JPH03130087A - ワクチン用ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はワクチンの調製、さらに詳しくは、組換型ＤＮ
Ａ技術によるワクチン用インフルエンザウィルス・ポリ
ペプチドの調製に関する。

発明の背景 インフルエンザウィルス感染は、時々、世界的規模でヒ
ト、ウマおよびニワトリに急性呼吸器疾患を引き起こす
。インフルエンザウィルスはオルソミクンウイルスであ
り、それ自体は直径８０〜１２０ｎｍのピリオンを包含
し、２つの異なる糖タンパク質スパイクを有する。３つ
の型Ａ、ＢおよびＣがヒトに感染する。時おりＢ型感染
の流行もあるが、Ａ型ウィルスが、近午のヒトにおける
流行の大部分の原因である。Ｃ型ウィルスもまたブタか
ら単離されているが、既知のブタ、ウマおよびニワトリ
ウィルスは大抵の場合Ａ型である。

Ａ型ウィルスは血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダ
ーゼ（Ｎ　Ａ）表面糖タンパク質の抗原特性に基づいて
亜型に分けられる。Ａ型の中で、亜型Ｈ１（ブタインフ
ルエンザ）、Ｈ２（アジアインフルエンサ）およびＨ３
（香港インフルエンザ）がヒト感染において優勢である
。

ＨＡおよびＮＡタンパク質中の抗原決定因子に影響を及
ぼすおよそｌ午間隔での遺伝的変動のために、通常の死
菌または弱毒ウィルスを用いて、「万能の」インフルエ
ンザウィルス・ワクチン、すなわち、株非特異性ワクチ
ンを調製することは不可能であった。最近、異なる株を
交差することにより調製した再配列ウィルスから、かか
る万能、または半万能ワクチンを調製する試みがなされ
ている。ごく最近において、かかる試みは、主としてＨ
Ａタンパク質に焦点を合わせた組換型ＤＮＡ技法を包含
している。

報告されている発達技術 ウィンターら（Ｗｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）は、ネイ
チャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２９２巻、７２−７５頁
（１９８１）において、トリプシン様酵素により、グロ
セッシングの間に認識されると思われる単一アルギニン
残基（’３２７）により分離された１７残基の疎水性シ
グナルペプチド、ＨＡＩサブユニット（３２６残基長）
およびＨＡ２サブユニット（２２２残基長）からなるＡ
／ＰＲ／８／３４株（ＨＩＮＩ）のＨＡのＤＮＡコーデ
ィング配列を報告している。木様のＨＡＩおよびＨＡ２
サブユニットのアミノ酸およびヌクレオチド配列の相同
％を、亜型Ｈ２、Ｈ３およびＨ７の代表様のそれらと比
較した。

バエズら（Ｂａｅｚ　ｅｔ　ａｌ、）は、ニュークレイ
ツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、）、８巻、５８４５〜５８５７頁（１９８０）に
おいて、Ａ／ＰＲ／８／３４株の非構造（ＮＳ）タンパ
ク質のＤＮＡコーディング配列を報告している。

ヤングら（Ｙｏｕｎｇ　ａｔ　ａｌ、）は、ジ・オリジ
ン・オプ・パンデミツク・インフルエンザ・バイラシー
ズ（Ｔｈｅ　Ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　Ｐａｎｄｅｍｉｃ　
Ｉ　ｎｆｌｕｅｎｚａＶ　１ｒｕｓｅｓ）、１９８３、
ダブル・ジー・レイパー編、エルスヴイール・サイエン
ス・パブリッシング・カンパニー　（ｅｄｉｔ、ｂｙ　
Ｗ、Ｇ、Ｌａｖｅｒ、Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃ
ｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）およびプロシーデ
インダス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　
ＵＳＡ、　８０巻、６１０５〜６１０９頁（１９８３）
において、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＡ／Ｐ　Ｒ／
８／３４株からの８個のＲＮＡセグメント全てのｃＤＮ
Ａのクローニング、およびイー・コリのＮＳＩタンパク
質の高レベル発現を報告している。

エムテイジら（Ｅｍｔａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、）は、米国
特許第４３５７４２１号において、インフルエンザウィ
ルスＨＡ遺伝子のコーディング配列のクローニングおよ
び発現を開示し、ＨＡポリペプチドがワクチン目的で投
与できる抗原であることを開示している。

ザ・モービディティ・アンド・モータリティ・ウィーク
リー・レポート（Ｔｈｅ　Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ
Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　Ｗｅｅｋｌｙ　Ｒｅｐｏｒｔ）、
３３巻、１９号、２５３〜２６１頁には、ＨＡタンパク
質金含有ヒトワクチン投与量および投与方法を含む最も
最近のインフルエンザウィルスの予防および抑制計画が
評論されている。

デービスら（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）は、ジーン（
Ｇ　ｅｎｅ）、２１巻、２７３〜２８４頁（１９８３）
において、ＨＡ由由来ポリペプチド対するマウスの免疫
応答を報告している。

さらにいくつかの文献が、Ａ／ＰＲ／８／３４および他
の株のＨＡ、ＮＳおよび他のインフルエンザウィルス遺
伝子のクローニングおよび発現を報告している。かかる
文献のいくつかは以下に引用されている。

図面の記載 第１図は、Ｃ１３タンパク質のコーディング領域のヌク
レオチド配列およびそのアミノ酸配列である。枠で囲ん
だ領域は、ＮＳＩのＣ−末端アミノ酸８１（メチオニン
）と無傷のＨＡ２サブユニット（アミノ酸１〜２２２）
のＮ−末端アミノ酸１（グリシン）を連結する配列を示
す。

第２図は、Ｄタンパク質のコーディング領域のヌクレオ
チド配列およびそのアミノ酸配列である。

枠で囲んだ領域は、ＮＳｌのＣ−末端アミノ酸８１　（
メチオニン）と切形のＨＡ２サブユニットのＮ−末端ア
ミノ酸６５（アラニン）の間のリンカ−配列を示す。ｒ
ＡＪタンパク質、「Ｃ」タンパク質および「ΔＤ」タン
パク質における切形のＨＡ２サブユニットのＮ−末端ア
ミノ酸に、各々、対応するＨＡ２のアミノ酸位６９（グ
ルタミン酸）、８１　（アスパラギン）および１５０（
グルタミン酸）もまた示されている。

第３図は、Ｃ１３シヨートタンパク質のコーディング領
域のヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列である。

枠で囲んだ領域は、ＮＳＩのＣ−末端アミノ酸４２（セ
リン）と無傷のＨＡ２サブユニットのＮ−末端アミノ酸
１　（グリシン）を連結する配列を示す。ＮＳＩのアミ
ノ酸１３（システィン）はセリンにより置換されている
。

第４図は、Ｄショートタンパク質のコーディング領域の
ヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列である。枠で
囲んだ領域はＮＳＩのＣ−末端アミノ酸４２（セリン）
と切形のＨＡ２サブユニットのＮ−末端アミノ酸６６（
バリン）の間のリンカ−配列を示す。ＮＳＩのアミノ酸
１３（システィン）はセリンにより置換されている。

発明の要約 −つの態様において、本発明は、ＨＡタンパク貢のＨＡ
２サブユニットの免疫原決定因子を有する、ＨＡタンパ
ク質以外のポリペプチドからなるインフルエンザウィル
スによる感染に対して動物における防御を刺激するワク
チンである。

もう一つ別の態様において、本発明は、ＨＡ２サブユニ
ットの免疫原決定因子からなり、本発明のワクチンに使
用できる、ＨＡタンパク質以外のポリペプチドである。

さらにもう一つの態様において、本発明は：細胞溶解産
物を、約６〜約８．５の範囲のｐＨにて、最初の洗浄処
理に付し、宿主細胞の汚染物を選択的に溶解させ、それ
により可溶性フラクションと不溶性フラクションを形成
させ、該不溶性フラクションはポリペプチドを含有して
おり：可溶性フラクションを不溶性フラクションから分
離し； 不溶性フラクションを、約９〜約１１の範囲のｐＨにて
、第２の洗浄処理に付し、宿主細胞汚染物を選択的に溶
解させ、それにより可溶性フラクションと不溶性フラク
ションを形成させ、該不溶性フラクションはポリペプチ
ドを含有しており；可溶性フラクションを不溶性フラク
ションから分離し； 不溶性フラクションをカオトロピズム剤に付し、それに
よってポリペプチドを溶解させ：可溶性フラクションを
不溶性フラクションから分離し、該可溶性フラクション
はポリペプチドを含有しており： 還元剤を可溶性フラクションに加え；および可溶性フラ
クションをイオン交換クロマトグラフィーに付し、ポリ
ペプチドを含有する溶出液を回収し、該溶出液は実質的
に混入している宿主細胞核酸、内毒素およびポリペプチ
ドがないことを特徴とする組換型宿主細胞培養の細胞溶
解産物からの本発明のポリペプチドを精製する方法に関
する。

他の態様において、本発明は、コーディング配列のみ、
またはＤＮＡクローニングまたは発現ベクターのような
より大きな分子への取り込みを含め、本発明のワクチン
用ポリペプチドのコーディング配列を含むＤＮＡ分子、
およびかかるＤＮＡ分子で形質転換した微生物まｌ；は
細胞である。

発明の詳説 しばしば、免疫原決定因子は、免疫防御応答を刺激しな
い。これは、大部分、宿主の身体防御系についての決定
因子が適当な配置で存在していないためであると考えら
れる。

以下に開示するように、ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユ
ニットの免疫原決定因子（１つまたはそれ以上の隣接し
た、または分離したハプテンからなっていてもよい）は
、驚くべきことに、もとの亜型中の種々の株に対して、
細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する。したがって、ＨＡ２免
疫原決定因子は、免疫原配置にて存在する場合、株特異
的であるよりもむしろ、亜型特異的である防御的免疫応
答を誘発することができる。例えば、ＨＡ２サブユニッ
トに免疫原配置をとらせることによって、ＨＡ２決定因
子を、免疫原決定因子に対して免疫応答をさせる第２の
ポリペプチドに融合し！：、　ＨＡ２サブユニット、す
なわち、実質的にＨＡタンパク質の無傷の）ｉＡ２サブ
ユニットからなるワクチン用ポリペプチド中に存在させ
ることができる。

好ましくは、ＨＡ２免疫原決定因子に対してそのような
免疫応答をさせるポリペプチドは、原核生物または真核
生物の組換型宿主により高レベルで発現される、実質的
に無傷のＨＡ２サブユニットのＮ−末端に融合したアミ
ノ酸配列からなる。

特に好ましくは、インフルエンザウィルス・タンパク質
由来のポリペプチドである。ＨＡタンパク質に対する免
疫防御応答は株特異的であると考えられるため、ワクチ
ン用ポリペプチドは、ＨＡタンパク質ではない。

イー・コリにおけるＨＡ免疫原決定因子を有するそのよ
うなワクチン用ポリペプチドの発現については、ＨＡ２
決定因子に対して免疫応答をさせるポリペプチドは、Ｎ
ＳＩインフルエンザウィルス・タンパク質のＮ末端であ
ることが好ましい。

その代表的かつ好ましい具体例は、本明細書にてＣ１３
と称するタンパク質である。第１図に示されているよう
に、ＣＩ３タンパク質は、アスパルテート−ロイシンを
コードするリンカ−配列を介して、ＨＡタンパク質のＨ
ＡＩＡ２サブユニットミノ酸３２６（セリン）、ＨＡ２
からＨＡｌを分離するＨＡのアミノ酸３２７（アルギニ
ン）、および無傷のＨＡ２サブユニット（アミノ酸１〜
２２２）からなるペプチドに融合したＮＳＩタンパク質
の最初の８１９１のアミノ酸を有する（ＨＡアミノ酸は
、ウィンターら、ネイチャー、２９２ニア２（１９８１
）から番号付けた）。

もう一つ別の具体例において、ワクチン用ポリペプチド
は、ｒｃ１３Ｃ１３シヨートされるタンパク質である。

第３図に示すように、Ｃ１３シヨートは、メチオニン−
アスパルテート−ロイシンをコードするりンカー配列を
介して、ＨＡタンパク質のＨＡＩサブユニットのアミノ
酸３２６（セリン）、ＨＡ２からＨＡＩを分離するＨＡ
のアミノ酸３２７（アルギニン）、および無傷のＨＡ２
サブユニット（アミノ酸ｌ〜２２２）からなるペプチド
に融合しｔ；、（アミノ酸１３（システィン）がセリン
により置換されていることを除いては）ＮＳＩタンパク
質の最初の４２個のアミノ酸からなる。

その単離および精製が比較的容易であるため、Ｄタンパ
ク質であることがさらに好ましい。第２図に示すように
、Ｄタンパク質は、グルタミン−イソロイシン−プロリ
ンをコードするリンカ−配列を介して、切形のＨＡ２サ
ブユニット（アミノ酸６５〜２２２）のＮ−末端アミノ
酸６５に融合したＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸から
なる。

Ｄタンパク質のＤＮＡコーディング配列は、ＨＡ２コー
ディング配列を、ＰｖｕＩ［で制限し、合皮オリゴヌク
レオチドリンカーを介して、Ｎｃｏ１部位のＣ−末端領
域をＮＳＩコーディング配列におけるアミノ酸８１と８
２の間に結ぶことにより調製される。

他の具体例において、ワクチン用ポリペプチドは、Ｄタ
ンパク質誘導体、すなわち、ＮＳＩの最初の８１個のア
ミノ酸が、グルタミン−イソロイシン−プロリンをコー
ドするリンカ−配列を介して、各々、切形のＨＡ２サブ
ユニット（アミノ酸６９〜２２２）のＮ−末端アミノ酸
６９（Ａタンパク質）および切形のＨＡ２サブユニット
（アミノ酸８１〜２２２）のＮ−末端アミノ酸８１　（
Ｃタンパク質）に融合している「Ａ」タンパク質および
ｒＣＪＣタンパク質なる。第３のＤタンパク質誘導体は
、グルタミン−イソロイシン−プロリン−バリンをコー
ドするリンカ−配列を介して、切形のＨＡ２サブユニッ
ト（アミノ酸１５０〜２２２）のＮ−末端アミノ酸１５
０に融合したＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸からなる
ΔＤタンパク質である。

