JPH0288960A - 酵素センサ用電極および酵素センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素の特異的な触媒作用を利用して血中、尿
中などの生体化学物質濃度を電気化学的に検出すること
のできる新規酵素センサおよび当該センサ用電極に関す
るものである。

〔従来技術〕

成人病早期発見の要求が多くなっている現在において、
簡便にして迅速、低コストで疾病の診断ができる有力な
酵素センサ、たとえばグルコースセンサ、コレステロー
ルセンサ、尿酸センサ、乳酸センサなど酸化還元酵素と
組合わせたものに適用可能な酵素センサが待望されてい
る。

酵素センサとは、酵素と基質との特異的な反応による変
化（即ち、物理的変化、化学的変化、電気的変化など）
をトランスジューサにより検出することをその基本的原
理とするものである。このうち酵素反応により生成もし
くは消費された物質をトランスジューサにより電気的に
検出する酵素電極よりなる酵素センサは、臨床検査の分
野で広く使用されている。その検出の方法としては、過
酸化水素電極、酸素電極に代表されるアンペロメトリッ
クなもの、ガラス電極、ｒ　Ｓ　Ｆ　ＥＴ　（ｉｏｎ３
ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｆｉｅｌｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｒａ
ｎｓｉｓｔｏｒ）に代表されるポテンショメトリックな
ものの２通りがある。

一方、近年アンペロメトリックな測定法の１つにメディ
エータ（電子伝達体）を使った酵素電極よりなるセンサ
の報告がなされている。これは、前述の過酸化水素電極
、酸素電極を使った測定法に比べ以下の（１）および（
２）の点で優れているとされている。

（１）ダイナミックレンジが広い、（反応に酸素が関与
しないため高濃度において酸素欠乏が起きない、） （２）応答が早い。

メディエータの原理を、基質としてグルコースを、酵素
としてグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）を、メディエ
ータとしてフェロセンを用いた場合を例にとって以下に
説明する。

ＣＯＤの補酵素ＦＡＤは、グルコースの存在下で、酸化
体から還元体へと変化する。

ＧＯＤ−ＦＡＤ＋ＧＩｕｃｏｓｅ　→ＧＯＤ−ＦＡＤＨ
ｇ＋ＧＩｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ　（］）ここで生成
した還元体Ｃ０Ｄ−ＦＡＤＨ，は、フェロセンの酸化体
により再び元の酸化体へと戻される。

００口・ＦＡＤＨｇ＋２Ｍ”　　→　ＧＯＤ−ＦＡＤ＋
２Ｍ＋２Ｈ”　　　　　（２）（式中、台はフェロセン
を、ｒはフェリジニウムイオンを示す） この還元されたフェロセンは、それ自身の酸化電位以上
の電位を印加されることにより再び酸化体となる。

２Ｍ−２ｅ−→２Ｍ’　　　　　　　　　　　　　　　
　（３）（式中、河はフェロセンを、ｈ゛は前記と同意
義）この時の電子の量を検出することにより基質である
グルコースの濃度を求めることを原理としている。

メディエータを溶液系の中に溶かして生体化学物質濃度
を測定することも可能であるが、実用性を考慮した場合
、電極上にメディエータを固定化した方がコストの面に
おいて有利なだけではなく測定操作法においても非常に
簡便なセンサとなり得る。

〔発明が解決しようとする課題］ メディエータの固定化法としては、現在までに次のよう
な方法が報告されている。

（１）　　バルク状の金属、酸化スズ、酸化イリジウム
などの酸化物などの電極上にメディエータ溶液を落とし
込み溶媒を除去することによって固定化する方法。

（２）バルク状の金属、酸化スズ、酸化イリジウムなど
の酸化物などの電極上に紫外線硬化樹脂によってメディ
エータを固定化する方法（特開昭５７６９６６７号公報
）。

（３）グラファイト粉末とメディエータ粉末（たとえば
、ベルリングリーン）を充分混合し円盤状にプレス成型
することにより固定化する方法（特開昭５７−１２３５
９号公報）。

（４）　　スパッタ、蒸着などにより形成した薄膜電極
上（チタン、カーボン、白金など）にラングミュラープ
ロジェット法（ＬＢ法）によりメディエータを固定化す
る方法。

しかし、上記の（１）〜（３）の手法は、バルク状の金
属を電極として用いているため小型化に限界があるばか
りでなく、大量生産に向いていない。（４）の手法は小
型化は可能であるが、ＬＢ膜累積の工程において細心の
注意が必要となってくる。

