JPH03145499A

JPH03145499A - ヒト単球成長因子

Info

Publication number: JPH03145499A
Application number: JP1281974A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Okabe; 哲郎岡部
Original assignee: NIPPON KOSEI BUTSUSHITSU GAKUJIYUTSU KIYOUGIKAI
Current assignee: NIPPON KOSEI BUTSUSHITSU GAKUJIYUTSU KIYOUGIKAI
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1989-10-31
Publication date: 1991-06-20
Also published as: EP0426458A2; EP0426458A3; US5216133A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）（３）（２）（産業上の利用分野）本発明はヒト末梢血単球の分化・増殖を誘導するヒト単
球成長因子、及びその採取方法に関するものである。

（発明の背景）血液幹細胞は分化して、いろいろな機能を持った細胞に
なる。このような細胞は多能性幹細胞とよばれ、その増
殖や分化には特定の増殖因子や分化因子を必要とする。

血液幹細胞から顆粒球やマクロファージへの分化には以
下の４つのＣ３Ｆ（ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：コロニー刺激因子）が必要である
ことが知られている。１つ目は、インターロイキン３　
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　３：　ＩＬ３）として知ら
れる多能性（ｍｕｌｔｉ）　−ＣＳ　Ｆであり、顆粒球
、マクロファージ及びそれらの前駆細胞を分化・増殖さ
せる。２つ目は、顆粒球を分化・増殖させる顆粒球ＣＳ
Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆ）　、３つ目は、マクロファージを分
化・増殖させるマクロファージＣ５Ｆ　（Ｍ−Ｃ５Ｆ）
、４つ目は、顆粒球とマクロファージの両方の細胞系列
の増殖を促進する顆粒球・マクロファージＣ５Ｆ　（Ｇ
Ｍ−Ｃ５Ｆ）である。

これら４つのＣ３Ｆは、マウスのものについてはその構
造も、ＤＮＡ配列も明らかになっている（Ｍｅｔｃａｌ
ｆ、−Ｄ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．１６．　
（１９８５）　：岡部哲部ほか：医学の歩み、上、　１
０３７．　（１９８５））、ヒト由来のＣ３Ｆもその殆
んどは、マウスのＣ３Ｆと同様の機能、構造を有する。

しかし、ヒトマクロファージを刺激するようなヒト由来
のＭ−Ｃ５Ｆは見い出されていない０例えば、ヒト由来
のＭ−Ｃ３ＦはマウスＭ−ＣＳＦと相同で免疫的にも交
叉反応を示し、マウスの骨髄細胞に対しＣ３Ｆ活性を有
する６しかしヒトの骨髄細胞にはＣ３Ｆ活性を示さない
（臨床科学、　２２，２５５．（１９８６）、　Ｄａｏ
、Ｓ、に、ｅｔａｌ、、Ｂｌｏｏｄ、　５８，６３０．
ｆ１９８１））　。

一方、ヒト末梢血液の単球は***・増殖しない細胞と一
般に考えられていたものであるが、発明者らはレクチン
で刺激したリンパ球細胞の培養液中にヒト単球を増殖・
分化させる液性因子を見出し、末梢血液の単球も***・
増殖することを明らかにしている（　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　。

１２５．７０５−７１１．　（１９８５）　）。この液
性因子はリンパ球細胞培養液中の分子量２５．０００と
６０．０００の２つの分画に存在し、また抗Ｍ−Ｃ５Ｆ
抗体や抗ＧＭ−Ｃ３Ｆ抗体でその活性が部分的に吸収さ
れる。従ってこの液性因子はＭ−Ｃ３ＦやＧＭ−Ｃ３Ｆ
などの種々の液性因子の混合物であって、その機構は不
明であるが、これらの共動作用によってヒト単球の増殖
・分化を刺激するちのと考えられる。

このような状況下において、発明者は今回、ヒト末梢血
液の単球の増殖・分化を起す蛋白性因子をヒト肺ガン細
胞株の培養液中に見出し、これを単独物質として純化し
た。さらに、このヒト単球成長因子を単離しその生理活
性を調べたところ、既知のＣ３Ｆやγ−インターフェロ
ンとも異なる新規生理活性物質であることを確認した。