さらにもう一つ別の具体例において、ワクチン用ポリペ
プチドは、「Ｄショート」と称されるタンパク質である
。第４図に示すように、Ｄショートは、メチオニン−ア
スパルテート−ヒスチジンメチオニン−ロイシン−スレ
オニン〜セリンースレオニンーアルギニン−セリンをコ
ードするりンカー配列を介して、切形のＨＡ２サブユニ
ット（アミノ酸６６〜２２２）のＮ−末端アミノ酸６６
に融合した、（アミノ酸１３（システィン）がセリンに
より置換されていることを除いては）ＮＳＩタンパク質
の最初の４２個のアミノ酸からなる。

本発明のワクチン用ポリペプチドは、化学的合成技術に
より調製できる。しかしながら、それら・は宿主微生物
または細胞内にて、該ポリペプチドのコーディング配列
を有するＤＮＡ７ラグメントをクローニングおよび発現
することにより、公知の組換型ＤＮＡ技法で調製するこ
とが好ましい。

多量の所望のタンパク質を安全かつ安価に産生ずるため
に用いることができるため、好ましい宿主はイー・コリ
である。

インフルエンザウィルス び他のウィルス性タンパク質のコーディング配列は、合
皮的に調製可能であり、または公知の技術によりウィル
スＲＮＡから、または入手可能なｃＤＮＡ含有プラスミ
ドから誘導することができる。例えば、前記の文献に加
えて、ゲシングら（Ｇｅｔｈｉｎｇ　ｓｔ　ａｌ．）は
、ネイチャー、２８７巻、３０１〜３０６頁（１　９　
８　０）において、Ａ／ジャパン／３　０　５１５　７
株からのＨＡのＤＮＡコーディング配列をクローンし、
配列したことを報告しており；スリーら（Ｓ　ｌｅｉｇ
ｈ　ａｔ　ａｌ．）およびポウスら（Ｂｏｔｈ　ｅｔ　
ａｌ、）は、共に、ディベロップメンツ・イン・セル・
バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　１ｎＣｅｌ
ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、エルスヴイール・サイエンス
・パブリッシング・カンパニー、６９〜７９頁および８
１〜８９頁、１９８０において、Ａ／ＮＴ／６０／６８
株のＨＡココ−ィング配列をクローンしたことを報告し
ており：デービスら（Ｄａｖｉｓａｔ　ａｌ、）は、ジ
ーン（Ｇ　ｅｎｅ）、１０巻、２０５〜２１８頁（＋９
８０）において、およびヒチら（Ｈｉｔｉ　ｅＬ　ａｌ
、）は、パイロロジー（Ｖ　ｉ　ｒｏ　Ｉｏｇｙ）、１
１１巻、１１３〜１２４頁（１９８１）において、Ａ／
ＷＳＮ／３３株のＨＡココ−ィング配列をクローンしｔ
；ことを報告している。ポーターら（Ｐｏｒｔｅｒ　ｅ
ｔ　ａｔ、）およびエムテイジら（Ｅ　ＩＩＩｔａｇｅ
ｅｔ　ａｔ、）は、共に、前記のディベロップメンツ・
イン・セル・バイオロジー、３９〜４９頁および１５７
〜１６８頁において、ニワトリのペストウィルスのＨＡ
ココ−ィング配列をクローンしたことを報告している。

また、他の株、亜をおよび型を含むインフルエンザウィ
ルスは、臨床試料および米国、メリーランド州、ロック
ビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクシ３ンのような公的寄託機関
から入手可能である。

例えば、イー・コリ、バチルス（ＢＢｃｉｌｌｕｓ）、
ストレプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、
サツカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　、
哺乳動物および昆虫の細胞を含む種々の微生物および細
胞において、ワクチン用ポリペプチドをクローニングお
よび発現する系が知られており、私的および公的研究所
および寄託機関、および商業的販売者から入手可能であ
る。

本発明の方法は、組換型宿主細胞培養から誘導された、
細胞源の発熱性、タンパク様および核酸汚染物を含有す
る細胞溶解産物を、遠心分離およびクロマトグラフィー
を包含する一連の溶解および分離操作に付し、実質的に
汚染物のない所望のポリペプチドを得ることを包含する
。

組換型宿主は、以下に記載するように調製する。

かかる組換型細胞を、酸素の存在下、標準的発酵技法に
より、炭素、窒素および無機物の同化可能な供給源を含
有する滋養培地中にて培養する。組換型ポリペプチドを
発現するのに十分な時間、発酵させた後、遠心分離また
は濾過により細胞を収集する。ついで、得られた細胞ペ
ーストを再懸濁させ、溶解作用に付す。

細胞溶解は、湿った細胞ペレット重量に基づき約１００
〜３００　ｇ／Ｑの細胞濃度での細胞ペレットの緩衝懸
濁液（ｐＨ６およびｐＨ８，５の間、好ましくはｐＨ８
）に、リゾチームまたは他の溶解もしくは浸透剤を添加
することにより達成することができる。生産規模の操作
における細胞ペレットの重量は、精製した個々のポリペ
プチドに依存し、８００〜３０００ｇの範囲とすること
ができる。適当な溶解緩衝液は、約８．０のｐＨを有す
るトリス（５０ｍＭ）　、ＥＤＴＡ　（２ｍＭ）　、ジ
チオスレイトール（ＤＴＴＸｏ、１ｍＭ）　、およびグ
リセロール（５％）である。細胞溶解はまた、リゾチー
ムの不在下、機械的または超音波破壊の手段により行な
ってもよい。申し分のない結果が、ガラリン・ホモジナ
イザー（Ｇａｕｌｉｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（マ
サチューセッツ州、工ヴエレット、ＡＰＶガウリン・イ
ンコーホレイティラド）（Ａ　Ｐ　Ｖ　Ｇａｕｌｉｎ。

Ｉ　ｎｃ、、　Ｅ　ｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓ
ｅｔｔｓ）を用いて得られた。所望により、化学的、機
械的および／または超音波溶解手段を組み合わせて用い
てもよい。

ついで、細胞溶解した懸濁液を、約６８よび８゜５の間
のｐＨ，好ましくはｐＨ８にて、洗浄剤、例えば、デオ
キシコール酸塩、例えばナトリウム塩・モノ水和物（約
０．１％）のようなイオン性洗浄剤で処理し、所望の組
換型ポリペプチドが、細胞残骸（膜およびタンパク質）
および／またはタンパク質を変質させることな←細胞形
質膜を溶かす、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００Ｘコ不テイカツト州、二ニー・ハベン、インタ
ーナショナル・バイオチクノロシーズ・インコーホレイ
ティラド（Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ　ｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、、ＮｅｗＨａｖ
ｅｎ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）のような非イオン性洗
浄剤に結合することを妨げる。細胞溶解した懸濁液を、
例えば、１００〜５００ｍ１２／分の流速で、ベツクマ
ン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）　Ｊ　ＣＦ−Ｇ回転機を用い約
２５０００Ｘｇにて連続遠心分離を行なうことにより清
浄化し、溶解した宿主細胞の汚染物を含有する上澄液を
捨て、ポリペプチドを含有する不溶性フラクションをさ
らに精製に付す。

さらに別の宿主細胞汚染物を除去するため、該細胞溶解
産物を付加的な洗浄処理に付してもよい。

例えば、ポリペプチドを含有するベレットを、約９．５
〜約１１の範囲のｐＨでの適当な緩衝液に再懸濁させる
ことができる。特に有用な緩衝液は、ｐＨ９，５〜Ｉｉ
１好ましくはｐＨＩ　Ｏ〜１Ｏ０５、最も好ましくはｐ
Ｈ１０，５でのグリシン−ＮａＯＨ（５０ｍＭ）、ＥＤ
ＴＡ　（２ＩＩＩＭ）８よびグリセロール（５％）であ
る。ホモジナイザーを用い、再懸濁を促進させてもよい
。低ｐＨの前の洗浄処理工程にて、初期に溶解すること
なくポリペプチドと複合した宿主細胞膜を溶解させるた
め、トリトンＸ−１００のような非イオン性洗浄剤を該
懸濁液に加えてもよい。該懸濁液を遠心分離（２５００
０×ｇ）により清浄化し、溶解した宿主細胞汚染物を含
有する上澄液を捨て、ポリペプチドを含有するペレット
状の不溶性フラクションをさらに別の処理に付す。

洗浄剤で処理した後、組換型ポリペプチドを含有するベ
レットを、適当なカオトロピズム剤、例えば、尿素また
はグアニジン塩酸塩、好ましくは尿素で処理する。カオ
トロピズム剤として尿素を用いる場合、組換型ポリペプ
チドを含有するペレットを尿素緩衝液、例えば、ｐＨ７
５〜９、好ましくはｐＨ８にて、５０ｍＭトリスの８Ｍ
尿素に溶かす。不溶性の宿主細胞汚染物を、遠心分離、
例えば、２５０００Ｘｇにより除去する。溶解したポリ
ペプチドは上澄液中に残る。

記載されている方法における細胞溶解産物の部分的精製
は、最初、該細胞溶解産物中にある宿主細胞汚染物の量
を有意に減少させる。

残りの宿主ＭＪ胞汚染物、特に核酸および内毒素を、部
分的に精製したポリペプチドからさらに分離することは
、適当なマトリックスに結合したジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）　、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）および
ポリエチレンイミン（ＰＥｌ）のようなアニオン交換基
を有する微粒子カラム充填剤を用いるイオン交換クロマ
トグラフィーにより実施することができる。イオン交換
体は、精製ずべきポリペプチドが通過するのに十分に多
孔性であり、開口性のマトリックスを提供しなければな
らない。核酸、内毒素および低分子量の宿主細胞混入タ
ンパク質を、ポリペプチドを含有する部分的に精製した
細胞溶解産物から有意に減少させることは、アニオン交
換担体、例えば、組換型タンパク質を溶解させるのと同
じ緩衝液、例えば、ｐＨ８での８ＭＲ素、５０ｍＭトリ
スで平衡にしｆ：ＤＥＡＥ・７アースト・７０−・セフ
ァロース・カラム（ＤＥＡＥ　　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎ）上にて達成される。

還元剤、例えば、ジチオスレイトールまたは２−メルカ
プトエタノールを緩衝溶液に添加することにより、イオ
ン交換クロマトグラフィーによる宿主細胞タンパク’ｉ
ｓよび低分子量切断産生物の除去が促進される。

ペプチド含有溶液をイオン交換担体と接触させ、ついで
そこから溶出させる。溶出は、実質的に核酸および混入
している宿主細胞タンパク質がなく、所望の免疫原ポリ
ペプチドを含有するフラクションを得る適当な緩衝溶液
を用いて実施することができる。ここで溶出液として用
いられる緩衝溶液は、生物学的物質のイオン交換クロマ
トグラフィーにおいて広く用いられるものである。アニ
オン交換担体からのグラジェント溶出、例えば、５倍以
上のカラム容量にわたり、０．０−０．５ＭＮａＣＱグ
ラジェント、好ましくは、０．０〜０゜３Ｍ　ＮａＣＱ
グラジェントを用いることが、本発明のポリペプチドで
は有利である。宿主細胞汚染物および所望のポリペプチ
ドはイオン交換マトリックス上に吸着され、所望のポリ
ペプチドは該汚染物とは別々のフラクションにて特異的
に脱着される。タンパク質含有溶出液を、連続的に数回
、同一のイオン交換カラムを、または種々の充填剤を有
する別のカラムを通してもよい。

すぐ前に記載したアニオン交換クロマトグラフィ−（例
えば、ＤＥＡＥ・ファースト・７０−・セファロース）
から回収された精製細胞溶解産物から、核酸、低分子量
の宿主細胞混入タンパク質、および、特に内毒素をさら
に有意に減少させることは、該溶解産物を、還元状況下
（還元剤、例えば、ジチオスレイトールの添加により達
成される）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のよう
な強変性剤で処理することにより実施することができる
。

変性剤が問題のタンパク質の展開をもたらし、還元状況
が該タンパク質のジスルフィド結合を破壊し、より一層
の展開を可能とすることが理論付けられ、それにより溶
解している宿主細胞汚染物がタンパク質と共に凝集する
と考えられる。サイズ排除クロマトグラフィー、例えば
、バイオ−ゲルへおよびバイオ−ゲルＰＣ（米国、カリ
フォルニア州、リッチモンド、パイオーラッド（Ｂ　ｉ
ｏ−Ｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ　　Ｕ　Ｓ　Ａ　）　　；ス
ペロース１２（Ｓ　ｕｐｅｒｏｓｅ　ｌ　２　）　、セ
ファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）、セファクリル−
ＨＲ（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ−ＨＲ）　、セファロース
（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）およびスーパーデックス（Ｓ
　ｕｐｅｒｄｅｘ）　　（ファーマシア）　　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｔａ）、特に好ましくは、スペローズ１２（フ
ァーマシア）クロマトグラフィーにより、かように処理
された細胞溶解産物のクロマトグラフィーは、それと共
に前に凝集した宿主細胞汚染物を除去することにより、
実質的にさらに純粋なタンパク質含有フラクシタンの溶
出をもたらす。宿主細胞汚染物のより一層の減少は、精
製した細胞溶解産物を、強変性剤および還元剤、つづい
てサイズ排除クロマトグラフィーでの処理を繰り返すこ
とにより行なうことができる。

精製しｔ；細胞溶解産物から前記の変性剤を除去するた
めに、サイズ排除クロマトグラフィーから回収したタン
パク質含有フラクションを、加えてサイズ排除クロマト
グラフィーに付してもよい。