また、上記の（１１〜（４）の手法によって製造された
酵素センサ用電極ひいては酵素センサは、電極間のばら
つきが大きい傾向があるというｒｊＩａ点がある 従って、本発明の目的は小型化が可能で、かつ大量生産
の可能な酵素センサ用電極および酵素センサを提供する
ことである。

本発明の他の目的は電極間のばらつきが小さく、応答時
間が速く、かつダイナミックレンジの広い酵素センサを
提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、メディエータおよび導電性物質よりなる電極
部をスクリーン印刷法にて絶縁基板上に設けてなる酵素
センサ用電掻および当該酵素センサ用電極上の電極部上
に酵素を固定化してなる酵素センサに関する。

即ち、本発明はメディエータを分散した導電性ペースト
にて、スクリーン印刷法を用いて絶縁基板上に電極部を
製作することにより電極部製作と同時にメディエータの
固定化を行った酵素センサ用電極であり、また当該電極
を使用した酵素センサである。

本発明において、スクリーン印刷は自体既知の方法に準
じて行えばよく、たとえばスクイジーとしてはゴムなど
が使用され、またスクリーンとしてはシルクスクリーン
、ペンキスクリーン、ステンシルスクリーンなどの自体
既知のものを使用すれば十分である。スクリーンの網目
の大きさは、通常ｉｏｏ〜４００、好ましくは２００〜
３００メツシユ、さらに好ましくは約２５０メツシユで
ある。

スクリーン印刷に使用されるメディエータを分散した導
電性ペーストは、メディエータが分散された導電性のも
のでスクリーン印刷が可能なものであれば特に制限はな
く、その２５℃における粘度は、通常５０〜２０００ボ
イズ、好ましくは１００〜１０００ボイズである。

当８亥ペーストは、通常メディエータ、バインダ用樹脂
、導電性物質、溶媒よりなるペースト組成物である。

バインダー用樹脂はメディエータおよび導電性物質を固
定化するために配合されるものであり、次の条件を満た
すものが好ましい。

（１）　　メディエータおよび導電性物質を固定化しう
ること。

（２）溶媒の存在下または不存在下にスクリーン印刷可
能な粘度を提供しうるちのであること。

好ましいバインダー用樹脂としては、アクリル樹脂、ポ
リビニルブチラール樹脂、酢酸ビニル共重合体樹脂、ポ
リアミド樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスルホン樹脂、
ポリカーボネート樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリウレ
タン樹脂、石油系樹脂、合成ゴム、ポリオレフィン樹脂
、セルロース樹脂等の熱可塑性樹脂類、フェノール樹脂
、メラミン樹脂、アルキッド樹脂、エポキシ樹脂等のイ
オン重合性樹脂類、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ
アクリレート樹脂、ウレタンアクリレート樹脂等のラジ
カル重合性樹脂類等があげられ、これらは単独または２
種以上併用して使用される。また、必要に応じて、溶剤
、熱硬化促進剤、架橋剤、光開始剤、重合禁止剤、カッ
プリング剤、消泡剤、分散剤等を添加してもよい。

メディエータは、酸化還元酵素の電子伝達体として機能
するレドックス化合物であれば特に制限はなく、具体的
にはフエロモン、フェロセン誘導体（たとえば、１．１
°ジメチルフエロセン、フェロセンカルボン酸）、ベン
ゾキノン、メチレンブルー、２．６−ジクロロインドフ
ェノール、金属シアン化錯体（たとえば、フェロシアン
化カリウム、ルテニウムパープルなどが例示される。

また、電極部に導電性をもたせるために導電性物質が配
合される。導電性物質は粉末状（特に、平均粒子径０．
１〜１００μｍのもの）であることが好ましく、具体的
化合物としては、カーボン類、特にグラファイト、カー
ボンブラック、これらの混合物が好適なものとして例示
される。

カーボンブラックとグラファイトとの配合割合は、カー
ボンブラック１重量部に対してグラファイト１〜８重量
部、好ましくは２〜６重量部、さらに好ましくは４重量
部程度である。

バインダー用樹脂は、当該導電性ペースト中の固形分重
量の全重量に対して、通常４０〜８０重量％、好ましく
は４０〜７０重量％、さらに好ましくは４０〜６０重量
％含有されていることが好適である。

