JPH03118472A - Insulin assay and reagent therefor - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、不溶性担体を用いたインスリンの定量方法及
び定量試薬に関し、より特定的には、インスリンと抗イ
ンスリン抗体の抗原抗体反応に基づく凝集の程度を検出
する形式の定量方法及びそのための試薬に関する。Detailed Description of the Invention [Field of Industrial Application] The present invention relates to a method and reagent for quantifying insulin using an insoluble carrier, and more specifically, to an agglutination method based on an antigen-antibody reaction between insulin and an anti-insulin antibody. The present invention relates to a quantitative method for detecting the degree of
〔従来の技術）
インスリンは、ヒト血中にはごく微量しか存在しないた
め、その正確な測定は非常に困難である。[Prior Art] Since only a very small amount of insulin exists in human blood, its accurate measurement is extremely difficult.
従来より、微量のインスリンを測定する方法として、ラ
ジオイムノアッセイ法（以下、ＲＴＡ法）及び酵素免疫
測定法（以下、ＥＩＡ法）が公知である（例えば、石川
栄治、河井忠、宮井潔：酵素免疫測定法 第２版：医学
書院、第２１１頁〜第２２６頁（１９８２））。Conventionally, radioimmunoassay method (hereinafter referred to as RTA method) and enzyme immunoassay method (hereinafter referred to as EIA method) have been known as methods for measuring trace amounts of insulin (for example, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai: Enzyme Immunoassay Measurement method 2nd edition: Igaku Shoin, pp. 211-226 (1982)).
ＲＩＡ法では、放射性同位元素でラベリングされた■ｇ
Ｇを試料中のインスリンと反応させて、インスリン濃度
を測定するものであり、感度が優れているため、微量の
インスリンを検出することができ、血中インスリンの測
定に広く用いられている。In the RIA method, ■g labeled with a radioactive isotope
The insulin concentration is measured by reacting G with insulin in a sample, and because it has excellent sensitivity, it can detect trace amounts of insulin and is widely used to measure blood insulin.
他方、ＥＩＡ法は、検出感度に優れた酵素が結合された
ＩｇＧを、試料中のインスリンと反応させ、反応したＩ
ｇＧに結合された酵素の活性を測定することにより、イ
ンスリン濃度を測定するものである。On the other hand, in the EIA method, IgG bound to an enzyme with excellent detection sensitivity is reacted with insulin in a sample, and the reacted I
Insulin concentration is measured by measuring the activity of an enzyme bound to gG.
〔発明が解決しようとする技術的課題〕ＲＩＡ法は、感
度こそ優れているものの、安全を期するために特殊な器
具・装置を必要とし、さらにアイソトープを含む廃物処
理や汚染に注意を払わなければならない等、取扱上の制
約が多い。[Technical problem to be solved by the invention] Although the RIA method has excellent sensitivity, it requires special instruments and equipment to ensure safety, and furthermore, it requires careful treatment of waste containing isotopes and contamination. There are many restrictions on handling, such as:
他方、ＥＩＡ法による測定では、酵素が結合されたＩｇ
Ｇと試料中のインスリンとの免疫反応だけでなく、酵素
活性を測定するために酵素と基質を反応させる必要があ
る。従って、測定に長時間（少な（とも３時間）要し、
その上、手技も煩雑であった。On the other hand, in measurement by EIA method, enzyme-bound Ig
In order to measure not only the immunoreaction between G and insulin in the sample, but also the enzyme activity, it is necessary to react the enzyme with the substrate. Therefore, it takes a long time (less than 3 hours) for measurement.
Moreover, the procedure was complicated.
よって、本発明の目的は、試料中のインスリンを迅速に
かつ簡便に測定することを可能とする新規なインスリン
定量方法及び定量試薬を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a novel insulin quantification method and quantification reagent that enable rapid and simple measurement of insulin in a sample.
〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明のインス
リン定量方法は、不溶性担体に担持された抗インスリン
抗体と、試料中のインスリンとを反応させ、該抗原抗体
反応に基づく凝集の程度を検出することにより、インス
リンを定量することを特徴とするものである。[Means and effects for solving the problem] The method for quantifying insulin of the present invention involves reacting an anti-insulin antibody supported on an insoluble carrier with insulin in a sample, and detecting the degree of agglutination based on the antigen-antibody reaction. This method is characterized in that insulin is quantified by this method.
また、本発明のインスリン定量試薬は、上記インスリン
定量方法に用いられるものであり、抗インスリン抗体が
担持された不溶性担体を含有するものであり、試料中の
インスリンに該不溶性担体に担持された抗インスリン抗
体を反応させ、抗原抗体反応に基づく凝集の程度を検出
することにより、インスリンを定量するのに用いられる
。Furthermore, the insulin quantitative reagent of the present invention is used in the insulin quantitative method described above, and contains an insoluble carrier carrying an anti-insulin antibody, so that the insulin in the sample has an anti-insulin antibody supported on the insoluble carrier. It is used to quantify insulin by reacting with insulin antibody and detecting the degree of agglutination based on the antigen-antibody reaction.
本発明において用いられる不溶性担体としては、本発明
の測定時に用いられる液体媒体に実質的に不溶であり、
かつ粒径が０．０５μｍ〜１．０μｍ程度の種々の有機
物質及び無機物質を用いることができる。The insoluble carrier used in the present invention is substantially insoluble in the liquid medium used in the measurement of the present invention,
Various organic and inorganic substances having a particle size of about 0.05 μm to 1.0 μm can be used.
