JPH0291097A - プロウロキナーゼ配列を有するペプチドおよびその製法 - Google Patents
プロウロキナーゼ配列を有するペプチドおよびその製法Info
- Publication number
- JPH0291097A JPH0291097A JP20705689A JP20705689A JPH0291097A JP H0291097 A JPH0291097 A JP H0291097A JP 20705689 A JP20705689 A JP 20705689A JP 20705689 A JP20705689 A JP 20705689A JP H0291097 A JPH0291097 A JP H0291097A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- prourokinase
- amino acid
- peptide according
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 5
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 4
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- -1 9-fluorenylmethoxy carbonyl (Fmoc) group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 abstract description 5
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 15
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 15
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N Cl.OP(O)(O)=O Chemical compound Cl.OP(O)(O)=O BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABLJDBFJPUWQQB-DCAQKATOSA-N Cys-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ABLJDBFJPUWQQB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- GESRUPNWDGSYQI-UHFFFAOYSA-N bromylformonitrile Chemical compound O=Br(=O)C#N GESRUPNWDGSYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006032 tissue transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプロウロキナーゼのアミノ酸配列部分を有する
ペプチド、その製法および使用、ならびにこれらペプチ
ドに対する抗体、およびプロウロキナーゼ測定へのその
使用に関する。
ペプチド、その製法および使用、ならびにこれらペプチ
ドに対する抗体、およびプロウロキナーゼ測定へのその
使用に関する。
プロウロキナーゼはプラスミノーゲンアクチベーターの
酵素前駆体である。プラスミノーゲンアクチベーターの
機能は酵素前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに変換
することであり、このものはそこでタンパク分解活性を
有することになる。プラスミンは血栓の溶解または組織
の変換のような多数の生理学的および病理生理学的過程
に関与じている（***、***形成、胚増殖、マクロファ
ージ遊走、転移）。繊維素溶解系を活性化すると、プロ
ウロキナーゼ（ＰＵＫ）がウロキナーゼ（ＵＫ）に変換
される。次にウロキナーゼがプラスミノーゲンアクチベ
ーターとして作用してプラスミノーゲンをプラスミンに
変換する。正常な生理学的条件下においては血管中には
ウロキナーゼでなくプロウロキナーゼが検出される。血
漿中におけるプロウロキナーゼの測定は診断上非常に重
要である。なぜなら血漿濃度の低下から繊維素溶解系の
活性化状況に関する情報を得ることが出来るからである
。しかしながらプロウロキナーゼはタンパク分解活性を
をせず従ってその生物学的活性によって検出することが
できない。それゆえプロウロキナーゼを免疫学的に検出
する必要がある。しかしながら従来法で利用できる抗体
はＰＵＫと口にとを区別できない。
酵素前駆体である。プラスミノーゲンアクチベーターの
機能は酵素前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに変換
することであり、このものはそこでタンパク分解活性を
有することになる。プラスミンは血栓の溶解または組織
の変換のような多数の生理学的および病理生理学的過程
に関与じている（***、***形成、胚増殖、マクロファ
ージ遊走、転移）。繊維素溶解系を活性化すると、プロ
ウロキナーゼ（ＰＵＫ）がウロキナーゼ（ＵＫ）に変換