変性剤、特に変性剤がＳＤＳである場合に該変性剤を除
去するには、「脱塩カラムＪとして当業者に知られてい
るクロマトグラフィーカラム、例工ば、Ｇ５０または好
ましくはＧ２５セフアデツクス（ファーマシア）のファ
イン・クロマトグラフィーカラムを用いることが有利で
あることが判明した。変性剤除去は、カオトロピズム剤
、例えば、尿素の存在下にて行なわれた場合に、特に効
果的である。例として、ＳＤＳ含有フラクションを、８
Ｍ尿素含有緩衝溶液で予め平衡にした脱塩カラムに適用
し、その後かかるフラクションを平衡緩衝液で溶出する
ことが、ＳＤｓによる混入のないタンパク質の回収を最
大限にするにおいて、特に効果的であることが見いださ
れた。

前記のように混入しているポリペプチド、内毒素および
核酸の除去処理を行なった後に、細胞溶解産物には実質
的に残りの宿主細胞汚染物がなくなる。

高純度の医薬グレード産生物を得るのにかかる他の操作
が必須であるわけではないが、種々の他の操作を本発明
の方法に関連して用いることができる。かかる操作は、
前記の処理工程の間、前または後に用いることができる
。一つのかかる最適工程は、シアフィルトレージ：Ｉ　
ン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。

「ジアフィルトレーション」なる語は、本明細書では、
その分野において認識されている意味にて用いられ、多
くの緩衝液交換を行なうに極めて効果的である連続透析
形をいう。ジアフィルトレージョンハ、セルロース膜ま
たは限外フィルターを通して実施することが好ましい。

適当な膜／フィルターは、約１０００分子量（ＭＷ）か
らのカットオフを有するもの、ないし直径２，４μｍま
での孔径を有するものである。ジアフィルトレーション
に適用できる多くの異なる系は、ＩＯＫ・アミコン・デ
ュアル・スパイラル・カートリッジ系（１０Ｋ　Ａｍ１
ｃｏｎ　ｄｕａｌ　５ｐｉｒａｌ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅ
　ｓｙｓｔｅｍ）のように、商業上入手可能である。本
発明の方法においては、約８のｐＨでの２０ｍＭトリス
緩衝液を用いるジアフィルトレーションを、ポリペプチ
ドの精製およびその後の濃縮において効果的に用いるこ
とができる。

本発明のワクチンは、１またはそれ以上の本発明のワク
チン用ポリペプチドと、担体または希釈剤とからなる。

例えば、かかるワクチンは、実質的に、いくつかの亜型
の各々からの無傷のＨＡ２サブユニットからなることが
でき、各々は、生理食塩水または他の生理溶液中で、高
度に保存されたＮＳＩタンパク質のＮ末端アミノ酸に融
合している。水酸化アルミニウムのようなアジュバント
の使用も好ましい。好ましいワクチンは、３つのワクチ
ン用ポリペプチドからなり、各々は実質的に、Ｃ１３タ
ンパク質の場合と同様、いずれかのＮＳＩタンパク質の
最初の８１個のアミノ酸の周囲に融合しｆ；Ｈ１％Ｈ２
およびＨ３亜型の１つからの無傷のＨＡ２サブユニット
からなっている。

また、多価ワクチンが、サブユニットまたはポリペプチ
ド抗原または死苗ウィルスもしくは菌体のようなインフ
ルエンザウィルスまたは他の病原体に由来する追加免疫
原と結合しｔ；本発明の１つまたはそれ以上のポリペプ
チドから調製でき、インフルエンザならびに他の侵入生
物またはウィルスに対する防御を刺激しうるワクチンを
産生する。

かかるワクチンの処方技術はよく知られている。

例えば、ワクチン用ポリペプチド、および複合ワクチン
の場合の他の免疫原は凍結乾燥し、後に生理食塩水まＩ
；は他の生理溶液中に再水和することができる。

投与量および投与プロトコルは、標準的なワクチン接種
法に従って最適化できる。経口、眼球内、皮肉および鼻
腔的投与のような他の投与経路を用いてもよいが、典型
的には、該ワクチンを筋肉内に投与する。他のポリペプ
チドワクチンについての公知事実に基づき、平均成人に
対する有効な１回の投与量は１〜１０００μｇ、好まし
くは５〜１５０ｐｇ、最も好ましくは１０〜１１００ｐ
であると考えられる。該ワクチンは、最初は、晩夏また
は初秋に投与でき、所望により、２〜６週間後、または
免疫が弱まる毎に定期的に、例えば、２〜５年毎に再投
与することができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ プラスミドｐＭ３０ プラスミドｐＡＰＲ７０１は、ＭｌおよびＭ２インフル
エンザウィルス・タンパク質（Ａ／ＰＲ／８／３４）の
コーディング領域を有するｐＢＲ３２２由来のクローニ
ング・ベクターである。そのことは、ヤングら（Ｙｏｕ
ｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）が、ジ・オリジン・オブ・パンデ
ミツク・インフルエンザ・バイラシーズ（Ｔｈｅ　Ｏｒ
ｉｇｉｎ　ｏｆ　Ｐａｎｄｅｍｉｃ　Ｉ　ｎｆｌｕｅｎ
ｚａＶ　１ｒｕｓｅｓ）、１９８３、ダブル・ジー・レ
イバー（Ｗ、Ｇ、Ｌａｖｅｒ）編、エルスヴイール◆サ
イエンス・パブリッシング・カンパニー（Ｅ　ｌ５ｅｖ
ｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、
）において記載している。

プラスミドｐＡＰＲ８０１は、ＮＳＩコーディング領域
（Ａ／ＰＲ／８／３４）を有するｐＢＲ３２２由米のク
ローニング・ベクターである。ヤングらが、前掲におい
て記載している。

プラスミドｐＡＳ　ｌは、ＰＬプロモーター、Ｎ利用部
位（Ｎタンパク質の存在下、転写極性効果を緩和するた
め）および直接ＢａｍＨ１部位に続＜ｃＵ翻訳開始コド
ンを含むｃｌｒリポソーム結合部位を含むＤＢＲ３２２
由来の発現ベクターである。ローゼンバーグら（Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）が、メソンズ・イン・エ
ンザイモロジー（Ｍ６ｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ１．）、
１０１巻、１２３−１３８頁（１９８３）において記載
している。

プラスミドｐＡｓ１ΔＥＨは、ｐＡＳ　ｌからｐＢＲ３
２２複製開始点の非必須ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ領
域を欠失させることにより調製した。

ウィルス復製開始点の８６１塩基対ＢよびｐＢＲ３２２
複製開始点の３７５塩基対におけるＮＳＩコーディング
領域を含んでいるｐＡＰＲ８０１の１２３６塩基対Ｂａ
ｍ　Ｈｌフラグメントを、ｐＡＳＩΔＥＨのＢａｍＨ１
部位に挿入した。得られたプラスミド、ｐＡｓｌΔＥＨ
／８０１は標品のＮ５Ｉ（２３０アミノ酸）を発現する
。このプラスミドは、アミノ酸８１および８２のコドン
の間にＮｃｏＩ部位、およびＮＳ配列に対するＮｒｕＩ
部位３′を有している。アミノ酸ｌおよび２の間のＢａ
ｍＨ１部位は保持されている。

Ｍｌタンパク質のＣ末端の５０１１１のアミノ酸のコー
ディング配列を有する５７１塩基対７ラグメントは、ｐ
ＡＰＲ７０１をＮｃｏｌおよびＥｃ。

ＲＶで制限することにより得た。このフラグメントを、
該プラスミドからそのフラグメントの欠失後のｐＡＳ　
ｌΔＥＨ／８０１におけるＮｃｏｌおよびＮｒｕ　Ｉ部
位の間に挿入した。得られｔ；プラスミド、ｐＭ３０は
、Ｍｌの最後の５０個のアミノ酸に融合したＮＳＩの最
初の８１個のアミノ酸である融合タンパク質をコードす
る。ＮｃｏｌおよびＢａｍＨ１部位は保持されている。

実施例２ プラスミドｐｃ１３ プラスミドｐＪＺ１０２は、無傷のＨＡタンパク質（Ａ
／ＰＲ／８／３４）のコーディング領域を有するｐＢＲ
３２２由来のクローニング・ベクターである。実施例１
で引用しｔ；ヤングらにより記載されている。

プラスミドｐＢｇｌｌｌは、ｐＢＲ３２２のＮｒｕＩ部
位にて８ｇｌｌｌリンカ−を有するｐＢＲ３２２由来の
クローニング・ベクターである。

ｐＪＺ１０２をＭｎ１Ｉで切断した。８ｇｌｌｌリンカ
−を全末端に結び、ＨＡ２含有フラグメントをｐＢｇｌ
ｌｌに挿入した。得られたプラスミド、ｐ　Ｂ　ｇ　ｌ
　ＩＩ　／　ＨＡ　２における５′末端は、次のように
配列している。

１　　　　　　　２　　　　　　　３ ５’　　ＡＧＡＴＣＴＧ　　　ＴＣＣＡＧＡ　　　ＧＧ
Ｔ　　　　　　３’領域ｌは８ｇｌｌｌリンカ−に由来
し、アスパルテートおよびロイシンをコードする。ｌＪ
［２はＨＡｌに由来し、セリン（ＨＡｌアミノ酸３２６
）およびアルギニン、（ＨＡＩをＨＡ２から分離するＨ
Ａアミノ酸３２７）をコードする。領域３はＨＡ２に由
来し、ＨＡ２サブユニットのすべてのアミノ酸をコード
する。

３′末端は次のように配列している。

５′ ３　　　４　　　　５　　　　　　　６−−−ＡＴＡＴ
ＧＣＡＴＣＴＧＡ　　ＧＡＴＴＡＧＡＡＴＴＴＣＡ　　
ＣＡＧＡＴＣＴ領域４はＨＡ２停止コドンである。領域
５はウィルス複製開始点の３゛非コ一デイング配列であ
る。

領域６は８ｇｌ１１リンカ−に由来している。

ＨＡ２コーディング配列を有する８９１塩基対７ラグメ
ントは、ｐＢｇｌｌｌ／ＨＡ２をＢｇｌ［ｌで制限する
ことにより得られた。該フラグメントをＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（クレノー）　（Ｋ　Ｉｅｎｏｗ）で末端をふさ
ぎ（ｅｎｄ−ｆｉｌｌｅｄ）、Ｎｃｏｌで切断され、同
様に末端をふさいだ（クレノー）ｐＡＳ１ΔＥＨ／８０
１に結んだ。得られたプラスミドはｐｃＩ３である。Ｎ
５Ｉ−ＨＡ２、平滑末端部は、次のように配列している
。

領域７はＮＳＩ遺伝子に由来している。領域１．２８よ
び３は前記と同じである。

実施例３ ＣＩ３タンパク質の産生 イー・コリ宿主株Ｎ５１５１である温度感受性欠損Ａ溶
原（ｃＩ８５７）を、ｐｃｉ３で形質転換した。形質転
換体を、アンビンリン１００μｇ／−を補足したＬＢジ
ブロス中３２℃にて中央対数期（Ａ　ｚ　ｓ。−０，６
）まで増殖させた。ついで、培養物を４２°Ｃに移し、
ｃＩを不活性化し、かくしてＣ１３タンパク質の合成を
誘発した。４２℃にて２時間後、菌体を遠心分離（３５
００ｒｐｍ。

２０分間）により収集し、菌体ペレットを一２０℃にて
凍結させＩ；。

該ペレットを解凍し、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｑ、ｐＨ８，０１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレ
イトール、５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール）に再懸濁させ
た。リゾチームを最終濃度が０゜２　ｍｇ／−になるま
で加え、混合物を氷上にて２０分間インキュベーション
した。ついで、該混合物をワーリング・ブレンダー（Ｗ
ａｒｉｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒ）中、高速にて１５秒間ず
つ６回バーストして処理した。

ライト、該懸濁液を、ブランソン・プローブ・ソニファ
イアー（Ｂｒａｎｓｏｎ　ｐｒｏｂｅ　５ｏｎｉｆｉｅ
ｒ）を用いて、１分間超音波処理した。ついで、該混合
物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）に付した
。

超音波処理（４Ｘ１５秒間バースト）を行なうことによ
り、該ペレットをＭｉ衝液Ａに再懸濁させた。ついで混
合物を０．１％デオキシコール酸塩とし、４℃にて１時
間撹拌した。混合物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３
０分間）に付し、タンパク質をペレット化した。デオキ
シコール酸塩処理を繰り返し、ついで、得られたベレッ
トを超音波処理により緩衝液Ａに再懸濁させた。ついで
、該懸濁液を１％トリトンｘ−ｉｏｏとし、４°Ｃにて
１時間撹拌した。該混合物を再度遠心分離（１５０００
ｒｐｍ、３０分間）に付し、タンパク質ベレットを収集
しＩ；。タンパク質を超音波処理により再懸濁させ、該
タンパク質を尿素で溶解させた（最終濃度４Ｍ）。この
溶液を遠心分離に付し、いずれの粒状物質をも除去しく
１５０００ｒｐｍ。

３０分間）、上澄液を収集し、ｌＱのｌＱｍＭトリス−
ＨＣＱ％ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡに対して３回透析
し、尿素を除去した。タンパク質溶液を再度遠心分離に
付し、いずれの粒状物質をも除去しく１５０００ｒｐｍ
、３０分間）、Ｃ１３タンパク質を含有する上澄液を収
集し、検定用に用いた。Ｃ１３タンパク質の収率は、５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合、全細胞タンパク質
の約ｌＯ％である。

