JPH03133391A - ジペプチドの製造法 - Google Patents
ジペプチドの製造法Info
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- JPH03133391A JPH03133391A JP27011489A JP27011489A JPH03133391A JP H03133391 A JPH03133391 A JP H03133391A JP 27011489 A JP27011489 A JP 27011489A JP 27011489 A JP27011489 A JP 27011489A JP H03133391 A JPH03133391 A JP H03133391A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、プOIJン含有ペプチドの1!造法に関スル
。L−プロリル−し−フェニルアラニン、Lプロリル−
し−チロシンおよびL−プロリルL−)リブトファンな
どのプロリン含有ペプチドは、血圧降下剤の構成成分と
しての用途が期待される。
。L−プロリル−し−フェニルアラニン、Lプロリル−
し−チロシンおよびL−プロリルL−)リブトファンな
どのプロリン含有ペプチドは、血圧降下剤の構成成分と
しての用途が期待される。
従来の技術
プロリン含有ペプチドの製造方法には、有機化学的方法
と酵素的方法がある。
と酵素的方法がある。
有機化学的方法におけるペプチド合成は、N末端、C末
端および側鎖の保護、縮合、脱保護の3つの過程が要求
され、工程が複雑になっている。
端および側鎖の保護、縮合、脱保護の3つの過程が要求
され、工程が複雑になっている。
また反応中に、酸処理、アルカリ処理および加熱処理を
伴うためラセミ化が起こる可能性もある。
伴うためラセミ化が起こる可能性もある。
有機化学的方法において保護を必要としない方法として
、例えばL−プロリンにホスゲンを作用させてL−プロ
リンのN−カルボキシアミノ酸無水物としたものと、L
−フェニルアラニンを含有するホウ酸カリウム水溶液と
をp H10,2で、0℃の温度で反応させる方法が知
られている〔ジャーナル・才ブ・オーガニック・ケミス
トリー(Journal of Organic Ch
emistry) 32.3415(I967)]。
、例えばL−プロリンにホスゲンを作用させてL−プロ
リンのN−カルボキシアミノ酸無水物としたものと、L
−フェニルアラニンを含有するホウ酸カリウム水溶液と
をp H10,2で、0℃の温度で反応させる方法が知
られている〔ジャーナル・才ブ・オーガニック・ケミス
トリー(Journal of Organic Ch
emistry) 32.3415(I967)]。
酵素的にプロリン含有ペプチドを合成する方法として、
例えば、N−カルボベンゾキシ−し−アルギニンメチル
エステルとL−プロリンアミドとにクロストリパイン(
酵素番号3.4.22.8 >を作用させてN−カルボ
ベンゾキシ−L−アルギニルヒープロリンアミドを合成
する方法が知られている〔バイオテクノロジー・レター
ズ(BiotechnologyLetters)8
.873 (I986)]。
例えば、N−カルボベンゾキシ−し−アルギニンメチル
エステルとL−プロリンアミドとにクロストリパイン(
酵素番号3.4.22.8 >を作用させてN−カルボ
ベンゾキシ−L−アルギニルヒープロリンアミドを合成
する方法が知られている〔バイオテクノロジー・レター
ズ(BiotechnologyLetters)8
.873 (I986)]。
発明が解決しようとする課題
有機化学的方法におけるペプチド合成で、保護を必要と
しない方法は、N−カルボキシアミノ酸無水物を合成す
る際、極めて毒性の高いホスゲンを使うため、危険な合
成法であるっ また、酵素的方法におけるペプチド合成で使用されるク
ロストリバインは、嫌気性細菌であるクロストリジウム
属由来のため調製が困難な点と、両方の基質がいずれも
保護アミノ酸で、しかも生成物の脱保護も必要であると
いう点で実用的な方法であるとは言い難い。
しない方法は、N−カルボキシアミノ酸無水物を合成す
る際、極めて毒性の高いホスゲンを使うため、危険な合
成法であるっ また、酵素的方法におけるペプチド合成で使用されるク
ロストリバインは、嫌気性細菌であるクロストリジウム
属由来のため調製が困難な点と、両方の基質がいずれも
保護アミノ酸で、しかも生成物の脱保護も必要であると
いう点で実用的な方法であるとは言い難い。
課題を解決するだめの手段
本発明者らは、プロリン含有ペプチドのV進法について
