JPH03175999A - β―ガラクトシダーゼのための基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、β−ガラクトシダーゼのための基質、それら
の調製、およびアッセイにおけるそれらの利用に関する
。

〔従来の技術〕

β−ガラクトシダーゼ酵素およびその誘導体は、多数の
アッセイにおいて使われている。β−ガラクトシダーゼ
は様々な基質を加水分解することができる。β−ガラク
トシダーゼ活性を有する酵素（ＥＣ３，２，１，２３）
を必要とするアッセイのための基質の選択は、酵素反応
が起こる条件および反応生成物の濃度を測定しなければ
ならない条件に左右される。与えられたアッセイのため
に基質を選択する時に考慮すべき重要な因子の幾つかと
しては、溶解性、安定性、酵素親和性、反応の速度、生
じるシグナルの強度、およびアッセイ結果が測定される
吸光波長が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ活性の測
定を伴うアッセイの種類が増加するにつれて、基質にか
かる束縛も増すので、異なる性質を有するより多くの基
質の必要性も高まるだろう。

〔関連文献〕

米国特許第４，７０８，９２９号明細書は、ＣＥＤＩ八
〇Ｍへッセイにおいて分析物の濃度を測定するためのＥ
ＤおよびＥＡの利用を教示している。この特許は引用に
より本明細書に組み込まれる。

ヨーロッパ特許出願ＥＰ−＾−０２９２１６９は、β−
ガラクトシダーゼにより加水分解され得る新規基質を開
示している。他のβ−ガラクトシダーゼ基質は、＾ｎａ
ｌ　ｔ、ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　（１９８４）　１
６３　：　６７−７２　；５ｔｏｋｅｓおよびＷｉｌｓ
ｏｎ、　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒ　　（１９７２）　１
１．　＋１０６１−１０６４　、並びにヨーロッパ特許
出願ＥＰ−＾−０１４６８６６に記載されている。

〔課題を解決するための手段〕

β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素のための新規基
質が提供される。これらの基質は、ニトロフェニル誘導
体とβ−Ｄ−ガラクトピラノシドとの接合体である。前
記基質は、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質、例えば０
ＮＰＣ（０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド）よりもすぐれた酵素基質特性を有する。

〔特定の実施態様〕

本発明は、β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素によ
る加水分解のための新規基質を提供する。

この基質は、それらが従来のβ−ガラクトシダーゼ基質
を上回る有意な利点を有する操作において使用すること
ができる。

提供される化合物は、次の式（１）により表わされる。

−Ｒ Ｏ２ 上式中、ＡまたはＢのいずれか一方（両方ではない）が
水素であり、そして水素以外の時、Ａはメトキシ（−０
ＣＨ，）またはホルミル（−０１１０）であり、そして
Ｂは−Ｎｏ２または−ＣＮである。Ｒはβ−Ｄガラクト
シジル成分である。

具体的には、式（１）の化合物の合成および特性が本明
細書に記載される。これらの化合物の化学名は次のもの
である： Ａが一〇ＣＨ，である式（Ｉ）の化合物は０−メトキシ
−ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（
ＮＧＰＧ）であり； Ｂが−ＮＯ□である式（１）の化合物は３．４−ジニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３、４−Ｄ
ＮＰＧ）であり； Ｂが−ＣＮである式（１）の化合物はｍ−シアノｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｍ　−Ｃ
Ｎ−ＮＰＣ）であり；そしてＡが−Ｃ１（０である式（
１）の化合物は４−ニトロサリチルアルデヒド−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（ＮＳＰＧ）である。

β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素は、ガラクトピ
ラノシド成分のＣ８と隣接酸素原子との間の結合を加水
分解することにより本発明の化合物に作用する。酵素反
応により遊離されるニトロフェニル誘導体の濃度は、分
光分析法により容易に測定される。

