外在的なペプチドは、発現
されたポリペプチドのプロ配列とすることができる。

〈発明の背景〉 多くのポリペプチド（蛋白質、ペプチド）の遺伝子が異
なる宿主においてクローニングされ、異なる宿主におい
て過剰に発現されるようになった。この結果、従来技術
では大量に製造でき得なかったポリペプチドあるいは発
現でき得なかったポリペプチドが工業的に利用されるよ
うになった。　異種細胞における過剰発現の結果場合に
よっては、これらのクローニングされたポリペプチドは
、このポリペプチドの天然型の物の精製法をわずかに改
良するだけで生物学的に活性の状態のまま精製すること
かできる。しかし、時として発現されたポリペプチドの
活性が低下あるいは全く活性を有さない場合がある。こ
の現象は、過剰生産のため、あるいは、宿主が、本来、
自身のものではない異種のポリペプチドを、複雑な高次
構造を保ったまま、翻訳以降のプロセスを行うことがで
きないことに起因すると考えられる。宿主細胞の顕微鏡
的分析から、これらの不活性ポリペプチドの封入体と呼
ばれる大型の凝集物が形成している可能性がある。この
凝集体内ではポリペプチドは非天然の不活性状態で存在
している。この凝集物は容易に分画でき、変性剤、たと
えば尿素または塩酸グアニジンによって解離させること
ができる。しかし、この解離後に、ポリペプチドをその
正しいコンホーメーションに復元させなければ、遺伝子
工学技術を用いて大量に生産させ得たポリペプチドを、
工業的に利用する事は全く不可能である。この復元技術
には種々のものがあるが、それらは主に経験的に決定さ
れているのみである。そのため、適切なポリペプチドの
折りたたみに伴う諸問題、およびもっと体系的な方法の
必要性については、バイオテクノロジー産業も認めると
ころであり、ポリペプチドの折りたたみについての研究
に相当拍車がかかっている（キング＝Ｋｉｎｇ、１９８
９）。

原核細胞あるいは真核細胞のいずれでも、ポリペプチド
によっては、そのタンパク貿より長い前駆体として合成
されるものもある。こうした前駆体は、活性の成熟した
分子となるのに回置上のペプチド鎖分解性の開裂を必要
とする。前駆体は、プレ配列およびプロ配列として知ら
れるアミノ酸をさらに含有しており、これらプレ配列お
よびプロ配列は、前駆体分子中にその片方または両方が
見いだされる。

プレ配列はポリペプチド鎖のＮ末端に位置しており、ポ
リペプチド自身の分泌および膜への局在化に必要である
ことがわかっている。

般に、プレ配列（シグナルペプチド）は２０−３０アミ
ノ酸の長さを有しており、高含量の疎水性残基を含有し
ている。この前駆体は一時的に存在するものである。成
長中のペプチドが十分長くなり、シグナルペプチドがリ
ポソームを越えて延びるようになると、細胞性シグナル
認識粒子がシグナルペプチドと結合し、その結果生じた
粒子／リポソーム複合体が細胞膜まで移動する。複合体
が膜の受容体に結合する間に、シグナル認識粒子がはず
れる。翻訳が継続されるにつれて、プレ配列が膜を通過
し、その後新生ポリペプチド鎖の残りの部分が通過する
。ポリペプチドが膜に十分挿入された時点で、シグナル
配列が切り離される。翻訳が完了すると、ポリペプチド
は膜を完全に通過しているか（分泌性）、あるいは、膜
内に局在化している（膜結合性）。シグナル配列の除去
が、分泌性ポリペプチド、たとえば、胎盤性ラクトゲン
、リゾチーム、オボムコイド、成長ホルモン、およびウ
ィルスの膜タンパク質であるＶＳＶ糖タンパク質の成熟
形態を形成するのに必要な唯一の開裂である。

しかし、ポリペプチドの多くは、さらにプロ配列を含ん
でいる。プレ配列の開裂の結果生じたプロポリペプチド
またはプロホルモンは１、安定な前駆体として存在する
。成熟した活性分子を生じる開裂は、プロポリペプチド
あるいはプロホルモンが分湯小胞に包みこまれてはじめ
て生じる。多くの細胞は毒素あるいは潜在的に有害な酵
素を分泌する。活性ポリペプチドとなることがこのよう
に遅れることによって、自身から産生されるポリペプチ
ドによって生じる可能性のある有害な影響から産生細胞
が保護されるのだと考えられる。当初プロ形態で存在す
るポリペプチドの例としては、アルブミン、インシュリ
ン、副甲状腺ホルモン、およびインフルエンザウィルス
血球凝集素がある。

プロ配列の機能は十分にはわかっていない。

この配列は、活性酵素の培地への放出の前にプロ酵素を
細胞と会合させ、モして／または、ポリペプチドのその
活性のあるコンホーメーションへの適切な折りたたみを
誘導するために必須である可能性があると考えられる。

最近、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）由来のズブチリ
シンの場合について、ポリペプチドが適切に折りたたま
れて活性酵素となるのを誘導するためには、その共有結
合で結合されたプロ配列が必要であることが示唆された
（地材ら、１９８７、地材および弁上、１９８Ｂ）。

タンパク質によっては、その最大の生物学的活性を得る
ためには、そのリーダー配列もクローニングする必要が
あることが観察されている。リーダー配列不在の結果ポ
リペプチドが不活性となるのは、不適切な折りたたみの
せいであると考えられる。この問題を解決すべくリーダ
ー配列も生成すると、たとえばＥ、ｃｏｌｉのように宿
主細胞が前駆体分子からこれらの配列を切り離す能力を
持っていない場合には、天然生成物より多くのアミノ酸
を有する最終生成物が生じることになってしまう。得ら
れたポリペプチドはプロ配列が除去されるまで不活性な
ままである可能性がある。この除去を行う現存の方法は
面倒なものである（文献参照）。