不溶性担体として用いる有機物質の例としては、ポリス
チレンもしくはスヂレンブタジエン共重合体のような重
合により得られる有機高分子ラテックス、個々に分散さ
れたブドウ球菌もしくは連鎖球菌のような球菌型の細菌
または細胞膜片等が挙げられる。また、無機物質の例と
しては、シリカ、シリカアルミナもしくはアルミナのよ
うな無機酸化物、その他の鉱物粉末または金属等が挙げ
られる。Examples of organic substances used as insoluble carriers include organic polymer latices obtained by polymerization such as polystyrene or styrene-butadiene copolymers, individually dispersed bacteria of the coccus type such as Staphylococcus or Streptococcus or Examples include cell membrane fragments. Further, examples of inorganic substances include silica, inorganic oxides such as silica alumina or alumina, other mineral powders, and metals.
本発明では、上記のような不溶性担体に抗インスリン抗
体が担持（感作）されている、この担持方法については
、不溶性担体に対して抗インスリン抗体を物理的に吸着
させて行ってもよく、化学的に吸着させて行ってもよい
。In the present invention, the anti-insulin antibody is supported (sensitized) on the above-mentioned insoluble carrier. This loading method may be carried out by physically adsorbing the anti-insulin antibody to the insoluble carrier, It may also be carried out by chemical adsorption.
本発明において用いる抗インスリン抗体としては、例え
ば免疫グロブリンを用いることができ、免疫グロブリン
全体が使用できるだけでなく、「改定新版免疫化学」山
村雄−他３名編集：第４５７〜第５４４頁（昭和４８年
）に記載されているように、免疫グロブリンから誘導さ
れるＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ （ａｂ’ ）２等も用い
得る。As the anti-insulin antibody used in the present invention, for example, immunoglobulin can be used, and not only the whole immunoglobulin can be used, but also "Revised New Edition Immunochemistry" edited by Yu Yamamura and 3 others: pages 457 to 544 (Showa Fab, Fab', F(ab')2, etc. derived from immunoglobulins may also be used, as described in 1997).
なお、本発明では、抗インスリン抗体を感作した不溶性
担体粒子（以下、感作担体粒子という）は、該感作担体
粒子の濃度が０．０１重量％以上の懸濁液として、好ま
しくは、０．０５〜１． ０重量％の懸濁液の試薬とし
て調製される。In the present invention, insoluble carrier particles sensitized with an anti-insulin antibody (hereinafter referred to as sensitized carrier particles) are preferably prepared as a suspension having a concentration of 0.01% by weight or more of the sensitized carrier particles. 0.05-1. It is prepared as a 0% by weight suspension reagent.
より具体的に説明すると、例えばポリスチレンラテック
スを不溶性担体として用い、抗インスリン抗体を該ポリ
スチレンラテックスに物理吸着させる場合、ｐＨ５，０
〜１Ｏ００の緩衝液中に、好適にはｐｉ−１ｆ３．
Ｏ〜９．０の緩衝液中に、濃度０．０５重量％〜２．０
重重量、より好適には濃度０．１〜１．０重量％となる
ように、ポリスチレンラテックスを加える。To explain more specifically, for example, when polystyrene latex is used as an insoluble carrier and an anti-insulin antibody is physically adsorbed to the polystyrene latex, the pH is 5.0.
Preferably pi-1f3.
Concentrations of 0.05 wt % to 2.0 in a buffer of O to 9.0
Polystyrene latex is added to give a concentration of 0.1 to 1.0% by weight, more preferably 0.1-1.0% by weight.
さらに、１〜５０°Ｃの温度において、好適には、２０
〜４０°Ｃの温度で撹拌しつつ、抗インスリン抗体を０
．００１重景重景０． １重量％、好ましくは０．０１
〜０．１重量％となるように添加する。しかる後、１０
分間〜４８時間、好ましくは３０分〜２時間の間、撹拌
し続け、抗インスリン抗体をポリスチレンラテックスに
感作する。Further, at a temperature of 1 to 50°C, preferably 20°C
Add anti-insulin antibodies to 0 with stirring at a temperature of ~40 °C.
．． 001 heavy view heavy view 0. 1% by weight, preferably 0.01
Add so that the amount becomes ~0.1% by weight. After that, 10
Continue stirring for a period of minutes to 48 hours, preferably 30 minutes to 2 hours, to sensitize the anti-insulin antibodies to the polystyrene latex.
次に、冷却下で遠心分離を行い、沈澱を傾潟し、分離し
た抗インスリン抗体感作ポリスチレンラテックス粒子を
牛血清アルブミン溶液に懸濁させ、該感作ラテツクス粒
子が１重量％の抗インスリン抗体感作ラテックス試薬す
なわちインスリン定量試薬を調製する。Next, centrifugation is performed under cooling, the precipitate is decanted, and the separated anti-insulin antibody-sensitized polystyrene latex particles are suspended in a bovine serum albumin solution. Prepare a latex reagent, that is, an insulin quantitative reagent.