本発明の化合物は、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
様々な酵素の基質として用いることができる。これらの
酵素は、β−ガラクトシダーゼ自体、β−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼの断
片もしくは修飾断片の複合体であることができる。特に
着目されるのは、当該基質がβ−ガラクトシダーゼ由来
の２つのペプチドの複合体により加水分解される時であ
り、ここで前記２つのペプチドは、α−相補性断片（ま
たはα−相補性断片が測定しようとする分析物に接合さ
れている誘導体）とα−相補性受容体から戒る。この２
つのβ−ガラクトシダーゼ由来ペプチドの複合体は、一
般に米国特許に４，７０８，９２９に記載されているＥ
ＡおよびＥＤ誘導体であろう。

本明細書中に記載される基質は、β−ガラクトシダーゼ
活性の測定を必要とする操作において使用することがで
きる。例えば、β−ガラクトシダーゼおよびそれの誘導
体は、分子生物学の至る所に多数の用途を見出す。β−
ガラクトシダーゼは、従来の手段によりアッセイするこ
とが困難である遺伝子の発現を、着目遺伝子へのβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の融合により、測定するのに一般
的に使われている。

β−ガラクトシダーゼ−分析物接合体は様々な診断アッ
セイにおいて使用することができる。本発明の化合物は
それらのアッセイと関連して使用することができる。そ
のようなアッセイを用いて、特定のタンパク質、炭水化
物およびポリヌクレオチドを含む様々な化合物の存在お
よび／または濃度を決定することができる。アッセイは
ＥＬＩＳＡアッセイを含む不均一アッセイであってもよ
い。特に、本発明の化合物はＣＥＤＩＡ”″Ｉアッセイ
に使用できる。ＣＥＤＩ＾ＴＭアッセイは、分析物また
は交差反応性化合物に接合したβ−ガラクトシダーゼα
相補性断片への抗−分析物抗体の結合反応を使う時に観
察される酵素活性に影響を及ぼす分析物の能力を使って
、分析物の量を測定する。遊離分析物の非存在下では、
観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性は低い。よってＣ
ＥＤＩ＾ＴＭアッセイでは、分析物の量が増加するにつ
れてβ−ガラクトシダーゼ活性が増加する。ＣＥＤＩＡ
”アッセイは、米国特許４，７０８，９２９に詳細に記
載されているように、ＥＤとＥＡ間のα補完現象を利用
する。

β−ガラクトシダーゼ活性の測定を伴う方法のための適
当な基質の選択は、幾つかの因子、例えば必要とするア
ッセイの感度、必要とするアッセイの速度、観察される
結果を妨害し得るアッセイ試料中に存在する化合物、酵
素の活性等に依存する。

本発明の基質化合物は、様々な状況下において、現在常
用されているβ−ガラクトシダーゼ基質、例えば０ＮＰ
Ｃよりもずっと有用にする性質を有する。

当該化合物およびβ−ガラクトシダーゼによる当該化合
物の加水分解に関連する化合物は、幾つかの特徴におい
て従来のβ−ガラクトシダーゼ基質と異なっている。そ
れらの異なる特徴の全体が、当該化合物を現在入手可能
なβ−ガラクトシダーゼ基質よりも有用にする。

当該化合物は、それらのニトロフェニル誘導体反応生成
物の吸光特性により、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質
と異なる。当該化合物の加水分解により生成されるニト
ロフェニル誘導体のモル吸光係数は、一般に、従来の０
ＮＰＣのようなβ−ガラクトシダーゼ基質の加水分解生
成物のものよりも大きい。反応生成物のモル吸光係数（
ε）が増加すると、アッセイが分光光度的検出に対して
より感受性になる。というのは、一定濃度についてのシ
グナル強度が増加するであろうからである。変調される
結合反応の量が低い時、例えば試料容量が小さい時、分
析物濃度が低い時、または酵素活性が低い時、シグナル
強度の増加は特に望ましいだろう。モル吸光係数の増加
は速度も増加させ、これにより全ての現象が同等になり
、検出可能なシグナルがより迅速に獲得されるため、ア
ッセイが完全になり得る。従って新規基質は、低い吸光
バックグラウンドを有する感度の高いアッセイを生じる
ように、それらの状況下で有利に使用することができる
。