本発明は、プロ配列なしで発現されたポリペプチド、ま
たは部分的あるいは全体的に変性されたポリペプチドを
外在的なペプチド配列をこのポリペプチドにトランスに
添加することにより活性化する方法を提供するものであ
る。本発明は生物学的に活性なペプチドも提供する。

背景技術 タンパク貿工学の分野では相当量の情報が公開されてい
る。酵素であるズブチリシンはこの分野の研究のための
理想的なモデル系となってきた（参考文献参照）。この
ポリペプチドについては、詳細な酵素的研究およびＸ線
による結晶学的研究が行われている（参考文献参照）。

ここでは、ポリペプチド構造の形成および安定化、そし
てズブチリシンＥおよび他のポリペプチドの前駆体の処
理について取扱った刊行物について説明する。このよう
な文献はすべて文献としてここに包含する。

アンフィンセン（Ｃ，Ｂ、　　Ａｎｆｉｎｓｅｎ）の「
タンパク貿構造の形成と安定化（ＴｈｅＦｏｒｍａｔｉ
ｏｎ　　ａｎｄ　　５ｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏ
ｆ　　ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ　）　Ｊ　、
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
　）　１２８、第７３７−７４９頁（１９７２）、およ
びザビンら（１，Ｚａｂｉｎ　　およびＭ、　Ｒ，Ｖｉ
ｌｌａｒｅｊｏ）の「タンパク貿の相補性（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　）　」、アニ
ュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Δｎｎ
、　Ｒｅｖ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、）　、４４、第２９５
３１３頁（１９７５）には、生物学的に活性な分子を形
成する際に別のプロ配列を必要としないポリペプチドの
折りたたみに対する分子間の効果が報告されている。

パワー（Ｓ、　Ｄ、Ｐｏｗｅｒ→らの「ズブチリシンの
分泌および自己タンパク質分解による成熟（Ｓｅｃｒｅ
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　
ｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆ　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）　
Ｊ　、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　）８３、第
３０９６−３１００頁（１９８６）は、ズブチリシンの
全長の前駆体（プレプロズブチリシン）が細胞膜に結合
して存在することを明らかとした。未成熟な遺伝子産物
から成熟した酵素への転換が、活性型のズブチリシンで
媒介されることが示されている。この過程は自己触媒的
であると考えられている。

ウォングら（Ｓ、　　−Ｌ、　　Ｗｏｎｇ　　および　
Ｒ，ＨＩ３ Ｄｏｔ　　）の「バチルス・ズブチリスのプレプロズブ
チリシンにおけるシグナルペプチダーゼの開裂部位の決
定（Ｄｅｔａｒｎｌｊｎａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　Ｓｉ
ｇｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　５
ｉｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅＰｒｅｐｒｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉ
ｎ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｊ　、　　ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　ＢＬｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６１、第１０１７６１０１８１頁
（１９８６）では、プレプロ酵素におけるシグナルペプ
チダーゼの開裂部位が詳細に決定されている。プレプロ
ズブチリシンのシグナルペプチドは、２９アミノ酸の長
さを有することが見いだされている。

池村（Ｈ，Ｔｋｅｍｕｒａ）らの「大腸菌での活性ズブ
チリシンＥの産生のためのプロ配列の必要性（Ｒｅｑｕ
ｉｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｒｏ−３ｅｑｕｅｎｃｅ　ｆ
ｏｒ　ｔｈａＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ａｃｔ
ｉｖｅ　　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　　Ｅ　　１ｎＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　」、ジャーシール申オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ、）　２６２、第７８５９−７８６４頁（１９
８７）には、酵素的に活性なズブチリ　２ シンの形成にプレプロズブチリシンのプロ配列が果たす
重要な役割が説明されている。著者は、酵素的に活性な
ズブチリシンＥの適切な折りたたみを誘導するためにプ
ロ配列が必要であることを提唱している。

池村ら（Ｈ，Ｉｋｅ＋ｌ１ｕｒａ　　およびＩＡ、　Ｉ
ｎｏｕｙｅ）の「大腸菌で産生されたプロズブチリシン
のイン・ビトロでの処理（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｎｇｏｆＰｒｏ−５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　　Ｐ
ｒｏｄｕｃｅｄ　　ｉｎ　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａｃ
ｏｌｔ）　Ｊ　、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　　２
６３、第１２９５９−１２９６３頁（１９８８）には、
活性のあるズブチリシンが、−度６ＭグアニジンーＨＣ
ｌ中で変性すると再活性化できなかったことが示されて
いる。６Ｍグアニジン−ＭＣＩに溶解したプロズブチリ
シンは、復元して活性のズブチリシンを生成することが
できた。活性のズブチリシンを生成するうえで必要なプ
ロ配列の開裂は、プロズブチリシンの再活性化の際に生
じる。この過程は、同一分子内の自己処理的な機構によ
って生じることが見いだされた。

上記に挙げた文献は、適切な折りたたみのための分子間
触媒として外在的なペプチド（成熟したタンパク質の一
部でないペプチド）を使用することによって、生物学的
に活性なポリペプチドを産生ずる方法を開示するもので
はない。

