JPH0315397A - グリチルレチン酸グルコシルエステルの製造法および抗炎症剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、グリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステ
ルの製造法、およびグリチルレチン酸β一トグルコシル
エステルの医薬品としての利用に関するものである。

〔従来の技術〕

甘草から抽出されるグリチルリチンは、抗炎症剤、抗潰
瘍剤、抗アレルギー剤等に広く利用されているが、その
薬理作用は、グリチルリチンのアグリコンであるグリチ
ルレチン酸に基づくものであることが明らかにされつつ
ある。

グリチルレチン酸から副作用のない医薬品となりうる誘
導体を得ようとする試みは幾つかあるが、グリチルレチ
ン酸を再び配糖体の形にする修飾により医薬品として有
用なものを得ようとする試みは少ない。その一例は、グ
リチルレチン酸の３０位にβ一Ｄ−グルコピラノースを
エステル結合させた配糖体の合或であり、グリチルレチ
ン酸のナトリウム塩をジメチルホルムアミドに溶解し、
アセトブロモグルコースと共に撹拌して反応させ、脱ア
セチル化してグリチルレチン酸β−Ｄ−グノレコシノレ
エステノレを得！ものでＪ＞６ＣＣｋｅ鵬．Ｐｋａｒ鳳
．Ｂｗ１ｌ．Ｈ（７），Ｈ目〜１０３（１！７４））。

しかしながら、この合或法は多段の化学反応と分離精製
工程等の繁雑な操作が必要である。なお、この化合物の
薬理作用については、ほとんど検討されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、グリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシル
エステルのより有利な製造法と利用法を提供することに
ある。

（課題を解決するための手段） 上記目的を達或することに或功した本発明のグリチルレ
チン酸β−Ｄ−グルコシルエステルの製造法は、グリチ
ルレチン酸またはグリチルレチン酸塩（以下、グリチル
レチンという）を含む培地でユーカリ属植物の細胞を培
養し、培養液よりグリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシル
エステルを採取することを特徴とする。

以下、この製造法について述べる。

ユーカリ細胞の培養に用いる培地としては、植物の組織
培養に通常使用される培地、すなわち、無機戊分および
炭素源を必須虞分として含有し、ほかに植物ホルモン類
、ビタミン類、アミノ酸類等が適宜配合されたものを用
いることができる。無機或分としては、通常、窒素、リ
ン、カリウム、鉄、亜鉛、モリブデン、ホウ素、コバル
ト、ヨウ素、カルシウム、マグネシウム、マンガン、塩
素、ナトリウム等が使用される。炭素源としては、シヨ
糖その他の炭水化物の他に、有機酸等が使用される。植
物ホルモンには、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレ
ン酢酸（ＮＡＡ）　、２．４−ジクロロ７エノキシ酢酸
（！，４−Ｄ）等のオーキシン類、カイネチン（Ｋ）、
ペンジルアデニン（ＢＡ）等のサイトカイニン類が用い
られる。具体的には、植物の組臓培養に使用されている
ムラシゲ・スクーグ（Ｍ＋＋ｒ＊ｓｉ（ｅ−Ｓｋ＠●ｇ
）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓ−ｍｘ
ｉｅｒ　＆　ＳｋｏＢ）の培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ
）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂ●ｒｔ）のＢ５培地等
に、前記した炭素源および植物ホルモンを添加し、さら
に、必要に応じて前記ビタミン類、アミノ酸類、ココナ
ッツミルク、酵母エキス等の天然物を添加して調製され
た培地を使用することができる。本発明の製造法におけ
るユーカリ細胞の培養には、これらの中でも特にムラシ
ゲ●スクーグの培地を用いて調製した培地が好ましく、
その組成例を下記に示す。