、鋭意検討した結果、N末端がプロリンであるペプチド
鎖からN末端のプロリンを特異的に除去できるプロリン
イミノペプチダーゼ(酵素番号3.4.11.5 )の
存在下プロリンのエステル類とアミノ酸とを反応させた
際に、基質であるプロリンのエステル類のイミノ基、ま
たこれに作用するアミノ酸のカルボキシル基および側鎖
の官能基を保護する必要がなく縮合反応を行うことがで
き、かつ反応条件が中性かつ常温常圧であることよりラ
セミ化が起こる可能性が少ないプロリルアミノ酸で表わ
されるジペプチドが合成できることを見い出し、本発明
を完成した。
、鋭意検討した結果、N末端がプロリンであるペプチド
鎖からN末端のプロリンを特異的に除去できるプロリン
イミノペプチダーゼ(酵素番号3.4.11.5 )の
存在下プロリンのエステル類とアミノ酸とを反応させた
際に、基質であるプロリンのエステル類のイミノ基、ま
たこれに作用するアミノ酸のカルボキシル基および側鎖
の官能基を保護する必要がなく縮合反応を行うことがで
き、かつ反応条件が中性かつ常温常圧であることよりラ
セミ化が起こる可能性が少ないプロリルアミノ酸で表わ
されるジペプチドが合成できることを見い出し、本発明
を完成した。
すなわち、本発明は、水性媒体中、プロリンイミノペプ
チダーゼ活性を有する酵素源の存在下式() (式中、Rは低級アルキル基または了り−ル基を表わす
) で表わされるし−またはDL−プロリンのエステル類と
L−またはDL−α−アミノ酸とを反応させ、該水性媒
体中に、式([1) %式%() ) (式中、Roはα−アミノ酸残基を表わす)で表わされ
る含プロリンジペプチドを生成させることを特徴とする
ジペプチドの製造法を提供する。
チダーゼ活性を有する酵素源の存在下式() (式中、Rは低級アルキル基または了り−ル基を表わす
) で表わされるし−またはDL−プロリンのエステル類と
L−またはDL−α−アミノ酸とを反応させ、該水性媒
体中に、式([1) %式%() ) (式中、Roはα−アミノ酸残基を表わす)で表わされ
る含プロリンジペプチドを生成させることを特徴とする
ジペプチドの製造法を提供する。
式(I)のRの定義中、低級アルキル基としては、炭素
数1〜8の直鎮または分岐状のアルキル、例えばメチル
、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、
イソブチル、5ec−ブチル、tert−ブチル、n−
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル
、n−ヘプチルおよびn−オクチルなどの基があげられ
る。アリール基としては、フェニル、ナフチルなどの基
があげられる。
数1〜8の直鎮または分岐状のアルキル、例えばメチル
、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、
イソブチル、5ec−ブチル、tert−ブチル、n−
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル
、n−ヘプチルおよびn−オクチルなどの基があげられ
る。アリール基としては、フェニル、ナフチルなどの基
があげられる。
式(II)のRoの定義中、α−アミノ酸残基にいうア
ミノ酸としては、いかなるアミノ酸も含まれろ。
ミノ酸としては、いかなるアミノ酸も含まれろ。
本発明に用いるプロリンイミノペプチダーゼ活性を有す
る酵素源としては、ペプチド鎖のN末端に存在するブD
IJンをそのペプチドから遊離させる触媒作用を有す
る限り、とくに制限されるものではなく、該酵素の精製
標品、同粗精製標品、該酵素含有物、例えば該酵素活性
を有する微生物の菌体または菌体処理物などいずれも用
いることができる。
る酵素源としては、ペプチド鎖のN末端に存在するブD
IJンをそのペプチドから遊離させる触媒作用を有す
る限り、とくに制限されるものではなく、該酵素の精製
標品、同粗精製標品、該酵素含有物、例えば該酵素活性
を有する微生物の菌体または菌体処理物などいずれも用
いることができる。
例えば、バチルス・プレビス(Bacillus br
evis)ATCC8185、バチルス・プレビス(B
acillus brev+5)ATCC9999、バ
チルス・プレビス(Baciビus brev+5)F
ERlJ P−5242(特公昭62−51591号公
報)、ビフィドバクテリウム・インファンテイス(Bi
fidobacteriumn「antis)^TCC
I5697などの微生物が生産する酵素や高等動物の肝
臓由来または植物由来の酵素などを用いることができる
。