本発明の基質は、従来のβ−ガラクトシダーゼ基質とは
異なる溶解性を有する。この性質の有用性は、アッセイ
を実施する環境によるだろう。

Ｎ５ＰＧの高い水溶解度に注目すべきである〈第１表参
照）。

該化合物は、優れた加水分解貯蔵安定性を有することも
わかり、このため試薬溶液を調製し、長期間に渡り使用
することが可能である。加えて、当該化合物は、一般に
入手可能な化合物から簡単で効率的で且つ経済的な化学
的方法で調製することができる。

本明細書に記載の化合物は、従来のβ−ガラクトシダー
ゼ基質に比べて、特にＣＥＤＩＡ”アッセイにおいて有
用である。

以下の実施例は例示のために与えられ、決して限定のた
めではない。

〔実施例〕

１、ｏ−メトキシ−ｐ−ニトロフェノール（２２０ｍｇ
、＾１ｄｒｉｃｈ） ■、アセトブロモガラクトース（０，６ｇ、　Ｓｉｇｍ
ａ）■、炭酸カリウム（無水、０．２５ｇ）■、アセト
ニトリル（８ｍＮ） ■、メタノール（５０ｍｆｆ） ■、２５％ナトリウムメトキシド／メタノール試薬（＾
１ｄｒｉｃｈ） ■、酢酸（０，５ｍｌ＞ モー漿 成分１．Ｉ［および■を、磁気撹拌機を取り付けた２５
ｍ１のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そし
て室温で２４時間撹拌した。反応混合物をｒ過し、枦液
をアスピレータ−圧にて回転蒸発により（湯浴−５０℃
）濃縮ガラスにまで濃縮した。

このガラスを３−のアセトン中に再構成し、そしてこの
溶液を、短波長蛍光団を含む２枚の２０ｃｍＸ　２０ｃ
ｍのシリカゲル分取用プレート　（厚さ２０００μ、＾
ｎａｌｔｅｃｈ）に適用した。プレートを乾燥した後、
クロロホルム中で２回展開した。短波長ＵＶ光でプレー
トを照射し、Ｒｆ　＝０．２−０．３の暗青色バンドに
印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取り、アセト
ンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトンを除去する
と透明なオイルが得られた。

このオイルに７ｍｌのメタノールを添加し、そして激し
く撹拌することによりオイルをゆっくり溶解させた。生
じた溶液に０．２ｍｉ！の■を滴下添加し、２０分間撹
拌した。次いでこの溶液を、６０°Ｃの浴温を有する回
転式エバポレーターにセットし、そして約半分の量に′
？ａ縮した。残渣を回転式エバポレーターから取り出し
、湿ったｐＨ試験紙に添加した時３μｅアリコートの溶
液の添加がわずかに酸性応答を示すまで、溶液を５μｌ
アリコートの氷酢酸で処理した（１０ｕＺの酢酸を使っ
た）。

次いで回転蒸発により溶液を濃縮乾固し、生じたガラス
を真空下に１時間置いた。次いでこの生酸物を３５−の
メタノールから結晶化させると、１４０Ｂの白色結晶質
粉末が得られた。

１．５−二トロサリチルアルデヒド（３００ｍｇ、＾Ｉ
ｄｒｉｃｈ） ■、アセトブロモガラクトース（０，６ｇ、　Ｓｉｇｍ
ａ）■、炭酸カリウム〈無水、０．３０ｇ）■、アセト
ニトリル（８ｍｌ） ■、メタノール（５０ｒＱｌ） ■、２５％ナトリウムメトキシド／メタノール試薬（＾
Ｉｄｒｉｃｈ） ■、酢酸（０，５ｍｊり Ｌ−且 成分子、■および■を、磁気撹拌機を取り付けた２５−
のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そして室
温で２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、？；’？
ｉをアスピレータ−圧にて回転蒸発により（湯浴＝５０
℃〉濃縮ガラスにまで濃縮した。

このガラスを３ｍｌのアセトン中に再構成し、そしてこ
の溶液を、短波長蛍光団を含む２枚の２０ｃｍＸ　２０
ｃｍのシリカゲル分収用プレート（厚さ２０００μ、＾
ｎａｌｔｅｃｈ）に適用した。プレー１へを乾燥した後
、クロロホルム中で２ｆｆｆｌ展開した。短波長ＵＶ光
でプレートを照射し、Ｒｆ　＝０．１．−０．２の暗青
色バンドに印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取
り、アセトンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトン
を除去すると透明なオイルが得られた。