さらに、背景技術には、外在的に加えたポリペプチド（
成熟したタンパク質の一部ではない）が不活性酵素の再
折りたたみを行いうることを明らかとしたものはない。

ザビンら（ＺａｂｉｎおよびＶＨｌａｒｅｊｏ）がレピ
ュウを行っている、ポリペプチドの折りたたみに対する
分子間効果について報告した研究は、ズブチリシンのよ
うに、活性酵素の形成にさらなるプロ配列を必要とする
ポリペプチドに関するものではなかった。これらの著者
によって報告されたポリペプチドの相補性の研究では、
相補性ポリペプチドは、活性酵素のサブユニットで通常
見いだされるものである。本発明では、適切な折りたた
みを行う外在的なペプチド配列は成熟したタンパク質中
には見いだされない。したがって、本発明は従来技術か
ら新規に発展したものである。

発明の開示 本発明は、変性したポリペプチド分子の適切な折りたた
みの誕導を促進するための方法および組成物を提供する
。これらのポリペプチドは、適切に折りたたまれた後は
生物学的な活性を有する。

具体的には、本発明は、生物学的に活性なポリペプチド
を生成するにあたり、生物学的に不活性または部分的に
不活性なポリペプチドを、外在的なペプチド配列ととも
に処理する工程よりなり、上記の外在的なペプチド配列
が、上記ポリペプチドの生物学的に活性なポリペプチド
への折りたたみを分子間作用によって補うものである方
法を提供する。

本発明は、最終的な活性ポリペプチドの一部５ ではない、外在的に加えられるポリペプチドを提供する
。ポリペプチドは変性したタンパク質のプロ配列とする
ことができ、プロ配列ならびにさらなるアミノ酸を含む
こともできる。ポリペプチドのソースは、天然のもので
も人工のもの（「遺伝子工学」によって得たものも含む
）でもよい。

本発明は、本発明の方法を応用することによって、「工
学的」に得られた過剰に発現されたタンパク質の活性を
復元することも意図している。原核生物でのポリペプチ
ドの過剰の発現は、凝集を生じることがある。これらの
凝集物は木質的に不活性で、解離するには変性剤を必要
とする。本発明では、本発明の方法を使用して、解離の
後に生物学的活性を復元、すなわち発現させることも意
図している。さらに、ポリペプチドのそのプロ配列を付
着したままでの発現は、所望の活性を有する天然の成熟
した形態とは異なるので、望ましくない場合もある。本
発明では、プロ配列を有さないポリペプチドを　６ 発現させ、しかも正確な折りたたみを生じさせ、所望の
生成物が確実に高い生物学的活性を有するようにするこ
とも意図している。

本発明の方法は、変性したあるいは不適切に折りたたま
れたポリペプチド（すなわち、生物学的に活性でないポ
リペプチド）と、外在的なポリペプチドとの組合せを提
供する。２種の成分の間の分子間相互作用によって、不
活性ポリペプチドの活性形態への適切な折りたたみが話
導される。この方法によって、天然の手段によってでは
なく、「人工の」手段によって活性化されたポリペプチ
ドを得ることが可能となる。活性タンパク質を得るこの
活性折りたたみの過程は、イン・ビトロでもイン・ビボ
でも行うことができると考えられる。

具体的説明 本発明は、変性した（すなわち不活性な）ポリペプチド
の活性コンホーメーションへの折りたたみを分子間作用
で補うための外在的なボリペプチドの使用に関する。こ
の反応を行うために使用するポリペプチドは最終的な活
性ポリペプチドの一部ではない。より具体的には、プロ
配列構造を前駆体の形態としてとるポリペプチドを例示
する事ができる。変性したポリペプチドとしては活性を
持つ状態のポリペプチドと同じアミノ酸配列を持つ事が
望ましいが、その部を人工的に修飾せしめたアミノ酸配
列をもつポリペプチドでもよい。遺伝子工学的に大量に
発現されその生物活性を完全にあるいは部分的に失なっ
たポリペプチドはその好例である。外在的なポリペプチ
ドとしては変性したポリペプチドの活性コンホーメーシ
ョンへの折りたたみを分子間作用で補えればいずれでも
よいが、変性したポリペプチドのプロ配列を有するポリ
ペプチドが望ましい。そのため本発明の実施態様として
はプロ配列構造を前駆体の形態としてとる各種のポリペ
プチド、例えばアルブミン、インシュリン、副甲状腺ホ
ルモンおよびインフルエンザウィルス血球凝集素等、多
数が想定されるが、より詳細には、本発明の好適実施態
様では、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｕｓ）
によって産生されるアルカリ性セリンプロテアーゼであ
るズブチリシンＥの活性化についての説明を行う。

従来、Ｅ、ｃｏｌｉ高発現分泌ベクターで発現されたプ
ロズブチリシンを６Ｍグアニジン−ＨＣｌに溶解したも
のを復元して、活性ズブチリシンを生成することができ
ることが示されてきた。しかし、同じベクターからプロ
配列を含まないズブチリシンが発現された場合には、こ
のズブチリシンは不活性で、変性プロズブチリシンの復
元用に見いだされた最適の条件下でも、再度折りたたん
で活性なズブチリシンとすることはできなかった（池田
および弁上、１９８８）。

外在的なポリペプチドを使用して変性したポリペプチド
を適切に折りたたむ本発明の方法は、外在的なポリペプ
チドを製造する工程を含む。本発明の特定の実施態様で
は、外部から加９ ０ えるズブチリシンのプロ配列を、Ｅ、ｃｏｌｉ発現プラ
スミドｐＨＩ２１６から得ている。このプラスミドは、
成熟したズブチリシンの第３２位のアスパラギン酸残基
がアスパラギンで置換されたプロズブチリシン変異体を
産生ずることができる（地材ら、１９８７）。Ａｓｐ−
３２は活性中心トライアット（Ｔｒｉａｄ）の一部であ
り、その置換の結果酵素活性が完全に失われる（パワー
＝　Ｐ　ｏ　ｗ　ｅ　ｒら、１９８６）。プロ配列を含
むポリペプチドは、標準的なポリペプチド精製技術によ
って、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞抽出物から得られる（太田およ
び弁上、１９８９、印刷中）。不活性ズブチリシン（プ
ロ配列を含まない）は、同様の方法でＥ、ｃｏｌｉ発現
ベクターｐター７００から得られる（第１図）。

