JPH03175999A - β―ガラクトシダーゼのための基質 - Google Patents
β―ガラクトシダーゼのための基質Info
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- JPH03175999A JPH03175999A JP2214442A JP21444290A JPH03175999A JP H03175999 A JPH03175999 A JP H03175999A JP 2214442 A JP2214442 A JP 2214442A JP 21444290 A JP21444290 A JP 21444290A JP H03175999 A JPH03175999 A JP H03175999A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、β−ガラクトシダーゼのための基質、それら
の調製、およびアッセイにおけるそれらの利用に関する
。
の調製、およびアッセイにおけるそれらの利用に関する
。
β−ガラクトシダーゼ酵素およびその誘導体は、多数の
アッセイにおいて使われている。β−ガラクトシダーゼ
は様々な基質を加水分解することができる。β−ガラク
トシダーゼ活性を有する酵素(EC3,2,1,23)
を必要とするアッセイのための基質の選択は、酵素反応
が起こる条件および反応生成物の濃度を測定しなければ
ならない条件に左右される。与えられたアッセイのため
に基質を選択する時に考慮すべき重要な因子の幾つかと
しては、溶解性、安定性、酵素親和性、反応の速度、生
じるシグナルの強度、およびアッセイ結果が測定される
吸光波長が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ活性の測
定を伴うアッセイの種類が増加するにつれて、基質にか
かる束縛も増すので、異なる性質を有するより多くの基
質の必要性も高まるだろう。
アッセイにおいて使われている。β−ガラクトシダーゼ
は様々な基質を加水分解することができる。β−ガラク
トシダーゼ活性を有する酵素(EC3,2,1,23)
を必要とするアッセイのための基質の選択は、酵素反応
が起こる条件および反応生成物の濃度を測定しなければ
ならない条件に左右される。与えられたアッセイのため
に基質を選択する時に考慮すべき重要な因子の幾つかと
しては、溶解性、安定性、酵素親和性、反応の速度、生
じるシグナルの強度、およびアッセイ結果が測定される
吸光波長が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ活性の測
定を伴うアッセイの種類が増加するにつれて、基質にか
かる束縛も増すので、異なる性質を有するより多くの基
質の必要性も高まるだろう。
米国特許第4,708,929号明細書は、CEDI八
〇Mへッセイにおいて分析物の濃度を測定するためのE
DおよびEAの利用を教示している。この特許は引用に
より本明細書に組み込まれる。
〇Mへッセイにおいて分析物の濃度を測定するためのE
DおよびEAの利用を教示している。この特許は引用に
より本明細書に組み込まれる。
ヨーロッパ特許出願EP−^−0292169は、β−
ガラクトシダーゼにより加水分解され得る新規基質を開
示している。他のβ−ガラクトシダーゼ基質は、^na
l t、chimica Acta (1984) 1
63 : 67−72 ;5tokesおよびWils
on、 Bioehemistr (1972) 1
1. +1061−1064 、並びにヨーロッパ特許
出願EP−^−0146866に記載されている。
ガラクトシダーゼにより加水分解され得る新規基質を開
示している。他のβ−ガラクトシダーゼ基質は、^na
l t、chimica Acta (1984) 1
63 : 67−72 ;5tokesおよびWils
on、 Bioehemistr (1972) 1
1. +1061−1064 、並びにヨーロッパ特許
出願EP−^−0146866に記載されている。
β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素のための新規基
質が提供される。これらの基質は、ニトロフェニル誘導
体とβ−D−ガラクトピラノシドとの接合体である。前
記基質は、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質、例えば0
NPC(0−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノ
シド)よりもすぐれた酵素基質特性を有する。
質が提供される。これらの基質は、ニトロフェニル誘導
体とβ−D−ガラクトピラノシドとの接合体である。前
記基質は、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質、例えば0
NPC(0−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノ
シド)よりもすぐれた酵素基質特性を有する。
本発明は、β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素によ
る加水分解のための新規基質を提供する。
る加水分解のための新規基質を提供する。
この基質は、それらが従来のβ−ガラクトシダーゼ基質
を上回る有意な利点を有する操作において使用すること
ができる。
を上回る有意な利点を有する操作において使用すること
ができる。
提供される化合物は、次の式(1)により表わされる。
−R
O2
上式中、AまたはBのいずれか一方(両方ではない)が
水素であり、そして水素以外の時、Aはメトキシ(−0
CH,)またはホルミル(−0110)であり、そして
Bは−No2または−CNである。Rはβ−Dガラクト
シジル成分である。
水素であり、そして水素以外の時、Aはメトキシ(−0
CH,)またはホルミル(−0110)であり、そして
Bは−No2または−CNである。Rはβ−Dガラクト
シジル成分である。
具体的には、式(1)の化合物の合成および特性が本明
細書に記載される。これらの化合物の化学名は次のもの
である: Aが一〇CH,である式(I)の化合物は0−メトキシ
−p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(
NGPG)であり; Bが−NO□である式(1)の化合物は3.4−ジニト
ロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(3、4−D