溶媒の配合量は、バインダー用樹脂１重■部に対して、
通常０．５〜４重量部、好ましくは１〜３重量部である
。たとえばボエステル樹脂であるバイロン（ＲＶ１０３
、東洋紡社製）の場合、バイロン１重景部に対してブチ
ルセロソルブアセテート２重量部程度が配合される。

導電性物質は、当該導電性ペースト中の固形分重量の、
全重量に対して２０重量％以上、好ましくは３０重ロン
以上、さらに好ましくは３０〜４０重量％含有されてい
ることが好適である。

メディエータの配合量は多いほど好ましいが、導電性と
の関係から導電性物質１重量部に対してメディエータは
０．５〜５重量部、好ましくは１〜４重量部、さらに好
ましくは約２重量部程度である。なお、メディエータの
配合量を多くしたい場合には、絶縁基板上に下地電極部
を形成し、その上にペースト組成物をスクリーン印刷す
ることによりメディエータ分１ｔＨｉを上げることが可
能である。

下地電極部は、通常銀、カーボンなどの導電性物質より
なるものであり、好ましくは導電性ペースト（銀ペース
ト、カーボンペーストなど）を、スクリーン印刷するこ
とにより形成される。スクリーン印刷は本発明における
メディエータおよび導電性物質よりなる電極部の形成時
と同様にして行われる。

本発明においてメディエータおよび導電性物質よりなる
電極部は絶縁基板上に設けられる。絶縁基板としては、
たとえばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）　、Ｓ
　ｉｏｇ　、アルミナ、エポキシ樹脂、アクリル樹脂な
どよりなるものが例示される。

絶縁基板上に設けられる当該電極部は、通常作用極と対
極との２極であり、本発明における酵素センサ用電極は
当該２極の電極部でも十分である。

ところで、酸化還元電流がカソードへ流れ込むと電極界
面電位が変化するが、本発明の酵素センサは一般的に小
型であり、出力電流が小さいため、この電位の変化が精
度に大きな要因を与える。従って、第３極目として、ア
ノードに電位を与えるための基準となるべき基準（参照
）電極、たとえばＡｇ／ＡｇＣ１電極部を下地電極を介
し、または介さずに絶縁基板上に貼り付けたり、スクリ
ーン印刷法などにより形成することが好ましい。

また、本発明の酵素センサ用電極には、アノード面積を
一定にすることによりバッチ間のバラツキを小さくし、
キャリプレニ−ジョンなしで測定可能とする目的で前記
電極部上にオーバーコートを施すことが好ましい、オー
バーコートは絶縁被覆可能な樹脂を、たとえばスクリー
ン印刷法などによって印刷することによって形成される
。

本発明の酵素センサ用電極について、リン酸緩衝液中に
おいて電位走査を行ったところ、メディエータの酸化還
元電流が観察された。

さらに、上記の本発明の酵素センサ用電極の電極部上に
酵素を固定化することによって酵素センサを作成するこ
とができる。

固定化される酵素は、酸化還元酵素であれば特に制限は
なく、たとえはグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）、キ
サンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
ピルベートオキシダーゼ、オキサレートオキシダーゼ、
ラクテートオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、
マンニラトールデヒドロゲナーゼ、シトクロムｂ２、ト
リメチルアミンデヒドロゲナーゼなどが例示される。

酵素の固定化は自体既知の手段にて行えばよいが、本発
明の酵素センサの作成に当たってはスピンコーティング
、フォトリソグラフなどの手法を介して行うことが好ま
しい。

より具体的には次のようにして酵素の固定化を行うこと
が好ましい。

まず、酵素および感光性樹脂よりなる組成物を、作用極
である電極部上にコーティングする。その際、スピンコ
ーティングを行うことが好ましい。

ここで感光性樹脂としては、好ましくは感光性ポリビニ
ルアルコール（ＰＶＡ）が例示される。

コーテイング後、必要に応じてコーティング層を乾燥（
好ましくは、風乾）後、フォトリングラフの手法によっ
てパターニングを行うことによって任意の形状の酵素、
樹脂よりなる層を固定化することができる。

即ち、酵素および感光性樹脂よりなる組成物にて酵素セ
ンサ用電極の電極部形成側の全面に、スピンコーティン
グによって、酵素および感光性樹脂よりなる層を形成さ
せた後、マスクパターンを通して光照射を行い、溶媒（
たとえば、感光性ＰＤＡの場合は純水、もしくはリン酸
緩衝液など）を使用して露光硬化していない部分を溶か
して除去することによってパターニングが行われる。