このオイルに７ｍｌのメタノールを添加し、そして激し
く撹拌することによりオイルをゆっくり溶解させた。生
じた溶液に０．２ｍｌの■を滴下添加し、２０分間撹拌
した。次いでこの溶液を、６０℃の浴温を有する回転式
エバポレーターにセラ１〜し、そしてアスピレータ−圧
にて約半分の量に濃縮した。

残渣を回転式エバポレーターから取り出し、湿ったｐｌ
＋試験紙に添加した時３μｌアリコートの溶液の添加が
わずかに酸性応答を示すまで、溶液を５μｌアリコート
の氷酢酸で処理したく１５μｌの酢酸を使った）。

次いでこの溶液を回転蒸発により濃縮乾固し、生じたガ
ラスを真空下に１時間置いた。メタノールからの結晶化
は成功しなかったので、１５ｍＮの蒸留水で処理し、こ
の溶液をエチルエーテルで抽出＜３　Ｘ　Ｓｎｉ’）　
した、水溶液を凍結乾燥用バイアルに入れ、−７０℃の
フリーザー中で２時間凍結させ、そして−晩凍結乾燥す
ると、約１４０岡の淡黄色のふわふわした生成物が得ら
れた。

■。

３．４−ジニトロフェノール（２２０ｍｇ、　Ｆｌｕｋ
ａ）アセトブロモガラクトース（０，６ｇ、Ｓｉｇｍａ
）炭酸カリウム（無水、０．２５ｇ） アセトニトリル（８−） メタノール（５０ｍｔ’） ２５％ナトリウムメトキシド／メタノール試薬（＾１ｄ
ｒｉｃｈ） 酢酸（０，５ｍＮ＞ 壬−」艷 成分１．ＩＩおよび■を、磁気撹拌機を収り付けた２５
ｍ１２のフラスコに入れた。この混合物に■を加え、そ
して室温で２４時間撹拌した。反応混合物をｒ過し、枦
液をアスピレータ−圧にて回転蒸発により（湯浴＝５０
℃）濃縮ガラスにまで濃縮した。

このガラスを３−のアセトン中に再構成し、そしてこの
溶液を、短波長蛍光団を含む２枚の２０ｃ＋ｎＸ　２０
ｃｍのシリカ分取用ＴＬＣプレート　（厚さ２０００μ
、＾ｎａｌｔｅｃｈ）に適用した。プレートを乾燥した
後、クロロホルム中で２回展開した。短波長ＵＶ光でプ
レートを照射し、Ｒｆ　＝０．２−０．３の暗青色バン
ドに印をつけた。このシリカゲルバンドを切り取り、ア
セトンで溶出せしめ、そして溶出液からアセトンを除去
すると透明なオイルが得られた。

このオイルに０．３ｍｆの■を含む７ｍｌのメタノール
を添加し、そして２０分間激しく撹拌することによりオ
イルをゆっくり溶解させた。ごく薄い黄色の沈澱が次第
に形成され、混合物を１時間放置しておいた。次いで湿
ったｐＨ試験紙に添加した時３μｇアリコートの溶液の
添加がわずかに酸性応答を示すまで、混合物を５μｌア
リコートの氷酢酸で処理したく１０μｌの酢酸を使った
〉。生じた固体をｐ遇し、そして１０１０−ｌ２’のメ
タノールから結晶化せしめると、１９０１１１８の白色
結晶質固体が得られた。

夫施組しＬ：　ｍ−シアノ−ｐ−ニトロフェノールのｔ
腹 一 ■、氷酢酸（９，０ｍｊり ■、酢酸ナトリウム（無水、１．０ｇ）■、塩酸ヒドロ
キシルアミン（０，６ｇ）ＩＶ、５−ヒドロキシ−２−
二トロベンズアルデヒド 壬−」走 ＩとＨの混合物を２５ｍ１の丸底フラスコ中に入れ、そ
して油浴中で還流させた。該フラスコに蒸留塔をセット
し、そして２ｍ／容量の蒸留物を収集した。