NPG)であり; Bが−CNである式(1)の化合物はm−シアノp−ニ
トロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(m −C
N−NPC)であり;そしてAが−C1(0である式(
1)の化合物は4−ニトロサリチルアルデヒド−β−D
−ガラクトピラノシド(NSPG)である。
細書に記載される。これらの化合物の化学名は次のもの
である: Aが一〇CH,である式(I)の化合物は0−メトキシ
−p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(
NGPG)であり; Bが−NO□である式(1)の化合物は3.4−ジニト
ロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(3、4−D
NPG)であり; Bが−CNである式(1)の化合物はm−シアノp−ニ
トロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(m −C
N−NPC)であり;そしてAが−C1(0である式(
1)の化合物は4−ニトロサリチルアルデヒド−β−D
−ガラクトピラノシド(NSPG)である。
β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素は、ガラクトピ
ラノシド成分のC8と隣接酸素原子との間の結合を加水
分解することにより本発明の化合物に作用する。酵素反
応により遊離されるニトロフェニル誘導体の濃度は、分
光分析法により容易に測定される。
ラノシド成分のC8と隣接酸素原子との間の結合を加水
分解することにより本発明の化合物に作用する。酵素反
応により遊離されるニトロフェニル誘導体の濃度は、分
光分析法により容易に測定される。
本発明の化合物は、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
様々な酵素の基質として用いることができる。これらの
酵素は、β−ガラクトシダーゼ自体、β−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼの断
片もしくは修飾断片の複合体であることができる。特に
着目されるのは、当該基質がβ−ガラクトシダーゼ由来
の2つのペプチドの複合体により加水分解される時であ
り、ここで前記2つのペプチドは、α−相補性断片(ま
たはα−相補性断片が測定しようとする分析物に接合さ
れている誘導体)とα−相補性受容体から戒る。この2
つのβ−ガラクトシダーゼ由来ペプチドの複合体は、一
般に米国特許に4,708,929に記載されているE
AおよびED誘導体であろう。
様々な酵素の基質として用いることができる。これらの
酵素は、β−ガラクトシダーゼ自体、β−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼの断
片もしくは修飾断片の複合体であることができる。特に
着目されるのは、当該基質がβ−ガラクトシダーゼ由来
の2つのペプチドの複合体により加水分解される時であ
り、ここで前記2つのペプチドは、α−相補性断片(ま
たはα−相補性断片が測定しようとする分析物に接合さ
れている誘導体)とα−相補性受容体から戒る。この2
つのβ−ガラクトシダーゼ由来ペプチドの複合体は、一
般に米国特許に4,708,929に記載されているE
AおよびED誘導体であろう。
本明細書中に記載される基質は、β−ガラクトシダーゼ
活性の測定を必要とする操作において使用することがで
きる。例えば、β−ガラクトシダーゼおよびそれの誘導
体は、分子生物学の至る所に多数の用途を見出す。β−
ガラクトシダーゼは、従来の手段によりアッセイするこ
とが困難である遺伝子の発現を、着目遺伝子へのβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の融合により、測定するのに一般
的に使われている。
活性の測定を必要とする操作において使用することがで
きる。例えば、β−ガラクトシダーゼおよびそれの誘導
体は、分子生物学の至る所に多数の用途を見出す。β−
ガラクトシダーゼは、従来の手段によりアッセイするこ
とが困難である遺伝子の発現を、着目遺伝子へのβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の融合により、測定するのに一般
的に使われている。
β−ガラクトシダーゼ−分析物接合体は様々な診断アッ
セイにおいて使用することができる。本発明の化合物は
それらのアッセイと関連して使用することができる。そ
のようなアッセイを用いて、特定のタンパク質、炭水化
物およびポリヌクレオチドを含む様々な化合物の存在お
よび/または濃度を決定することができる。アッセイは
ELISAアッセイを含む不均一アッセイであってもよ
い。特に、本発明の化合物はCEDIA”″Iアッセイ
に使用できる。CEDI^TMアッセイは、分析物また
は交差反応性化合物に接合したβ−ガラクトシダーゼα
相補性断片への抗−分析物抗体の結合反応を使う時に観
察される酵素活性に影響を及ぼす分析物の能力を使って
、分析物の量を測定する。遊離分析物の非存在下では、
観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性は低い。よってC
EDI^TMアッセイでは、分析物の量が増加するにつ
れてβ−ガラクトシダーゼ活性が増加する。CEDIA
”アッセイは、米国特許4,708,929に詳細に記
載されているように、EDとEA間のα補完現象を利用
する。
セイにおいて使用することができる。本発明の化合物は
それらのアッセイと関連して使用することができる。そ
のようなアッセイを用いて、特定のタンパク質、炭水化
物およびポリヌクレオチドを含む様々な化合物の存在お
よび/または濃度を決定することができる。アッセイは
ELISAアッセイを含む不均一アッセイであってもよ
い。特に、本発明の化合物はCEDIA”″Iアッセイ
に使用できる。CEDI^TMアッセイは、分析物また
は交差反応性化合物に接合したβ−ガラクトシダーゼα
相補性断片への抗−分析物抗体の結合反応を使う時に観
察される酵素活性に影響を及ぼす分析物の能力を使って
、分析物の量を測定する。遊離分析物の非存在下では、
観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性は低い。よってC
EDI^TMアッセイでは、分析物の量が増加するにつ
れてβ−ガラクトシダーゼ活性が増加する。CEDIA
”アッセイは、米国特許4,708,929に詳細に記