evis)ATCC8185、バチルス・プレビス(B
acillus brev+5)ATCC9999、バ
チルス・プレビス(Baciビus brev+5)F
ERlJ P−5242(特公昭62−51591号公
報)、ビフィドバクテリウム・インファンテイス(Bi
fidobacteriumn「antis)^TCC
I5697などの微生物が生産する酵素や高等動物の肝
臓由来または植物由来の酵素などを用いることができる
。
菌体処理物としては、例えばアルギン酸などの担体に固
定化したもの、凍結乾燥菌体、細胞膜を破壊して得られ
た粗抽出液、あるいはこの抽出液を上記と同様に固定化
したもの、また二の粗抽出液を塩析、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフイーなどの手段により精製したもの、さ
らにはこの精製標品を上記の様に固定化したものなどが
あげられる。また、遺伝子のクローニングにより得られ
る高発現プラスミドを有する組換株、あるいはその生産
する高力価酵素を利用することはさらに好ましい。
定化したもの、凍結乾燥菌体、細胞膜を破壊して得られ
た粗抽出液、あるいはこの抽出液を上記と同様に固定化
したもの、また二の粗抽出液を塩析、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフイーなどの手段により精製したもの、さ
らにはこの精製標品を上記の様に固定化したものなどが
あげられる。また、遺伝子のクローニングにより得られ
る高発現プラスミドを有する組換株、あるいはその生産
する高力価酵素を利用することはさらに好ましい。
本発明のプロリンのエステル類とアミノ酸との縮合反応
は、水またはリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液など
の緩衝液、あるいはメタノール、エタノーノ呟ジメチル
フォルムアミドなどを含有する水性媒体中で、pH7〜
10、好ましくはph8〜9で、15〜80℃、好まし
くは25〜60℃の温度で行う。プロリンのエステル類
は反応液に対して、10〜1000mM、好ましくは1
00〜500mMの濃度で用いられる。各種アミノ酸は
反応液に対して1〜100 mM、好ましくは5〜50
m1Aの濃度で用いられる。
は、水またはリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液など
の緩衝液、あるいはメタノール、エタノーノ呟ジメチル
フォルムアミドなどを含有する水性媒体中で、pH7〜
10、好ましくはph8〜9で、15〜80℃、好まし
くは25〜60℃の温度で行う。プロリンのエステル類
は反応液に対して、10〜1000mM、好ましくは1
00〜500mMの濃度で用いられる。各種アミノ酸は
反応液に対して1〜100 mM、好ましくは5〜50
m1Aの濃度で用いられる。
プロリンイミノペプチダーゼは、抽出酵素を使う場合、
0.05〜3. OU/wt、好まシくハ0.2〜2、
OU/−加え、直接微生物菌体を使う場合には、0、
1〜10%(湿重量)菌体濃度で反応させる。
0.05〜3. OU/wt、好まシくハ0.2〜2、
OU/−加え、直接微生物菌体を使う場合には、0、
1〜10%(湿重量)菌体濃度で反応させる。
ここで、プロリンイミノペプチダーゼの酵素活性は、3
0℃、50mMのトリス塩酸緩衝液(pH7,4)中で
、1分間にプロリンパラニトロアニリドより1μmol
eのブD IJンを遊離させる力価を1単位(I[I)
として表わす。
0℃、50mMのトリス塩酸緩衝液(pH7,4)中で
、1分間にプロリンパラニトロアニリドより1μmol
eのブD IJンを遊離させる力価を1単位(I[I)
として表わす。
縮合反応において、反応時間が長くなると生成物である
ジペプチドの加水分解が起こるので好ましくない。従っ
て、縮合反応終了と同時に反応液から菌体およびその処
理物を除去するか、加熱処理(約100℃)などにより
酵素を失活させて反応を停止させ、生成したジペプチド
の加水分解を極力抑えることが必要である。
ジペプチドの加水分解が起こるので好ましくない。従っ
て、縮合反応終了と同時に反応液から菌体およびその処
理物を除去するか、加熱処理(約100℃)などにより
酵素を失活させて反応を停止させ、生成したジペプチド
の加水分解を極力抑えることが必要である。
し−プロリル−し−アミノ酸で表わされるジペプチドの
合成反応が終了した時点で速やかに反応を停止させ、反
応液より目的物質であるジペプチドと未反応基質である
プロリンメチルエステルおよびL−アミノ酸とをそれぞ