される。次にウロキナーゼがプラスミノーゲンアクチベ
ーターとして作用してプラスミノーゲンをプラスミンに
変換する。正常な生理学的条件下においては血管中には
ウロキナーゼでなくプロウロキナーゼが検出される。血
漿中におけるプロウロキナーゼの測定は診断上非常に重
要である。なぜなら血漿濃度の低下から繊維素溶解系の
活性化状況に関する情報を得ることが出来るからである
。しかしながらプロウロキナーゼはタンパク分解活性を
をせず従ってその生物学的活性によって検出することが
できない。それゆえプロウロキナーゼを免疫学的に検出
する必要がある。しかしながら従来法で利用できる抗体
はＰＵＫと口にとを区別できない。
それゆえ本発明の目的はプロウロキナーゼの特異的検出
ならびに精製のための試薬および方法を開発することで
ある。
ならびに精製のための試薬および方法を開発することで
ある。
前記目的はＰＵＫをタンパク質特にウロキナーゼの存在
下に選択的かつ定量的に測定しうる特異的な抗体を調整
することにより達成された。
下に選択的かつ定量的に測定しうる特異的な抗体を調整
することにより達成された。
かかる抗体はプロウロキナーゼ配列に由来するペプチド
を用いて免疫することにより得られる。
を用いて免疫することにより得られる。
それゆえ本発明はプロウロキナーゼの１４０〜１８０領
域からのアミノ酸配列を有する４〜４０個のアミノ酸を
含有するペプチド、好ましくは切断部位１５８／ １５
９ （−Ｌｙｓ／ １ｉｅ−）を含有するペプチドに関
する。
域からのアミノ酸配列を有する４〜４０個のアミノ酸を
含有するペプチド、好ましくは切断部位１５８／ １５
９ （−Ｌｙｓ／ １ｉｅ−）を含有するペプチドに関
する。
かかるペプチドは動物をそれで免疫した場合にプロウロ
キナーゼ特異的な抗体を誘発させる。
キナーゼ特異的な抗体を誘発させる。
これら新規ペプチドは場合により担体分子に固定化でき
るように好ましくはＣ−末端またはＮ−末端で付加的に
反応性の基例えばチオール基を含有することができる。
るように好ましくはＣ−末端またはＮ−末端で付加的に
反応性の基例えばチオール基を含有することができる。
場合により、Ｎ−末端またはＣ−末端で遊離のスルフヒ
ドリル基を存するシネティンを含有する下記ペプチド： ＲＰＲＦＫ Ｉ ＩＧＧＥＦＴ。
ドリル基を存するシネティンを含有する下記ペプチド： ＲＰＲＦＫ Ｉ ＩＧＧＥＦＴ。
ＬＲＰＲＦＫＩ ＩＧＧＥＦ丁ＴおよびＧＯＫＴＬＲＰ
ＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴＴＩＥ（特に適当である（ここで
略語は以下のとおりである）： Ｃシスティン Ａ アラニン Ｒアルギニン Ｐ プロニン Ｆ フェニルアラニン Ｋ リジン ■ インロイシン Ｇ グリシン Ｅ グルタミン酸 Ｔ トレオニンおよび Ｑ グルタミン、 であり、そしてこれらアミノ酸はＤ−形またはＬ−形を
とることができるが別に記載がない限りＬ−形をとるも
のとする）。
ＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴＴＩＥ（特に適当である（ここで
略語は以下のとおりである）： Ｃシスティン Ａ アラニン Ｒアルギニン Ｐ プロニン Ｆ フェニルアラニン Ｋ リジン ■ インロイシン Ｇ グリシン Ｅ グルタミン酸 Ｔ トレオニンおよび Ｑ グルタミン、 であり、そしてこれらアミノ酸はＤ−形またはＬ−形を
とることができるが別に記載がない限りＬ−形をとるも
のとする）。
本発明はまた本発明によるペプチドの製法にも関する。
本発明は特に、保護されｔこアミノ酸誘導体またはペプ
チドセグメントを溶液中でまたは固相上で相互に結合さ
せ、そして保護基を除去しならびに固相の場合は担体樹
脂を取り外すことにより本発明によるペプチドを得るこ
とからなる、本発明によるペプーチドのそれ自体知られ
た製法にも関する。
チドセグメントを溶液中でまたは固相上で相互に結合さ
せ、そして保護基を除去しならびに固相の場合は担体樹
脂を取り外すことにより本発明によるペプチドを得るこ
とからなる、本発明によるペプーチドのそれ自体知られ
た製法にも関する。
この方法で合成されたペプチドＣｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−１１ｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＰｈｅＴｈｒ−Ｔｈｒが特に
好ましい。−時的な保護基としてはＦｍｏｃ基（９−フ
ルオレニルメトキシカルボニル）、第二官能基にとって
永久的な保護基としては第三ブチル／Ｂｏｃ（第三ブト
キシカルボニル）基に基づくもの、ＡｒｇにはＭｔｒ
（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスル
ホニル）基、そしてＣｙｏには第三ブチルメルカプト基
が用いられる。Ｃ−末端アミノ酸の固定は、ペプチド合
成に適する慣用のポリマー担体好ましくは架橋ポリスチ
レンに結合しているｐ−アルコキシベンジルエステル基
を介して行われる。ペプチドの合成は好ましくはＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペ
リジンを用いてＦｍｏｃを除去し、後続の保護されたア
ミノ酸を好ましくはＨＯＢＴ （ヒドロキシベンゾトリ
アゾール）の存在下にカルボジイミドを用いて結合させ
る工程を反復することにより行われる。この目的にはア
ミノ酸誘導体を好ましくは３倍過剰でＤＭＦ中１〜１．
５時間給合させる。各操作工程、Ｆｍｏｃ除去または縮
合工程の後、樹脂を少量（１５ｍＱ／ｇ）ずつのＤＭＦ
またはイソプロパツールを用いて３回ずつ洗滌する。本
発明によるペプチドのとりはずしは側鎖官能基を同時に
遊離させながらアシトリシュにより行われる。場合によ
り、遊離させるべきスルフヒドリル基はアルコール例え
ばトリフルオロエタノ−、ル中のトリーｎブチルホスフ
ィンまたは水中のＤＴＴ （ジチオトレイトール）を用
いて「脱保護」する。ペプチドはイオン交換クロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびゲル透過クロ
マトグラフィーにより精製する。アミノ酸分析を用いて
ペプチド含量を測定しそしてペプチドの組成が正しいか
どうか判定する。
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−１１ｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＰｈｅＴｈｒ−Ｔｈｒが特に
好ましい。−時的な保護基としてはＦｍｏｃ基（９−フ
ルオレニルメトキシカルボニル）、第二官能基にとって
永久的な保護基としては第三ブチル／Ｂｏｃ（第三ブト
キシカルボニル）基に基づくもの、ＡｒｇにはＭｔｒ
（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスル
ホニル）基、そしてＣｙｏには第三ブチルメルカプト基
が用いられる。Ｃ−末端アミノ酸の固定は、ペプチド合
成に適する慣用のポリマー担体好ましくは架橋ポリスチ
レンに結合しているｐ−アルコキシベンジルエステル基
を介して行われる。ペプチドの合成は好ましくはＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペ
リジンを用いてＦｍｏｃを除去し、後続の保護されたア
ミノ酸を好ましくはＨＯＢＴ （ヒドロキシベンゾトリ
アゾール）の存在下にカルボジイミドを用いて結合させ
る工程を反復することにより行われる。この目的にはア
ミノ酸誘導体を好ましくは３倍過剰でＤＭＦ中１〜１．
５時間給合させる。各操作工程、Ｆｍｏｃ除去または縮
合工程の後、樹脂を少量（１５ｍＱ／ｇ）ずつのＤＭＦ
またはイソプロパツールを用いて３回ずつ洗滌する。本
発明によるペプチドのとりはずしは側鎖官能基を同時に
遊離させながらアシトリシュにより行われる。場合によ
り、遊離させるべきスルフヒドリル基はアルコール例え
ばトリフルオロエタノ−、ル中のトリーｎブチルホスフ
ィンまたは水中のＤＴＴ （ジチオトレイトール）を用
いて「脱保護」する。ペプチドはイオン交換クロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびゲル透過クロ
マトグラフィーにより精製する。アミノ酸分析を用いて
ペプチド含量を測定しそしてペプチドの組成が正しいか
どうか判定する。
抗体は例えばペプチドを担体タンパク質好ましくはアル
ブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンと好ま
しくはチオエーテル結合を介して結合させ、それを用い
て動物、好ましくはウサギを免疫することにより、それ
自体知られた方法で調整される。１回またはそれ以上の
ブースター処置後動物から全血を採りそして粗製抗血清
を取得する。場合によりこれら抗血清を本発明によるペ
プチドが固定化さ・れたアフイニテイ物質でのアフイニ
テイクロマトグラフイーにかける。その上さらに、確立
された技法に従いこれらペプチドに対するモノクローナ
ル抗体をも調整することができる。
ブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンと好ま
しくはチオエーテル結合を介して結合させ、それを用い
て動物、好ましくはウサギを免疫することにより、それ
自体知られた方法で調整される。１回またはそれ以上の
ブースター処置後動物から全血を採りそして粗製抗血清
を取得する。場合によりこれら抗血清を本発明によるペ
プチドが固定化さ・れたアフイニテイ物質でのアフイニ
テイクロマトグラフイーにかける。その上さらに、確立
された技法に従いこれらペプチドに対するモノクローナ
ル抗体をも調整することができる。
驚くべきことにこれら抗体を用いてグロウロキナーゼお
よびウロキナーゼが免疫化学的検査、例えばＥＬＩＳＡ
により区別されうる。
よびウロキナーゼが免疫化学的検査、例えばＥＬＩＳＡ
により区別されうる。
それゆえ本発明はまた前記したペプチドに対する抗体を
含有する、プロウロキナーゼ測定のための試薬にも関す
る。
含有する、プロウロキナーゼ測定のための試薬にも関す
る。
かかる測定にＥＬ’ＩＳＡが用いられる場合は、サンド
インチアッセイとして実施されるのが好ましく、その場
合本発明による抗体は固相に固定される。次に被分析物
質とインキュベーションし、洗浄しそして好ましくはＰ