ＫＮＯ． ＮＨ．ＮＯ． ＫＨ．ＰＯ． Ｈ３ＢＯ． ＫＩ Ｎ＊ＭｅＯ， Ｃ　ａｃ　Ｉ，−６　Ｈ　．Ｏ Ｃ　＊Ｃ　ｌｔａ２　Ｈ　！Ｏ ＭｔＳ　Ｏ　ａ・７Ｈ，Ｏ ＭＩＳＯ４”４８！Ｏ ＺＩＩＳＯｓ”７Ｈ１０ ＣＩＳＯ４●５Ｈ，Ｏ Ｎｓ，・ＥＤＴＡ ＦｅＳＯ．−７８．０ イノシトール チアミン塩酸塩 ニコチン酸 ピリドキシン塩酸塩 べ冫ジノレアデニン シ３糖 １　９　０　０ａｔ／ａ ｌ　６　５　０ １７０ ６．２ ０．８　３ ０　．２　５ ０．０２５ ４　４　０ ３７０ ２　２．３ １０．６ ０．０２５ ３　７．３ ２　７　．８ １　０　０ ０．１ ０．５ ０．５ １．０ ３　０　ｔ／Ｌ ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　５．７（以下、こ
の培地をＭＳＢＡＩ培地という）また、本発明の製造法
において用いるユーカリ属植物は、特に限定されるもの
ではないが、適当なものとしては、Ｅｕｃｓｌ７１ｍｓ
　ｐｓｒｒｉｉｉａ＋ａ、ＥｍｃａｌｙＬｉｓ　ｇｌｏ
ｂｕｌｕｓ，Ｅｍｃａｌ７１ｍｓ　ｃｉｌｒｉｏｄｏｒ
＊，　Ｅｕｃａｌｙｔｗｓ　ｃａｌｏｐｈｙｌｌｓ，　
ｂｃｓ−１２１ａｓ　　ｄｉｖｅｓ，Ｅｗｃｓｌｙｔａ
ｓ　　ｐｏｌｙｂｒ＊ｃｔｅｓ、Ｅ＋＋ｅａｌｙ’ｔ＋
＋ｓｒｓｄｉ＊ｔｓ等を挙げることができる。

上述の培地を用いて行うユーカリ属植物細胞の培養は、
いわゆるカルス培養である。すなわち、ユーカリ属植物
の若い組織の切片を茎や葉の部分あるいは種子から取り
、たとえば７０％アルコールで滅菌すると共に表面のワ
ックス分を除去し、滅菌水で洗浄後、ｌＯ％サラシ粉で
２回洗浄し、その後、適当な大きさに切断してＭＳＢＩ
寒天培地に植え付け、カルスを誘導する。得られたカル
スを液体培地に接種し、温度１５〜４０℃、好ましくは
２０〜３０℃の暗所中で、好気的条件下で２〜４週間振
盪培養する。

グリチルレチンは、エタノール溶液にしておき、上述の
ような液体培養における細胞数が好ましくは最大に達し
た後、移植したユーカリ細胞１重量部に対してグリチル
レチン０．００１〜０．１重量部の割合で添加する。同
時に、グルコースを０．１−１重量部、添加してもよい
（ただし、グリチルレチンのグルコシル化に必要なグル
コースは、培地中の他の炭素涼からも合戒されるので、
グルコースは本発明の製造法に用いる培地の必須戊分で
はない。）。引続き３日ないし十数日間振盪培養すると
、添加されたグリチルレチンはユーカリ属植物細胞に吸
収されたのち細胞中で配糖体化されて、グリチノレレチ
ン酸β−Ｄ−グノレコシノレエステノレを生じる。培養
中、ユーカリ細胞は茎葉や根などの器官に分化せず、カ
ルスのままである。

培養液からグリチルレチン酸β一Ｄ−グルコシルエステ
ルを採取するには、遠心分離により細胞を培地から分離
し、得られた細胞をホモゲナイザ一等で処理して破砕し
、固形物を濾別後、濾液から抽出、クロマトグラ７イ一
等、任意の分離精製手段により目的物を単離する。