以上のようにして調製された本発明のインスリン定量試
薬を用い、試料中のインスリンと抗原抗体反応させ、不
溶性担体の凝集の程度を検出することにより、インスリ
ンの定量を行う。Using the insulin quantitative reagent of the present invention prepared as described above, insulin in a sample is reacted with antigen and antibody, and the degree of aggregation of the insoluble carrier is detected, thereby quantifying insulin.
不溶性担体の凝集の程度を検出する方法としては、通常
、光学的検出方法を用いる。この場合、通常、試料を適
当な緩衝液を含む溶液反応用希釈液で希釈した後、上記
インスリン定量試薬を混合する。この際、緩衝液中に増
感剤を用いてもよい。Optical detection methods are usually used to detect the degree of aggregation of insoluble carriers. In this case, the sample is usually diluted with a diluent for solution reaction containing an appropriate buffer, and then the insulin quantitative reagent is mixed. At this time, a sensitizer may be used in the buffer solution.
増感剤としては、例えば、分子量３万以上のポリエチレ
ングリコールを挙げることができる。Examples of the sensitizer include polyethylene glycol having a molecular weight of 30,000 or more.
なお、反応の際のｐＨは５〜１０、特に６〜８が好まし
い。また、緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液等の任意のもの
を用いることができる。反応温度は、０〜５０°Ｃ１特
に２０〜４０°Ｃが好ましい。Note that the pH during the reaction is preferably 5 to 10, particularly preferably 6 to 8. Further, as the buffer, any one such as phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, ammonia buffer, etc. can be used. The reaction temperature is preferably 0 to 50°C, particularly 20 to 40°C.
光学的検出方法としては、散乱光強度または吸光度を測
定する方法を用いる。測定波長としては、３００〜２４
００ｎｍを使用することができる。As the optical detection method, a method of measuring scattered light intensity or absorbance is used. The measurement wavelength is 300 to 24
00 nm can be used.
測光方法については、公知の方法に従って、用いる不溶
性担体粒子の大きさもしくは濃度または反応時間の選択
により、散乱光強度または吸光度を測定する。また、公
知の方法により、吸光度の増加または増加速度を測定す
ることによって定量することも可能である。さらに、光
音響法を利用してａ集程度を検出してもよい。なお、上
記の検出に際し、本発明の定量方法では、反応時間を適
宜選択することができる。Regarding the photometric method, the scattered light intensity or absorbance is measured by selecting the size or concentration of the insoluble carrier particles used or the reaction time according to a known method. It is also possible to quantify by measuring the increase or rate of increase in absorbance using known methods. Furthermore, the degree of a collection may be detected using a photoacoustic method. In addition, in the above-mentioned detection, the reaction time can be appropriately selected in the quantitative method of the present invention.
以下、実施例を示すことにより、本発明をより具体的に
説明する。Hereinafter, the present invention will be explained more specifically by showing examples.
〔実施例１〕
インスリン定量試薬の調覧
モルモット産生抗ブタインスリン抗血清５ｍｌを撹拌し
つつ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７゜４）を飽和硫
安としたものを、３０％飽和になるまで滴下する。室温
で３時間放置した後、４°Ｃで１８．００Ｏｒｐｍ、１
時間の条件で遠心分離し、上澄みを取り除く。[Example 1] Inspection of insulin quantitative reagent While stirring 5 ml of guinea pig-produced anti-swine insulin antiserum, 0.1 M phosphate buffer (pH = 7°4) with saturated ammonium sulfate was added to 30% saturation. Drip until it is. After leaving at room temperature for 3 hours, at 4°C and 18.00 rpm, 1
Centrifuge for 1 hour and remove the supernatant.
沈澱物を集め、５ｍｊ２の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
＝７．４）に溶解する。次に、再度、上記の硫安塩析を
行い、同様にして遠心分離した後の沈澱物に１ｍｌの０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を加える。The precipitate was collected and added to 5mj2 of 0.1M phosphate buffer (pH
=7.4). Next, the above-mentioned ammonium sulfate salting out was carried out again, and 1 ml of the precipitate was centrifuged in the same manner.
．． Add 1M phosphate buffer (pH=7.4).
得られた溶液を、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．１
）で透析して脱塩する。The obtained solution was diluted with O, 1M phosphate buffer (pH=7.1
) to desalinate.
以上のようにして精製された抗インスリン抗体を０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で濃度が２ ｍ ｇ
／ ｍ ｌとなるように濃度調整する。The anti-insulin antibody purified as above was added to 0.1
M phosphate buffer (pH = 7.0) at a concentration of 2 mg
Adjust the concentration so that it is / ml.
次に、直径０． ３μｍのポリスチレンラテックス（積
水化学工業株式会社製）を用意し、５０ｍＭグリシン緩
衝液（ｐＨ＝９．０）で濃度が１重量％となるように希
釈する。得られたラテックス希釈液１ｍｊ２をとり、３
０゛Ｃの温度で撹拌する。Next, the diameter is 0. A 3 μm polystyrene latex (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) is prepared and diluted with a 50 mM glycine buffer (pH=9.0) to a concentration of 1% by weight. Take 1 mj2 of the obtained latex diluted liquid and
Stir at a temperature of 0°C.
撹拌溶液中に、上記した精製抗インスリン抗体溶液を１
００μ２添加し、しかる後３０°Ｃの温度で２時間撹拌
して感作する。Add 1 portion of the above purified anti-insulin antibody solution to the stirring solution.