ＯＤで標識されたポリクローナルウロキナーゼ抗体を用
いて検出する。
インチアッセイとして実施されるのが好ましく、その場
合本発明による抗体は固相に固定される。次に被分析物
質とインキュベーションし、洗浄しそして好ましくはＰ
ＯＤで標識されたポリクローナルウロキナーゼ抗体を用
いて検出する。
さらにこれら抗体はそれをポリマーに固定し、そしてＰ
ＵＫを含有する検体をそれと一緒にインキュベーション
することによりＰＵＫの精製にも用いることができる。
ＵＫを含有する検体をそれと一緒にインキュベーション
することによりＰＵＫの精製にも用いることができる。
ＰＵＫは好ましくは酸性緩衝液を用いて溶離することに
よりこれらポリマ−から精製された形態で得ることがで
きる。
よりこれらポリマ−から精製された形態で得ることがで
きる。
ペプチドは抗血清を精製する目的でアフイニテイクロマ
トグラフイー用の担体物質として適当な物質、例えばブ
ロムシアンで活性化されたセファロースに結合させる。
トグラフイー用の担体物質として適当な物質、例えばブ
ロムシアンで活性化されたセファロースに結合させる。
本発明によるペプチドにとっての上記以外の担体分子に
は可溶性あるいはまた不溶性である高分子物質があげら
れ、それらには好ましくはグルグルアルデヒドで活性化
されていることもできるアルブミン、卵アルブミンなら
びに樹脂例えばポリスチレン、誘導体化されたシリカゲ
ルおよびアクリル酸に基づくコポリマーが包含される。
は可溶性あるいはまた不溶性である高分子物質があげら
れ、それらには好ましくはグルグルアルデヒドで活性化
されていることもできるアルブミン、卵アルブミンなら
びに樹脂例えばポリスチレン、誘導体化されたシリカゲ
ルおよびアクリル酸に基づくコポリマーが包含される。
実施例 ｌ
免疫化抗原の調整
ａ） Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｙｓ−＋１ｅ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒの合成ＦＩＩＩＯＣ−Ｔｈ
ｒ（ｔＢｕ） −ｐ−アルコキシベンジルエステル樹脂
１ｇを１５ｍｆｆのＤＭＦを用いて１分間ずつ２回洗浄
しそしてＦｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／
ｖ）１５ｍＱを用いて除去した（ｌ×３分、■×ｌＯ分
）。次に樹脂をＤＩＪＦおよびインプロパツール（各１
５＋Ｑ）で３回ずつおよびＤＭＦ １５ｍ１２ずつで２
回洗浄した。１．５ミリモルのＦｍｏｃ−アミノ酸およ
び２．２５ミリモルのＨＯＢｔを１５＋＋＋Ｑ中に溶解
して樹脂に加え、ジクロロメタン中の１Ｍジイソプロピ
ルカルボジイミド溶液１．６５＋＋ｃＱを添加したのち
この混合物を室温で１．５時間振盪した。反応の完結は
ニンヒドリンテストを用いて検査した。次に樹脂をＤＭ
Ｆおよびインプロパツール（各１５＋＋ＩＱずつ）を用
いて３回ずつ洗いそして新たなサイクルを開始した。Ｂ
ｏｃで保護されたアミノ酸が最後のアミノ酸として用い
られた。樹脂をトリフルオロエタノール１５ｍ（１およ
び水５滴中にとりモしてＮ−メチルモルホリンを用いて
ｐＨ７，２に調整した。これに４ミリモルのトリーｎ−
ブチルホスフィンを加え、室温で一夜振盪した。そこで
樹脂を各１５＋ｍｆｆずつのインプロパツールおよびジ
エチルエーテルを用いて３回ずつ洗い、高真空下に乾燥
した。樹脂１．９９をチオアニソールｌ ｍＱ、エタン
ジチオール１ｍＱおよびトリフルオロ酢酸１８ｍ１２と
３５°Ｃで３．５時間撹拌し、濾過し、樹脂をトリフル
オロ酢酸／ジクロロメタン（１：ｌ）を用いて３回洗い
そして炉液をエーテルから結晶化させた。粗製ペプチド
をジエチルエーテルで洗いそして乾燥させた。このペプ
チドを０．５％酢酢酸上セファデックスＧ２５クロマト
グラフィーした。収量＝８７８１１Ｉｇ。
ｈｅ−Ｌｙｓ−＋１ｅ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒの合成ＦＩＩＩＯＣ−Ｔｈ
ｒ（ｔＢｕ） −ｐ−アルコキシベンジルエステル樹脂
１ｇを１５ｍｆｆのＤＭＦを用いて１分間ずつ２回洗浄
しそしてＦｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／
ｖ）１５ｍＱを用いて除去した（ｌ×３分、■×ｌＯ分
）。次に樹脂をＤＩＪＦおよびインプロパツール（各１
５＋Ｑ）で３回ずつおよびＤＭＦ １５ｍ１２ずつで２
回洗浄した。１．５ミリモルのＦｍｏｃ−アミノ酸およ
び２．２５ミリモルのＨＯＢｔを１５＋＋＋Ｑ中に溶解
して樹脂に加え、ジクロロメタン中の１Ｍジイソプロピ
ルカルボジイミド溶液１．６５＋＋ｃＱを添加したのち
この混合物を室温で１．５時間振盪した。反応の完結は
ニンヒドリンテストを用いて検査した。次に樹脂をＤＭ
Ｆおよびインプロパツール（各１５＋＋ＩＱずつ）を用
いて３回ずつ洗いそして新たなサイクルを開始した。Ｂ
ｏｃで保護されたアミノ酸が最後のアミノ酸として用い
られた。樹脂をトリフルオロエタノール１５ｍ（１およ
び水５滴中にとりモしてＮ−メチルモルホリンを用いて
ｐＨ７，２に調整した。これに４ミリモルのトリーｎ−
ブチルホスフィンを加え、室温で一夜振盪した。そこで