載されているように、EDとEA間のα補完現象を利用
する。
β−ガラクトシダーゼ活性の測定を伴う方法のための適
当な基質の選択は、幾つかの因子、例えば必要とするア
ッセイの感度、必要とするアッセイの速度、観察される
結果を妨害し得るアッセイ試料中に存在する化合物、酵
素の活性等に依存する。
当な基質の選択は、幾つかの因子、例えば必要とするア
ッセイの感度、必要とするアッセイの速度、観察される
結果を妨害し得るアッセイ試料中に存在する化合物、酵
素の活性等に依存する。
本発明の基質化合物は、様々な状況下において、現在常
用されているβ−ガラクトシダーゼ基質、例えば0NP
Cよりもずっと有用にする性質を有する。
用されているβ−ガラクトシダーゼ基質、例えば0NP
Cよりもずっと有用にする性質を有する。
当該化合物およびβ−ガラクトシダーゼによる当該化合
物の加水分解に関連する化合物は、幾つかの特徴におい
て従来のβ−ガラクトシダーゼ基質と異なっている。そ
れらの異なる特徴の全体が、当該化合物を現在入手可能
なβ−ガラクトシダーゼ基質よりも有用にする。
物の加水分解に関連する化合物は、幾つかの特徴におい
て従来のβ−ガラクトシダーゼ基質と異なっている。そ
れらの異なる特徴の全体が、当該化合物を現在入手可能
なβ−ガラクトシダーゼ基質よりも有用にする。
当該化合物は、それらのニトロフェニル誘導体反応生成
物の吸光特性により、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質
と異なる。当該化合物の加水分解により生成されるニト
ロフェニル誘導体のモル吸光係数は、一般に、従来の0
NPCのようなβ−ガラクトシダーゼ基質の加水分解生
成物のものよりも大きい。反応生成物のモル吸光係数(
ε)が増加すると、アッセイが分光光度的検出に対して
より感受性になる。というのは、一定濃度についてのシ
グナル強度が増加するであろうからである。変調される
結合反応の量が低い時、例えば試料容量が小さい時、分
析物濃度が低い時、または酵素活性が低い時、シグナル
強度の増加は特に望ましいだろう。モル吸光係数の増加
は速度も増加させ、これにより全ての現象が同等になり
、検出可能なシグナルがより迅速に獲得されるため、ア
ッセイが完全になり得る。従って新規基質は、低い吸光
バックグラウンドを有する感度の高いアッセイを生じる
ように、それらの状況下で有利に使用することができる
。
物の吸光特性により、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質
と異なる。当該化合物の加水分解により生成されるニト
ロフェニル誘導体のモル吸光係数は、一般に、従来の0
NPCのようなβ−ガラクトシダーゼ基質の加水分解生
成物のものよりも大きい。反応生成物のモル吸光係数(
ε)が増加すると、アッセイが分光光度的検出に対して
より感受性になる。というのは、一定濃度についてのシ
グナル強度が増加するであろうからである。変調される
結合反応の量が低い時、例えば試料容量が小さい時、分
析物濃度が低い時、または酵素活性が低い時、シグナル
強度の増加は特に望ましいだろう。モル吸光係数の増加
は速度も増加させ、これにより全ての現象が同等になり
、検出可能なシグナルがより迅速に獲得されるため、ア
ッセイが完全になり得る。従って新規基質は、低い吸光
バックグラウンドを有する感度の高いアッセイを生じる
ように、それらの状況下で有利に使用することができる
。
本発明の基質は、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質とは
異なる溶解性を有する。この性質の有用性は、アッセイ
を実施する環境によるだろう。
異なる溶解性を有する。この性質の有用性は、アッセイ
を実施する環境によるだろう。
N5PGの高い水溶解度に注目すべきである〈第1表参
照)。
照)。
該化合物は、優れた加水分解貯蔵安定性を有することも
わかり、このため試薬溶液を調製し、長期間に渡り使用
することが可能である。加えて、当該化合物は、一般に
入手可能な化合物から簡単で効率的で且つ経済的な化学
的方法で調製することができる。
わかり、このため試薬溶液を調製し、長期間に渡り使用
することが可能である。加えて、当該化合物は、一般に
入手可能な化合物から簡単で効率的で且つ経済的な化学
的方法で調製することができる。
本明細書に記載の化合物は、従来のβ−ガラクトシダー
ゼ基質に比べて、特にCEDIA”アッセイにおいて有
用である。
ゼ基質に比べて、特にCEDIA”アッセイにおいて有
用である。
以下の実施例は例示のために与えられ、決して限定のた
めではない。
めではない。
1、o−メトキシ−p−ニトロフェノール(220mg
、^1drich) ■、アセトブロモガラクトース(0,6g、 Sigm
a)■、炭酸カリウム(無水、0.25g)■、アセト
ニトリル(8mN) ■、メタノール(50mff) ■、25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^
1drich) ■、酢酸(0,5ml> モー漿 成分1.I[および■を、磁気撹拌機を取り付けた25
m1のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そし
て室温で24時間撹拌した。反応混合物をr過し、枦液
をアスピレータ−圧にて回転蒸発により(湯浴−50℃
)濃縮ガラスにまで濃縮した。
、^1drich) ■、アセトブロモガラクトース(0,6g、 Sigm
a)■、炭酸カリウム(無水、0.25g)■、アセト
ニトリル(8mN) ■、メタノール(50mff) ■、25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^
1drich) ■、酢酸(0,5ml> モー漿 成分1.I[および■を、磁気撹拌機を取り付けた25
m1のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そし
て室温で24時間撹拌した。反応混合物をr過し、枦液
をアスピレータ−圧にて回転蒸発により(湯浴−50℃
)濃縮ガラスにまで濃縮した。
このガラスを3−のアセトン中に再構成し、そしてこの
溶液を、短波長蛍光団を含む2枚の20cmX 20c
mのシリカゲル分取用プレート (厚さ2000μ、^
naltech)に適用した。プレートを乾燥した後、
クロロホルム中で2回展開した。短波長UV光でプレー
トを照射し、Rf =0.2−0.3の暗青色バンドに