00μ2 is added and then stirred at a temperature of 30°C for 2 hours to sensitize.
感作後、４°Ｃで１８．ＯＯＯｒｐｍ、１時間の条件で
遠心分離し、沈澱物を集めるｅ ５０ ｍ Ｍグリシン
緩衝液（ｐＨ＝９．０）にウシ血清アルブミン（以下、
ＢＳＡ）を加えて１重量％ＢＳＡ溶液としたちの１ｍｌ
を、上記沈澱物に加え、さらに３０℃の温度で１時間撹
拌する。After sensitization, incubate at 4°C for 18. Centrifuge at OOO rpm for 1 hour and collect the precipitate. Bovine serum albumin (hereinafter referred to as
BSA) to make 1 ml of 1 wt% BSA solution.
is added to the above precipitate and further stirred at a temperature of 30°C for 1 hour.
次に、４℃で１８．ＯＯＯｒｐｍ、１時間の条件で遠心
分離を行い、沈澱物を集めて、５０ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ＝８．０）２ｍｆを加えて沈澱物を懸濁し、イン
スリン定量試薬を調製する。Next, 18. Centrifugation is performed at OOO rpm for 1 hour, the precipitate is collected, and 2 mf of 50 mM glycine buffer (pH=8.0) is added to suspend the precipitate to prepare an insulin quantitative reagent.
反息里希玉放Ω遷星
反応用希釈液として、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ＝
９．０）を用いる。50mM glycine buffer (pH=
9.0) is used.
夾定
５重量％ＢＳＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）を用いて、標準ヒトインスリンを希釈し、濃度０．
１０．２０．４０．８０．１６０及び３２０．ｕＵ／ｒ
ｒ＋／！の各検体を作製する。0.1M phosphate buffer containing 5% by weight BSA (pH=7.
0) to dilute standard human insulin to a concentration of 0.
10.20.40.80.160 and 320. uU/r
r+/! Prepare each specimen.
上記検体２０μｌ、前述したインスリン定量試薬（抗イ
ンスリン抗体感作ラテックス試薬）５０μｔ、及び反応
用希釈液３５０μ２をセルに計り込み、波長５５０ｎｍ
における吸光度の測定を行い、１０分間の反応性を測定
した。結果を、下記の第１表及び第１図に示す、なお、
この結果では、吸光度の値を１０’倍したものを反応性
として示している。Weigh out 20 μl of the above sample, 50 μt of the insulin quantitative reagent (anti-insulin antibody sensitizing latex reagent) mentioned above, and 350 μ2 of the reaction diluent into a cell, and set the wavelength at 550 nm.
The absorbance was measured for 10 minutes, and the reactivity was measured for 10 minutes. The results are shown in Table 1 and Figure 1 below.
In this result, the absorbance value multiplied by 10' is shown as the reactivity.
（以下、余白）
第
表
〔実施例２〕
インスリン 置薬の」
モルモット産生抗ブタインスリン抗血清５ｍｊ２を撹拌
しながら、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を飽
和硫安としたものを、３０％飽和になるまで滴下する。(The following is a blank space) Table 1 [Example 2] Insulin Prescription While stirring 5 mj2 of guinea pig-produced anti-pig insulin antiserum, 0.1 M phosphate buffer (pH = 7.4) was mixed with saturated ammonium sulfate. , dropwise until 30% saturation.
室温で３時間放置した後、４°Ｃで１８，０００ｒｐｍ
、１時間の条件で遠心分離により沈澱物を集め、上澄み
は除去する。After 3 hours at room temperature, 18,000 rpm at 4°C
The precipitate was collected by centrifugation for 1 hour, and the supernatant was removed.
沈澱物を集めた後、５ｍｌのＯ，１Ｍリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ−７，４）に溶解する０次に、再度、上記の硫安塩析
を行い、上記と同様の条件で遠心分離した後の沈澱物に
１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を加え
る。得られた溶液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７
．１）で透析して脱塩する。After collecting the precipitate, add 5 ml of O, 1M phosphate buffer (P
Next, the above-mentioned ammonium sulfate salt precipitation was performed again, and after centrifugation under the same conditions as above, 1 ml of 0.1M phosphate buffer (pH = 7) was added to the precipitate. .4) Add. The obtained solution was diluted with 0.1M phosphate buffer (pH=7
．． Desalt by dialysis using step 1).
以上のようにして精製された抗インスリン抗体を０．１
Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＝７．０）で、濃度が２ ｍ ｇ
／ ｍ ｌになるように４度調整する。The anti-insulin antibody purified as above was added to 0.1
M phosphate buffer (PH=7.0) at a concentration of 2 mg
/ml Adjust 4 times.
次に、直径０．３μｍのポリスチレンラテックス（積水
化学工業株式会社製）を用意し、５０ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ＝９．０）で濃度が１重量％となるように希釈
する。Next, polystyrene latex (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) with a diameter of 0.3 μm is prepared and diluted with a 50 mM glycine buffer (pH=9.0) to a concentration of 1% by weight.
上記ラテックス希釈液を１ｍｌとり、３０″Ｃの温度で
撹拌する。撹拌溶液中に、上記精製抗インスリン抗体溶
液１０００μｉを添加し、しかる後３０゛Ｃの温度で２
時間撹拌し、感作する。Take 1 ml of the above diluted latex solution and stir at a temperature of 30"C. Add 1000μi of the above purified anti-insulin antibody solution to the stirred solution, and then stir at a temperature of 30"C for 2 hours.