本発明はまた、上述のようにして容易に製造が可能にな
ったグリチルレチン酸β一Ｄ−グルコシルエステルから
なる抗炎症剤を提供するものである。

グリチルレチン酸β一Ｄ−グルコシルエステルの抗炎症
作用は従来知られていない。この化合物は、抗炎症作用
においてグリチルリチンよりも優れ、グリチルレチン酸
とほぼ同等であることが確認された。

グリチルレチン酸β一Ｄ−グルコシルエステルからなる
抗炎症剤は、通常、皮膚塗布剤または経口投与剤の形で
利用することができる。皮膚塗布剤とする場合は、グリ
チルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステルを塗布剤全量
のＯ．ＯＳ〜５重量％、好ましくは０．１〜２．０重量
％程度、含有させる。製剤化に当たっては、グリチルレ
チン酸β−Ｄ−グルコシルエステルの抗炎症作用を損な
わない範囲で、保湿剤、粘着剤、防腐剤、界面活性剤、
金属イオン封鎖剤等を配合してもよい。一方、経口投与
の場合は、患者の午令、症状にもよるが、般的には虞人
１日当たり約１０〜２０１ｍｇの範囲で用いることによ
り十分な効果が期待できる。この場合も、必要に応じて
、賦形剤を用いて顆粒剤や錠剤にしたり、カプセル剤に
したりすることができる。

〔発明の効果〕

本発明の製造法は上述のようにユーカリ属植物細胞内の
代謝反応を利用するので、複雑な化学合或反応によらず
にグリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステルを得る
ことができ、経済性と安全性の点で優れている。

まｔ二、グリチノレレチン酸β−Ｄ−グノレコシノレエ
ステノレを有効或分とする本発明の抗炎症剤は、グリチ
ルレチン酸やグリチルリチンと同様に抗炎症剤として広
く利用されることが期待される。

〔実施例〕

実施例ｌ ツキヌキユーカリ（Ｅａｅａｌｙｌｉ＋ｓ　ｐｅｒｒｉ
鳳ｉａ＊ａ）のＢＡｌ株［Ｐｈｙｔｏｃｌ＋ｓｓｉｓｔ
ｒｙ　２６，７１５　（１９１７）　］を２５０ｍｌの
ＭＳＢＡＩ液体培地の入った５００■ｌ容三角７ラスコ
１５０本にフラスコ１本あたりユーカリ細胞新鮮重量約
１５ｇを接種し、２５゜Ｃの暗所で、７０回／ｌｉｌノ
回転振盪を行いながらｌＯ日間振盪培養した。その後、
各フラスコにグリチルレチン酸を３回に分けて１日おき
に、各回７５ｍｇを２ｍｌのエタノールに溶解して添加
した（全７クスコに対する合計添加量は３４ｇとなる）
。

引き続き振盪培養を行い、３回目のグリチルレチン酸を
加えてから７日後に、培養液を遠心分離して培費細胞約
１　０　ｋｇを収穫した。

得られた培養細胞にメタノール１０Ｍを加え、ホモゲナ
イザー処理（１万一×５−）を２回施して細胞を破砕し
た。得られた細胞破砕液を、濾過後、減圧濃縮し、約２
０００ｍｌにした。得られた濃縮液に蒸留水２ｌを加え
、酢酸エチル４ｔで２回抽出した。抽出液を合わせ、無
水硫酸ソーダで乾燥し、溶媒を減圧留去後、残った固形
物をクロロホルムに溶解してシリカゲル力ラムクロマト
グラフィーにかけ、クロロホルム／メタノール／蒸留水
（５：ｌ：０．１）で溶出させ、溶媒を減圧留去した。