実施例４ プラスミドｐＤ プラスミドｐＡｓｌΔＥＨ／８０１（前記実施例１に記
載されている）を、Ｂｇｌｌｌで切断し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ　（ＤＮＡｐｏ　Ｉ　Ｉ　；クレノー）で末端
をふさぎ、連結して閉じ、かくしてＢｇｌＩ［部位を除
去した。得られたプラスミドｐ１３ｇ　ｌ−をＮｃｏｌ
で消化し、ＤＮＡｐｏ　ｌ　Ｉ（クレノー）で末端をふ
さぎ、８ｇ１１＋リンカ−に結んだ。得られたプラスミ
ドのｐＢ４は、ＮＳｌコーディング領域内にＢｇ１ｍ部
位を有している。プラスミドｐＢ４をＢｇｌｌｌで消化
し、配列が・ で示される合ＦＲＤＮＡリンカ−に結んだ。

得られたプラスミド、ｐＢ４＋は、すべての３つの解読
７レームにおける終止コドンに統＜ＮＳｌの最初の８１
個のアミノ酸のコーディング領域の後のリンカ−内での
ＤＮＡ７ラグメントの挿入を可能とする。ｐＢＪ＋をＸ
ｍａ　Ｔで消化しくリンカ−内で切断）、末端をふさぎ
（クレノー）、ＮＡ２コーディング領域に由来する５２
０塩基対ＰｖｕＩ［／Ｈｉｎｄｌ［ｒの末端をふさいだ
フラグメントに結んだ。得られたプラスミドのｐＤは、
第２図に示すように、ＮＳＩの最初の８１１’ｉのアミ
ノ酸、合成ＤＮＡリンカ−に由来する３個のアミノ酸（
ｇｉｎ−ｉ　１ｅ−ｐｒｏ）、つづいてＮＡ２のアミノ
酸６５〜２２２からなるタンパク質をコードする。

実施例５ シラスミドｐｃ１３ショート プラスミドｐＡｓ　ｌΔＥＨ８０１（実施例１にて記載
）を、Ｎｃｏｌおよび５ａｌＩで切断し、ＮｃｏＩ／５
ａｌＩフラグメントのようなヒトＴＧＦｔをコード化す
る合成ＤＮＡに結んだ。得られたグラスミド、ｐＮＳ　
ｌ□ＴＧＦσは、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸と成
熟（ｍａｔｕｒｅ）　ＴＧＦσ配列からなるタンパク質
をコード化する。プラスミドｐＮＳＬｓｒＴＧＦａをＨ
ｉｎｄＩ［ＩおよびＮｃｏｌで切断し、ＮＳＩのアミノ
酸８〜８１をコード化する２１８塩基対フラグメントを
遊離させた。ついで、ＨｉｎｄＩ［ｌ／ＮｃｏＩフラグ
メントのような（ＮＳＩ配列のアミノ酸番号１３がシス
ティンからセリンに変わっていることを除いては）ＮＳ
Ｉの最初の４２個のアミノ酸の８〜４２をコード化する
合成りＮＡを、該プラスミドに結んだ。得られたプラス
ミドであるｐＮｓ１４２ＴＧＦαは、ＮＳＩの最初の４
２個のアミノ酸および成熟ＴＧＦσ配列からなるタンパ
ク質をコード化する。ついで、プラスミドｐ　Ｎ　Ｓ　
１−ｚＴ　Ｇ　ＦσをＮｃｏＩで消化し、ｐｃ１３由来
のＮＡ２領域をコード化する７０４塩基対ＮｃｏＩフラ
グメントに結んだ。得られたプラスミドのｒｐｃＩ３シ
ョート」は、第３図に示すように、（アミノ酸番号１３
がシスティンからセリンに変わっていることを除いては
）ＮＳＩの最初の４２個のアミノ酸、合成りＮＡリンカ
−によりコード化された３個のアミノ酸（ｍｅ　ｔ−ａ
ｓｐ−Ｉｅｕ）、ＨＡＩのカルボキシ末端からのアミノ
酸（３２６Ｘｓ　ｅ　ｔ）、ＨＡＩおよびＨＡ　２サブ
ユニツトを分離するアルギニン残基（３２７）および無
傷のＨＡ２サブユニットからなるタンパク質「Ｃ１３シ
ヨート」をコード化する。

実施例６ ブラスミドｐＤシゴート ブラスミドｐＭＧ２７Ｎ、ｐＡｓ］誘導体（モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ　Ｂ　ｉｏ、）、５．１０１５−１０２４（＋９８５
））を、ＢａｍＨＩおよび５ａｃＩで切断し、ｐＡｓｌ
ΔＥＨ８０１からＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸をコ
ード化するＢａｍＨＩ／Ｎｃｏｒ７ラグメントおよび以
下の配列を有する合成りＮＡＮｃｏｌ／５ａｃＩフラグ
メントに結んだ。

得られたプラスミドのｐＭＧｌは、３つのすべての解読
フレームにおける終止コドンに続く合成リンカー７ラグ
メント内の３つのいずれかの解読フレームにおけるＮＳ
Ｉの最初の８１個のアミノ酸の後のＤＮＡフラグメント
の挿入を可能とする。

ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸よりもむしろＮＳｌの
最初の４２個のアミノ酸のコーディング領域を有する類
似のベクターを誘導するため、ｐＭＧｌを、ＢａｍＨＩ
およびＮｃｏＩで消化し、ｐＮＳＩ、、ＴＧＦσからＮ
ＳＩのアミノ酸２〜４２をコード化するＢａｍＨＩ／Ｎ
ｃｏｌフラグメントに結んだ。ついで、得られたｐＭＧ
４２Ａと称されるプラスミドを、Ｎ５１１２配列後、一
連の種々の制限酵素部位で選択的合成リンカ−を有する
ように修飾し、異種のＤＮＡフラグメントをＮ５１４、
の後の３つの解読フレームに挿入した。このリンカ−は
以下の配列を有する： ついで、得られたプラスミド、９ＭＧ４２Ｂを、合成リ
ンカー内で切断するＥｃｏＲＶおよびｘｈｏｌで消化し
た。ついで、それをｐ　Ｍ　Ｓ　２に由来するＰｖｕｌ
ｌ／５ａｌＩ７ラグメントで結び、プラスミド「ｐＤシ
ョート」を得た。このプラスミドはタンパク質、　「Ｄ
シミ−ト」をコード化し、それは、第４図に示すように
（アミノ酸番号１３がシスティンからセリンに変わって
いることを除いては）ＮＳＩの最初の４２個のアミノ酸
、合成リンカー由来の１０個のアミノ酸（ｍｅｔ−ａｓ
ｐ−ｈｉｓ−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ｔｈｒ
−ａｒｇ−ｓｅｒ）およびＨＡ２サブユニットのアミノ
酸６６〜２２２からなる。

実施例７ プラスミドｐｃＩ３（８６９〜２２２）プラスミドｐＢ
４＋　（実施例４において記載）をＸｍａＩで切断（−
１末端をふさぎ（クレノー）、ＨＡ２コーディング領域
に由来する５０８塩基対ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ［Ｉの
末端をふさいだ７ラグメントをそれに結んだ。得られＩ
；プラスミドｐＣ１３（８６９〜２２２）は、ＮＳＩの
最初の８１個のアミノ酸、合成りＮＡリンカ−由来の３
個のアミノ酸（ｇｌｎ−ｉ　１ｅ−ｐｒｏ）およびＨＡ
２サブユニットのアミノ酸６９〜２２２からなる「Ａ」
タンパク質をコードする。

プラスミドｐＢ４＋　（実施例４において記載）をＳｍ
ａ　Ｉで切断し、ＨＡ２コーディング領域に由来の４７
４塩基対ＡｈａＩＩ［／Ｈｉｎｄｎ［の末端をふさいだ
フラグメントに結んだ。得られたプラスミド、ｐｃ１３
（Ｈ８１〜２２２）は、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ
酸、合成りＮＡリンカ由来の３個のアミノ酸（ｇｌｎ−
ｉ　１ｅ−ｐｒｏ）ｂ′よびＨＡ２サブユニットのアミ
ノ酸８１〜２２２からなる「Ｃ」タンパク質をコードす
る。

実施例９ プラスミドｐｃｉ３（ＨＡ１５０〜２２２）プラスミド
ｐＪＺ１０２　（実施例２において記載）を、Ｈｉｎｄ
ＩＩｌで切断し、ＨＡ　　ｃＤＮＡを遊離させた。この
１７８４塩基対フラグメントを単離し、ＨｉｎｄｌＩＩ
で切断されたｐＵＣ８に結んだ。ついで、得られたプラ
スミド、Ｉ）ＭＳ２をＢｓｍＩで切断し、ついでヤエナ
リ（ｍｕｌｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理した５ａｌＩ
を消化した。ついで、ＨＡ２のＣ−末端コーディング領
域を含む２８０塩基対フラグメントを単離した。このフ
ラグメントを、Ｘｍａｌで切断し、末端をふさぎ（クレ
ノー）、ついで５ａｌＩで切断したｐＢ４＋プラスミド
に結んだ。得られｔ；プラスミド、ｐｃ１３（Ｈ６５〜
２００）は、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合１ｇ
ＤＮＡリンカ−によりコード化された４個のアミノ酸（
ｇｌｎ−４１ｅ−ｐｒｏ−ｖａｌ）、つづいてＨＡ２サ
ブユニットのアミノ酸１５０〜２２２からなる「ΔＤ」
タンパク質をコードする。

実施例１０ プラスミドｐΔ１３ プラスミドｐｃ１３をＥｃｏＲＩで切断し、１１６３塩
基対の７ラグメントを遊離させ、連結して閉じ、プラス
ミドｐΔ１３を得た。この操作は、ＨＡ２のＣ−末端１
５２アミノ酸のコーディング領域の喪失をもたらす。結
果的に、このプラスミドから得られた融合タンパク質「
Δ１３Ｊは、Ｎ３１の最初の８１個のアミノ酸、合成Ｄ
ＮＡリンカ−によりコード化された２個のアミノｒＩｉ
（ａ　５ｐ−１ｅｕ）、ＨＡＩのカルボキシ末端からの
１個のアミノ酸（ｓｅｔ）、ＨＡ２からＨＡＩを分離す
るアルギニン残基（３２７）、ＨＡ２の最初の７０個の
アミノ酸、つづいてｐＢＲ３２２配列に由来する８個の
アミノ酸（ｓｅｒ−ｃｙｓ−１ｅｕ−ｔｈｒ−ａｌａ−
ｔｙｒ−ｈｉｓ−ａｒｇ）を有する。

実施例ＩＩ プラスミドｐｃＩ３（Ｈ６５〜１９６）αＭＳＨプラス
ミドｐＭＳ２（実施例９に記載）をＢｓｔＸＩおよび５
ａｌＩで消化し、σ−色素胞刺激ホルモン（ａＭＳＨ）
をコード化する合成リンカ−に結んだ。得られたプラス
ミド、ｐＭＳ２αＭＳＨを、ＥｃｏＲＩ　（ＨＡ２：ｌ
−ディング領域内）およびＳａ　Ｉ　Ｉ　（ｙＭＳＨコ
ーディング配列のカルボキシ末端）で消化し、４３１塩
基対７ラグメントを遊離させ、それを単離し、Ｅ　ｃ　
ｏ　ＲＩおよび５ａｌＩで消化されたプラスミドｐＤに
結んだ。

得られたプラスミドのｐｃ１３（Ｈ６５〜１９６）ａ　
Ｍ　Ｓ　Ｈは、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合成
ＤＮＡリンカー由来の３個のアミノａ（ｇｌｎ−ｉ　Ｉ
ｅ−ｐｒｏ）、ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５〜１
９６．２ｉ１のグリシン、つづいてａＭＳＨ（ｓｅｒ−
ｔｙｒ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｇｌｕ−ｈｉｓ−ｐｈｅ−ａ
ｒｇ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｖａｔ）から
なるハイブリッドタンパク質ｒＭＪをコード化する。

実施例１２ プラスミドｐｃ１３（Ｈ６５〜１９６）ΔＭＳＨプラス
ミドｐｃ１３　（Ｈ６５〜Ｉ９６）ａＭＳＨをＮｃｏｌ
で消化し、末端をふさぎ（クレノー）、次の配列の１２
塩基対の翻訳停止リンカ−に結んだ。

得られたプラスミド、ｐｃ１３（Ｈ６５〜１９６）ａＭ
ＳＨは、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合成りＮＡ
リンカ−由来の３個のアミノ酸（ｇＩｎ−ｉ　１ｅ−ｐ
ｒｏ）、ＨＡ２サブユニットのアミノ酸６５〜＋９６、
ｇｌｙ−ｇＮ’ｑ　　ａＭＳＨの最初の４個のアミノ酸
（ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｓｅｔ−ｍｅｔ）、つづいて終止リ
ンカ−に由来する３個のアミノ＃（Ｉｅｕ−ｖａ　１−
ａｓｎ）からなる「６Ｍ」タンパク質をコード化する。

実施例１３ プラスミドｐｃ１３（Ｈ６５〜２００）プラスミドｐＭ
Ｓ２（実施例９において記載）を、Ｂｓ　ｔＸＩおよび
Ｓａ１丁で消化し、以下の配列を有する合成リンカ−に
結んだ。

得られたプラスミド、ｐＭＳ２−アンカーレス（ａｎｃ
ｈｏｒｌｅｓｓ）を、ＥｃｏＲＩ　　（ＨＡ２コーディ
ング領域内）および５ａｌｌで消化し、３３Ｉ塩基対フ
ラグメントを遊離させ、それを単離し、ＥｃｏＲＩ８よ
び５ａｉｌで消化されＩ；プラスミドｐｌ）に結んだ。

得られ！ニブラスミドのｐｃ１３（Ｈ６５〜２００）は
、ＮＳＩの最初の８１個のアミノ酸、合成ＤＮＡリンカ
−に由来する３１’ｉ！のアミノ酸（ｇｌｎ−ｉ　Ｉｅ
−ｐｒｏ）（前記実施例４において記載）、ＨＡ２サブ
ユニットのアミノ酸６５〜１９６、つづいてＨＡ２サブ
ユニットのアミノ酸１９７〜２００に対応するアミノ酸
を修復する直前に記載の合成リンカ−に由来する１ｅｕ
−ｖａ　ｌ−１ｅｕ−１ｅｕからなるハイブリッドタン
パク質「ΔＭ＋Ｊをコード化する。