この時点で反応フラスコを油浴から取り出し、材料■と
■を熱溶液に添加し、そして蒸留塔を還流冷却器に置き
換えた。生じた混合物を油浴中で３時間還流せしめ、次
いで反応フラスコを油浴から取り出し、そして１．５時
間に渡り周囲温度まで冷却した。この間に沈澱が生成し
、これを？過し、１０分間吸引乾燥し、次いで真空オー
ブン中に１時間置くと、４５０ｍｇの黄色固体が得られ
た。この物質のＩＲスペクトルは、シアノ基の存在を示
す赤外の２２５０ｃｍ”　’に明白な吸収を示し、そし
てｍ−シアノフェノールのニトロ化から単離された生成
物のものと同じであった。

■。

ｍ−シアノ−ｐ−ニトロフェノール（６２０ｍｇ、実施
例４〉 アセトブロモガラクトース（１，８ｇ、　Ｓｉｇｍａ）
炭酸カリウム（無水、０．９ｇ） アセトニトリル（１８ｍＮ） メタノール（１００ｍｌ） ２５％ナトリウムメトキシド／メタノール試薬（＾Ｉｄ
ｒｉｃｈ） ■、酢酸（０，５ｍ１） 壬−」燵 成分１．ＩＩおよび■を、磁気撹拌機を取り付けた５０
−のアーレンマイヤーフラスコに入れた。この混合物に
■を加え、そして室温で２４時間撹拌した。反応混合物
を「過し、ｐ液をアスピレータ−圧にて回転蒸発により
（湯浴＝５０℃〉濃縮ガラスにまで濃縮した。

このガラスに１０−のメタノールを添加し、そして激し
く撹拌することによりガラスをゆっくりと溶解させた。

生じた溶液に０．５ｍｌの■を滴下添加し、２０分間撹
拌した。次いでこの溶液を、６０’Ｃの浴温を有する回
転式エバポレーターにセットし、そして約半分の量に濃
縮した。残渣を回転式エバポレーターから取り出し、湿
ったｐＨ試験紙に添加した時３μｌアリコートの溶液の
添加がわずかに酸性応答を示すまで、溶液を５μｌアリ
コートの氷酢酸で処理したく４０μ２の酢酸を使った）
。

次いで回転蒸発により溶液を濃縮乾固し、生じたガラス
を真空下に１時間置いた。次いでこの生成物を６０ｍ１
のメタノールから結晶化させると、５５０ｍｇの淡黄色
物質が得られた。

夾施員炙；五狂□脱豊迫且質１柚冒Ｕ１去第１表は、基
質および反応生成物についての最大吸収波長くλｍａｘ
　＞、基質および反応生成物についてのモル吸光係数ε
、溶解度、および新規基質の自然加水分解速度（安定度
〉を示す。標準的なβガラクトシダーゼ基質である０Ｎ
ＰＣを比較のために挙げる。

４つの本発明の化合物は全て、０ＮＰＧで達成されるよ
りも４〜６倍高い反応生成物εを示すことが理解できる
。Ｎ５ＰＧの高溶解度にも注目すべきである。高εおよ
び高溶解度のＮＳＰにを用いると、相対シグナル強度と
シグナルの絶体量の両方を増加させることができるので
、アッセイの感度を高めることができる。

懲よ宍 Ｎ５ＰＧ　　、　　　１９　　　　　＞４０．０　　　
２９８　　１４９００　　３８２ＮＧＰＣ１１，０２９
８７４００４３０ｍ−ＣＮ−ＮＰＧ　　　５　　　　　
＞８．０　　　３０８　　９２００　　４０５３４−Ｄ
ＮＰに　　　６　　　　　　３．０　　　２８０　　６
０００　　４００ＯＮＰＧ　　　　　　Ｏ，４１０，０
３１５２０００４１４６５００ ７６００ ７０００ ２４００ ０００ ′加水分解は室温で測定。結果は１００μ８７ｍｅの基
質出発濃度に標準化する。