種々の量の変性ｐＨＩ２１６プロズブチリシン変異体を
ｐＨＴ７００ズブチリシンと混合し、透析して変性剤を
除去する。約３時間の透析の後、ｐＨＴ７００ズブチリ
シンが活性を有するようになる。透析の後に回復される
活性は、混合物に加えたｐＨＩ２１６プロズブチリシン
変異体とほぼ比例しており、このことは、二次の反応機
構を示唆している。

本発明の好適実施態様では、発現された不活性ポリペプ
チドを６Ｍグアニジン−ＨＣｌ中で変性させる。ｐＨ７
７００ズブチリシンを６Ｍグアニジン−ＨＣｌ中で変性
し、ｐＨＩ２１６由来の外在的な配列と混合すると、再
折りたたみの効率（生物学的活性）は変性剤が５Ｍ尿素
の場合よりも高くなる。本発明の最も好適な態様では、
グアニジンで変性した発現タンパク質を、透析の前に、
変性した外在的な分子間エフェクター（プロ配列）とと
もに−２０℃付近の温度で１−７日間にわたって予備的
にインキュベートすることが必要とされる。このように
すると、活性ポリペプチドへの復元が最適に行われる。

外在的配列対変性ポリペプチドのモル比（Ｒ）が重要で
ある。不活性ズブチリシン（ｐＨ７７００由来のもの）
と突然変異タンパク質を含有するプロ配列（ｐＨＩ２１
６由来のもの）をＲ値（ｐＨＩ　２１６／ｐＨＴ７００
）が０．２−２．５となるように組合せ、ただちに透析
すると、２−３時間の透析の後に、酵素活性はＲ値が約
１まで直線的に増加した。Ｒが２．５まで増加すると、
活性はＲ＝０．８で観察された最大値の約２５％まで低
減した。透析の前に７日間の予備インキュベーションを
行うと、１より犬のＲ値について、透析開始後２−３時
間で劇的な活性化が観察される。Ｒ＝１．２では、予備
インキュベーションを行わなかった混合物と比べて、活
性が２倍となる。Ｒ値が１．６および２．４では、酵素
活性がさらに増加する。これらのデータから、変性ズブ
チリシンとその折りたたみ用エフェクター配列との間に
は、少なくとも２［ｉの異なった相互作用の様式がある
ことが示唆される。第一の様式は、Ｒが１未満の条件で
予備インキュベーションを行わなかった場合に観察され
、第二の様式は、Ｒが１より大の条件で混合物の予備イ
ンキュベーションを行った場合にのみ観察される。

本発明の別の態様では、エフェクター配列と変性ズブチ
リシン・カールズバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）あるい
はＢＰＮ’　との相互作用によって酵素活性を回復する
ことができる。未変性酵素を低いｐＨで変性し、ｐＨ１
２１６由来の外在的な配列と混合し、透析の前に一２０
℃で７日間予備インキュベーションを行った。Ｒ値が１
．２および２．４では、３時間の透析の後に特異的活性
が回復した。

本明細書で記載するポリペプチド分子はズブチリシンか
ら読導したものに限定されるものではない。当業者であ
れば、本発明の方法によって、種々のポリペプチドが活
性化できることが容易にわかるはずである。

以下の実施例は本発明を例示するために示すものであり
、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるも
のではない。

３ （実施例１） ｐＨＴ７００から生成した不活性ズブチリシンのズブチ
リシンプロ配列による活性化の時間的経過 精製シたｐＨＴ７００ズブチリシンの、６Ｍグアニジン
−）（ＣＩを含有する１　０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７，０）の溶液（０、３ｍｇ７ｍｌｌのもの２０μ
Ｊ２）を、精製したｐＨＩ２１６ブロズブチリシン変異
体の、５Ｍ尿素を含有する５゜ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐ　Ｈ８、１）　ヘの各種濃度の溶液２０μ℃と混合
し、次に混合物をさきに記載した（参考文献）滴下透析
技術を使用して、０．４Ｍ　（ＮＨ４）２　ＳＯ４を含
有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，１）３０　　ｌｌ
１ａｌに対して透析した。その一部を図示した時間に採
取し、ズブチリシンの活性を、基質としてスクシニル−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　　ｐ−ニトロアニリ
ドを使用して３７℃で検定した（太田および弁上、１９
８９（印刷中））。１単位の活性を、１時間当り１Ｍモ
ルのｐ−４ ニトロアニリンを生成する酵素の量として定義した。比
活性は、混合物中のｐＨ７７００ズブチリシンの濃度に
基づいて計算した。ｐＨ１２１６プロズプチリシン変異
体溶液の濃度は以下の通りであった。（０）０．０．（
・）０．０８、（Δ）０．１Ｂ、（ム）０．２３、およ
び（ロ）　０．３２　　、ｍｇ７ｍＪ１．結果（第２図
）から、２時間の透析の後にズブチリシンの活性が検出
され、３時間の透析の後に活性が最大レベルに達したこ
とが示される。３時間の透析の後に回復した活性は、混
合物に加えたｐＨ１２１Ｂプロズブチリシン・変異体の
濃度にほぼ比例していると考えられた。この結果は、ｐ
ＨＩ２１６プロズブチリシン変異体がｐＨ７７００ズブ
チリシンと相互に作用して折りたたみを訣導し、活性を
もつズブチリシンを形成したことを明らかに示している
。