実施例１４ Ｄタンパク質の精製 イー・コリ宿主株によりＤタンパク質の合成を誘発した
後、菌体細胞を遠心分離により収集し、得られたペレッ
トを一７０°Ｃに冷凍しｔ；。細胞ペースト１ｇに対し
て溶菌緩衝液Ａｌ０−を加え、室温にて解氷することに
より、ペレットを解氷し、溶菌緩衝液Ａ（ｐＨ８にて、
５Ｑ＋ａＭトリス、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｏ，１ｍＭジチ
オスレイトール−（ＤＴＴ）、５％グリセロール）に再
懸濁させた。得られた懸濁液に濃縮リゾチーム溶液を加
え、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍ１２のりゾチームの最
終濃度を得た。該懸濁液を室温にて約１時間〜１．５時
間撹拌し、ついで２パスのマントン・ガラリン・ホモジ
ナイザー（Ｍａｎｔｏｎ　Ｇａｕｌｉｎ　ｈｏｍｏｇｅ
ｎｉｚｅｒ）　　（マサチューセッツ州、エバレット、
ＡＰｖガウリン・インコーホレイティラド（Ａ　Ｐ　Ｖ
　Ｇａｕｌｉｎ、　　Ｉ　ｎｃ、。

Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）　　（
Ｌ　ＯＯＯＯｐ　ｓ　ｉ　）上にて細胞溶解させた。こ
の懸濁液にトリトンＸ−１００を最終濃度が１％になる
まで添加し、デオキシコール酸塩を０．１％の最終濃度
まで添加した。該懸濁液を室温にて１時間撹拌し、２５
０００×ｇにて約１時間遠心分離に付した。上澄液を捨
て、タンパク質を含有するペレットを、トーラツクス０
ホモジナイザー（Ｔｕｒｒａｘ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ
ｒ）を用いてすべての塊りがなくなるまで、グリンン緩
衝液（５０ｍＭ　ｇｌｙ−ＮａＯＨ＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ
＋５％グリセロール）（ｐＨ１ｏ、５）に、最初の細胞
ベース）Ｉｇに付きｌ〇−緩衝液にて懸濁させた。この
懸濁液にトリトンＸ−１００を最終濃度が１％になるま
で加え、最初の細胞ペースト１ｇについて最終容量１０
−にしＩ；。懸濁液を４℃にて１時間撹拌し、遠心分離
（２５０００Ｘｇ。

１時間）に付し、上澄液を捨てた。Ｄタンパク質含有ペ
レットを、室温にて１〜２時間、ついで４°Ｃにて一夜
、８Ｍ尿素＋５０ｍＭトリス（ｐＨ８−０）に溶かし、
つづいて遠心分離（２５０００Ｘｇ、１時間）に付し、
不溶性の汚染物を除去しＩ；。

Ｄタンパク質は上澄液中に残っていた。該上澄液にＤＴ
Ｔを最終濃度が５０ｍＭになるまで加え、該溶液を室温
にて約１時間撹拌した。ついで該撹拌溶液を、８Ｍ尿素
および５０ｍＭトリス（ｐＨ８）の溶液で平衡にしたＤ
ＥＡＥ・ファースト・７０−・セファロース・カラム上
に負荷した。この工程においては、最大負荷比率４ｍｇ
タンパク質／ｍ１２ゲルと最小２２０カラム長を維持し
た。Ｄタンパク質を、８Ｍ尿素、５０ｍＭｈリス（ｐＨ
８）中の０−０．３ＭのＮａＣＱグラジェント（５倍以
上のカラム容量にわたって）で溶出した。精製しｔ；Ｄ
タンパク質は、Ｏ，１ＭＮａＣＱを中心とするブロード
なピークにおいて溶出した。該タンパクを含有するフラ
クションを、ｐＨ８にて２０ｍＭ）リスおよび２ｍＭＥ
ＤＴＡの溶液に透析した。

Ｄタンパク質の収率は、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーザ
ー比重分析により測定した場合、全細胞タンパク質の約
２３％であった。

Ｃ１３、Ｃ１３シヨート、Ｄショート、Ａ、Ｃ。

およびΔＤ、タンパク質は、Ｄタンパク質の精製につい
てここに記載している方法によって同様に精製すること
ができる。

実施例１５ Ｄタンパク質のさらなる精製 実施例１４における前記のＤＥＡＥ・ファースト・フロ
ー・セファロース・カラムからＤタンパク質含有フラク
ションを溶出しｔ；後、該フラクションを、５００ａｎ
”オメガｌＯ膜およびスクリーン・チャネルを備えたミ
ニセット・接線７０−装置（Ｍｉｎｉｓｅｌｅ　ｔａｎ
ｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）（フ
ァーマシア）を用い、１平方インチ当たり１５〜２０ポ
ンドの膜内外圧で、１０００ｍ１２／分の交差流速にて
操作し、１５倍Ｃ３，８Ｑを２５５ｍｆ２に）濃縮した
。該濃縮物にｌＯ＠過剰量のドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）（米国、ミズリー州、セント・ルイス、シグマ
・ケミカル−・カンパニ（Ｓｉｇｏ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，Ｕ。

Ｓ、Ａ、）、すなわち、１ｍｇのタンパク質に対して１
０ｍｇのＳＤＳ、およびジチオツレイトール（ＤＴＴ）
（シグマ・ケミカル−・カンパニー）を５０ｍＭの最終
濃度まで添加した。該溶液を室温にて９０分間撹拌し、
ついで２５ｍＭトリス−グリシンおよび１％ＳＤＳを含
有する緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡にした２８００−ス
ペロース（Ｓ　ｏｐｅｒｏｓｅ）１２カラム（ファーマ
シア）上に負荷した（１６ａｎ／時間）。タンパク質を
カラム平衡緩衝液でインクラティカルに溶出した。５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・プロット（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ　Ｂ　１ｏｔ）分析により測定した際の十分に純粋
なフラクションをプールした。

前記のプールしたフラクションを前記のミニセット・接
線フロー装置にて濃縮した。該濃縮フラクションに１０
倍過剰量のＳＤＳ　（ｌｏｍｇｓＤｓ／１ｍｇタンパク
質）およびＤＴＴを５０ｍＭの最終濃度まで加えた。得
られた溶液を室温にて９０分間撹拌した。ついで、該溶
液を、２８００−スペロース１２カラム上に負荷しく１
６ａｎ／時間）、すぐ前における記載と同一の条件下に
てクロマトグラフィーに付しｔ；。溶出したフラクショ
ンを、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・プロット分
析により、純度について分析した。十分に純粋なフラク
ションをプールしに。

該プールしたフラクションからＳＤＳを除去するため、
第１に、該７ラクンヨンを、オメガ１０撹拌細胞装置　
（Ｏｍｅｇａ　ｌ　Ｏ５ｔｉｒｒｅｄ　ｃｅｌ！ａｐｐ
ａｒａＬｕｓ）　　（ファーマシア）にて濃縮した。つ
いで、濃縮しｔ；試料を５ＱｍＭ）リスおよび８Ｍ尿素
を含有するａｔｉ液（ｐＨ８）で予め平衡にした１４４
３−のＧ２５セフアデツクス・ファイン・クロマトグラ
フィー・カラム（ファーマシアＸ４゜４Ｘ９５Ｃ＋１に
負荷した（２５■／時間）。該カラムを、平衡緩衝液で
同一の流速にてインクラティカルに溶出した。フラクシ
ョンを収集し、タンパク質およびＳＤＳレベルについて
検定し、ついでＳＤＳ汚染のないタンパク質の回収を最
大にするようにプールした。

ＳＤＳ除去後、精製したタンパク質（約り０％純度およ
び実質的に内毒素不合）を、２０ｍＭトリスおよびＩｍ
ＭＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ８）に対して透析し
た。透析後、試料を滅菌濾過し、４℃にて貯蔵した。タ
ンパク質を冷凍乾燥するため、該試料を２（］ｎＭ炭酸
水素ナトリウムに対して透析し、ドライアイス−エタノ
ール浴にて凍結させ、ついで冷凍乾燥した。ついで、冷
凍乾燥したタンパク質を、２０ｍＭ）リスおよびＩｍＭ
ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ８）で再構成した。

実施例１６ Ｔ細胞検定 ｉｎ　ｖｉＬｒｏ検定において、細胞毒性Ｔ細胞応答を
誘発するＣ１３タンパク質の能力を、Ａ／ＰＲ／８／３
４起源の他のタンパク質のそれと比較した。他のタンパ
ク質は本明細書において以下のように称する： Ｃ７（完全ＨＡ） デルタ７　　　（ＨＡＩおよびＨＡ２の８’ＯＮ末端残
基） Ｃ３６（ＨＡ２） デルタ１３　　（ＮＳＩの８ＯＮ末端残基およびＨＡ２
の８ＯＮ末端残基） ＮＳＩ　　　　（ＮＳＩ） ＮＳ２　　　　（ＮＳ２） Ｍ２Ｏ（ＮＳＩおよびＭＸ実施例１参照）これらの各コ
ーディング配列を有する分子は、ヤングらが、ジ・オリ
ジン・オブ・パンデミツク・インフルエンザ・バイラシ
ーズ（Ｔｈｇ　Ｑｒｉｇｉｎ　ｏｆＰａｎｄｅｍｉｃ　
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）、１９８３、ダ
ブル・ジー・レイパー編、エルスヴイール・サイエンス
・パブリッシング・カンパニーにおいて記載しているよ
うに誘導され、実質的に前記のようにｐＡＳ　ｌΔＥＨ
において発現した。ＮＳＩを除いて、タンパク質は実質
的に実施例３において記載されているように産生した。

菌体ペレットの再懸濁、リゾチーム処理、超音波処理お
よび遠心分離をした後、ＮＳＩタンパク質はベレット中
よりもむしろ上澄液中に含まれる。ＮＳＩの回収は以下
に記載するようにして完了した。

上澄液を１００ｍＭ　ＭｇＣ（１，で処理し、４°Ｃに
て１時間撹拌した。ついで、溶液を遠心分離（１５００
０ｒｐｍ、３０分間）に付し、ＮＳＩをペレット化しｌ
；。該ベレットを緩衝液Ａ（実施例３において記載）中
に再懸濁させ、再度１００ｍＭＭｇＣＲ，で処理し、Ｎ
ＳＩタンパク質を再沈澱させた。再遠心分離後、ベレッ
トを緩衝液Ａ中に再懸濁させ、１１２のｌｏｎ＋Ｍｌ・
リス−ＭＣＩ２、ｐＨ７゜５．１ｍＭ　ＥＤＴＡに対し
て３回透析した。ついで、該溶液を再度遠心分離に付し
、いずれの粒状物質をも除去し、ＮＳＩタンパク質含有
上澄液を収集し、検定に用いた。

細胞毒性Ｔ細胞検定は、実質的に以下のように実施した
。細織細胞を、ウィルス免疫または非免疫マウスから単
離し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて培養した。

細胞を細かく分けて、ｉｎ　ｖｉｃｒｏにて９０分間、
種々の抗原に暴露した。ついで、細胞を繰り返し洗浄す
ることによって抗原を除去し、ついで、細胞を５日間培
養し、刺激された個体数を増大させた。刺激させた細胞
、すなわち、エフェクター細胞を、予め＆　ｌ　（、、
で負荷したウィルス感染または非感染Ｐ８１５（マウス
の肥満細胞種）標的細胞と混合した。５ＩＣｒの培地へ
の有意な放出は、２次細胞毒性Ｔ細胞（２’　ＣＴＬ）
が存在していることを示しており、それらは抗原でのｉ
ｎ　ｖｉｔｒ。

刺激により生じる。殺細胞の特異性を２つの方法にて調
べた＝１）種々のウィルスで感染した標的細胞を、殺細
胞について試験した：および２）種々のウィルスで免疫
されたマウスから、細織細胞を単離した。また、該検定
の直線性を、以下の表に示すように、種々の標的：エフ
ェクター細胞比を用い、および種々の抗原量を用いて調
べた。例示的な結果が数表に示されている。以下に挙げ
た結果は、エフェクター二標的細胞比が３０：１（ｒ３
０」）および１０：１（ｒｌＯＪ）であったことを示す
。

表中の値は、細胞の洗浄剤可溶化で測定した細胞におけ
るＳ　Ｉ　Ｃ、の全量と比較した場合の培地中に放出さ
れたＳ　Ｉ　Ｃ、の比率として表される。有意な陽性の
結果が枠で囲まれている。該検定に用いたウィルスは： Ａ／ＰＲ／８／３４（ＨＩＮＩ）　　　　（ｒＰＲ８Ｊ
）Ａ／ポート・カルマース／Ｉ／７４（Ｈ３Ｎ２）（ｒ
Ａ／ＰＣＪ） Ａ／ブラジル／Ｉ／７８（Ｈ２Ｎ　１）（ｒＡ／ＢＺＪ
）Ａ／ンンガポール／Ｉ１５７（Ｈ２Ｎ　２）（ｒＡ／
ＳｉｎｇＪ） 前記の表に示されているように、致死量以下のＰＲ８ウ
ィルスで予め感染させたマウスからの免疫肺臓細胞を用
いた場合、Ｃ１０は２次細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する
。ＮＳ　Ｌ　Δ７、Δ１３、Ｍ２Ｏ、ＮＳ２およびＣ３
６を含め、試験したすべての他のペプチド誘導体は、あ
る種の血球凝集素構成物が有するような応答を誘発しな
い。Ｃ１３ペプチドに対する応答は投与量に依存し、６
μｇ／−〜２４μｇ／−のレベルが２次細胞毒性Ｔ細抱
応答を誘発した。