れ分離回収する。この分離回収jよ、公知の吸着クロ7
トグラフイーイオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、溶媒抽
出、分別晶析などの方法で行うことができる。
合成反応が終了した時点で速やかに反応を停止させ、反
応液より目的物質であるジペプチドと未反応基質である
プロリンメチルエステルおよびL−アミノ酸とをそれぞ
れ分離回収する。この分離回収jよ、公知の吸着クロ7
トグラフイーイオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、溶媒抽
出、分別晶析などの方法で行うことができる。
以下に実施例を示す。
実施例I
L−プロリンメチルエステル200m!J&L−7ヱニ
ルアラニン25m!Jとを含むpH8,0の反応液に、
プロリンイミノペプチダーゼを1.2U/dとブーるよ
うに添加し、全量を100mとして30℃で振盪しm;
がろ反応を行った。40分間反応後、反応液を高速液体
クロマトグラフィー(HPLC)で分析したところプロ
リルフェニルアラニン18m!lの生成が認められた。
ルアラニン25m!Jとを含むpH8,0の反応液に、
プロリンイミノペプチダーゼを1.2U/dとブーるよ
うに添加し、全量を100mとして30℃で振盪しm;
がろ反応を行った。40分間反応後、反応液を高速液体
クロマトグラフィー(HPLC)で分析したところプロ
リルフェニルアラニン18m!lの生成が認められた。
この反応液を加熱処理(I00℃、3分間)し、変性タ
ンパクを遠心分離で除去した後、まずシリカゲルカラム
クロマトグラフィーでプロリンメチルエステルを取り除
き、ついで逆相I(PLCを用いて目的物質プロリルフ
ェニルアラニンとフェニルアラニンとを分離した。
ンパクを遠心分離で除去した後、まずシリカゲルカラム
クロマトグラフィーでプロリンメチルエステルを取り除
き、ついで逆相I(PLCを用いて目的物質プロリルフ
ェニルアラニンとフェニルアラニンとを分離した。
こ)結果、L−7’ロリルーL−フェニルアラニンを1
.44mM得た。
.44mM得た。
実施例2
L−フェニルアラニン25n+uの代わりにDLフェニ
ルアラニン25m!Jを用いる以外は実弥例1と同様に
行って、L−プロリル−L−フェニルアラニンを0.7
2 mM得た。
ルアラニン25m!Jを用いる以外は実弥例1と同様に
行って、L−プロリル−L−フェニルアラニンを0.7
2 mM得た。
実施例3
L−フェニルアラニン25+71!Jの代わりにL〜チ
ロンン25m1Jを用いる以外は実施例1と同様に行−
で、L−プロリル−し−チロシンを1.38 m!、I
i”、ptこ。
ロンン25m1Jを用いる以外は実施例1と同様に行−
で、L−プロリル−し−チロシンを1.38 m!、I
i”、ptこ。
実施例4
L−フェニルアラニン25mMの代わりにL −トリプ
トファン25mMを用いる以外は実施例1と同様に行っ
て、L−プロリル−L−) IJブトファンを1.88
m!J得た。
トファン25mMを用いる以外は実施例1と同様に行っ
て、L−プロリル−L−) IJブトファンを1.88
m!J得た。
実施例5
L−プロリンメチルエステル200mMの代わりにDL
−プロリンメチルエステル200m1Jを用いる以外は
実施例1と同様に行って、L−プロリルL−フェニルア
ラニンを0.68 m!J得た。
−プロリンメチルエステル200m1Jを用いる以外は
実施例1と同様に行って、L−プロリルL−フェニルア
ラニンを0.68 m!J得た。
発明の効果
本発明により効率のよいプロリン含有ペプチドの酵素的
製造法が提供される。
製造法が提供される。
手続補正書(自発)
■、事件の表示
平成1年特許願第270114号
2、発明の名称
ジペプチドの製造法
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 100
住 所 東京都千代田区大手町−丁目6番1号名 称
(I02)協和醗酵工業株式会社(2)同書中、第1
O頁13行目のro、72mJを「0.72n+mol
」に訂正する。
(I02)協和醗酵工業株式会社(2)同書中、第1
O頁13行目のro、72mJを「0.72n+mol
」に訂正する。
(3)同書中、第1O頁下から4行目の’1.38m!
わをr 1.38mmol」に訂正する。
わをr 1.38mmol」に訂正する。
(4)同書中、第11頁3行目のr 188 m!J」
をr 1.88mmol」に訂正する。
をr 1.88mmol」に訂正する。
(5)同書中、第11頁8行目のrO,68m!わを’
0.68mmoJに訂正する。