（実施例２） 変性したｐＨＴ７０Ｑズブチリシンの活性化の、ズプヂ
リシンブロ配列の濃度に対する依存性 ｐＨＴ７００ズブチリシンの、６Ｍグアニジン−１（Ｃ
１を含有する１　０　ｍＭＴｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐ　
Ｈ７，０）への溶液（０，３ｍｇ／ｍ℃のもの１５μｆ
Ｌ）を、ｐｍ（Ｔ２１６プロズブチリシン変異体の、５
Ｍ尿素を含有する５　０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩＣＩ（ｐＨ
８，１）への図示したモル比の溶液と混合した。次にこ
れらの混合物を、０．４ＭＣＮＨａ　）２　ＳＯ４を含
有する１０ｍＭ燐酸（ｐＨ７，１）２５　　ｍＪ２に対
して、（・）２時間、および（Ｏ）３時間、（Ａ）２種
の溶液の混合直後、および（Ｂ）混合物を一２０℃に７
日間保存後に透析した。酵素活性を実施例１に記載した
ようにして測定した。結果（第３図）から、変性したｐ
Ｈ７７００ズブチリシンと変性したｐＨ１２１６プロズ
ブチリシン変異体の混合物の予備インキュベーションが
ｐＨＴ７００ズブチリシンの最適な復元に大きく貢献し
、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ中で変性したｐＨ７７００ズ
ブチリシンの方が５Ｍ尿素中に溶解したズブチリシンよ
り効率的な再折りたたみが行われることが示唆される。

（実施例３） ズブヂリシンブロ配列の存在下での酸で変性したズブチ
リシンの復元 Ａ、ズブチリシン・カールスバーグ （Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）（シグマ＝Ｓ　ｉ　ｇｍａ社よ
り人手）およびＢ、ズブチリシンＢＰＮ（ペルリンガ−
＝Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社より人手）を、５０ｍＭクエ
ン酸および１０ｍＭ硼酸の溶液（ＰＨ２，２）に、最終
濃度が０．３ｍｇ／ｍβとなるよう溶解し、次に、６Ｍ
グアニジン−ＨＣｌを含有する１　０　ｍＭＴｒｉｓ−
１１ｃＩ　（ｐ　Ｈ７，０）に対して透析した。次に、
１５μ℃の酸で変性したズブチリシン溶液を、５Ｍ尿素
を含有する５　０　ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ　（ｐ　Ｈ
８、１）　ヘの７ ８ ｐＨ１２１６プロズプヂリシン変異体の溶液１５μ℃と
混合した。得られたｐｔｉは常に７と８の間であった。

使用したｐＨ１２１６プロズブチリシン変異体の濃度は
以下の通りであった。△およびム、Ｏ、Ｏｍｇ／＋ｎＪ
２　；○および・、０．４７ｍｇ／ｍｆｌＨ口および■
、０９５ＩＩ１ｇ／ｍρ。これらの混合物を一２０℃に
７日間保存し、次に、２　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ＋　２およ
び０．５Ｍ（ＮＨ４）２　Ｓ０４を含有する燐酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，１）３０　　ｍｆｌに対して透析
した。酵素活性を実施例１に説明したようにして測定し
た。自果（第４図）から、変性したｐＨＩ２１６ズブチ
リシン変異体を加えない場合には、ズブチリシン・カー
ルズバーグもズブチリシンＢＰＮ’　も、活性ズブチリ
シンへの復元をほとんど示さないことが示唆された。

さまざまな種のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）によって
産生される公知のズブチリシンには、他にもたとえば、
バチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂ、　ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から産生されるズブチリ
シンＢＰＮ’　、バチルス・リケニフオルミス（Ｂ、　
Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・プミリ
ス（Ｂ、　　ｐｕｍＮｉｓ）から産生されるズブチリシ
ン、カールズバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　）、および
バチルス・アミノサラカリティクス（Ｂ、　　ａｍｙｌ
ｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ　　）から産生きれるズ
ブチリシン・アミロサラカリティクス（Ａｍｙｌｏｓａ
ｃｃｈａｒｔｔｉｃｕｓ）がある。これらのズブチリシ
ンも本発明の方法にしたがって、同様に生物学的に活性
化することができる。

イン・ビトロで自動処理して活性のズブチリシンＥとす
る際の精製および特性解析については、下記に挙げた太
田（Ｙ、０ｈｔａ）および弁上（Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ）の
参考文献に記載されている。この文献は文献としてここ
に包含し、本明細書の１部とする。

他のポリペプチドも、上述の方法にしたがって同様に生
物学的に活性化することができる。

なお、ＰＨ１２１６プロズブチリシン変異体およびＰＨ
Ｔ７００不活性ズブ不活性ズブクリシン以下のようにし
て得られたものを用いた。

ズブチリシン発現プラスミドの作製 Ｂａｔｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｊｓ　１６８株の染色
体ＤＮＡを、Ｍａ　ｒｍａ　ｒの方法（Ｍａｒｍｕｒ、
　Ｊ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　３−２０８〜２１８１９６１）　　に従っ
て調製した。

この染色体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ
にて切断後ＤＮＡ断片をプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１８（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）にクローニングした。ズブチリシンＥの遺伝子が
挿入されたＤＮＡの確認を合成オリゴヌクレオヂト（配
列、５’　−ＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＧ−３’
　）をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション
にて行なった。確認したズブチリシンＥの染色体ＤＮＡ
の制限酵素地図は、第５図のごとく示される。