観察された応答のウィルス特異性は、Ｃ１３がＨＩＮＩ
ウィルスで予め感染させたマウスからの免疫ＷＩＩ臓細
胞を刺激するが、８３Ｎ２ウイルス（Ａ／Ｐ　Ｃ）で予
め感染させたマウスにおける・免疫牌濃細胞を刺激しな
いということを示している。こ１は、少なくとも部分的
に、交差反応性内部抗原こよって、生きているウィルス
で同一の肺臓細胞を刺激した場合に観察される亜型交差
反応性細胞男性Ｔりンパ球応答と異なる。加えて、Ｃ１
３による刺激はＨＩＮＩ亜型におけるウィルス株の間で
交差反応性であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにてＣ１３により
刺激されたＰＲ８免疫牌臓細胞は、ＰＨ１（１９３４か
らのＨＩＮ１株）で感染させた標的細胞ならびに１２μ
ｇ〜４８μｇの投与量範囲にわたり、高度の細胞毒性活
性にてＡ／ブラジル（１９７８からのＨＩＮＩ株）で感
染させた標的細胞を認識し、死滅させることができる。

細胞毒性Ｔリンパ球がマウス系のインフルエンザウィル
ス感染からの回復に寄与することは明らかであり、かか
るリンパ球応答を免疫マウスおよびヒトの両方において
認めることができる［エニスら（Ｅｎｎｉｓ　ｅｔ　ａ
ｔ、）　、マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）　−１９８４，４２７〜４３０頁、アメリカン
・ソサイエティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅ
ｒ、Ｓｏｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）参照］という
ことを示している実質的なデーターに基づき、かかる株
交差細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発するＣ１３タンパク質の
能力は、それ自体の有用性およびインフルエンザウィル
ス感染に抵抗する免疫応答を誘発するＨＡ２免疫原決定
因子の有用性を示しており、該応答は亜型特異的であり
、株特異的でないという点で半万能である。

実施例１７ Ｃ１３Ｔ細胞検定および防御研究 この実施例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣ１３タンパク質
で免疫化し、該免疫化がＣＴＬの誘発を介してインフル
エンザ感染に対する防御を誘発することを示す３研究に
ついて記載する。

第１の研究：Ｃ１３免疫牌臓細胞のウィルス特色塩 第１の研究においては、４週齢の雄のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スにＣ１３タンパク質３００μｇを腹腔内投与し、３．
４および５週間後に投与を繰り返した。（先行実験は、
フロイント完全アジュバントが、Ｃ１３タンパク質誘発
ＣＴＬ活性のレベルを有意に増加させなかったことを示
した）。４番目の免疫化の１週間後、マウスの肺臓細胞
を摘出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてウィルスでの刺激
用に培養した。非免疫化マウス（対照）を、ｉｎ　ｖｉ
ｔｒ。

における２次刺激用の肺臓細胞摘出の４週間前に、１０
０ブラツク形成単位（ＰＦＵ）のＡ／ＰＲ／８ウィルス
で鼻腔内的に感染させた。ＣＴＬ検定は実質的に前記実
施例４に記載されているように行なった。簡単には、免
疫化マウスまたは対照マウスからの３ＸｌＯ’個の肺臓
細胞を、細胞当たりｌ０ＰＦＵの感染多重度にてＡ／Ｐ
Ｒ／８またはＡ／ＰＣウィルスに感染させた３ＸｌＯ６
個の同系の正常な肺臓細胞と共に培養した。５日間培養
した後、これらの細胞をエフェクター細胞として用いた
。標的細胞については、２ＸｌＯ・個のＰ８１５細胞を
、２５０ｐＣｉのｓＩＣ「の存在下、ｌ細胞当たりｌ０
ＰＦＵの感染多重度にてＡ／ＰＲ／８またはＡ／ＰＣウ
ィルスと共にインキュベージ３ンし、ｌＸｌ０’個の”
Ｃｒ−標識標的細胞を４時間、９６−ウェルの丸底マイ
クロプレート中、指示されｔ；割合でエフェクター細胞
と共にインキュベーションした。上澄液を採収し％　”
Ｃｒを測定した。特異的細胞溶解パーセントは以下のよ
うに測定した： 特異的細胞溶解パーセント−（実験放出−最小放出）Ｘ
１００／（最大放出−最小放出）：自然発生放出はＰ８
１５細胞を培地中にてインキュベーションすることによ
り決定し、最大放出はＰ８１５細胞を１０％レネノクス
（Ｒｅｎｅｘ）　３０溶液にュージャージー州、ラガー
・ケミカル・カンパニー（Ｒｕｇｅｒ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ
、、　Ｎ　Ｊ　）　）にてインキュベーションすること
により決定した。ＥＡＴ（エフェクター／標的）比は、
示されているように３：　ｌ　（ｒ３」）〜２００　：
　ｌ　（ｒ２００Ｊ）にて変化し、各ＥＡＴ比について
４回の試料を試験した。

結果を以下の第５表に示す。

第５表は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＡ／ＰＲ／８ウィ
ルス感染の正常な同系の肺臓細胞により刺激されたＣ１
３免疫マウスの肺臓細胞が、Ａ／ＰＲ／８感染の正常な
肺臓細胞により刺激されたＡ／ＰＲ／８免疫エフェクタ
ー細胞より低度であるが、Ａ／ＰＲ／８感染標的細胞を
溶解させることができ、Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）ウィルス
感染の標的細胞まｔ；は非感染標的細胞を溶解させない
ことを示す。Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）ウィルスによる刺激
後、Ｃ１３タンパク質免疫牌臓細胞においては、ＣＴＬ
活性が認められないことが判明した。非免疫マウスの肺
臓細胞もまた。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるウィルスで
の刺激後、いずれの標的細胞についてもＣＴＬ活性を示
さなかった。

第２の研究：Ｃ１３免疫化マウスの肺ウィルス値 第２の研究においては、Ａ／ＰＲ／８　（ＨｌＮｌ）ま
たはＡ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）ウィルスによる攻撃後、Ｃ１
３タンパク質免疫化マウスおよび非免疫マウスの肺ウィ
ルス価（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒ）
を試験した。（第５表における）４番目の免疫化の１週
間後、マウスを、エーテル麻酔下、５ＸＩＯ’ＰＦＵの
投与量にてＡ／ＰＲ／８またはＡ／ＰＣウィルスで鼻腔
内的に攻撃した。４日後、肺ウィルス価の測定のため、
肺を無菌的に採収した。採収した肺を、ＰＢＳ　１．５
−中、手作業により、つづいて遠心分離（２０００ｇ、
４℃にて１５分間）により均質化した。該上澄液をウィ
ルスについて滴定するまで凍結させた。マディン・ダー
ビ４　（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ）のイヌの腎臓（ＭＤ
ＣＫ）細胞を、１０％熱−不活性化胎児ウシ血清を補足
した１００μｇ／−ペニシリン、１００μｇ　／　ｍｉ
２ストレプトマイシンおよび２００μｇ／ｍ１ｌｉＬ−
グルタミンを含有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）
に保持し、２４ウエルの組織培養プレートに接種した（
ＭＥＭ１ｍｇ中、２５ＸＩＯ’個の細胞）。結上澄液を
解凍し、つづけて０．１％ウシアルブミン含有ＰＢＳ中
にて希釈した。ウェルから培地を吸引により取り出した
後、希釈したウィルス溶液１００μａを各ウェルに加え
、３７°Ｃにて１時間、随時撹拌しながらインキュベー
ションした。ついで、各ウェルに、ＭＥＭ、０．１％Ｄ
−グルコース、０．Ｏ１％ＤＥＡＥ−デキストラン、１
％ビタミン（１６−００４−４９；米国、バージニア州
、マウスクレーン、フロー・ラボラドリース（Ｆ　ｌｏ
ｗ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ、ＭｃＣ１ｅａｎ、　Ｖ
　Ａ　。

ＵＳＡ）、１０μｇ／−トリプシンおよび１％寒天を含
有する寒天培地ｌ−を付与した。５％ＣＯ３中、３７°
Ｃにて２日間インキュベーションした後、ＰＢＳの１０
％ニュートラルレッドｌｄを、各ウェルの寒天にかぶせ
た。１０時間インキュベージタンした後、プラークを計
数した。結果を、以下の第６表において、２つの試料の
平均ｌｏｇ　、。ＰＦＵ／−として表わす。

第６表：Ｃ１３免疫化マウスの肺つィルス価免疫　　　
　　　　　　　受容体 ウィルス攻撃　　ウィルス価 Ｃ１３Ａ／ＰＲ／８（ＨＩＮＩ）　　　３．８±０．９
＊非免疫化　　　Ａ／ＰＲ／８　　　　　５．４±０．
２＊Ｃｌ　３　　　　　Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）　　　　
５．４±０．２非免疫化　　　Ａ／ＰＣ５，０±０，３
＊：Ｐ＜ｏ、ｏ０５、スチューデントｔ−テストにより
測定した 第６表は、Ｃ１３免疫化マウスが、非免疫化マウスのウ
ィルス価と比較した場合に、有意に低いＡ／ＰＲ／８ウ
ィルスの肺ウィルス価を有することを示す。Ａ／ＰＣ（
Ｈ３Ｎ２）ウィルス攻撃後、ＣＩ３免疫化マウスと非免
疫マウスの間には、肺ウィルス価において有意な差異は
ない。

Ａ／ＰＲ／８一致死攻撃感染後、Ｃ１３−免疫化マウス
８匹のうち７匹は６０日（観察の最後の日）以上生存し
ているが、非免疫マウスはすべて７日までに死んだ。こ
のＣ１３タンパク質によって誘発される防御は、ｉｎ　
ｖｉｔｒｏにおけるＡ／ＰＲ／８−感染標的細胞のウィ
ルス刺激Ｃ１３免疫牌臓細胞による細胞溶解の特異性、
およびＣ１３タンパク質により免疫化されたマウスの肺
におけるＡ／ＰＲ／８ウィルス複製の特異的制限をもた
らす。

第３の研究においては、また、最近単離されたＨ１亜型
ウィルス株であるＡ／タイワン／ｌ／８６（ＨＩＮＩ）
に対するＣ１３タンパク質−免疫マウスの防御について
試験した。４番目の免疫化（第５表）の３週間後、さら
に２００μｇ用量のＣ１３タンパク質を投与した。１週
間後、マウスを、エーテル麻酔下、ｌＸｌ０’ＰＦＵの
用量にて、Ａ／タイワン／ｌ／８６　（Ａ／ＴＷ／１／
８６）ウィルス株（米国食品医薬品局、生物学課（ｔｈ
ｅ　Ｏ［ｉｃｅ　ｏｆ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃｓ）から入
手）で鼻腔内的に攻撃した。攻撃前、中和抗体の滴定用
にＣＩ３タンパク質免疫化マウスから血清を入手した。

第６表に記載されているように、感染の４日後、ウィル
ス滴定用にマウスの肺を摘出した。ＭＤＣＫ細胞におけ
るプラーク検定により、Ａ／ＰＲ／８ウィルスに対する
中和抗体数を測定した。

一連の希釈したプール血清を、予め３７°Ｃにて１時間
、２０ＰＦＵのウィルスでインキュベーションし、第６
表のようにウィルスについて滴定した。

５０％プラーク−中和抗体価を算定した。６週間前、鼻
腔内にて１００ＰＦＵのＡ／ＰＲ／８ウィルスに感染さ
せたマウスのプール血清は、陽性対照に含まれる。結果
を以下の第７表において報告する。

第７表：０１３免疫化マウスの肺ウィルス価Ｃｌ　３　
　　Ａ／ＴＶ／ｌ／８６　　　２．５±０．９＊　　　
＜４（ＨＩＮＩ） 非免疫化Ａ／ＴＷ／ｌ／８６　　４．１±０．３＊　　
　＜４＾／ＰＲ７８Ｎ、Ｄ、　　　　　　　　Ｎ、Ｄ、
　　　　　　２５６＊　：　Ｐ＜０．００５、 スチューデントｔ−テストにより 測定 第７表において示されている結果は、Ｃ１３タンパク質
免疫化マウスが、攻撃後、非免疫マウスが有するよりも
有意に小さなＡ／タイワン／１／８６の肺ウィルス価を
有するが、Ｃ１３タンパク質免疫化マウスも非免疫マウ
スのどちらもＡ／ＰＲ／８ウィルスに対して血清中和抗
体を有していないことを示している。これは、ＨＡ２サ
ブユツトが中和抗体を誘発する部位を有していないため
と思われる。反対に、陽性対照としてのＡ／ＰＲ／８ウ
ィルス注入マウスは、高レベルの中和抗体価を示した。

これらの結果は、Ｃ１３タンパク質での免疫化が、中和
抗体の誘発によるのではなく、ＣＴＬ応答の誘発を介し
て、Ｌ９３４および１９８６からのＨ１亜型のウィルス
株に対する防御を誘発することを示唆している。これら
の結果は、インフルエンザＡ　（Ａ／ＰＲ／８）ウィル
スのＨＡ２サブユニットを含む融合タンパク質での免疫
化が、５０年間にわたって孤立していたインフルエンザ
Ａウィルス株に対となずな防御を誘発し、赤血球凝集抗
体特異性において多くの多様性を有することを示してい
る。

実施例１８ Ｄタンパク質刺激ＣＴＬのインフルエンザウィルスの特
異性 クローンレベルでのＤタンパク質刺激ＣＴＬのウィルス
特異性を検定するため、Ｄタンパク質刺激のウィルス免
疫肺臓細胞を、照射同系肺臓細胞の存在下、ＣｏｎＡ刺
激ラットの肺臓細胞からの１０％上澄液中にて８週間培
養した。このＤタンパク質刺激ＣＴＬ系統の限定希釈（
ｌｉｍｉｔｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎ）が、以下、十分に
記載するようにＣＴＬクローンを発現させｔ；。