印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取り、アセト
ンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトンを除去する
と透明なオイルが得られた。
溶液を、短波長蛍光団を含む2枚の20cmX 20c
mのシリカゲル分取用プレート (厚さ2000μ、^
naltech)に適用した。プレートを乾燥した後、
クロロホルム中で2回展開した。短波長UV光でプレー
トを照射し、Rf =0.2−0.3の暗青色バンドに
印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取り、アセト
ンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトンを除去する
と透明なオイルが得られた。
このオイルに7mlのメタノールを添加し、そして激し
く撹拌することによりオイルをゆっくり溶解させた。生
じた溶液に0.2mi!の■を滴下添加し、20分間撹
拌した。次いでこの溶液を、60°Cの浴温を有する回
転式エバポレーターにセットし、そして約半分の量に′
?a縮した。残渣を回転式エバポレーターから取り出し
、湿ったpH試験紙に添加した時3μeアリコートの溶
液の添加がわずかに酸性応答を示すまで、溶液を5μl
アリコートの氷酢酸で処理した(10uZの酢酸を使っ
た)。
く撹拌することによりオイルをゆっくり溶解させた。生
じた溶液に0.2mi!の■を滴下添加し、20分間撹
拌した。次いでこの溶液を、60°Cの浴温を有する回
転式エバポレーターにセットし、そして約半分の量に′
?a縮した。残渣を回転式エバポレーターから取り出し
、湿ったpH試験紙に添加した時3μeアリコートの溶
液の添加がわずかに酸性応答を示すまで、溶液を5μl
アリコートの氷酢酸で処理した(10uZの酢酸を使っ
た)。
次いで回転蒸発により溶液を濃縮乾固し、生じたガラス
を真空下に1時間置いた。次いでこの生酸物を35−の
メタノールから結晶化させると、140Bの白色結晶質
粉末が得られた。
を真空下に1時間置いた。次いでこの生酸物を35−の
メタノールから結晶化させると、140Bの白色結晶質
粉末が得られた。
1.5−二トロサリチルアルデヒド(300mg、^I
drich) ■、アセトブロモガラクトース(0,6g、 Sigm
a)■、炭酸カリウム〈無水、0.30g)■、アセト
ニトリル(8ml) ■、メタノール(50rQl) ■、25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^
Idrich) ■、酢酸(0,5mjり L−且 成分子、■および■を、磁気撹拌機を取り付けた25−
のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そして室
温で24時間撹拌した。反応混合物を濾過し、?;’?
iをアスピレータ−圧にて回転蒸発により(湯浴=50
℃〉濃縮ガラスにまで濃縮した。
drich) ■、アセトブロモガラクトース(0,6g、 Sigm
a)■、炭酸カリウム〈無水、0.30g)■、アセト
ニトリル(8ml) ■、メタノール(50rQl) ■、25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^
Idrich) ■、酢酸(0,5mjり L−且 成分子、■および■を、磁気撹拌機を取り付けた25−
のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そして室
温で24時間撹拌した。反応混合物を濾過し、?;’?
iをアスピレータ−圧にて回転蒸発により(湯浴=50
℃〉濃縮ガラスにまで濃縮した。
このガラスを3mlのアセトン中に再構成し、そしてこ
の溶液を、短波長蛍光団を含む2枚の20cmX 20
cmのシリカゲル分収用プレート(厚さ2000μ、^
naltech)に適用した。プレー1へを乾燥した後
、クロロホルム中で2fffl展開した。短波長UV光
でプレートを照射し、Rf =0.1.−0.2の暗青
色バンドに印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取
り、アセトンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトン
を除去すると透明なオイルが得られた。
の溶液を、短波長蛍光団を含む2枚の20cmX 20
cmのシリカゲル分収用プレート(厚さ2000μ、^
naltech)に適用した。プレー1へを乾燥した後
、クロロホルム中で2fffl展開した。短波長UV光
でプレートを照射し、Rf =0.1.−0.2の暗青
色バンドに印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取
り、アセトンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトン
を除去すると透明なオイルが得られた。
このオイルに7mlのメタノールを添加し、そして激し
く撹拌することによりオイルをゆっくり溶解させた。生
じた溶液に0.2mlの■を滴下添加し、20分間撹拌
した。次いでこの溶液を、60℃の浴温を有する回転式
エバポレーターにセラ1〜し、そしてアスピレータ−圧
にて約半分の量に濃縮した。
く撹拌することによりオイルをゆっくり溶解させた。生
じた溶液に0.2mlの■を滴下添加し、20分間撹拌
した。次いでこの溶液を、60℃の浴温を有する回転式
エバポレーターにセラ1〜し、そしてアスピレータ−圧
にて約半分の量に濃縮した。
残渣を回転式エバポレーターから取り出し、湿ったpl
+試験紙に添加した時3μlアリコートの溶液の添加が
わずかに酸性応答を示すまで、溶液を5μlアリコート
の氷酢酸で処理したく15μlの酢酸を使った)。
+試験紙に添加した時3μlアリコートの溶液の添加が
わずかに酸性応答を示すまで、溶液を5μlアリコート
の氷酢酸で処理したく15μlの酢酸を使った)。
次いでこの溶液を回転蒸発により濃縮乾固し、生じたガ
ラスを真空下に1時間置いた。メタノールからの結晶化
は成功しなかったので、15mNの蒸留水で処理し、こ
の溶液をエチルエーテルで抽出<3 X Sni’)
した、水溶液を凍結乾燥用バイアルに入れ、−70℃の
フリーザー中で2時間凍結させ、そして−晩凍結乾燥す
ると、約140岡の淡黄色のふわふわした生成物が得ら
れた。
ラスを真空下に1時間置いた。メタノールからの結晶化
は成功しなかったので、15mNの蒸留水で処理し、こ
の溶液をエチルエーテルで抽出<3 X Sni’)