このＤＮＡをさらに制限酵素Ａｃｅ　ＩおよびＸｍｎ１
を切り出し、発現用ベクターｐｒＮ−１１１−ｏｍｐＡ
３（第６図参照、Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、　ｅｔａｌ、
　ＥＭＢＯＪ、　旦２４３７−２４４２１９８４）　へ
ズブチリシンＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片をサブクローニ
ングした。この時ｐ　Ｉ　Ｎ　−ＩＩＩ　−ｏ　ｍ　ｐ
　Ａ　３を制限酵素Ｈｆ　ｎ　ｄ　ＩＩＩにて切断後、
ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片により平滑末端とした
箇所へクローニングした。得られたブラスミ１−をｐＨ
１１２６（第７図）と命名した。

次にｐＨ１１２６を材料として部位特異的変異を行なっ
た。

まず、ＤＮＡ合成機（Ｓｙｓｔｅｃ　Ｍｉｃｒｏｓｙｎ
　１４５０）により第８図に示す合成オリゴヌクレオチ
ドを作製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて精製
しＩｎｏｕｙｅらの方法（Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｍ　ａｎｄ
１ ２ Ｉｎｏｕｙｅ、　　Ｓ、ｉｎ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　
　ｏｆ　　ＤＮＡ、　　ＲＮ八　ａｎｄＴｈｅｉｒ　　
八ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　（Ｎａｒａｎｇ、　　Ｓ　
　ｅｄ、）　　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）　に従いこれを使用
してｐＨ１１２６のズブチリシンＥ部分の塩基配列の一
３６６位から一２５０位までを欠失させた。

得られた大腸菌ｏｍｐＡのシグナルベプヂド、ズブチリ
シンＥのプレ配列のＣ末端側６アミノ酸、ズブチリシン
Ｅのプロ配列およびズブチリシンＥの成熟蛋白質部分を
コードするプラスミドなｐＨＩ２１２と命名した（第９
図）。

ざらにｐＨＩ２１２を同様の方法にて合成オリゴヌクレ
オヂド（第８図、オリゴマーｄ）を使用して部位特異的
変異を行ない、ズブチリシンＥの成熟タンパク質部分３
２位のアスパラギン酸残基をアスパラギンをコートする
様に塩基配列を変換させた（コード部分ＧＡＣをＡＡＣ
へと変換）。得られたプラスミドをｐＨＩ２１６と命名
した。

一方、ｐｕｃｔａにクローニングされたズブチリシンＥ
遺伝子の制限酵素ＦｓｐｌおよびＸｍｎＩにて切り出さ
れるＤＮＡ断片を、ｐ　Ｉ　Ｎ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２　
（Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ。

ＥＭＢＯＪ、　３２３３７−２４４２１９８４）を制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩにて切断後
ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片を作用させて平滑末端
とした箇所へサブクローニングした。得られたプラスミ
ドはｐＨ１１００と命名され、大腸菌ＯｍｐＡシグナル
ペプチド、グルタミン酸、ロイシン次いでズブチリシン
Ｅ成熟蛋白質をコートする塩基配列を有する（第５図）
。さらにｐＨ１１００のグルタミン酸およびロイシンの
２アミノ酸をコードする配列を除去するため既出の方法
にて、合成オリゴヌクレオチド（第８図、オリゴマーｅ
）を使用して部位特異的変異処理を行なった。得られた
プラスミドは大腸菌ｏｍｐＡシグナルペプチドに直接ズ
ブチリシンをコードする塩基配列を有し、ｐＨ７７００
と命名された。（第９図参照） ズブチリシンＥ遺伝子の発現 ｐＨＩ２１６あるいはｐＨ７７０を有する大腸菌ＪＡ２
２１株を２％カザノミノ酸を含むＭ９培地（Ｍｉｌｌｅ
ｒ、　Ｊ、　Ｈ，（１９７２）　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｐ
ｐ４３１−４３２．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にて培養し、ブルーフイ
ルターを使用してクレット値が５０を示した時にイソプ
ロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終
濃度が２ｍＭとなるように添加して遺伝子発現を誘発し
た。２時間後細胞を回収し全細胞蛋白質をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果、構築した
遺伝子に特異的な蛋白質が認められそれらは、各々、総
蛋白質の約１０％であった。

ｐＨＩ２１６を有する大腸菌ＪＡ２２１株ては、４４お
よび４２ＫｄにそれぞれｏｍｐＡシグナルとプロズブチ
リシン変異体の融合蛋白質およびプロズブチリシン変異
体に相当するバンドが認められた。また３２位のアスパ
ラギン酸に置換をおこしていない親プラスミドｐＨＩ２
１２を有するものでは、成熟ズブチリシンに相当するバ
ンドが出現しているのに対しｐＨＩ２１６ではこれに相
当するものは認められなかフた。

方、ｐＨ７７００を有する大腸菌ＪＡ２２１株では、成
熟ズブチリシンに相当するバンドが認められた。しかし
、同様の培養上清あるいは超音波破壊した菌体の可溶性
画分にも実施例１で示す方法にて活性を調べた結果、ズ
ブチリシン性は全く認められなかった。

ｐＨＩ２１６プロズブチリシン変異体およびｐＨ７７０
０不活性ズブチリシンの精製ｐＨ１２１６プロズブチリ
シン変異体を発現した細胞を培養液の約１／１００容の
冷１０ｍＭｔｒｉｓ　ＨＣｕ　　（ｐｔ＋７．０）緩衝
液に懸濁後、超音波処理を行なった（ｍｏｄｅｌ　　Ｗ
−２２０Ｆ、　　Ｖｌｔｒａｓｏｎｉｃ社）。この処理
液を２０，０００ｇにて１０分間遠心分離し、得られた
沈殿を１５ｍｆＬの冷６Ｍグア　５ ６ ニジン塩酸／　１０　ｌＩＩＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＡ　（
ｐＨ７，０）にて溶解した。４℃にて２時間放置後、１
０（１，０（１（ｌ　ｇにて４０分間遠心分離する事に
より不溶物を除去し、上清を１００倍客の５０ｍＭリン
酸ナトリウムカリウム緩衝液（ＰＨ５，０）１５Ｍ尿素
（以下、リン酸−尿素緩衝液と略す）に対して４℃−夜
透析した。