Ｄタンパク質は、実質的に、前記実施例３におけるＣ１
３タンパク質について記載されている方法で、組換型イ
ー・コリにて産生じた。簡単には、菌体の溶解後、０．
１％デオキシコール酸塩抽出を２回および１％トリトン
Ｘ−１００抽出をｌ同行ない、混入しているイー・コリ
のタンパク質を除去し、Ｄタンパク質を、４℃にて３０
分間、４Ｍ尿素を用いて溶解させた。ついで、該尿素を
４℃での透析により除去した。調製しｔ；タンパク質を
、５０ＩＩＭトリスーＨＣＱ、ｐＨ８，０，ｌ＋ＩＩＭ
ＥＤＴＡ中に貯蔵した。

４〜５週齢の雄のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを、エ
ーテル麻酔下、１００ＰＦＵのウィルスで鼻腔内的に免
疫化した。Ａ／ＰＲ／８で免疫化したマウスの肺臓を、
ｉｎ　ｖｉＬｒｏ刺激の免疫化の３週間後またはそれ以
上後に摘出した。

ラットのインターロイキン−２（ＩＬ２）を、実質的に
、タウンセンドら（Ｔｏｖｎｓｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、）
、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン
（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、１６０：５５２　（１９８
４）における記載に従い調製した。簡単には、２月齢の
ルイス（Ｌｅｖｉｓ）ラットからの肺臓細胞を、赤血球
を溶解させることなく、２Ｘ１０’リンパ球／−に調整
し、３７℃にて２時間、２０℃ｇ／−の濃度でのＣａｎ
　Ａ　（シグマ型ＩＩＩ）　　（ミズリー州、セント・
ルイス、シグマ・ケミカル・カンパニー）と共にインキ
ュベーションした。肺臓細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１
０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭ１１６４
０中、３７°Ｃにて４８時間、５ＸＩＯ’細胞／−にて
培養した。上澄液を採収し、０．４５μｍフィルターを
通した後、−８０’Ｃにて凍結した。

２次ＣＴＬは、実質的に、実施例１６８よび１７におけ
る記載に従って調製した。ウィルス免疫−肺臓細胞をＤ
タンパク質で刺激するため、肺臓細胞を、５０℃ｇ／−
の濃度でのＤタンパク質と共に１時間培養し、ついで培
地で２回洗浄した。

培養５日後、それらをＣＴＬ検定のエフェクター細胞と
して用いた。

ＣＴＬクローンは以下のように定着させた。バルク培養
における生存２次ＣＴＬを、フィコ−ルーバキュー　（
Ｆ　１ｃｏｌｌ　−Ｐａｑｕｅ）　（ファーマシア、ニ
ューシャーシー州、ビス力タウエイ）にて分離した。非
免疫Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスからの同系のγ照射
（２００Ｑｒａｄ）肺臓細胞を、３７℃にて１時間、Ｄ
タンパク質（１００μｇ／−）で刺激した。生存してい
る再生細胞（２０ＸｌＯ’細胞／−）を、１０％（ｖ　
／　ｖ　）粗ラットＩＬ２および５Ｘ１０−’Ｍの２−
メルカプトエタノール（２ＭＥ）の存在下の培地ｌ〇−
中、Ｄタンパク質刺激γ照射肺臓細胞（３００Ｘ１０’
細胞／−）と共に培養した。この操作を週単位で実施し
、ＣＴＬ株を刺激した。このＣＴＬ株の培養の８週間後
、実質的に、ブラシタルら（Ｂｒａｃｉａｌｅ　ａｔ　
ａｌ、）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ
ディスン、１５３：９１０　（１９８１）による記載に
従って、限定希釈を行ない、ＣＴＬクローンを発生させ
た。簡単には、この操作にて用いた培地は、１０％ＦＢ
Ｓ、抗生物質（１００Ｕ／−ペニシリンおよび１００μ
ｇ／−ストレプトマイシン）、５ＸＩＯ−６Ｍの２−メ
ルカプトエタノール（２ＭＥ）およびｌＯ％ＣｏｎＡ誘
発ラットＩＬ２う補足したＲＰＭ１１６４０である。生
存キラー細胞（０゜５．１．２．４．８および１６細胞
／ウエル）を、９６−ウェルの平面底のマイクロタイタ
・プレート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、コス
タ−（Ｃｏｓｔａｒ）　）のウェルにおいて、培地０．
２−のｌＸｌ０’個の同系のＤタンパク質刺激照射ＢＡ
Ｌ　Ｂ　／　ｃ肺臓細胞と共に培養した。ステイミュレ
ータ−細胞を７日毎に加えた。クローンは増殖するにつ
れて、２４ウ工ル組織培養プレート（コスタ−）、６ウ
エル培養プレート（カリフォルニア州、オックスナード
、ファルコン（Ｆ　ａｌｃｏｎ）　）または２５ａａ’
組緘培養フラスコにューヨーク州、コーニング、コーニ
ング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　）のようなより大きな容器に
て発展する。

ｓｌＣ「−放出検定においては、Ｐ８１５細胞を標的細
胞として用い、実質的に、前記の実施例１６および１７
に記載されているように実施した。

Ｈ−６およびＢ−７と称する２つのクローンは、前記の
Ｄタンパク質−刺激ウイルスー免疫肺臓細胞の培養から
定着させた；クローンＨ−６は２つのキラー細胞が接種
されたウェルにて増殖し、Ｂ−７は４細胞が接種された
ウェルにて増殖した。これらクローンの細胞表面表現形
は、Ｔｈｙｌ、２’″およびＬｙｔ２＋である。これら
のＣＴＬクローンはＡ／ＰＲ／８感染Ｐ８１５（Ｈ−２
つ細胞を溶解するが、Ａ／ＰＲ／８感染ＭＣ５７Ｇ細胞
（Ｈ−２つまたはＡ／ＰＲ／８感染ＢＷ５１７４細胞（
Ｈ−２１）を溶解しないため、それらはＨ−２４ハブロ
タイブにより限定される。

以下の第８表に示すように、これらのＣＴＬクローンは
、ＨＩＮ　ｌ　（Ａ／ＰＲ／８およびＡ／Ｂ２）亜型お
よびＨ２Ｎ２　（Ａ／ＪＡＦ）亜型ノウイルス株により
感染された標的細胞に対して交差反応性細胞毒性活性を
示すが、Ｈ３Ｎ２　（Ａ／ＰＣ）亜型ウィルスまたはイ
ンフルエンザＢ　（Ｂ／ＨＫ）ウィルスにより感染され
た標的細胞を溶解しない。すなわち、これらのクローン
は、ＨｌまたはＨ２亜型ウィルスにより感染された標的
細胞の交差反応性細胞溶解を示す。これは、優勢死滅が
Ｈ１亜型のウィルスで感染された標的細胞にて認められ
、はとんどまたはまったく細胞溶解がＨ２亜型のウィル
ス株により感染された標的細胞にて観察されない、バル
ク培養において観察された２次ＣＴＬの特異性とは異な
る。本発明のワクチンは、亜型内のすべての株に対して
だけでなく、少なくともある種の亜型を横切って防御を
付与しうろことを示しているため、かかる交差亜型応答
は予期しえなかった。

Ｈ−６ＣＴＬクローンの！ｎ　ＶｉＶＯ１７ｘフタ１旌 ついで、Ｈ−６ＣＴＬクローンをマウスに養子免疫伝達
した。ＲＰＭＩ　ｆ　６４０　Ｃ０，５ｒｒｔｌ）に懸
濁させた細胞（２ＸＩＯ’）を、ウィルス攻撃の６時間
前、足部静脈を介して、静脈内的にマウスに移入した。

３日後、感染させたマウスの肺を取り出し、均質化し、
実質的に前記の実施例１７に記載されているようにプラ
ーク形成法によりウィルス価を測定した。

以下、第９表は、このＣＴＬクローンの養子免疫伝達が
、Ｈ３（Ａ／ＰＣ）亜型またはＢ型インフルエンザウィ
ルスで感染されたマウスの肺におけるウィルス価を有意
に減少させないが、Ｈｌ（Ａ／ＰＲ／８）およびＨ２（
Ａ／ＪＡＦ）亜型のウィルス株により感染されたマウス
のウィルス価ヲ有意に減少させることを示す。これらの
結果は、Ｄタンパク質により刺激され、かつＨｌおよび
Ｈ２ウィルスのＨ２サブユニットについて特異的である
Ｃ丁Ｌクローンが、Ｉｎ　ＶＩＶＯにおいて防御を付与
することを示す。これにより、Ｈｌまｔ；はＨ２ウィル
スにより感染された標的細胞に対する該クローンのｉｎ
　ｖｉｔｒｏにおけるＣＴＬ活性の予測価が確認された
。

寒冷標的抑制研究 Ｄタンパク質の抗原特異性がＣ１３のそれに等しいこと
を確かめる！こめに、寒冷標的抑制実験を、Ｄタンパク
質刺激Ｂ−７ＣＴＬクローンを用いて実施した。Ａ／Ｐ
Ｒ／８感染標的細胞の細胞溶解は、Ｃ１３およびＤタン
パク質をコートした寒冷標的細胞の両方ｌこより、なら
びＩこＡ／ＰＲ／８ウィルス感染寒冷標的細胞により抑
制された。ｃ１３タンパク質をコートした６１Ｃｒ−標
識標的細胞の細胞溶解の抑制は、寒冷Ａ／ＰＲ／８ウィ
ルス感染ＣＩ３またはＤタンパク質をコートした標的細
胞についても観察された。両方のケースに３いて、Ａ／
ＰＣ−感染寒冷標的および非感染寒冷−標的細胞のいず
れも、Ｓ　Ｉ　Ｇ　、標識標的細胞と拮抗しなかった。

これらの結果は、Ｄタンパク質がＣ１３タンパク質と同
じ抗原特異性を有することを示している。

第９表 ＣＴＬクローンＨ−６によるｉｎ　ｖｉｖｏにおける肺
ウィルス減少のウィルス特異性移入された ＣＴＬり口　　　　　　　受容体 一７Ｈ−６”　ウィルス攻撃　肺のウィルス価ゝ＋　　
　　Ａ／ＰＲ／８　　５．０±１．０（ＨＩＮＩ） Ａ／ＰＲ／８　　６．９ｆＯ，ｌ’ ＋　　　　Ａ／ＪＡＰ　　　　２．６±０．３（Ｈ２Ｎ
　２） Ａ／ＪＡＰ　　　　３．７±０．４１ ＋　　　　Ａ／ＰＣ４，２±０．３ （Ｈ３Ｎ２） Ａ／ＰＣ４，１±０．１ ＋　　　　Ｂ／ＨＫ　　　　　４．２ｔ０．４Ｂ／ＨＫ
　　　　　４．７±０．５ ３・２×ＩＯ″細胞をウィルス攻撃の６時間前に移入し
た。

ｂ＝ウィルス攻撃の３日後、肺を摘出し、ウィルス価を
ＭＤＣＫ細胞におけるプラーク検定により試験した。

ｃ：Ｐ＜０．０５はスチューデントｔ−テストにより測
定した。

ｄ：Ｐ＜０．０２はスチューデントｔ−テストにより測
定した。

実施例１９　付ｈａペグチド Ｄタンパク質に付加的な組換型ペプチドを組換型イー・
コリにおいて産生し、実質的に前記のようにＣＴＬ検定
において試験した。これらのペプチドを以下の第１Ｏ表
に列挙する。第１０表はまた、抗原における最初と最後
のＨＡ２アミノ酸の番号を記載しており、Ｔ細胞検定に
おいて抗原は陽性（＋）であるか、または陰性（−）で
あるかのいずれかである。Ｃ１３およびＤタンパク質を
参考のために記載する。アミノ酸は１文字の記号で示さ
れている。

バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ）　
２版、エイ・エル・レニンガ−（Ａ、Ｌ、Ｌｅｈｎｉｇ
ｅｒ）　　（１９７７）。

第１Ｏ表　Ｃ１３、Ｄタンパク質および誘導体タンパ　
　　　　　　　　　　　　　　ＣＴＬり質　　　　　　
　　　　　　　　　　　　活性ｃ　ｌ　３　　　Ｎ５Ｉ
（１〜８１）−Ｄ−Ｌ−５−Ｒ−ＨＡ２（１〜２２２）
　　＋Ｄ　　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−０−１−Ｐ−
ＨＡ２（１〜２２２）　　　＋ＣＩ　３　　　Ｎ５Ｉ（
１〜４２）−Ｍ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−１？−１（Ａｔ　　　　
＋ショート　　　　　　　　　　　（６５〜２２２）Ｄ
シｇ−トＮ５Ｉ（１〜４２）−Ｍ−Ｄ−Ｈ−Ｍ−Ｌ−Ｔ
−５−Ｔ−＋Ｒ−５−）ＨＡ２（６６〜２２２） Ａ　　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ２
（６９〜２２２）　　＋ＣＮ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１
−Ｐ−ＨＡ、２（８１〜２２２）　　＋ΔＤ　　　　Ｎ
５Ｊ（１−８１）−Ｑ−１−Ｐ−Ｖ−ＨＡ２（１５（１
−２２２）＋Δｌ　３　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｄ（
−Ｓ−Ｒ−ＨＡ２（１〜７０）−３−Ｃ−Ｌ−Ｔ−Ａ−
Ｙ−Ｈ−Ｒ Ｍ　　　　　Ｎ５Ｉ（１〜８１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ２
（６５〜１９６）−Ｇ−Ｇ−５−Ｙ−Ｓ−Ｍ−Ｅ−Ｈ−
Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−に−Ｐ−ＶΔＭ　　　　Ｎ５Ｉ（１〜
８１）−Ｑ−１−Ｐ−ＨＡ２（６５〜１９６）−Ｇ−Ｇ
−５−Ｙ−Ｓ−Ｍ−Ｌ−Ｖ−Ｎ 実施例２０　抗ウィルスＣＴＬのｉｎ　ｖｉｖｏ￥Ｓ以
下の実施例においては、Ｄタンパク質、６Ｍタンパク質
およびΔＭ十タンパク質（各々、前記の実施例４．１２
および１３において記載）を、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける
抗ウィルス細胞毒性下−リンパ球を誘発するその能力に
ついて試験した。