残った固形物をメタノールで再結晶生威して、グリチル
レチン酸β−Ｄ−グルコシルエステルの無色針状結晶６
９２ｇを得た。

また、培養細胞を分離した後の培地を多孔性樹脂ＨＰ−
２０　（三菱化虞）１０００鳳皇のカラムに通液し、グ
リチルレチン酸の代謝物を吸着させた後、メタノールで
溶出させた。溶出液を減圧濃縮後、乾固物を展開溶媒に
溶解してシリカゲル力ラムにかけ、クロロホルム／メタ
ノール／蒸留水（５　：　１　：　０．ｔ）で溶出させ
、溶媒を減圧留去、乾燥すると、グリチルレチン酸β−
Ｄ−’／ノレコシノレエステノレ３２．６膳１がＷＩｂ
ｌ’Ｌｆこ。

上述のようにして得られたグリチルレチン酸β−Ｄ−グ
ルコシルエステルの理化学的性質は次のとおりで、合戊
した標品のそれとよく一致した。

■　色および形状：無針状結晶（メタノールより）■　
融点＝２１０〜２３５℃ ■　旋光度［ａ　ＴＢ．：　ｌ　４　１　’　　（ｃ−
ｆａｌｌ．　ＭｅＯｆｌ）■　赤外吸収　Ｗ　ａｈａａ
＊ｃ＠−’ＣＫＢｒ錠剤法”）：　３　４　０　０（０
１１）２８００〜３　０　０　０　（ＣＩ！），　１　
７　５　５　（Ｃｏｏ−Ｇｌｃ）１　６　６　０　（Ｃ
＝Ｃ−Ｃ＝０） ■　ＦＡＢ−マススペクトノレｌ／！　：　６　５　５
　（［Ｍ＋Ｎｉｌ”）■　ＮＭＲ　：　Ｃ−Ｃ．Ｈｓ　
Ｃ３１１．ｓ）δ０．Ｈ　（６Ｈ，ｓ）δ●１１．１．
＋５，ｌ．Ｈ　　：Ｃ　Ｈ　（ＩＩ，ｓ）ａ　５．１１
　　：Ｃ　Ｈ　（１Ｂ，ｂ４）δ３．０７　　ミＣＨ（
目ｏｓ）δ１３１　（ＩＩＩ，ｄｄ）δＬ０（ｌｆｔ，
ｄ）δＬＨ　（ＩＩＩ，ｍ）δ３．１３　　−Ｃ　Ｈ　
！−Ｏ　Ｈ　（ｅｉｃｋｌｌｌ，ｄｄ）δ４．２ｌδ４
．３７　　＝ＣＨ−ＯＨ　（ＩＩＩ，Ｉｄ）δ３．１１
実施例２ 種々のユーカリ属植物を用い、実施例１と同様にしてグ
リチルレチン酸β一トグルコシルエステルを生成させ、
グリチルレチン酸変換能を調べた。

なお、グリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステルの
生戊量は、細胞破砕液および培地について高速液体クロ
マトグラ７イーで定量した。用いたユーカリ属植物は、
Ｅｗｃｔｌｙｔｍｓ　ＨＩｅｂ＋ｌｍｓ，　Ｅｍｃｘｌ
７ｔｗｓ　ｃｉｔｒｉｅｄｏｒｓ、Ｅ＊ｃａｌｙｔａｓ
　ｃａｌ●ｐｋｙｌｌａ，　Ｅｍｃａｌｙｔｍｓ　ｄｉ
ｖｅｓ，　Ｅｉｃａｌｙｌｍｓｐｏｌｙｂｒａｃｌｓａ
、およびＥｎｃａｌｙｔ＠ｓ　ｒ＊ｄｉ亀ｔｓの６種類
である。