再び、１００．ＯＤＤ　ｇ　、　４０分間の遠心分離に
て不溶物を除去し、上清を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２
００にてゲルろかを行なった（２．５Ｘ　１１４ｃｍ）
。緩衝液にはリン酸−尿素緩衝液を使用した。ここでプ
ロズブチリシン変異体の認められた分画を次にリン酸−
尿素緩衝液にて平衡化させたＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘＣ
−５０カラム（１，５ｘ　１５ｃｍ）　　に供した。

同緩衝液にて洗浄後、０〜０．　５Ｍ　ＮａＣｆＬ／リ
ン酸−尿素緩衝液の濃度勾配にて溶出させ、プロズブチ
リシン変異体を含む分画を回収した。

本分画を限外ろか膜（ＹＭ−１０、アミコン社）にて濃
縮後、ついで１００倍容の５０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣｆｌ
（ｐＨ８，５）７５Ｍ尿素に対して一夜透析した。

次に透析に使用した緩衝液にて平衡化したＱＡＥ−５ａ
ｐｈａｄｅｘ　Ｑ−５０カラム　（１，５ｘ　１５ｃｍ
）に供した。透析したＣＭ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５
０カラムのプロズブチリシン変異体分画を吸着後、同緩
衝液にて洗浄し、０〜０　、　１　Ｍ　　ＮａＣｊ２１
５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩｌ、　（ｐｌ（８，５）１５
Ｍ尿素の濃度勾配にて溶出させた。得られたプロズブチ
リシン変異体を含む分画を限外ろか膜にて濃縮（ＹＭ−
１０、アミコン社）し、これを１５０倍客の１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　ＨＣｕ（＋１１１７．０）１５Ｍ尿素に対し
て透析後、実験に供するまで一２０℃にて保存した。

なお、各精製段階のプロズブチリシン変異体の確認は１
７５％　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて
行なった。

ｐＨＴ７００不活性ズブチリシンの精製についても上記
と同様の方法にて行なった。

参考文献 Ｃ，Ｂ、アンフィンセン、バイオケミカル・ジャーナル
１２８．７３７（１９７２）ｒタンパク貿構造の形成と
安定化ｊ 八ｎｆｉｎｓｅｎ、　　Ｃ，Ｂ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　　Ｊ、　　１２８　　７３７（１９７２）、　　“Ｔ
ｈｅ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔａｂｉｌｉＺ
ａｔｉｏｎｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ
池村および弁上、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミス］・リ−２６３，１２９５９（１９８８）ｒ大腸
菌で産生されたプロズブチリシンのイン・ビトロでの処
理」 Ｉｋｅｌｌｕｒａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｍ、
　Ｊ、　Ｒｉａｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６３．１２９５９　（１９８８）、　　
”Ｉｎ　ｖｉｔｒ。

Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏ−５ｕｂｔｉｌｉ
ｓｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｔ、”地材、高木および弁上、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２．７８５９
、（１９８７）ｒ大腸菌での活性ズブチリシンＥの産生
のためのプロ配列の必要性」Ｉｋｅｍｕｒａ、　Ｈ，、
Ｔａｋａｇｆ、　ｔｌ、　ａｎｄ　Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｍ
。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２．７８５９　（
１９８７）。

”Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｒｏ−５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ａｃｔｉｖｅ　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｅ　１ｎＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ、”Ｊ、キング、ケミカ
ル・エンジニアリング・ニュース、４月１０日号（１９
８９）ｒタンパク買折りたたみの規則を解読する」 Ｋｉｎｇ、　　Ｊ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｅｎｇ、　　Ｎ
ｅｗｓ、　　八ｐｒｉｌ　　１０　１ｓｓｕｅ（１９８
９）、　　”Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｒｕ１
ｅｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　Ｆｏｌｄｉｎｇ 太田および弁上、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー、印刷中（１９８９）「プロズブチリシン
Ｅ、イン・ビトロで自動処理によフて活性ズブチリシン
Ｅとする際の精製と特性解析」 ０ｈｔａ、　Ｙ、　ａｎｄ　Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｍ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

　９ ０ ｉｎ　　ｐｒｅｓｓ　　（１９８９）、　　　”Ｐｒｏ
−５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　　Ｅ；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃ、ｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ　　ｏｆ　　ｉｔｓＡｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　
　ｔｏ　　八ｃｔｉｖｅ　　５ｕｂｔｊｌｊｓｉｎ　　
Ｅ　　ＩｎＶｉｔｒｏ。

Ｓ、Ｄ、パワー　Ｒ，Ｍ、アダムスおよびＪ、Ａ、ウェ
ルズ、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ８３．３０９６　（１９
８６）ｒズブチリシンの分泌および自己タンパク質分解
による成熟」 Ｐｏｗｅｒ、　　Ｓ、　　Ｄ、、　　八ｄａｍｓ、　　
Ｒ，Ｍ、　　ａｎｄ　　Ｗｅｌｌｓ　　Ｊ。

Ａ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　
　Ｓｃｉ、　　［］Ｓ八　８３．　３０８６（１９８６
）、　　”５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｕｔｏｐｒ
ｏｔｅｏｌｙｔｉｃｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　
５ｕｂｔｉｌｉｓ＋ｎ。