樹脂を各１５＋ｍｆｆずつのインプロパツールおよびジ
エチルエーテルを用いて３回ずつ洗い、高真空下に乾燥
した。樹脂１．９９をチオアニソールｌ ｍＱ、エタン
ジチオール１ｍＱおよびトリフルオロ酢酸１８ｍ１２と
３５°Ｃで３．５時間撹拌し、濾過し、樹脂をトリフル
オロ酢酸／ジクロロメタン（１：ｌ）を用いて３回洗い
そして炉液をエーテルから結晶化させた。粗製ペプチド
をジエチルエーテルで洗いそして乾燥させた。このペプ
チドを０．５％酢酢酸上セファデックスＧ２５クロマト
グラフィーした。収量＝８７８１１Ｉｇ。
この生成物１１００ＩＩＩを調整用ＨＰＬＣ系中逆相物
質でクロマトグラフィーすることによりさらに精製した
（０．０５モル燐酸ナトリウム緩衝液／アセトニトリル
、ｐＨ２，５、グラジェント）。このペプチドプールか
らセファデックスＧ２５上０．５％酢酸を用いて脱塩し
た。収量： ３９ｍｇ。
質でクロマトグラフィーすることによりさらに精製した
（０．０５モル燐酸ナトリウム緩衝液／アセトニトリル
、ｐＨ２，５、グラジェント）。このペプチドプールか
らセファデックスＧ２５上０．５％酢酸を用いて脱塩し
た。収量： ３９ｍｇ。
ｂ）接合体の調整
ＫＬＨ２０ｍｇを０．０５ミリモル燐酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ８，０、中に溶解させそして２ｍｇのガンママ
レイミド酪酸ヒドロキシスクシンイミドエステルと１時
間撹拌した。このタンパク質をセファデックス０５０カ
ラム（２Ｘ ３０ｃｍ）でクロマトグラフィーした（０
．１モル燐酸ナトリウム、０．５ミリモルＥＤＴＡＸｐ
Ｈ６，ｏ） 、溶出液を５ｍＩ２となるまで濃縮しそし
てペプチド２０ｍｇと１時間インキュベートした。透析
および凍結乾燥後にペプチド接合体２５ｍｇが得られた
。
液、ｐＨ８，０、中に溶解させそして２ｍｇのガンママ
レイミド酪酸ヒドロキシスクシンイミドエステルと１時
間撹拌した。このタンパク質をセファデックス０５０カ
ラム（２Ｘ ３０ｃｍ）でクロマトグラフィーした（０
．１モル燐酸ナトリウム、０．５ミリモルＥＤＴＡＸｐ
Ｈ６，ｏ） 、溶出液を５ｍＩ２となるまで濃縮しそし
てペプチド２０ｍｇと１時間インキュベートした。透析
および凍結乾燥後にペプチド接合体２５ｍｇが得られた
。
実施例 ２
ウサギの免疫化
５匹のウサギを一匹当り２ｍｇずつの接合体を用い８週
間にわたり皮下および静脈から免疫した。次に動物から
全血をとりそして抗血清を防腐剤で安定化させた。収量
： ９２０ｍＱ０実施例 ３ ＰＵＫ−抗体の精製 生成物（実施例１ａ）をＢｒＣＮ活性化されたセファロ
ース１ｇ当り２ｍｇの濃度でマトリックスに結合させた
。ウサギの血清（実施例２ ）２００ｍ０゜にこのアフ
イニテイ樹脂５０ｇを加え室温で１８時間インキュベー
トした。液体を分離したのち樹脂を緩衝液（ＰＢＳ、
ｐＨ７，２） １５０ｍＱ中に懸濁させそしてカラム中
に充填した。次にこの樹脂を２ＭＮａＣＱを含有する同
じ緩衝液１００＋１２で洗いそして抗体を０．２５Ｍグ
リジン溶液、ｐＨ２、５，２００ｍｆｆを用いて溶離し
た。溶出液をトリスを用いてｐＨ７，０に調整した。次
にこの溶液をＰＢＳで４°Ｃで１８時間透析した。
間にわたり皮下および静脈から免疫した。次に動物から
全血をとりそして抗血清を防腐剤で安定化させた。収量
： ９２０ｍＱ０実施例 ３ ＰＵＫ−抗体の精製 生成物（実施例１ａ）をＢｒＣＮ活性化されたセファロ
ース１ｇ当り２ｍｇの濃度でマトリックスに結合させた
。ウサギの血清（実施例２ ）２００ｍ０゜にこのアフ
イニテイ樹脂５０ｇを加え室温で１８時間インキュベー
トした。液体を分離したのち樹脂を緩衝液（ＰＢＳ、
ｐＨ７，２） １５０ｍＱ中に懸濁させそしてカラム中
に充填した。次にこの樹脂を２ＭＮａＣＱを含有する同
じ緩衝液１００＋１２で洗いそして抗体を０．２５Ｍグ
リジン溶液、ｐＨ２、５，２００ｍｆｆを用いて溶離し
た。溶出液をトリスを用いてｐＨ７，０に調整した。次
にこの溶液をＰＢＳで４°Ｃで１８時間透析した。
実施例 ４
ＥＬ Ｉ ＳＡでのＰＵＫの検出
ａ）プレートの調整
マイクロタイタープレートを実施例３記載の精製された
抗体を含有する溶液（５μｇ／ｍＱ）で被覆した（６０
μｍ２／ウエル）。インキュベーションは室温で１８時
間行われた。次にプレートを５０ミリモルのトリス、５
０ミリモルのクエン酸を含有する緩衝液、ｐＨ７，４、
約１００ｍ（ｌを用いて洗った。
抗体を含有する溶液（５μｇ／ｍＱ）で被覆した（６０
μｍ２／ウエル）。インキュベーションは室温で１８時
間行われた。次にプレートを５０ミリモルのトリス、５
０ミリモルのクエン酸を含有する緩衝液、ｐＨ７，４、
約１００ｍ（ｌを用いて洗った。
ｂ）接合体の調整
Ｖａｋａｎｅ氏の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｈ４ｓｔｏｃ
ｈｅｍ、ＣｙＬｏｃ−ｈｅｍ、 ２２．１０８４１０９
１．１９７４）に従いウロキナーゼ抗体をＰＯＤ（ペル
オキシダーゼ）で標識した。
ｈｅｍ、ＣｙＬｏｃ−ｈｅｍ、 ２２．１０８４１０９
１．１９７４）に従いウロキナーゼ抗体をＰＯＤ（ペル
オキシダーゼ）で標識した。
Ｃ）アッセイ操作