マウス（（Ｂａｌｂ／ｃ　Ｘ　Ｃ５７Ｂ　Ｌ／　６）　
Ｆ　＋）を、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中
、Ｄタンパク質、６Ｍタンパク質およびΔＭ＋タンパク
質で免疫化した。Ｄタンパク質は実施例１５に従って精
製した（純度約９０％）。６Ｍタンパク質およびΔＭ＋
タンパク質は、各々、前記の実施例３に８けるＣ１３タ
ンパク質の精製についての記載に従って精製した（純度
約５０％）。

各抗原の試験については、マウスを３群（１群当たり３
匹のマウス）に分け、第１群には合計１０μｇのタンパ
ク質を投与し、第２群には合計５０μｇのタンパク質を
投与し、対照群にはＣＦＡのみを投与した。各マウスは
２回注射、１回は足部の基部（０，１ｍ）にて、１回は
後足肉祉（０゜１ｍ１２）に投与した。注射の１週間後
、注入部位の回りのリンパ節を各マウスから摘出した。

群におけるすべてのマウスからの節をプールした。リン
パ節をステンレススチールメツシュＩこ通すことにより
、単一細胞の懸濁液を調製した。得られた細胞を２回洗
浄し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４Ｑ＋ｌＯ％胎児ウシ血
清、２ｍＭグルタミン、ＩＯｎＭＨｅｐｅｓ緩衝液５Ｘ
ｌＯ−’Ｍ２−メルカプトエタノール、ペニシリンおよ
びストレプトマイシン）中に再懸濁させた。

免疫リンパＨ細胞（６ＸｌＯ’細胞）を、６％ＣＯ，中
、３７℃にて５日間、１０６個のＡ／ＰＲ／８感染の正
常肺臓細胞（以下に記載）で刺激した。ウェル当たり合
計容量２−の２４−ウェル・プレートにて培養を始めた
。ついで、培養細胞（「ｃＴＬエフェクター細胞」）を
採収し、２回洗浄し、後記のＣＴＬ　（クロミウム放出
）検定用に、適当な濃度の完全培地に再懸濁させた。

ウィルス感染のステイミュレータ−細胞を調製するため
、肺臓を（Ｂａｌｂ／ｃ　Ｘ　Ｃ５７Ｂ　Ｌ／　６）Ｆ
、マウスから摘出し、ステンレススチールメツシュを介
して梳き、単一細胞の懸濁液を調製した。

赤血球を低張性シＨツク（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　５ｈｏ
ｃｋ）により溶解させた。細胞を２回洗浄し、６Ｘ１０
’細胞／ｍ１２での完全培地に再懸濁させた。細胞を、
５％ＣＯ，下、３７℃にて１時間、１５分間の間隔でゆ
っくりと振盪しながらＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスで感
染させた（細胞当たり約２０プラ７り形成単位（ＰＦＵ
））。（Ａ／ＰＲ／８／３４（ＨＩＮＩ）およびＢ　／
　Ｌ　ｅ　ｅ　／　４０インフルエンザウイルスを、９
日齢の胚含有の鶏卵にて４８時間増殖させた。感染卵か
らの尿膜絞液を採収し。

プールし、−７０’Ｏにて一部貯蔵した。）ついで、細
胞を２回洗浄し、完全培地中、！×１０６細胞／−細胞
核−た。感染した細胞懸濁液１−を、６Ｘ１０’免疫リ
ンパ節細胞を含有するウェルに添加した。

ＣＴＬ検定は以下のように実施した。タロミウム放出検
定における標的細胞として、ｌｏｇ増殖段階のＰ８１５
細胞（１０％胎児ウシ血清および２ｍＭグルタミンを補
足したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）の懸濁培養に維
持した、ＤＢＡマウスに由来する肥満細胞腫系統）を用
いた。Ｐ８１５を、血清不在下、６％ＣＯ７，３７℃に
て３０分間、Ｎａ、ＣｒＯ，（Ｃｒ”）（１０’細胞当
たり３００μＣｉ）で標識化した。ついで、ウィルス（
細胞当たり約１０ＰＦＵ）を加え、インキュベーション
をさらに１時間続けた。ついで、細胞を２回洗浄し、完
全培地（ｌ〜２ＸＩＯ’細胞／−）に再懸濁させ、３７
°Ｃにて３６５時間再インキュベーションした。該細胞
を２回洗浄した後、それらをｌＸｌ０’細胞／ｍ１２に
調整し、そのＯ，Ｉｎｔｆ２を、標的細胞に対するエフ
ェクターの最終比が５０：Ｌ２５：１．１２．５：ｌお
よび６．２５：ｌであるようにＱ、１ｍＱＣＴＬエフェ
クター細胞を含有する丸底マイクロウェル（９６ウエル
プレート）に加えた（すべて３つのウェルにて開始した
）。該プレートを６００　ｒｐｒＱにて５分間遠心分離
に付し、ついで５％Ｃｏｚ、３７℃にて４時間インキュ
ベーションした。放出された”Ｃｒの量は、上澄形の各
培養０．１−をサンプリングし、γカウンター（ベック
マン計器ガンマ８０００）にて計数することにより測定
した。

細胞毒性％は、式： ％式％ ［式中、Ｅはエフェクター細胞の存在下、１分間当たり
に放出された数、Ｃは０．１艷の完全培地でインキュベ
ーションされた標的細胞により１分間当たりに放出され
た数（自然発生放出）、およびＴは１ウエルに付き、１
分間当たりの総数］により計数した。１分間当たりの総
数としては、０．１−標的細胞を、０．１ｍ１２の１％
ドデシル硫酸ナトリウムで３．５時間インキュベーショ
ンし、ウェルの内容物を０１ｌ−サンプリングする前に
混合した。

増殖検定を行なうについては、免疫リンパ節（０，２＋
ｌ１１２）からの細胞を、ｌウェル当たり４Ｘ１０５細
胞にて９６ウエルのマイクロタイタ・プレートの平坦底
のウェルに添加した。該細胞を、６％ＣＯ，，３７°Ｃ
にて７２時間、Ｄタンパク質（９０％純度）１０μｇ／
−で刺激した。（ｌウェル当たり２５μａ添加する前に
、Ｄタンパク質のストック調製物を、適宜、水中５％デ
キストロースで希釈した。）ついで、該ウェルを、最後
の６時間の培養の間、１Ｈチミジン（ｌｕｃｉ）で刺激
し、シンチレーション・カウンティング用の自動細胞採
収器（スカトロン）（Ｓ　ｃａｔｒｏｎ）のフィルター
上で収集した。

結果を以下の第１１表に示す。

該データーは、Ｍ十タンパク質が、試験した両方の用量
（１０μｇと５０μｇ）にて、効果的にＡ型持異的細胞
毒性Ｔ−リンパ球応答を誘発することを示している。６
Ｍタンパク質は高用量（５０μｇ）で陽性ＣＴＬ応答を
誘発したが、ＣＴＬ活性は、Ｂ型感染標的が死滅したの
と同様、Ａ型感染標的に対しても全く向けられなかった
。類似の組換型インフルエンザ・タンパク質（クワノら
（Ｋ＋ｒｖａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、）、１９８８、ジャー
ナル・オプ・イムノロジー（Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ
、）、１４０　：１２６４〜１２６８）に対して、また
はウィルス（ヤップら（Ｙａｐ　ａｔ　ａｌ、）、１９
７８、ネイチャー、２７３　：　２３８〜２３９）に対
して向けられたＣＴＬｓは、マウスのモデルにおいて防
御的免疫性を養子移入することができ、さらにはヒト・
インフルエンザウィルスのウィルス清掃において役割を
果たす（フック・ミカエルら（ＭｃＭｉｃｈａｅｌｅｔ
　ａｔ、）、１９８３、二ニー・イングランド・ジャー
ナル・オブ・メディスン（Ｎ、Ｅｎｇｌ、　Ｊ　、Ｍｅ
ｄ、）と考えられるため、これら２つのタンパク質のい
ずれかはヒトインフルエンザ・ワクチンの候補である。

Ｄタンパク質、ΔＭまたはΔＭ＋のいずれ力）で免疫化
したマウスからの細胞をまた、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

において、Ｄタンパク質ｌＯμｇ／ｆｆ１１２に対する
増殖応答について試験した。すべての群の応答は高度に
陽性であった（スチューデントｔ−テストの両側検定ｖ
ｓ、ＣＦＡ対照群に対する応答によりｐ＜０．００１）
。インフルエンザ誘導タンパク質に応じてのｉｎ　ｖｉ
Ｌｒｏにおける増殖は、Ｂ型細胞によるインフルエンザ
特異的抗体産生を増大させ、または支持することのでき
るＴヘルパー細胞クローンの確立された特性である（シ
ェリルおよびゲルハード（ＳｃｉｅｒｌｅおよびＧ　ｅ
ｒｈａｒｄ）、１９８６、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メディスン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　、
　１６４　：　１１１４−１１２８）。中和抗体の産生
は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ヘルパーＴ細胞により促
進することができるため（シェリルおよびゲルハード、
１９８６、前押、および１９８８、ＰＮＡＳ４４４６〜
４４５０゜チテら（Ｔｉｔｅｅｔ　ａｌ、）、ｌ９８８
、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１４１　：　３９
８０−３９８７）、強力なＴヘルパー細胞活性で細胞を
誘発するタンパク質はまた、ヒトワクチン免疫原の候補
であると考えられる。

本発明およびその好ましい具体例を開示したが、本発明
はこれらに限定されるものではなく、本発明の範囲内の
全ての修飾も包含する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｃ１３タンパク質のコーディング領域のヌク
レオチド配列およびそのアミノ酸配列であり、第２図は
、Ｄタンパク質のコーディング領域のヌクレオチド配列
およびそのアミノ酸配列であり、第３図は、Ｃ１３シヨ
ートタンパク質のコーディング領域のヌクレオチド配列
およびそのアミノ酸配列であり、第４図は、Ｄショート
タンパク質のコーディング領域のヌクレオチド配列およ
びそのアミノ酸配列である。 ５＋ｉ　　ξ　９ｊ３５ｉ：百　二　ＨＨＨ図面の浄書
（内容に変更なし）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換型宿主細胞培養の細胞溶解産物からインフル
   エンザウイルスＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニットの
   免疫原決定因子を有し、細胞溶解産物において不溶性で
   ある免疫原ポリペプチドを精製する方法であって； 細胞溶解産物を、約６〜約８．５の範囲のｐＨにて、最
   初の洗浄処理に付し、宿主細胞汚染物を選択的に溶解さ
   せ、それにより可溶性フラクションと不溶性フラクショ
   ンを形成させ、該不溶性フラクションはポリペプチドを
   含有しており； 可溶性フラクションを不溶性フラクションから分離し； 不溶性フラクションを、約９．５〜約１１の範囲のｐＨ
   にて、第２の洗浄処理に付し、宿主細胞汚染物を選択的
   に溶解させ、それにより可溶性フラクションと不溶性フ
   ラクションを形成させ、該不溶性フラクションはポリペ
   プチドを含有しており； 可溶性フラクションを不溶性フラクションから分離し； 不溶性フラクションをカオトロピズム剤に付し、それに
   よってポリペプチドを溶解させ；可溶性フラクションを
   不溶性フラクションから分離し、該可溶性フラクション
   はポリペプチドを含有しており； 還元剤を可溶性フラクションに加え；および可溶性フラ
   クションをイオン交換クロマトグラフィーに付し、ポリ
   ペプチド含有溶出液を回収し、該溶出液は実質的に混入
   している宿主細胞核酸およびポリペプチドがないことを
   特徴とする組換型宿主細胞培養の細胞溶解産物からポリ
   ペプチドを精製する方法。
2. （２）第１の洗浄処理の洗浄剤がイオン洗浄剤である請
   求項（１）記載の方法。
3. （３）イオン洗浄剤がデオキシコール酸塩である請求項
   （２）記載の方法。
4. （４）第１の洗浄処理を約８のｐＨにて実施する請求項
   （１）記載の方法。
5. （５）第２の洗浄処理の洗浄剤が非イオン洗浄剤である
   請求項（１）記載の方法。
6. （６）第２の洗浄処理を約１０．５のｐＨにて実施する
   請求項（１）記載の方法。
7. （７）カオトロピズム剤が約７．５〜約９の範囲のｐＨ
   における尿素である請求項（１）記載の方法。
8. （８）クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラ
   フィーである請求項（１）記載の方法。
9. （９）さらに、ポリペプチド含有溶出液をジアフィルト
   レーションに付すことからなる請求項（１）記載の方法
   。
10. （１０）さらに、イオン交換クロマトグラフィーから回
    収した免疫原ポリペプチド含有フラクションを、還元条
    件下、強変性剤で処理し、かように処理したフラクショ
    ンをサイズ排除クロマトグラフィーに付し、得られた実
    質的に宿主細胞内毒素のない免疫原ポリペプチド含有溶
    出液を回収することからなる請求項（１）記載の方法。
11. （１１）さらに、サイズ排除クロマトグラフィーから回
    収した免疫原ポリペプチド含有フラクションを、カオト
    ロピズム剤の存在下、第２のサイズ排除クロマトグラフ
    ィーに適用し、得られた実質的に変性剤のない免疫原ポ
    リペプチド含有フラクションを回収する第２のサイズ排
    除クロマトグラフィー工程からなる請求項（１０）記載
    の方法。
12. （１２）変性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項
    （１０）記載の方法。
13. （１３）カオトロピズム剤が尿素である請求項（１１）
    記載の方法。
14. （１４）第２のサイズ排除クロマトグラフィー工程を脱
    塩クロマトグラフィーにて実施する請求項（１１）記載
    の方法。