Ｓ、−Ｌ、ウォングおよびＲ，Ｈト仁 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６
１．１０１７６　（１９８６）ｒバヂルス・ズブチリス
のプレブロズブヂリシンにおけるシグナルペプチダーゼ
の開裂部位の決定」Ｗｏｎｇ、　Ｓ、　−Ｌ、　ａｎｄ
　Ｄｏｊ、　Ｒ，Ｈ，Ｊ、　ＢｌｏｌＣｈｅｍ、　２６
１．１０１７６　（１９８６）、　　”Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｐａｐｔｉ
ｄａｓｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ　１ｎｔｈｅ　
Ｐｒｅｐｒｏｓｕｂｔ＋１ｉｓｉｎ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ。

■、ザビンおよびＭ、Ｒ，グイラレジョ、アニュアル・
レビュー・オプ・バイオケミストリー、４４．２９５（
１９７５）ｒタンパク貿の相補性」 Ｚａｂ＋ｎ、　　１．　　ａｎｄ　　ＶｉｌｌａｒｅＪ
ｏ、　　Ｍ、　　Ｒ，八ｎｎ、　　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４４．２９５　（１９７５）、　　
”ＰｒｏｔｅｉｎＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａＨｏｎ

【図面の簡単な説明】

第１図は、ズブチリシン発現ベクターであるｐＨＴ７０
０およびｐＨＩ２１６から得られたポリペプチド生成物
の模式図を示す。 第２図は、不活性なズブチリシンの活性化の時間的経緯
を示す。 第３図は、変性ズブチリシンの活性化の、ズブチリシン
プロ配列（プロズブチリシン変異体）の濃度に対する依
存性を示す。 第４図は、酸で変性したズブチリシンのズブチリシンプ
ロ配列（プロズブチリシン変異体）の存在下での復元を
示す。 第５図は、ズブチリシンＥの染色体ＤＮＡの制限酵素地
図を示す図である。 第６図は、発現用ベクターｐ　Ｉ　Ｎ　−ＩＩＩｏｍｐ
Ａ１〜３を示す図である。 第７図は、プラスミドＰ　Ｈ１１２６を示す図である。 第８図は、合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図
である。 第９図は、プラスミドＰＨ１２１２、ＰＨ１１００、Ｐ
Ｈ１１００およびＰＨＩ２１６中に挿入されたズブチリ
シン遺伝子の範囲ならびにＰＨＩ２１６のアミノ酸の変
異部位を示す図である。 ３ （５山／頭１０ 下１．要］１ ｉ ｇ オ リゴマ ５　’　−ＧＣＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＣ
Ｇ−３　’オリゴマ オリゴマ ｄ 一〇 ５　’　−ＧＣＴＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴ
ＴＧＡＣ−３　’５　’　−ＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＧ
ＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴ−３　’３− Ｍ法（ｐＨＩ２１６） ３９１ ３３１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物学的に活性なポリペプチドを生成するにあた
   り、生物学的に不活性または部分的に不活性なポリペプ
   チドを、外在的なペプチド配列とともに処理する工程よ
   りなり、前記の外在的なペプチド配列が、前記ポリペプ
   チドの生物学的に活性なポリペプチドへの折りたたみを
   分子間作用によって補うものである方法。 （２）前記の外在的なペプチド配列が、前記の不活性ま
   たは部分的に不活性なポリペプチドのプロ配列を包含す
   る請求項１に記載の方法。 （３）前記の外在的なペプチド配列が、前記の不活性ま
   たは部分的に不活性なポリペプチドのプロ配列と前記ポ
   リペプチドのアミノ末端断片を包含する請求項１に記載
   の方法。 （４）前記の外在的なペプチド配列が、前記の不活性ま
   たは部分的に不活性なポリペプチドのプロ配列と他のポ
   リペプチドとを包含する請求項１に記載の方法。 （５）前記不活性ポリペプチドが、変性剤を用いた処理
   によって得られたものである請求項１ないし４のいずれ
   かに記載の方法。 （６）前記処理をイン・ビトロで行う請求項１ないし５
   のいずれかに記載の方法。 （７）前記不活性ポリペプチドが、そのプロ配列との共
   有結合を欠くことによって生じたものである請求項１な
   いし６のいずれかに記載の方法。 （８）前記不活性ポリペプチドがズブチリシンで、前記
   ポリペプチド生成物がその生物学的に活性な形態である
   請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。 （９）外在的なペプチドとの分子間相互作用によって、
   生物学的に活性なコンホーメーションに折りたたまれた
   ポリペプチド。 （１０）前記の外在的なペプチド配列が、前記ポリペプ
   チドのプロ配列を包含する請求項９にしたがって折りた
   たまれたポリペプチド。 （１１）前記の外在的なペプチド配列が、前記ポリペプ
   チドのプロ配列およびそのポリペプチドのアミノ末端断
   片を包含する請求項９にしたがって折りたたまれたポリ
   ペプチド。（１２）前記の外在的なペプチド配列が、前
   記ポリペプチドプロ配列と他のポリペプチドとを包含す
   る請求項９にしたがって折りたたまれたポリペプチド。 （１３）前記ポリペプチドがズブチリシンである請求項
   ９ないし１２のいずれかの記載にしたがって折りたたま
   れたポリペプチド。 （１４）（ａ）不活性なズブチリシンを（ｂ）ズブチリ
   シンのプロ配列を含む外在的なペプチド配列と、当該（
   ａ）および当該（ｂ）を変性することによって反応させ
   、変性したポリペプチドをインキュベートし、そして変
   性物から生物学的に活性なポリペプチドを分離する工程
   よりなる請求項８に記載の方法。