ＰＵＫ溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ａ）をＰＢＳ ｐＨ７，２，１％ＢＳＡおよび０．０５
％ツイーンを含有する緩衝液を用いて２４００ｎｇ／ｍ
Ｑ； １２００ｎｇ／ｍＱ； ８００ｎｇ／ｍｆｆ ；
４００ｎｇ／ｍ１２； ２００ｎｇ／ｍｆｆ ； １
００ｎｙ／ｍｆｆ１ ；５０ｎｇ／ ｍＱ ；および２
０ｎｇ／ｉＱに希釈した。この希釈された溶液５０μα
ずつをウェルにピペットで加えた。インキュベーション
して抗原を固定相抗体に結合させたのち（３７°ＯＳ
１時間）、プレートを前記緩衝液で洗った。ペルオキシ
ダーゼで標識されたＵＫ−抗体をＰＢＳ ｐＨ７，２；
０．０５％ツイーン２０を含有する緩衝液でｌ：８０
０に希釈しそして５０μＱずつをピペットで各ウェルに
加えた。
ａ）をＰＢＳ ｐＨ７，２，１％ＢＳＡおよび０．０５
％ツイーンを含有する緩衝液を用いて２４００ｎｇ／ｍ
Ｑ； １２００ｎｇ／ｍＱ； ８００ｎｇ／ｍｆｆ ；
４００ｎｇ／ｍ１２； ２００ｎｇ／ｍｆｆ ； １
００ｎｙ／ｍｆｆ１ ；５０ｎｇ／ ｍＱ ；および２
０ｎｇ／ｉＱに希釈した。この希釈された溶液５０μα
ずつをウェルにピペットで加えた。インキュベーション
して抗原を固定相抗体に結合させたのち（３７°ＯＳ
１時間）、プレートを前記緩衝液で洗った。ペルオキシ
ダーゼで標識されたＵＫ−抗体をＰＢＳ ｐＨ７，２；
０．０５％ツイーン２０を含有する緩衝液でｌ：８０
０に希釈しそして５０μＱずつをピペットで各ウェルに
加えた。
接合体と抗原との反応は１時間（３７°Ｃ）後に洗浄す
ることにより終了させた。オルトフェニレンジアミン、
Ｈ２Ｏ２を含有する色原体基質（Ｂｅｈ−ｒ ｉｎｇｗ
ｅｒｋｅ）を、ｌｏｗ（２中にクエン酸１００ｍｇ、燐
酸水素シナｌ−ＩＪウム２００ｍｇ、尿素・過酸化水素
８ｍｇおよびメルチオルート （Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔ
ｅ） ｌ ｍｇを含有する緩衝液、ｐＨ５，０−５，４
，１０ｍＱを用いて溶解させそして５０μαずつをピペ
ットで各ウェルに加えた。３０分後呈色反応を０．５Ｍ
硫酸を用いて停止させた。４９２ｎｍでの吸光度を光度
計で測定しＩこ。
ることにより終了させた。オルトフェニレンジアミン、
Ｈ２Ｏ２を含有する色原体基質（Ｂｅｈ−ｒ ｉｎｇｗ
ｅｒｋｅ）を、ｌｏｗ（２中にクエン酸１００ｍｇ、燐
酸水素シナｌ−ＩＪウム２００ｍｇ、尿素・過酸化水素
８ｍｇおよびメルチオルート （Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔ
ｅ） ｌ ｍｇを含有する緩衝液、ｐＨ５，０−５，４
，１０ｍＱを用いて溶解させそして５０μαずつをピペ
ットで各ウェルに加えた。３０分後呈色反応を０．５Ｍ
硫酸を用いて停止させた。４９２ｎｍでの吸光度を光度
計で測定しＩこ。
第１表
２４００ ｎｇ／＋ｎＱ１．５１９ １．５
１３１２００ ｎｙ／ｍＱ Ｏ，９４２０，
９７６８００ｎｇ／ｍＱ Ｏ，８０２０，８
５３４００ｎｙ／ｍＱ Ｏ，５３２０，５
２７２００ｎｇ／ｍ（１０，３３８０，３１７１０Ｏｎ
９／ｍｄ Ｏ，２３００，１８９５０ｎｇ
／ｍＱ ０．２２４ ０−１９
７２０ ｎｇ／ｍＱＯ，２１８０，２０にのＥＬＩＳＡ
の特異性を検査するために、４００ｎｇ／ｍＱおよび８
００ｎｇ／ｍＱ、のＰＵＫを含有する２種の溶液に種々
の濃度のウロキナーゼ（＋２０ｎｇ／ １１１＋２ Ｕ
Ｋ； ５０ｎｇ／ ｍＱ ＵＫ ； １１００ｎ／ ｍ
Ｑ ＵＫ ； ２００ｎｇ／ ｍＱ ＵＫ；４００ｎ９
／ｍＱ ＵＫ ； ８００ｎｇ／ｍＯＵＫ ； １ ｕ
ｇ／ｍＱ ＵＫおよび５μｇ／ ｍ Ｑ Ｕ Ｋ ）
を加えた。この検査においてＵＫの添加によっては測定
値は損われないことが示された。この結果により、この
アッセイの特異性、従ってＰＵＫに対するここに記載さ
れる方法により得られた抗体の高い特異性が証明される
（第２表参照）。
１３１２００ ｎｙ／ｍＱ Ｏ，９４２０，
９７６８００ｎｇ／ｍＱ Ｏ，８０２０，８
５３４００ｎｙ／ｍＱ Ｏ，５３２０，５
２７２００ｎｇ／ｍ（１０，３３８０，３１７１０Ｏｎ
９／ｍｄ Ｏ，２３００，１８９５０ｎｇ
／ｍＱ ０．２２４ ０−１９
７２０ ｎｇ／ｍＱＯ，２１８０，２０にのＥＬＩＳＡ
の特異性を検査するために、４００ｎｇ／ｍＱおよび８
００ｎｇ／ｍＱ、のＰＵＫを含有する２種の溶液に種々
の濃度のウロキナーゼ（＋２０ｎｇ／ １１１＋２ Ｕ
Ｋ； ５０ｎｇ／ ｍＱ ＵＫ ； １１００ｎ／ ｍ
Ｑ ＵＫ ； ２００ｎｇ／ ｍＱ ＵＫ；４００ｎ９
／ｍＱ ＵＫ ； ８００ｎｇ／ｍＯＵＫ ； １ ｕ
ｇ／ｍＱ ＵＫおよび５μｇ／ ｍ Ｑ Ｕ Ｋ ）
を加えた。この検査においてＵＫの添加によっては測定
値は損われないことが示された。この結果により、この
アッセイの特異性、従ってＰＵＫに対するここに記載さ
れる方法により得られた抗体の高い特異性が証明される
（第２表参照）。
第２表
Ｑｎｇ／ｍＱ
２０ ｎｙ／ｍＱ
５０ｎｇ／ｍＱ
１００ ｎｇ／ｍＱ
２００ ｎｇ／ｍＱ
４００ ｎｇ／ｍＱ
８００ ｎｇ／ ｍＱ
ｌμｇ／ｍＱ
５μｇ／ｍＱ
２回測定
０．８０２ ０．７５３
０．７２１ ０．７４３
０．７７８ ０．７２３
０．７５０ ０．７８３
０．７６９ ０．８２６