0.68mmoJに訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 水性媒体中、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する
酵素源の存在下、式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、Rは低級アルキル基またはアリール基を表わす
) で表わされるL−またはDL−プロリンのエステル類と
L−またはDL−α−アミノ酸とを反応させ、該水性媒
体中に、式(II) ▲数式、化学式、表等があります▼(II) (式中、R’はα−アミノ酸残基を表わす)で表わされ
る含プロリンジペプチドを生成させることを特徴とする
ジペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27011489A JPH03133391A (ja) | 1989-10-17 | 1989-10-17 | ジペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27011489A JPH03133391A (ja) | 1989-10-17 | 1989-10-17 | ジペプチドの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03133391A true JPH03133391A (ja) | 1991-06-06 |
Family
ID=17481739
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27011489A Pending JPH03133391A (ja) | 1989-10-17 | 1989-10-17 | ジペプチドの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03133391A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1006069C2 (nl) * | 1997-05-16 | 1998-11-17 | Dsm Nv | Werkwijze voor de bereiding van peptiden. |
US7288388B2 (en) | 2001-07-26 | 2007-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and peptide producing method |
JP2011139667A (ja) * | 2010-01-07 | 2011-07-21 | Tottori Univ | プロリンおよびβ−アラニンをN末端に有するジペプチド、及びその環化ジペプチドの酵素合成法 |
-
1989
- 1989-10-17 JP JP27011489A patent/JPH03133391A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1006069C2 (nl) * | 1997-05-16 | 1998-11-17 | Dsm Nv | Werkwijze voor de bereiding van peptiden. |
WO1998051815A1 (en) * | 1997-05-16 | 1998-11-19 | Dsm N.V. | Method for preparing peptides |
US7288388B2 (en) | 2001-07-26 | 2007-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and peptide producing method |
EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
US7618796B2 (en) | 2001-07-26 | 2009-11-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and peptide producing method |
JP2011139667A (ja) * | 2010-01-07 | 2011-07-21 | Tottori Univ | プロリンおよびβ−アラニンをN末端に有するジペプチド、及びその環化ジペプチドの酵素合成法 |
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