結果は次のとおりであった。

表１ 実施例３：ラット力ラゲニン足踏浮腫の抑制作用体重１
８０〜２００ｇの雄性ＳＤ系ラット１０匹を１群とし、
Ａ群には薬物としてグリチルレチン酸β−Ｄーグルコシ
ルエステルを、Ｂ群にはグリチルレチン酸（比較例）を
、それぞれ０．２ｍＭ／ｋｌを５％ＴｖｅｅｓｌＯに懸
濁させて軽口投与した。対照群には５％Ｔｗｅｅａ８　
０のみを投与した。１時間後、ラット後肢足隨皮下に起
炎剤として１％カラゲニン０．１量１／ｆ●●ｔ　’ｌ
ｌｌｄ投与した。

カラゲニン投与３時間後に、生じた浮腫を足浮腫測定装
置（室町機械株式会社）を用いて測定し、浮腫率、抑制
率を算出した。その結果を表２に示す。

表　　２ 見え　　浮腫率（％）　抑制率（％） 対照　　　６７、２ Ａ群　　　４１．３　　　　３８．５ Ｂ群　　　４４．９　　　　３３．２ 実施例４：ラフトカラゲニン足筺浮糎の抑制作用体重１
８０〜２００ｇの雄性ＳＤ系ラットｌＯ匹を１群とし、
Ａ群にはグリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステル
を１％配合した親木軟膏（組戊後記）を、Ｂ群にはグリ
チルレチン酸（比較例）を１％配合した親木軟膏を、そ
れぞれ０．１ｇ，ラット後肢足隨皮下に塗布した。対照
群には、薬物を配合しない親木軟膏を等量塗布した。そ
のｌ時間後、上記塗布部位に起炎剤として１％カラゲニ
ンを０．１重１／ｆｏｏｌ　ｐｓｄ注入した。

カラゲニン塗布３時間後に、生じた浮腫を足浮腫測定装
置（室町機械株式会社）を用いて測定し、浮腫率、抑制
率を算出した。その結果を表３に示す。

表　　３ 処置　　浮腫率（％）　抑制率（％） 対照　　　６４．１ Ａ群　　　４９．９　　　　２２．３ Ｂ群　　　４７．２　　　　２６．４ （注）親木軟膏組ＦＲ＝ 白色ワセリン　　　　　　　２５０重量部ステアリルア
ルコール　　　２００ プロピレングリコール　　　１２０ ポリエチレン硬化ヒ′マシ油　　４０ モノステアリン酸グリセリン　ｌＯ バラオキシ安息香酸メチル　　　ｌ パラオキシ安息香酸プロビル 手続補正書 精製水を加えて全量を１０００重量部とする。

代理人 弁理士 平戊元午８月２２日 特許庁長官　吉　田　文　献　殿 ｌ．事件の表示 平成１午特許願第１７７９９３号 ２．発明の名称 グリチルレチン酸グルフシルエステルの製造法および抗
査症剤 ３．補正をする者 事件との関係　特許出願人 丸善化戊株式会社 ４．代理人 〒０１東京都港区北青山３−６−１８ 共同ピル７階　（電話４０●一〇！！）５，補正命令の
日付　自晃　　　　　　　　　〜一６．補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７．補正の内容

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）グリチルレチン酸またはグリチルレチン酸塩を含
   む培地でユーカリ属植物の細胞を培養し、培養液よりグ
   リチルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステルを採取する
   ことを特徴とするグリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシル
   エステルの製造法。
2. （２）ユーカリ属植物としてＥｕｃａｌｙｔｕｓ　ｐｅ
   ｒｒｉｍｉａｍａ、Ｅｕｃａｌｙｔｕｓ　ｇｌｏｂｕｌ
   ｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｔｕｓ　ｃｉｔｒｉｅｄｏｒａ、　
   Ｅｕｃａ−ｌｙｔｕｓ　ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃ
   ａｌｙｔｕｓ　ｄｉｖｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｔｕｓｐｏｌ
   ｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｔｕｓ　ｒａｄｉａｔ
   ａのいずれかを用いる請求項１記載の製造法。
3. （３）グリチルレチン酸β−Ｄ−グルコシルエステルを
   有効成分とする抗炎症剤。