０．７９４ ０．７６４
０．７４９ ０．６４４
０．７２９ ０．７０９
０．８３４ ０．８００
２回測定
０．５３２ ０．５２７
０．５３５ ０．４７９
０．４７１ ０．４７９
０．５３３ ０．５２４
０．５１１ ０．４８９
０．５１９ ０．５０６
０．４３８ ０．５１９
０．４４９ ０．５６２
０．７６４ ０．７１４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）プロウロキナーゼの１４０〜１８０領域からのアミ
ノ酸配列を有する４〜４０個のアミノ酸を含有するペプ
チド。 ２）プロウロキナーゼの切断部位１５８／１５９（−Ｌ
ｙｓ／Ｉｌｅ−）を含有する請求項１記載のペプチド。 ３）好ましくはＣ−末端またはＮ−末端で付加的にチオ
ール基を含有する請求項１記載のペプチド。 ４）下記アミノ酸配列 ＲＰＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴ、 ＬＲＰＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴＴまたは ＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴＴＩＥを有する請
求項１記載のペプチド。 ５）遊離のスルフヒドリル基を有するシステインをＮ−
末端またはＣ−末端で含有する請求項１記載のペプチド
。 ６）請求項１記載のペプチドに対する抗体を含有するプ
ロウロキナーゼを測定するための試薬。 ７）抗体の調整への請求項１記載のペプチドの使用。 ８）保護されたアミノ酸誘導体またはペプチドセグメン
トを溶液中でまたは固相上で相互に結合させ、そして保
護基を除去しならびに固相の場合は担体樹脂を取り外す
ことにより請求項１記載のペプチドを得ることからなる
請求項１記載のペプチドの製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3827416.7 | 1988-08-12 | ||
| DE19883827416 DE3827416A1 (de) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Peptide mit prourokinase-sequenzen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung, antikoerper gegen diese peptide und mittel enthaltend diese antikoerper zur bestimmung von prourokinase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0291097A true JPH0291097A (ja) | 1990-03-30 |
Family
ID=6360735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20705689A Pending JPH0291097A (ja) | 1988-08-12 | 1989-08-11 | プロウロキナーゼ配列を有するペプチドおよびその製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0358938A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0291097A (ja) |
| AU (1) | AU3951789A (ja) |
| DE (1) | DE3827416A1 (ja) |
| DK (1) | DK396189A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2686085B1 (fr) * | 1992-01-10 | 1995-08-04 | Agronomique Inst Nat Rech | Peptides representant des fragments du cmp, anticorps diriges contre lesdits peptides, et leurs utilisations. |
-
1988
- 1988-08-12 DE DE19883827416 patent/DE3827416A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-08-08 EP EP89114615A patent/EP0358938A3/de not_active Withdrawn
- 1989-08-11 JP JP20705689A patent/JPH0291097A/ja active Pending
- 1989-08-11 AU AU39517/89A patent/AU3951789A/en not_active Abandoned
- 1989-08-11 DK DK396189A patent/DK396189A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0358938A3 (de) | 1990-08-01 |