このヒト単球成長因子は単球の関与する生体防御反応を
促進する薬剤としての用途が期待でき、種々の感染防御
、免疫機能亢進、マクロファージの関与するガン免疫の
亢進などの作用を有する薬剤とじての用途を提供するも
のである。

（発明の目的）本発明は、ヒト単球の増殖・分化を促進する新規生理活
性因子を提供することを目的とする。

（発明の構成）前記の目的は、ヒト単球の分化・増殖を誘導するヒト単
線成長因子により達成される。

このヒト単球成長因子は、ヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３
０Ｌｕからその培養液中に産生される熱不安定性、トリ
プシン感受性、ＳＨ感受性の蛋白性因子であり、５ＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動により単一バンドを示す
分子量的２１，０００ダルトンの単独物質である。

（実施例）球　　　゛　の沸　法単球成長因子（ＭｏＧＦ）活性は、単球の***能（ｍｉ
ｔｏｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　）と、単球細胞数の増加
を観測することにより測定した。

ヒト末梢血の単核細胞は、健康成人血液よりＦｉｃｏｌ
ｌ液を用いて採取した（Ｐ、Ｅｄｅｌｓｏｎ、　Ｚ、Ａ
。

Ｃｏｈｅｎ、”Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｎｄＴｕｍｏ
ｒ　　Ｉｍｎ＋ｕｎｉｔｙ”　　（Ｂ、Ｒ，Ｂｌｏｏｍ
　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｒ，Ｄａｖｉｄ編）、ｐ３３３．　
　（１９７６）　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

この単核細胞をハム（Ｈａｍ’ｓ　）　Ｆ　−１０培地
（１％自己血清添加）に懸濁し、８×１０″細胞／ウエ
ルの割合で培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ　３０４７）に
播種し、５％炭酸ガス培養器内で一夜培養した。その後
、各ウェルをＦ−１０培地で洗浄し、非付着細胞を除去
した。ウェルに付着した細胞の９５％以上が、α−ナフ
チル−ブチレート−エステラーゼ陽性で、ラテックス粒
子に対する寅食能を示ず単球であった。

このウェル付着細胞を５％炭酸ガス培養器内で３日間培
養した。培地にはＦ−１０培地（１％自己血清添加）を
使用し、培養開始３日目に測定試料１０μｍを各ウェル
に添加した。

試料添加４日目の細胞に、０．１μＣｉ／ウエルの割合
でｌｏｕ　１の３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｎｕｃｆｅａｒ社製、比活性：　６．７　ｇ　ＣＬ
／　ｍｍｏｌ）でパルスラベルし培養した。２０時間培
養後、各ウェルの培地を捨てて、　１０％ＴＣＡ　（）
−リクロロ酢酸）１ｍｌ添加し２０分間放置した。ＴＣ
Ａ溶液を廃棄して、ＴＣＡ不溶分画をメタノール／エー
テル（３：１）で２回洗浄し、ＩＮ　ＮａＯＨ溶液２０
０μｌを添加して３７℃で６０分間放置して可溶化した
。これを２００μｍのＩＮ　ＨＣｌで中和し、シンチレ
ータ−（アクアゾール−２）を４．５ｍｌ添加して液体
シンチレーションカウンターで放射能を計測した。この
３Ｈ−チミジン取込み量を、単球のＤＮＡ合成能即ち、
単球の***能の尺度とした。なお測定はトリブリケート
で行なった。

単球の細胞数の測定は、Ｎａｋａｇａｗａｒａ　ａｎｄ
　Ｎａｔｈａｎの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ
ｏｄ、　５６，２６１．（１！１８３）　）に従い、核
を計数することにより行なった。すなわち前記した３Ｈ
−チミジン取込み量のアッセイと同様の条件でヒト単球
を３７℃で５％炭酸ガス培養器内で培養し、細胞数を毎
日測定した。測定にあたって、各ウェルから培地を取り
除き、１％Ｃｅｔａｖｌｏｎ　（第−製薬製）　、　０
．２％クエン酸溶液を添加して２０分間処理し、ピペッ
ト操作により細胞の核を浮遊させた。この浮遊した核を
血球換算板により、位相差顕微鏡下で計数して細胞数と
した。