Stir for an hour and sensitize.
感作後、４°Ｃで１８．０００ｒｐｍ、１時間の条件で
遠心分離し、沈澱物を集める。５０ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ＝９．０）にＢＳＡを加えて１重量％ＢＳＡ溶液
としたものを、上記沈澱物に１ｍ２加え、さらに３０℃
で１時間撹拌する。撹拌後、上記と同様の条件で遠心分
離により沈澱物を集め、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
＝８゜０）２ｍｌで懸濁して、インスリン定量試薬（抗
インスリン抗体感作ラテックス試薬）を潤製する。After sensitization, centrifuge at 4°C, 18,000 rpm for 1 hour, and collect the precipitate. Add BSA to 50 mM glycine buffer (pH = 9.0) to make a 1 wt% BSA solution, add 1 m2 to the above precipitate, and further incubate at 30°C.
Stir for 1 hour. After stirring, the precipitate was collected by centrifugation under the same conditions as above, and added to 50mM glycine buffer (pH
= 8°0) to prepare an insulin quantitative reagent (anti-insulin antibody sensitized latex reagent).
」゛の５１
５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ＝９．０）に分子量３０
万のポリエチレングリコールを濃度０゜１重量％となる
ように溶解して、反応用希釈液とする。51 Molecular weight 30 in 50mM glycine buffer (pH = 9.0)
A diluted solution for reaction is prepared by dissolving 1,000 ml of polyethylene glycol to a concentration of 0.1% by weight.
遣定
実施例１と同様にして、標準ヒトインスリンを希釈し、
濃度０，１０．２０．４０．８０．１６０及び３２０μ
Ｕ ／ ｍ （ｌの検体を作製する。Standard human insulin was diluted in the same manner as in Specification Example 1,
Concentrations 0, 10.20.40.80.160 and 320μ
Prepare a specimen of U/m (l).
上記各検体を用い、検体２０μｌ、インスリン定量試薬
５０ｕｌ、反応用希釈液３５０μｒをセルに計り込み、
波長５５０ｎｍの吸光度により１０分間の反応性を測定
した。結果を、第２表及び第２図に示す、なお、第２表
において反応性は、吸光度の１０４の値で示す。Using each of the above samples, measure 20 μl of the sample, 50 μl of insulin quantitative reagent, and 350 μr of reaction diluent into the cell.
Reactivity was measured for 10 minutes by absorbance at a wavelength of 550 nm. The results are shown in Table 2 and FIG. 2. In Table 2, the reactivity is indicated by the absorbance value of 104.
第
２
表
第２表から明らかなように、ポリエチレングリコールを
加えることにより、実施例１に比べて倍以上の反応性の
得られることがわかる。Table 2 As is clear from Table 2, by adding polyethylene glycol, reactivity more than double that of Example 1 can be obtained.
〔実施例３］
ｒインスリンｒ体の精製
モルモット産生抗ブタインスリン抗血／ｌ１１５ ｍ
ｅを撹拌しつつ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７゜４
）を飽和硫安としたものを、３０％飽和になるまで滴下
する。室温で３時間放置した後、４°Ｃで１８．０００
ｒｐｍ、１時間の条件で遠心分離により、沈澱物を集め
る。上澄みは除去する。[Example 3] Purification of r-insulin r-form guinea pig-produced anti-pig insulin anti-blood/l115 m
While stirring e, add 0.1M phosphate buffer (pH = 7°4
) as saturated ammonium sulfate is added dropwise until it becomes 30% saturated. After 3 hours at room temperature, 18.000 at 4°C
Collect the precipitate by centrifugation at rpm for 1 hour. Remove the supernatant.
沈澱物を集めた後、５ｍｆの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．４）に溶解する。次に、再度上記の硫安塩析を
行い、同様に遠心分離した後の沈澱物に１ｍｌのＯ，１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７゜４）を加える。しかる後、
得られた溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．りに
より透析して脱塩する。After collecting the precipitate, add 5mf of 0.1M phosphate buffer (p
H=7.4). Next, the above-mentioned ammonium sulfate salting out was performed again, and 1 ml of O, 1
Add M phosphate buffer (pH=7°4). After that,
The resulting solution is desalted by dialysis against 0.1M phosphate buffer (pH=7.0).
以上のようにして精製した抗インスリン抗体を０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で２ｍｇ／ ｍ １２と
なるように濃度調整する。0.1M of the anti-insulin antibody purified as above
Adjust the concentration to 2 mg/m 12 with phosphate buffer (pH = 7.0).
ＩＣのペプシン によるＦ（ａｂ’）ｚ化５０ｍＭク
エン酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）を用意し、濃度２ｍｇ／
ｍｆの上記精製抗インスリン抗体緩衝液溶液をバッファ
置換する。バッファ置換されたもの１ｍｆｆ１に対し、
ペプシン１０μｇを加え、２５゛Ｃの温度で１５時間放
置する。Prepare a 50mM citrate buffer solution (pH=4.0) for F(ab')zation using IC pepsin, and add a concentration of 2mg/
The above purified anti-insulin antibody buffer solution of mf is buffer-substituted. For buffer replaced 1mff1,
Add 10 μg of pepsin and leave at 25°C for 15 hours.