した、水溶液を凍結乾燥用バイアルに入れ、−70℃の
フリーザー中で2時間凍結させ、そして−晩凍結乾燥す
ると、約140岡の淡黄色のふわふわした生成物が得ら
れた。
■。
3.4−ジニトロフェノール(220mg、 Fluk
a)アセトブロモガラクトース(0,6g、Sigma
)炭酸カリウム(無水、0.25g) アセトニトリル(8−) メタノール(50mt’) 25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^1d
rich) 酢酸(0,5mN> 壬−」艷 成分1.IIおよび■を、磁気撹拌機を収り付けた25
m12のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そ
して室温で24時間撹拌した。反応混合物をr過し、枦
液をアスピレータ−圧にて回転蒸発により(湯浴=50
℃)濃縮ガラスにまで濃縮した。
a)アセトブロモガラクトース(0,6g、Sigma
)炭酸カリウム(無水、0.25g) アセトニトリル(8−) メタノール(50mt’) 25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^1d
rich) 酢酸(0,5mN> 壬−」艷 成分1.IIおよび■を、磁気撹拌機を収り付けた25
m12のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そ
して室温で24時間撹拌した。反応混合物をr過し、枦
液をアスピレータ−圧にて回転蒸発により(湯浴=50
℃)濃縮ガラスにまで濃縮した。
このガラスを3−のアセトン中に再構成し、そしてこの
溶液を、短波長蛍光団を含む2枚の20c+nX 20
cmのシリカ分取用TLCプレート (厚さ2000μ
、^naltech)に適用した。プレートを乾燥した
後、クロロホルム中で2回展開した。短波長UV光でプ
レートを照射し、Rf =0.2−0.3の暗青色バン
ドに印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取り、ア
セトンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトンを除去
すると透明なオイルが得られた。
溶液を、短波長蛍光団を含む2枚の20c+nX 20
cmのシリカ分取用TLCプレート (厚さ2000μ
、^naltech)に適用した。プレートを乾燥した
後、クロロホルム中で2回展開した。短波長UV光でプ
レートを照射し、Rf =0.2−0.3の暗青色バン
ドに印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取り、ア
セトンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトンを除去
すると透明なオイルが得られた。
このオイルに0.3mfの■を含む7mlのメタノール
を添加し、そして20分間激しく撹拌することによりオ
イルをゆっくり溶解させた。ごく薄い黄色の沈澱が次第
に形成され、混合物を1時間放置しておいた。次いで湿
ったpH試験紙に添加した時3μgアリコートの溶液の
添加がわずかに酸性応答を示すまで、混合物を5μlア
リコートの氷酢酸で処理したく10μlの酢酸を使った
〉。生じた固体をp遇し、そして1010−l2’のメ
タノールから結晶化せしめると、1901118の白色
結晶質固体が得られた。
を添加し、そして20分間激しく撹拌することによりオ
イルをゆっくり溶解させた。ごく薄い黄色の沈澱が次第
に形成され、混合物を1時間放置しておいた。次いで湿
ったpH試験紙に添加した時3μgアリコートの溶液の
添加がわずかに酸性応答を示すまで、混合物を5μlア
リコートの氷酢酸で処理したく10μlの酢酸を使った
〉。生じた固体をp遇し、そして1010−l2’のメ
タノールから結晶化せしめると、1901118の白色
結晶質固体が得られた。
夫施組しL: m−シアノ−p−ニトロフェノールのt
腹 一 ■、氷酢酸(9,0mjり ■、酢酸ナトリウム(無水、1.0g)■、塩酸ヒドロ
キシルアミン(0,6g)IV、5−ヒドロキシ−2−
二トロベンズアルデヒド 壬−」走 IとHの混合物を25m1の丸底フラスコ中に入れ、そ
して油浴中で還流させた。該フラスコに蒸留塔をセット
し、そして2m/容量の蒸留物を収集した。
腹 一 ■、氷酢酸(9,0mjり ■、酢酸ナトリウム(無水、1.0g)■、塩酸ヒドロ
キシルアミン(0,6g)IV、5−ヒドロキシ−2−
二トロベンズアルデヒド 壬−」走 IとHの混合物を25m1の丸底フラスコ中に入れ、そ
して油浴中で還流させた。該フラスコに蒸留塔をセット
し、そして2m/容量の蒸留物を収集した。
この時点で反応フラスコを油浴から取り出し、材料■と
■を熱溶液に添加し、そして蒸留塔を還流冷却器に置き
換えた。生じた混合物を油浴中で3時間還流せしめ、次
いで反応フラスコを油浴から取り出し、そして1.5時
間に渡り周囲温度まで冷却した。この間に沈澱が生成し
、これを?過し、10分間吸引乾燥し、次いで真空オー
ブン中に1時間置くと、450mgの黄色固体が得られ
た。この物質のIRスペクトルは、シアノ基の存在を示
す赤外の2250cm” ’に明白な吸収を示し、そし
てm−シアノフェノールのニトロ化から単離された生成
物のものと同じであった。
■を熱溶液に添加し、そして蒸留塔を還流冷却器に置き
換えた。生じた混合物を油浴中で3時間還流せしめ、次
いで反応フラスコを油浴から取り出し、そして1.5時
間に渡り周囲温度まで冷却した。この間に沈澱が生成し
、これを?過し、10分間吸引乾燥し、次いで真空オー
ブン中に1時間置くと、450mgの黄色固体が得られ
た。この物質のIRスペクトルは、シアノ基の存在を示
す赤外の2250cm” ’に明白な吸収を示し、そし
てm−シアノフェノールのニトロ化から単離された生成
物のものと同じであった。
■。
m−シアノ−p−ニトロフェノール(620mg、実施
例4〉 アセトブロモガラクトース(1,8g、 Sigma)
炭酸カリウム(無水、0.9g) アセトニトリル(18mN) メタノール(100ml) 25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^Id
rich) ■、酢酸(0,5m1) 壬−」燵 成分1.IIおよび■を、磁気撹拌機を取り付けた50
−のアーレンマイヤーフラスコに入れた。この混合物に
■を加え、そして室温で24時間撹拌した。反応混合物
を「過し、p液をアスピレータ−圧にて回転蒸発により