見癒肚：鉱災五珪θ遺度−論迫作潰一 β−ガラクトシダーゼおよびＥＤ２８−ジゴキシゲニン
＋ＥＡの基質として働く本発明の基質の能力を測定し、
そして０ＮＰＣを用いて得られた結果と比較した。ＥＤ
２８−ジゴキシゲニン＋ＥＡは、それぞれβ−ガラクト
シダーゼα断片−ジゴキシゲニン接合体およびα相補性
受容体である。ＥＤ２８−ジゴキシゲニンは、１位と４
６位にシスティンを有するβ−ガラクトシダーゼアミノ
酸１−４６、および前記システィンに接合したジゴキシ
ゲニンがら成る。

ＥＤおよびＥＡを含むアッセイは、米国特許Ｍ４．７０
８，９２９に詳細に記載されている。ＥＤ２８−ジゴキ
シゲニンとＥＡは通常ＣＥＤ丁Ａ”アッセイの成分であ
る；しかしながら、この節の実験では抗体は存在しない
。４または５種類の基質濃度を使って結果を得た。アッ
セイ結果を第２表に示す。転換率は、β−ガラクトシダ
ーゼではなく、ＥＡ＋ＥＤ２８−ジゴキシゲニンについ
て与えられている。

２つの酵素とも、０ＮＰＣと比較すると、新規基質を用
いて測定した時に約３倍高いＶｍを明らかに示す。両酵
素は、新規基質の大部分について、０ＮＰＧとほぼ同じ
Ｋｍを示す。ＮＧＰＣは、両醇素に対して０ＮＰＧより
幾分低い親和性を示すと思われる。

第２宍 ０ＮＰＣ０，０８１，００，１５１，０ＮＳＰＧ　　　
　Ｏ，１１３，２０，１４３，０３，４−ＤＮＰＧ　　
　Ｏ，１６３，５０，１９２，８ｍ−ＣＮ−ＮＰＧ　　
　Ｏ，１２３，００，１４２，４ＣＥＤＩ＾ＴＭアッセ
イにおいて機能する新規基質の能力をテストした。結果
を第３表に示す。全ての数値ハ、０ＣＮＰＣ（ｏ−クロ
ロニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を使
った反応速度と比較したものである。０ＣＮＰＣは、０
ＮＰＧがＣＥＤＩＡ”アッセイでは非常に弱いシグナル
を与えるため０ＮＰＣの代わりに標準として使った。Ｔ
３　　（甲状腺ホルモン、トリョードチロニン）、ジゴ
キシンおよび葉酸についてＣＨＤＩＡ”アッセイを行っ
た。

第３表中の用語は次のように定義される。〔基質）　／
　Ｋ　ｍは、アッセイに使用する基質の濃度対その基質
に対する酵素のＫｍの比である。％開放、％阻害、％変
調および％正味の数値は全て、０ＣＮｆ’Ｇを使って得
られた結果と比較して与えられている。

％開放は、抗体の非存在下での反応速度である。

第３表に示された数値は、０ＣＮＰＣを用いて得られた
反応速度と比較して与えられている。

％抑制は、抗体の非存在下での反応速度とＣＥＤＩＡ”
アッセイにおいて見つかる阻害抗体の存在下での反応速
度との差を、抗体の非存在下での反応速度で割ったもの
として定義される。第３表中に示される数値は、基質と
して０ＣＮＰＧを用いて得られた数値と比較したもので
ある。

％正味は、分析物の非存在下で且つ抗体の存在下でテス
ト基質を使ったＣＥＤＩＡ”アッセイの反応速度と、飽
和量の分析物の存在下（即ち最大獲得反応速度）で且つ
抗体の存在下での同じ反応速度との差を、分析物の非存
在下で且つ抗体の存在下で０ＣＮＰＧを使った反応速度
と、飽和量の分析物の存在下で且つ抗体の存在下で０Ｃ
ＮＰＧを使った反応速度との差で割ったものとして定義
される。

％変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、分析物の非存在下
で且つ抗体の存在下でのＣＥＤＩＡ”アッセイの反応速
度と、飽和量の分析物の存在下（即ち最大獲得反応速度
）で且つ抗体の存在下での同じ反応速度との差を、飽和
量の分析物の存在下での反応速度について得られた同じ
値により割ったものとして定義される９％変調が大きく
なるにつれて、アッセイが有効となるであろう分析物濃
度範囲が大きくなる。第３表に与えられた数値は、新規
基質について得られた％変調値を、０ＣＮＰＧについて
得られた％変調値で割ったものである。