７３Ｍ−３０Ｌｕの発明者らにより肺の大細胞ガン（ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ　）から樹立されたヒト肺ガン細胞
株Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕを培養した。この細胞株は、発明者
の研究室において４年間にわたり、ｌＯ％胎児牛血清（
ＦＢＳ）を添加したＦ−１０培地で継代培養させたもの
であり、この細胞株が本発明のヒト単球成長促進因子を
産生ずる（工業技術院微生物工業技術研究所受託番号：
微工研菌寄第１１０６５号、ＦＥＢＭ　Ｐ−１１０６５
）　。

プラスチック製培養フラスコに入れて培養した７３Ｍ−
３０Ｌｕ細胞は、速やかに成長して器壁に付着したモル
レーヤーを形成する。このモルレーヤーをトリプシン処
理により培養フラスコ器壁より剥離し、新たな培地に移
すことにより継代培養する０通常、培地には、Ｆ−１０
培地（１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含有）を使用した。

本発明の単球成長因子を精製するに当たって、Ｔ３Ｍ−
３０Ｌｕ細胞を無血清培地に移し、その培養濾液を本因
子の出発原料とした６すなわちＴ３　Ｍ　−３０Ｌ　ｕ
細胞を前記ｌＯ％ＦＢＳ添加Ｆ−１０培地でコンフルエ
ント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に成長させた後、培地を無
血清培地（２００ｍｇ／ｍｌジメチルーβ−シクロデキ
ストリン含有Ｆ−１０培地）に交換した。この無血清培
地では細胞をゆっくりと成長させることができる。１週
間ごとに新鮮無血清培地と交換し、その培養濾液（ｃｏ
ｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を集めて本因子精製
の出発原料とした。

この培養液によるヒト単球細胞数の増加を前記した細胞
核数を測定する方法で観察すると、コントロール培地で
は細胞数が約３０％減少するのに対し、約３００％増加
させるものであった。尚このようなＭｏＧＦ活性は調べ
たに−５６２，ＨＬ−６０、ＫＧ−１，ＨｅＬａ、Ｔ−
２４，７３Ｍ−１、Ｔ３Ｍ−３，Ｈ，ＬＣ−１等の他の
ガン細胞の培養濾液では観察できなかった。

また培養濾液のＭｏＧＦ活性を前記アッセイ方法に従い
ヒト単球の３■−チミジン取込量により調べた。第１図
に示すように、７３Ｍ−３０Ｌｕ細胞培養濾液添加後３
日以上経過すると、３Ｈ−チミジンの取込み、即ちヒト
単球の増殖が観察された（第１図；−・−）０図中−〇
−はＴ３Ｍ−３０Ｌｕ細胞を培養に用いる無血清培地に
よる結果（対照）を示す。

また第２図はＴ３Ｍ−３０Ｌｕ細胞の培養濾液のｍＨ−
チミジン取込量に対するドーズレスポンスを示す図であ
り、図に示すように４〜８倍に希釈してもＭｏＧＦ活性
が検出できた。

ヒト　　、　　　の　リＴ　３　Ｍ　−３０、Ｌ　ｕ細胞の培養濾液を集め、ま
ずホローファイバーフィルター５ＥＰ−１０１３（無化
成社製；分子量３０００）で低分子量成分を除去し、５
０倍に濃縮した。

この濃縮培養液をｐＨ７，５で硫安分画した。３０〜６
０％の飽和硫安による沈澱を遠心（３５，０００ｇ、　
３０分間）により集めた。この沈澱を５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　（ｐ）［７゜５）に溶解後、遠心して不溶
成分を除去し、遠心上溝を旧−１ＳＰフイルター（旭化
成社製、分子量６０００）で限外濾過し、２０倍に濃縮
した。

この濃縮液２００　ｕ　１をスーパーロース１２カラム
（ＨＲ１０／３０．　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）にてゲル濾過した。この
カラムをＦＰＬＣ（ｆａｓｔ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社製
）に装着し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ７，５
）を流速１　ｍ１７分で流した。