(湯浴=50℃〉濃縮ガラスにまで濃縮した。
例4〉 アセトブロモガラクトース(1,8g、 Sigma)
炭酸カリウム(無水、0.9g) アセトニトリル(18mN) メタノール(100ml) 25%ナトリウムメトキシド/メタノール試薬(^Id
rich) ■、酢酸(0,5m1) 壬−」燵 成分1.IIおよび■を、磁気撹拌機を取り付けた50
−のアーレンマイヤーフラスコに入れた。この混合物に
■を加え、そして室温で24時間撹拌した。反応混合物
を「過し、p液をアスピレータ−圧にて回転蒸発により
(湯浴=50℃〉濃縮ガラスにまで濃縮した。
このガラスに10−のメタノールを添加し、そして激し
く撹拌することによりガラスをゆっくりと溶解させた。
く撹拌することによりガラスをゆっくりと溶解させた。
生じた溶液に0.5mlの■を滴下添加し、20分間撹
拌した。次いでこの溶液を、60’Cの浴温を有する回
転式エバポレーターにセットし、そして約半分の量に濃
縮した。残渣を回転式エバポレーターから取り出し、湿
ったpH試験紙に添加した時3μlアリコートの溶液の
添加がわずかに酸性応答を示すまで、溶液を5μlアリ
コートの氷酢酸で処理したく40μ2の酢酸を使った)
。
拌した。次いでこの溶液を、60’Cの浴温を有する回
転式エバポレーターにセットし、そして約半分の量に濃
縮した。残渣を回転式エバポレーターから取り出し、湿
ったpH試験紙に添加した時3μlアリコートの溶液の
添加がわずかに酸性応答を示すまで、溶液を5μlアリ
コートの氷酢酸で処理したく40μ2の酢酸を使った)
。
次いで回転蒸発により溶液を濃縮乾固し、生じたガラス
を真空下に1時間置いた。次いでこの生成物を60m1
のメタノールから結晶化させると、550mgの淡黄色
物質が得られた。
を真空下に1時間置いた。次いでこの生成物を60m1
のメタノールから結晶化させると、550mgの淡黄色
物質が得られた。
夾施員炙;五狂□脱豊迫且質1柚冒U1去第1表は、基
質および反応生成物についての最大吸収波長くλmax
>、基質および反応生成物についてのモル吸光係数ε
、溶解度、および新規基質の自然加水分解速度(安定度
〉を示す。標準的なβガラクトシダーゼ基質である0N
PCを比較のために挙げる。
質および反応生成物についての最大吸収波長くλmax
>、基質および反応生成物についてのモル吸光係数ε
、溶解度、および新規基質の自然加水分解速度(安定度
〉を示す。標準的なβガラクトシダーゼ基質である0N
PCを比較のために挙げる。
4つの本発明の化合物は全て、0NPGで達成されるよ
りも4〜6倍高い反応生成物εを示すことが理解できる
。N5PGの高溶解度にも注目すべきである。高εおよ
び高溶解度のNSPにを用いると、相対シグナル強度と
シグナルの絶体量の両方を増加させることができるので
、アッセイの感度を高めることができる。
りも4〜6倍高い反応生成物εを示すことが理解できる
。N5PGの高溶解度にも注目すべきである。高εおよ
び高溶解度のNSPにを用いると、相対シグナル強度と
シグナルの絶体量の両方を増加させることができるので
、アッセイの感度を高めることができる。
懲よ宍
N5PG 、 19 >40.0
298 14900 382NGPC11,029
87400430m−CN−NPG 5
>8.0 308 9200 40534−D
NPに 6 3.0 280 6
000 400ONPG O,410,0
31520004146500 7600 7000 2400 000 ′加水分解は室温で測定。結果は100μ87meの基
質出発濃度に標準化する。
298 14900 382NGPC11,029
87400430m−CN−NPG 5
>8.0 308 9200 40534−D
NPに 6 3.0 280 6
000 400ONPG O,410,0
31520004146500 7600 7000 2400 000 ′加水分解は室温で測定。結果は100μ87meの基
質出発濃度に標準化する。
見癒肚:鉱災五珪θ遺度−論迫作潰一
β−ガラクトシダーゼおよびED28−ジゴキシゲニン
+EAの基質として働く本発明の基質の能力を測定し、
そして0NPCを用いて得られた結果と比較した。ED
28−ジゴキシゲニン+EAは、それぞれβ−ガラクト
シダーゼα断片−ジゴキシゲニン接合体およびα相補性
受容体である。ED28−ジゴキシゲニンは、1位と4
6位にシスティンを有するβ−ガラクトシダーゼアミノ
酸1−46、および前記システィンに接合したジゴキシ
ゲニンがら成る。
+EAの基質として働く本発明の基質の能力を測定し、
そして0NPCを用いて得られた結果と比較した。ED
28−ジゴキシゲニン+EAは、それぞれβ−ガラクト
シダーゼα断片−ジゴキシゲニン接合体およびα相補性
受容体である。ED28−ジゴキシゲニンは、1位と4
6位にシスティンを有するβ−ガラクトシダーゼアミノ
酸1−46、および前記システィンに接合したジゴキシ
ゲニンがら成る。
EDおよびEAを含むアッセイは、米国特許M4.70
8,929に詳細に記載されている。ED28−ジゴキ
シゲニンとEAは通常CED丁A”アッセイの成分であ
る;しかしながら、この節の実験では抗体は存在しない
。4または5種類の基質濃度を使って結果を得た。アッ
セイ結果を第2表に示す。転換率は、β−ガラクトシダ
ーゼではなく、EA+ED28−ジゴキシゲニンについ
て与えられている。
8,929に詳細に記載されている。ED28−ジゴキ
シゲニンとEAは通常CED丁A”アッセイの成分であ
る;しかしながら、この節の実験では抗体は存在しない
。4または5種類の基質濃度を使って結果を得た。アッ
セイ結果を第2表に示す。転換率は、β−ガラクトシダ
ーゼではなく、EA+ED28−ジゴキシゲニンについ
て与えられている。
2つの酵素とも、0NPCと比較すると、新規基質を用
いて測定した時に約3倍高いVmを明らかに示す。両酵
素は、新規基質の大部分について、0NPGとほぼ同じ
Kmを示す。NGPCは、両醇素に対して0NPGより
幾分低い親和性を示すと思われる。
いて測定した時に約3倍高いVmを明らかに示す。両酵
素は、新規基質の大部分について、0NPGとほぼ同じ
Kmを示す。NGPCは、両醇素に対して0NPGより
幾分低い親和性を示すと思われる。
第2宍
0NPC0,081,00,151,0NSPG
O,113,20,143,03,4−DNPG
O,163,50,192,8m−CN−NPG
O,123,00,142,4CEDI^TMアッセ
イにおいて機能する新規基質の能力をテストした。結果
を第3表に示す。全ての数値ハ、0CNPC(o−クロ
ロニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド)を使
った反応速度と比較したものである。0CNPCは、0
NPGがCEDIA”アッセイでは非常に弱いシグナル
を与えるため0NPCの代わりに標準として使った。T
3 (甲状腺ホルモン、トリョードチロニン)、ジゴ
キシンおよび葉酸についてCHDIA”アッセイを行っ
た。
O,113,20,143,03,4−DNPG
O,163,50,192,8m−CN−NPG
O,123,00,142,4CEDI^TMアッセ
イにおいて機能する新規基質の能力をテストした。結果
を第3表に示す。全ての数値ハ、0CNPC(o−クロ
ロニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド)を使
った反応速度と比較したものである。0CNPCは、0
NPGがCEDIA”アッセイでは非常に弱いシグナル
を与えるため0NPCの代わりに標準として使った。T
3 (甲状腺ホルモン、トリョードチロニン)、ジゴ
キシンおよび葉酸についてCHDIA”アッセイを行っ
た。
第3表中の用語は次のように定義される。〔基質) /
K mは、アッセイに使用する基質の濃度対その基質
に対する酵素のKmの比である。%開放、%阻害、%変
調および%正味の数値は全て、0CNf’Gを使って得
られた結果と比較して与えられている。
K mは、アッセイに使用する基質の濃度対その基質
に対する酵素のKmの比である。%開放、%阻害、%変
調および%正味の数値は全て、0CNf’Gを使って得
られた結果と比較して与えられている。
%開放は、抗体の非存在下での反応速度である。
第3表に示された数値は、0CNPCを用いて得られた
反応速度と比較して与えられている。
反応速度と比較して与えられている。
%抑制は、抗体の非存在下での反応速度とCEDIA”
アッセイにおいて見つかる阻害抗体の存在下での反応速
度との差を、抗体の非存在下での反応速度で割ったもの
として定義される。第3表中に示される数値は、基質と
して0CNPGを用いて得られた数値と比較したもので
ある。
アッセイにおいて見つかる阻害抗体の存在下での反応速
度との差を、抗体の非存在下での反応速度で割ったもの
として定義される。第3表中に示される数値は、基質と
して0CNPGを用いて得られた数値と比較したもので
ある。
%正味は、分析物の非存在下で且つ抗体の存在下でテス
ト基質を使ったCEDIA”アッセイの反応速度と、飽
和量の分析物の存在下(即ち最大獲得反応速度)で且つ
抗体の存在下での同じ反応速度との差を、分析物の非存
在下で且つ抗体の存在下で0CNPGを使った反応速度
と、飽和量の分析物の存在下で且つ抗体の存在下で0C
NPGを使った反応速度との差で割ったものとして定義
される。
ト基質を使ったCEDIA”アッセイの反応速度と、飽
和量の分析物の存在下(即ち最大獲得反応速度)で且つ
抗体の存在下での同じ反応速度との差を、分析物の非存
在下で且つ抗体の存在下で0CNPGを使った反応速度
と、飽和量の分析物の存在下で且つ抗体の存在下で0C
NPGを使った反応速度との差で割ったものとして定義
される。
%変調(modulation)は、分析物の非存在下
で且つ抗体の存在下でのCEDIA”アッセイの反応速
度と、飽和量の分析物の存在下(即ち最大獲得反応速度
)で且つ抗体の存在下での同じ反応速度との差を、飽和
量の分析物の存在下での反応速度について得られた同じ
値により割ったものとして定義される9%変調が大きく
なるにつれて、アッセイが有効となるであろう分析物濃
度範囲が大きくなる。第3表に与えられた数値は、新規
基質について得られた%変調値を、0CNPGについて
得られた%変調値で割ったものである。
で且つ抗体の存在下でのCEDIA”アッセイの反応速
度と、飽和量の分析物の存在下(即ち最大獲得反応速度
)で且つ抗体の存在下での同じ反応速度との差を、飽和
量の分析物の存在下での反応速度について得られた同じ
値により割ったものとして定義される9%変調が大きく
なるにつれて、アッセイが有効となるであろう分析物濃
度範囲が大きくなる。第3表に与えられた数値は、新規
基質について得られた%変調値を、0CNPGについて
得られた%変調値で割ったものである。
新規基質を用いて得られた結果は、0CNPCを用いて
得られたものと有意差はないが、理論上は0CNPCを
用いて得られたものの100%またはそれ以上であろう
ことが第3表かられかる。基質の濃度が2.7X K1
.lから4.lXK11lに増加されると、m −CN
−NPCを用いて得られたT3アッセイ結果が改善され
ることに注目すべきである。
得られたものと有意差はないが、理論上は0CNPCを
用いて得られたものの100%またはそれ以上であろう
ことが第3表かられかる。基質の濃度が2.7X K1
.lから4.lXK11lに増加されると、m −CN
−NPCを用いて得られたT3アッセイ結果が改善され
ることに注目すべきである。
基質
NPC
m−酎−NP
GPG
基質
NPG
m−酎−NPG
GPG
基質
NPG
m−開−NPC
GPC
第3表
ジゴキシンアッセイ
〔基質〕/KI11 %開放
4.0x 92
4.0X 82
4、OX 81
葉酸 アッセイ
〔基質〕/に講 %開放
3.2X 72
2.5X 62
3.2X 85
T3 アッセイ
〔基質〕/K111
3.3×
4.1×
2.0×
高キャリブレータ−
%変調 %正味
572
571
572
高キャリブレータ−
%変調 %正味
658
103 72
102 84
高キャリブレータ−
%変調 %正味
871
300 83
237
〔発明の効果〕
今までの説明と実施例がら明白なように、様々な状況下
でβ−ガラクトシダーゼ活性を検出するのに使用される
、多数の利点を提供する新規化合物が提供される。該化
合物は、多数の望ましい性質、例えば異なる最大吸収波
長、溶解性の結果としての酵素媒質中での増加された速
度、K、およびV□8、合成の容易さ、および高い吸光
係数を特徴する
でβ−ガラクトシダーゼ活性を検出するのに使用される
、多数の利点を提供する新規化合物が提供される。該化
合物は、多数の望ましい性質、例えば異なる最大吸収波
長、溶解性の結果としての酵素媒質中での増加された速
度、K、およびV□8、合成の容易さ、および高い吸光
係数を特徴する
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、次の式 I : ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (上式中、Rはβ−D−ガラクトシジルであり;Aは、