新規基質を用いて得られた結果は、０ＣＮＰＣを用いて
得られたものと有意差はないが、理論上は０ＣＮＰＣを
用いて得られたものの１００％またはそれ以上であろう
ことが第３表かられかる。基質の濃度が２．７Ｘ　Ｋ１
．ｌから４．ｌＸＫ１１ｌに増加されると、ｍ　−ＣＮ
−ＮＰＣを用いて得られたＴ３アッセイ結果が改善され
ることに注目すべきである。

基質 ＮＰＣ ｍ−酎−ＮＰ ＧＰＧ 基質 ＮＰＧ ｍ−酎−ＮＰＧ ＧＰＧ 基質 ＮＰＧ ｍ−開−ＮＰＣ ＧＰＣ 第３表 ジゴキシンアッセイ 〔基質〕／ＫＩ１１　　　％開放 ４．０ｘ　　　　　　　９２ ４．０Ｘ　　　　　　　８２ ４、ＯＸ　　　　　　　８１ 葉酸　アッセイ 〔基質〕／に講　　％開放 ３．２Ｘ　　　　　　　７２ ２．５Ｘ　　　　　　　６２ ３．２Ｘ　　　　　　　８５ Ｔ３　アッセイ 〔基質〕／Ｋ１１１ ３．３× ４．１× ２．０× 高キャリブレータ− ％変調　　％正味 ５７２ ５７１ ５７２ 高キャリブレータ− ％変調　　％正味 ６５８ １０３　　　　７２ １０２　　　　８４ 高キャリブレータ− ％変調　　％正味 ８７１ ３００　　　　８３ ２３７ 〔発明の効果〕 今までの説明と実施例がら明白なように、様々な状況下
でβ−ガラクトシダーゼ活性を検出するのに使用される
、多数の利点を提供する新規化合物が提供される。該化
合物は、多数の望ましい性質、例えば異なる最大吸収波
長、溶解性の結果としての酵素媒質中での増加された速
度、Ｋ、およびＶ□８、合成の容易さ、および高い吸光
係数を特徴する

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （上式中、Ｒはβ−Ｄ−ガラクトシジルであり；Ａは、
   ＢがＨである時、−ＯＣＨ＿３と−ＣＨＯから成る群か
   ら選択され； Ｂは、ＡがＨである時、−ＮＯ＿２と−ＣＮから成る群
   から選択され；そして ＡとＢのうちの一方がＨである） により表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
   酵素により基質として利用される化合物。 ２、Ａが−ＯＣＨ＿３である、請求項１に記載の化合物
   。 ３、Ｂが−ＮＯ＿２である、請求項１に記載の化合物。 ４、Ｂが−ＣＮである、請求項１に記載の化合物。 ５、Ａが−ＣＨＯである、請求項１に記載の化合物。 ６、媒質のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を測定するた
   めの改良された方法であって、 次の式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （上式中、Ｒはβ−Ｄ−ガラクトシジルであり；Ａは、
   ＢがＨである時、−ＯＣＨ＿３と−ＣＨＯから成る群か
   ら選択され； Ｂは、ＡがＨである時、−ＮＯ＿２と−ＣＮから成る群
   から選択され；そして ＡとＢのうちの一方がＨである） により表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
   酵素により基質として利用される化合物を酵素基質とし
   て使用することを含んで成る方法。 ７、前記β−ガラクトシダーゼ活性が、活性酵素を形成
   するためのβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体断片と酵素
   受容体断片との複合体形成の結果としてである、請求項
   ６に記載の方法。 ８、前記酵素供与体断片が、着目の分析物と交差反応性
   である化合物と接合されている、請求項７に記載の方法
   。 ９、前記β−ガラクトシダーゼ酵素活性が不均一アッセ
   イにおけるラベルとして使用される、請求項６に記載の
   方法。 １０、前記不均一アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項
   ９に記載の方法。 １１、前記アッセイがヌクレオチドプローブの検出のた
   めのものである、請求項９に記載の方法。