１ｍｌづつ分画してＭｏＧＦ活性を測定した。第３図に
示すように、分子量的１６．０００の部分に”Ｈ−チミ
ジンの取込みを示すピークが認められた。

この分画をプールし、遠心（３５，０００ｇ、　３０分
。

４℃“）で不溶成分を除去した後、モノーＱカラム（Ｈ
Ｒ５１５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）に直接アプライしてイオン交換クロ
マトグラフィーを行なった。カラムは５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）で、溶出開始後１５分ま
では０−２００ｍＭのＮａＣ１の直線濃度勾配をつけ、
１５分から３０分までは２００　ｍＭ　ＮａＣ１，３０
分から４５分までは２００−４００ｍＭ　ＮａＣ１の濃
度勾配をつけて流速１　ｍ１７分で溶出した。第４図に
示すように、約２８０ｍＭ　ＮａＣ１により溶出される
分画に３Ｈ−チミジンの取込みを示すピークが認められ
た。この活性画分を用いて、ヒト単球数に対する影響を
前記方法で調べたところ、下の表１のように、活性画分
は対照に比べて約２．３倍に細胞数を増加させていた。

表　　１次に、この活性画分を逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。

東洋曹達社製ＨＬＣ−８０３Ｄ　　ＨＰＬＣシステムに
装着したＶｙｄａｃ　ＣＡカラム（４，６Ｘ２５０ｍｍ
　；　Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ社製
）にモノーＱカラムの活性分画を直接アプライした。０
．１％トリフロロ酢酸（ＴＦＡ）を１０分間流してカラ
ムを洗浄した後、０．１％ＴＦＡに対して３０分間で０
−９０％アセトニトリルで直１Ｂ濃度勾配により流速０
．５ｍｌ／分で溶出し、１ｍｌづつ分画した６結果を第
５図に示す。６５％アセトニトリルで溶出された分画に
３Ｈ−チミジンの取込みを示すピークが認められた。こ
の分画を集め、透析後、ＳＯ３−ポリアクリルアミド電
気泳動で分析したところ、単一バンドを示し、その分子
量は約２１゜０００あった。

ヒト　　　　　の、・このようにして単離されたヒト単球成長因子について、
熱処理、トリプシン処理、２−メルカプトエタノール処
理を行ない、その安定性を調べた。トリプシン処理は５
０　Ｕ／ｍｌの不溶化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）で
一定時間試料を処理した後、遠心により不溶化トリプシ
ンを除去することにより反応を停止した。２−メルカプ
トエタノール処理は、０．５％の２−メルカプトエタノ
ールで室温下６０分間行なった。それぞれ処理後、Ｐ　
Ｂ　Ｓ　（１ｍｇ／ｍ１ＢＳＡ含有）で２倍に希釈した
後にアッセイした。

熱処理２５℃、４時間　　　　　　　８０．９５６℃、６０分
　　　　　　　　　７５．４１００℃、　　１０分　　
　　　　　　　　６．４トリプシン処理３７℃、１２０分　　　　　４０．７３７℃、２４０分　　　　　２６．９２−メルカプトエタノール処理６０分　　　　　　　　２．４以上の結果から、本発明のヒト単球成長因子は、熱、ト
リプシンに感受性の蛋白性物質と考えられ、またＳＨ感
受性があることからＭｏＧＦ活性に影響のある少くとも
一つのＳ−３架橋を有することがわかった。

また本発明のヒト単球成長因子を培養後３日目のヒト単
球細胞に添加し、その細胞数の変化とＤＮＡ合成能を調
べた（第６図）。コントロール（−〇−）に示すように
、細胞数は培養を続けるに従い減少するが、ＭｏＧＦを
添加した場合（−・−）では添加後３日目（培養６日目
）以降に細胞数の増加が認められた。またＤＮＡ合成能
はコントロール（−ロー）では殆ど認められないのに対
し、ＭｏＧＦを添加した場合（−一−）は添加後２日目
（培養５日目）以降に顕著なりＮＡ合成能が認められた
。

また本発明のＭｏＧＦを添加したヒト単球の形態学的変
化を顕微鏡により調べた。コントロール（第７図；培養
８日目）に比べ、ＭｏＧＦ添加によりヒト単球細胞のサ
イズが大きくなり又細胞質も増大していた（第８図：Ｍ
ｏＧＦ添加後５日目）白目た別の視野では、ヒト単球の
クラスターち認められた（第９図）。このようなりラス
ターは単球やマクロファージが異物を攻撃する際に見ら
れるものと同様なものである。異物が存在しなくてち、
ＭｏＧＦ添加によりヒト単球がこのようなりラスターを
形成することから、本発明のＭ。