BがHである時、−OCH_3と−CHOから成る群か
ら選択され; Bは、AがHである時、−NO_2と−CNから成る群
から選択され;そして AとBのうちの一方がHである) により表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
酵素により基質として利用される化合物。 2、Aが−OCH_3である、請求項1に記載の化合物
。 3、Bが−NO_2である、請求項1に記載の化合物。 4、Bが−CNである、請求項1に記載の化合物。 5、Aが−CHOである、請求項1に記載の化合物。 6、媒質のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を測定するた
めの改良された方法であって、 次の式 I : ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (上式中、Rはβ−D−ガラクトシジルであり;Aは、
BがHである時、−OCH_3と−CHOから成る群か
ら選択され; Bは、AがHである時、−NO_2と−CNから成る群
から選択され;そして AとBのうちの一方がHである) により表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
酵素により基質として利用される化合物を酵素基質とし
て使用することを含んで成る方法。 7、前記β−ガラクトシダーゼ活性が、活性酵素を形成
するためのβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体断片と酵素
受容体断片との複合体形成の結果としてである、請求項
6に記載の方法。 8、前記酵素供与体断片が、着目の分析物と交差反応性
である化合物と接合されている、請求項7に記載の方法
。 9、前記β−ガラクトシダーゼ酵素活性が不均一アッセ
イにおけるラベルとして使用される、請求項6に記載の
方法。 10、前記不均一アッセイがELISAである、請求項
9に記載の方法。 11、前記アッセイがヌクレオチドプローブの検出のた
めのものである、請求項9に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/394,495 US5444161A (en) | 1989-08-16 | 1989-08-16 | Substrates for β-galactosidase |
US394495 | 2003-03-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03175999A true JPH03175999A (ja) | 1991-07-31 |
JP2732501B2 JP2732501B2 (ja) | 1998-03-30 |
Family
ID=23559201
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2214442A Expired - Fee Related JP2732501B2 (ja) | 1989-08-16 | 1990-08-15 | β―ガラクトシダーゼのための基質 |
Country Status (7)
Country | Link |
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US (2) | US5444161A (ja) |
EP (1) | EP0413561B1 (ja) |
JP (1) | JP2732501B2 (ja) |
AU (1) | AU627611B2 (ja) |
CA (1) | CA1337966C (ja) |
DE (1) | DE69029107T2 (ja) |
ES (1) | ES2095858T3 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP0745222A4 (en) * | 1994-12-19 | 1998-11-25 | Boehringer Mannheim Corp | COMPETITIVE BINDING TESTS WITH IMPROVED LINEARITY |
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WO2013119579A1 (en) | 2012-02-06 | 2013-08-15 | Discoveryx Corporation | Detection of intracellular binding events by measuring protein abundance |
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1989
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- 1989-09-28 CA CA000613947A patent/CA1337966C/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
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- 1990-08-14 EP EP90308937A patent/EP0413561B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-14 DE DE69029107T patent/DE69029107T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-14 AU AU60992/90A patent/AU627611B2/en not_active Ceased
- 1990-08-15 JP JP2214442A patent/JP2732501B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-30 US US08/453,904 patent/US5514560A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2003522113A (ja) * | 1998-10-27 | 2003-07-22 | ユーエービー リサーチ ファンデイション | シアリダーゼの発色基質とその製造法および使用法 |
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