| DE3827416A1 (de) | 1990-02-15 |
| EP0358938A2 (de) | 1990-03-21 |
| DK396189A (da) | 1990-02-13 |
| AU3951789A (en) | 1990-02-15 |
| DK396189D0 (da) | 1989-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5516639A (en) | Antibodies specific for human prostate glandular kallkrein | |
| US4107298A (en) | Antigenically active polypeptide and a process for its preparation | |
| US6441141B1 (en) | Synthetic peptides, antibodies against them and their use | |
| US5296354A (en) | Kit for the specific assay of angiotensin II | |
| US5449601A (en) | Process for the identification or determination of proteins and its applications | |
| CS256960B1 (en) | Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production | |
| US6538113B1 (en) | Methods of obtaining antibody directed against prothrombin fragments F2/F1+2 | |
| CA1341014C (en) | Hcg peptides for use in antibody purification procedures | |
| US5340718A (en) | Method for assaying a human muscular dystrophy protein | |
| EP0257421B1 (en) | Antibodies for use in determining human glycoalbumin | |
| US4327075A (en) | Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation | |
| JPH09249699A (ja) | 抗ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた測定試薬及び測定方法 | |
| JPH0291097A (ja) | プロウロキナーゼ配列を有するペプチドおよびその製法 | |
| US5254672A (en) | Synthetic peptides which contain sequences from factor VIIa, and the use thereof | |
| JP2634683B2 (ja) | フイブリンに対する抗体；抗体の調製に適当な免疫原ペプチド、フイブリンを決定する方法および抗体に基づく製剤 | |
| US6222011B1 (en) | Antigenic peptides | |
| JP4258271B2 (ja) | ポリアミノ酸担体 | |
| JPH01199996A (ja) | ペプチドおよびその製法 | |
| JP3353133B2 (ja) | 抗体およびこれを使用した測定法 | |
| Tsung et al. | The preparation and tryptic hydrolysis of S-aminoethylated tobacco mosaic virus protein | |
| DESVAGES et al. | Structural Studies on Yeast 3‐Phosphoglycerate Kinase: Identification by Immuno‐affinity Chromatography of One Glutamyl Residue Essential for Yeast 3‐Phosphoglycerate Kinase Activity. Its Location in the Primary Structure | |
| RU2062473C1 (ru) | Иммунометрический способ определения хорионического гонадотропина человека | |
| EP0705841A1 (en) | Peptides havng antigenic activity against hepatitis A virus (HAV) | |
| CA2165672C (en) | Antibodies specific for human prostate glandular kallikrein | |
| JP2980991B2 (ja) | 癌遺伝子Ｋ−ｓａｍの遺伝子産物に対する抗体、その用途およびペプチド |