しかる後、アンモニア水によりＰＨ＝７．０付近にｐＨ
調整する。得られた試料を、ゲル濾過により分離し、分
子量１０万の分画を集める。この分画のＦ（ａｂ’）ｇ
４度は、０．５ｍｇ／ｍｌ。After that, adjust the pH to around 7.0 with ammonia water.
adjust. The obtained sample is separated by gel filtration, and fractions with a molecular weight of 100,000 are collected. F(ab')g of this fraction
4 degrees is 0.5 mg/ml.
であった。Met.
直径０．３μｍの試薬用ポリスチレンラテックス（積水
化学工業株式会社製）を用意し、５０ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ＝９．０）で濃度１重量％となるように希釈す
る。得られたラテックス試薬液１ｍｆをとり、３０°Ｃ
の温度で撹拌する。撹拌溶液中に、上記のようにして作
製したＦ（ａｂｌ）を溶液を１００μ２添加し、しかる
後３０゛Ｃの温度で２時間撹拌して感作する。A polystyrene latex for reagents (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) with a diameter of 0.3 μm is prepared and diluted with a 50 mM glycine buffer (pH=9.0) to a concentration of 1% by weight. Take 1 mf of the obtained latex reagent solution and heat at 30°C.
Stir at a temperature of 100 .mu.2 of F(abl) prepared as above was added to the stirred solution, and then stirred at a temperature of 30.degree. C. for 2 hours to sensitize.
２時間後、４°Ｃで１８．ＯＯＯｒｐｍ、１時間の条件
で遠心分離し、沈澱物を集める。５０ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ−９，０）にＢＳＡを加え１重量％ＢＳＡ溶液
としたちの１ｍｆｆ１を沈澱物に加え、さらに３０’Ｃ
で１時間撹拌する。１時間後、上記と同様の条件で遠心
分離により沈澱物を集め、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ＝８．０）２ｍｆｆで懸濁させて、抗インスリン抗体
Ｆ（ａｂ’）ｚ感作ラテツクス試薬（インスリン定量試
薬）とす反応用希釈液の調製
反応用希釈液として、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ＝
９．０）を用いる。After 2 hours, heat at 4°C for 18. Centrifuge at OOOrpm for 1 hour and collect the precipitate. Add BSA to 50mM glycine buffer (pH-9,0), add 1wt% BSA solution, add 1mff1 to the precipitate, and incubate at 30'C.
Stir for 1 hour. After 1 hour, the precipitate was collected by centrifugation under the same conditions as above, and added to 50mM glycine buffer (p
H = 8.0) and suspended in 2 mff to prepare a diluted solution for reaction with anti-insulin antibody F(ab')z sensitized latex reagent (insulin quantitative reagent). pH=
9.0) is used.
遥定
実施例１と同様にして、標準ヒトインスリンを用いて、
０．１０．２０．４０．８０．１６０及び３２０μＵ
／ ｍ Ｒ，の各検体を作製する。In the same manner as in Estimation Example 1, using standard human insulin,
0.10.20.40.80.160 and 320μU
/ m R, each specimen is prepared.
各検体を用い、検体２０μ！、抗インスリン抗体Ｆ（ａ
ｂ’）、感作ラテツクス試薬５０μｌ及び反応用希釈液
３５０μ２をセルに計り込み、波長５５０ｎｍの吸光度
により１０分間の反応性を測定した。結果を、下記の第
３表及び第３図に示す。なお、反応性は、吸光度を１０
４倍した値で示す。Using each sample, 20μ sample! , anti-insulin antibody F (a
b'), 50 µl of the sensitizing latex reagent and 350 µl of the reaction diluent were measured into a cell, and the reactivity was measured for 10 minutes by absorbance at a wavelength of 550 nm. The results are shown in Table 3 and Figure 3 below. Note that the reactivity is determined by measuring the absorbance by 10
It is shown as a value multiplied by 4.
（以下、余白）
第
３
表
第３表から明らかなように、抗インスリン抗体としてＦ
（ａｂ’）、を用いることにより、実施例１に比べてや
や感度の高い試薬の得られることがわかる。(Hereinafter, blank space) Table 3 As is clear from Table 3, F as an anti-insulin antibody.
It can be seen that by using (ab'), a reagent with slightly higher sensitivity than in Example 1 can be obtained.
〔実施例４〕
インスリンモノクローナル
特開昭６０−１８８３２７号公報に記載された方法に基
づいて製造したマウス産生抗ヒトインスリンモノクロー
ナル抗体腹水５ｍｌを撹拌しつつ、０．１Ｍリン＃緩衝
液（ｐＨ＝７．４）を飽和硫安としたものを、３０％飽
和になるまでゆっくり滴下し、室温で３時間放置した後
、４ ’Ｃで１８゜００Ｏｒｐｍ、１時間の条件で遠心
分離により沈澱物を集め、上澄みは取り除く。[Example 4] Insulin Monoclonal Mouse-produced anti-human insulin monoclonal antibody manufactured based on the method described in JP-A No. 60-188327 While stirring 5 ml of ascites, 0.1 M phosphorus # buffer (pH = 7) was added. .4) with saturated ammonium sulfate was slowly added dropwise until it reached 30% saturation, left at room temperature for 3 hours, and the precipitate was collected by centrifugation at 4'C and 18°00 rpm for 1 hour. Remove the supernatant.