ＧＦはヒト単球の増殖を促進するだけでなく、ヒト単球
を生体防御反応に即応し得る状態に機能分化させる誘導
作用があることが示唆された。従って、本発明のＭｏＧ
Ｆは単球の関与する生体防御反応を促進する薬剤、例え
ば、細胞性免疫機能の亢進、マクロファージの関与する
ガン免疫の亢進などの作用を有する薬剤としての用途が
広く期待できる。

なおこのスーパーロース１２カラムクロマトグラフイー
の活性分画を用いて、ＭｏＧＦのヒト及びマウスの骨髄
細胞に対する影響を常法に従ってコロニー法により調べ
たが、何れに対してもＣ３Ｆ活性を示さなかった。これ
らの事実は本発明のＭｏＧＦが既知Ｃ３Ｆとは異なるも
のであることを示している。

また近年、腫瘍細胞に対する単球−マクロファージの細
胞毒性を活性化するマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ
）がγ−インクフエロンと免疫学的に同じものであると
の報告がされている。

そこで、スーパーロース１２カラムクロマトグラフイー
の活性分画を用いて、Ｍ　ｏ　Ｇ　Ｆのインターフェロ
ンン活性を調べた。常法（Ｎａｔｕｒｅ、　２９５゜５
０３、　（１９８２）　；　Ｃｅ１ｌｕｌｅｒ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、、４９，３９０．　（１９８０））に従い、
ヒト羊膜由来ＦＬ細胞と５ｉｎｄｂｉｓウイルスを用い
て調べたが、ＭｏＧＦの活性画分にはインターフェロン
活性は認められなかった。またスーパーロース１２カラ
ムクロマトグラフイーの活性分画には、抗γ−インター
フェロン抗体との免疫反応性は認められなかった。さら
にγ−インターフェロン自体にも、ＭｏＧＦ活性は認め
られなかった。以上から、本発明のＭｏＧＦはγ−イン
ターフェロンとも異なる新規生理活性物質であることが
確認できた。

（発明の効果）以上のように本発明のヒト単球成長因子は、既知のＣ５
Ｆやγ−インターフェロンとは異なる新規生理活性物質
であり、ヒト単球の増殖・分化を誘導・促進する。従っ
て、このヒト単球成長因子は単球の関与する生体防御反
応を促進する薬剤として種々の用途が期待できる。

４、

【図面の簡単な説明】

第１図は７３Ｍ−３０Ｌｕ培養液添加後のヒト単球の３
Ｈ−チミジン取込量変化を示す図、第２図はヒト単球の
３Ｈ−チミジン取込量に対する７３Ｍ−３０Ｌｕ培養液
の濃度依存性を示す図、第３図はスーパーロース１２カ
ラムクロマトグラフイーの溶出パターンを示す図、第４
図はモノー〇カラムクロマトグラフィーの溶出パターン
図、第５図は逆相ＨＰＬＣの溶出パターン図である。第６図は精製ＭｏＧＦのヒト単球細胞の成長促進効果を
示す図である。第７〜９図はヒト単球細胞の顕微鏡像を
示す図であり、第７図はコントロール、第８．９図はＭ
ｏＧＦを添加した場合の像を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト単球の分化・増殖を誘導するヒト単球成長因
子。
（２）前記ヒト単球分成長因子がヒト肺ガン細胞株に由
来するものである請求項１記載のヒト単球成長因子。
（３）前記ヒト肺ガン細胞株がＴ３Ｍ−３０Ｌｕである
請求項２記載のヒト単球成長因子。
（４）ヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕの培養液を出
発原料とし、３０〜６０％硫安分画、ゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーの
各ステップにより、ヒト単球の分化・増殖を誘導する分
子量２１，０００の蛋白性物質を分離することを特徴と
するヒト単球成長因子の採取方法。
（５）ヒト肺ガン細胞株Ｔ３Ｍ−３０Ｌｕ