上記沈澱物を、÷÷ｉ蝕練５ｍｆの０．１ＭＩＪン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解する。次に、再度上記硫安
塩析を行い、上記と同様に遠心分離した後の沈澱物に１
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＝７．４）を加える
。得られた溶液を０゜１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．１
）で透析して脱塩する。The above precipitate is dissolved in 0.1 MIJ acid buffer (pH=7.4) with a concentration of ÷÷i of 5 mf. Next, the above-mentioned ammonium sulfate salting out was performed again, and the precipitate after centrifugation in the same manner as above was
Add ml of 0.1M phosphate buffer (PH=7.4). The obtained solution was diluted with 0°1M phosphate buffer (pH=7.1
) to desalinate.
以上のようにして精製された抗インスリンモノクローナ
ル抗体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ−７，０）で、
２ｍ ｇ ／ ｍ ｊ２となるように濃度調整する。The anti-insulin monoclonal antibody purified as described above was added to a 0.1M phosphate buffer (pH-7.0).
The concentration is adjusted to 2 mg/m j2.
同様にして、認識部位の異なる抗ヒトインスリンモノク
ローナル抗体を精製する。Similarly, anti-human insulin monoclonal antibodies with different recognition sites are purified.
それぞれの精製モノクローナル抗体について、以下の方
法により感作する。Each purified monoclonal antibody is sensitized by the following method.
インス１ンモノクロー ル の
直径０．３μｍの試薬用ボリスチレンラテンクス（積水
化学工業株式会社製）を用意し、５０ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ−９，０）で濃度１重量％となるように希釈す
る。Prepare a reagent-use polystyrene latinx (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) with a diameter of 0.3 μm and dilute it with 50 mM glycine buffer (pH -9,0) to a concentration of 1% by weight. .
得られたラテックス希釈液１ｍｊ２をとり、３０℃で撹
拌する。撹拌溶液中に、上記精製抗体溶液を１００μ！
添加し、しかる後３０″Ｃの温度で２時間撹拌して感作
する。Take 1 mj2 of the obtained latex diluted solution and stir at 30°C. Add 100μ of the above purified antibody solution to the stirring solution!
sensitized by stirring for 2 hours at a temperature of 30"C.
２時間後、４°Ｃで１８，０００ｒｐｍ、１時間の条件
で遠心分離し、沈澱物を集める。５０ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ＝９．０）にＢＳＡを加えて１重量％ＢＳＡ溶
液としたちの１ｍｊ！を、上記沈澱物に加え、さらに３
０℃で１時間撹拌する。After 2 hours, centrifuge at 4°C, 18,000 rpm for 1 hour, and collect the precipitate. Add BSA to 50mM glycine buffer (pH = 9.0) to make a 1% BSA solution and make 1 mj! was added to the above precipitate, and 3
Stir at 0°C for 1 hour.
１時間撹拌した後、上記と同様の条件で遠心分離により
沈澱物を集め、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ＝８．０
）２ｍＪ！で溶解する。After stirring for 1 hour, the precipitate was collected by centrifugation under the same conditions as above, and added to 50mM glycine buffer (pH = 8.0).
)2mJ! Dissolve with.
それぞれの精製モノクローナル抗体について得た感作液
を１ｍｌずつとり、混合して、インスリン定量試薬を得
る。Take 1 ml of the sensitizing solution obtained for each purified monoclonal antibody and mix to obtain an insulin quantitative reagent.
反廠亙亙釈痰旦週袈
反応用希釈液として、５０ｍＭグリシンｌ！衝液（ｐＨ
＝９．０）を用いる。50mM glycine as a diluent for the reaction! Solution (pH
=9.0) is used.
貞定
実施例１と同様にして、標準ヒトインスリンを用いて濃
度０．１０，２０，４０．８０．１６０及び３２０ｕＵ
／ｍｆｆ１の各検体を作製する。Similar to Chastity Example 1, using standard human insulin at concentrations of 0.10, 20, 40, 80, 160 and 320 uU.
/mff1 samples are prepared.
上記の各検体を用いて反応性を測定した。測定は、各検
体を２０μ！、インスリン定量試薬５０μ！及び反応用
希釈液３５０μｌをセルに計り込み、波長５５０ｎｍの
吸光度により１ｏ分間の反応性を測定した。結果を、第
４表及び第４図に示す、なお、第４表では、吸光度を１
０４倍したもので反応性を示した。Reactivity was measured using each of the above specimens. Measure 20μ of each sample! , insulin quantitative reagent 50μ! 350 μl of the diluted reaction solution was measured into a cell, and the reactivity was measured for 10 minutes by absorbance at a wavelength of 550 nm. The results are shown in Table 4 and Figure 4. In Table 4, the absorbance is
The reactivity was indicated by multiplying by 04 times.
（以下、余白）
第
４
表
Ｃ発明の効果〕
以上のように、本発明のインスリン定量方法では、不溶
性担体に回持された抗インスリン抗体と試料中のインス
リンとを反応させ、抗原抗体反応に基づく凝集反応の程
度を検出することにより試料中のインスリンが定量され
る。従って、従来のＲＩＡ法やＥＩＡ法に比べて、非常
に簡単にかつ短時間で試料中のインスリン濃度を検出す
ることが可能となる。すなわち、ＲＩＡ法のような特殊
な器具・装置を必要とせず、また取扱上の制約もほとん
どない、さらに、ＲＩＡ法やＥｒＡ法に比べて手技も簡
単であり、かつごく短時間にインスリンを測定すること
ができる。(Hereinafter, blank spaces) Table 4 Effects of the invention] As described above, in the method for quantifying insulin of the present invention, the anti-insulin antibody carried by the insoluble carrier is allowed to react with insulin in the sample, resulting in an antigen-antibody reaction. Insulin in the sample is quantified by detecting the degree of agglutination reaction. Therefore, compared to conventional RIA and EIA methods, it is possible to detect the insulin concentration in a sample much more easily and in a shorter time. In other words, unlike the RIA method, special instruments and devices are not required, and there are almost no restrictions on handling.Furthermore, the procedure is simpler than the RIA method or the ErA method, and insulin can be measured in a very short time. can do.
また、本発明のインスリン定量試薬は、不溶性担体に担
持された抗インスリン抗体を含むものを有するだけであ
り、ＥＩＡ法用試薬のような基質溶液や反応停止液等の
種々の試薬を必要としない。In addition, the insulin quantitative reagent of the present invention only contains an anti-insulin antibody supported on an insoluble carrier, and does not require various reagents such as a substrate solution or a reaction stop solution such as a reagent for EIA method. .
なお、本発明において、抗インスリン抗体としてＦ（ａ
ｂ’）、を用いたり、増感剤として３万以上のポリエチ
レングリコールを用いれば、測定感度をより一層高める
ことができる。In addition, in the present invention, F(a
b') or polyethylene glycol of 30,000 or more as a sensitizer, the measurement sensitivity can be further increased.
第１図は実施例１の結果を示し、試料中のインスリン濃
度と吸光度（ＸＩＯ’）の関係を示す図、第２図は実施
例２の結果を示し、試料中のインスリン濃度と吸光度（
ｘＩｏｌの関係を示す閏、第３図は実施例３の結果を示
し、試料中のインスリン濃度と吸光度（ＸＩＯ’）の関
係を示す図、第４図は実施例４の結果を示し、試料中の
インスリン濃度と吸光度（Ｘ１０’）の関係を示す図で
ある。
第１図
イ゛７又１１ン膿ｇ ＣｐＵ／ｒＪノ
第２図
イ〉スリング１度（ｐＵ／ｍＩり
第３図
イソ又すシフ乱Ｋ （μｖ／、、、ｅ＞第４図
イ〉又りレゾ４彦（Ｐ′Ｕ／／ｎカFigure 1 shows the results of Example 1 and shows the relationship between the insulin concentration in the sample and the absorbance (XIO'). Figure 2 shows the results of Example 2 and shows the relationship between the insulin concentration in the sample and the absorbance (XIO').
Figure 3 shows the results of Example 3 and shows the relationship between insulin concentration in the sample and absorbance (XIO'). Figure 4 shows the results of Example 4 and shows the relationship between It is a figure showing the relationship between insulin concentration and absorbance (X10'). Figure 1 I 7 or 11 pus g CpU/rJ Figure 2 I Sling 1 degree (pU/mI Figure 3 Iso or Schiff disturbance K (μv/,,, e > Figure 4 I) Matari Reso 4hiko (P'U//nka
Claims (5)
料中のインスリンとを反応させ、該抗原抗体反応に基づ
く凝集の程度を検出することによりインスリンを定量す
ることを特徴とする、インスリン定量方法。(1) A method for quantifying insulin, which comprises reacting an anti-insulin antibody supported on an insoluble carrier with insulin in a sample, and quantifying insulin by detecting the degree of aggregation based on the antigen-antibody reaction. .
チレングリコールを使用する、請求項１に記載のインス
リン定量方法。(2) The method for quantifying insulin according to claim 1, wherein polyethylene glycol having a molecular weight of at least 30,000 is used as the sensitizer.
、試料中のインスリンと抗原抗体反応させ、該抗原抗体
反応に基づく凝集の程度を検出することによりインスリ
ンを定量するためのインスリン定量試薬。(3) An insulin quantitative reagent containing an insoluble carrier carrying an anti-insulin antibody, for quantifying insulin by causing an antigen-antibody reaction with insulin in a sample and detecting the degree of agglutination based on the antigen-antibody reaction.
る請求項３に記載のインスリン定量試薬。(4) The insulin quantitative reagent according to claim 3, wherein the anti-insulin antibody is F(ab')_2.
ンスリンモノクローナル抗体である請求項３に記載のイ
ンスリン定量試薬。(5) The insulin quantitative reagent according to claim 3, wherein the anti-insulin antibody is at least two types of anti-insulin monoclonal antibodies.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25675889A JPH03118472A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Insulin assay and reagent therefor |
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| JPH03118472A true JPH03118472A (en) | 1991-05-21 |
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| JP25675889A Pending JPH03118472A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Insulin assay and reagent therefor |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03118472A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2011010673A1 (en) | 2009-07-21 | 2011-01-27 | 積水メディカル株式会社 | Insulin measurement method |
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1989
- 1989-09-29 JP JP25675889A patent/JPH03118472A/en active Pending
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