本発明の酵素センサは、通常法の様にして使用される。

即ちサンプルをセンサー・センシング部に滴下し、電圧
印加後一定時間（たとえば、２０秒）の出力電流値を検
出することにより、サンプル濃度を求めることにより行
われる。

〔実施例・実験例〕

以下、本発明を実施例・実験例により説明する。

実施例１ 表１の組成比によりペースト組成物を製作する。

スクリーンとして、２５０メツシユのポリエステルのス
クリーンを使用するスクリーン印刷法により、ペースト
組成物にて絶縁基板であるＰＥＴフィルム上に２極より
なる電極部を形成し、さらにアクリレート変性ブタジェ
ン、アクリレートモノマ、光開始剤、添加剤よりなる紫
外線硬化型のペースト組成物を使用し、上記と同じスク
リーンを使用するスクリーン印刷法によりオーバーコー
トを設け、酵素センサ用電極を作成する。当該酵素セン
サ用電極は第１図に斜視図でもって示す構造を有するも
のである。第１図において１は絶縁基板、２はメディエ
ータおよび導電性物質よりなる電極部（作用極）、２”
はメディエータおよび導電性物質よりなる電極部（対極
）、３はオーバーコートである。

Ｃ以下、余白） 表１ ＊ＲＶＩＯ３：ポリエステル樹脂（東洋紡製バイロン、
Ｔｇ＝４７°Ｃ） ＢＣＡニブチルセロソルブアセテート バインダーの硬化後ＣＯＤを感光性ポリビニルアルコー
ル（ＰＶＡ）水溶液に分散した溶液を電極部（作用極に
相当する電極部）上にスピンコーティングし、風乾後、
フォトリソ技法によりパターニングを行って酵素センサ
を作成した。上記溶液のパラメータは、表２の通りであ
る。

表２ このようにして製作された本発明のグルコースセンサと
従来品、即ちペーパー法（ペーパー上に酵素及び色素を
固定化し、酵素反応により生成した物質による色素の色
の変化を検出する原理）によるグルコースセンサとの特
性を対比した結果は次の通りである。

（１）応答時間； 実施例１の酵素センサ・・１分以内 従来の酵素センサ・・２分 測定方法・・センサーにサンプルを滴下。１分後にサン
プルふき取り、２分 後の色の変化を目視、あるいは 比色計により検出する。

（２）ダイナミックレンジ： 実施例１の酵素センサ・・０〜８００　ｍ　ｇ　／　ｄ
　１従来の酵素センサ・・０〜６００　ｍ　ｇ　／　ｄ
　１測定方法・・上記（１）と同じ。

（３）バッチ間バラツキ： 実施例１の酵素センサ・・Ｃｖ％＝３％以内従来の酵素
センサ・・Ｃ■％＝５％ 測定方法・・上記（１）と同じ。

実施例２ 実施例１と同様の方法により２極よりなる電極部を形成
する。その後、表３の組成をもったＡｇ／Ａｇ０１ペー
ストをスクリーン印刷する。

かくして製作された酵素センサ用電極は第２図に斜視図
でもって示す構造を有するものである。

第２図においてｌは絶縁基板、２はメディエータおよび
導電性物質よりなる電極部（作用極）、２゛はメディエ
ータおよび導電性物質よりなる電極部（対極）、１２は
Ａｇ／ＡｇＣｊ！電極部、３はオーバーコートである。

表３ ＊ＲＶ１０３：ポリエステル樹脂（東洋紡製バイロン） ＢＣＡニブチルセルソルブアセテート 実施例３ 表４の組成のカーボンペーストを実施例１と同様な方法
にてＰＥＴフィルム上にスクリーン印刷することにより
下地電極部を製作する。その下地電極のうちの１つの電
極部の一部に表５の組成物をスクリーン印刷することに
よって作用極とする。

もう一方の電極は、対極とする。さらに実施例２と同様
の方法によりＡｇ／ＡｇＣ１電極部をスクリーン印刷法
により形成する。酵素ＣＯＤを、実施例１と同様の方法
により作用極に相当する電極部上に固定化して酵素セン
サを作成する。当該酵素センサは第３図に斜視図および
第４図に断面図をもって示す構造を有するものである。

第３図および第４図において１は絶縁基板、４はカーボ
ンペーストよりなる下地電極部（作用極）、４゛はカー
ボンペーストよりなる下地電極部（対極）、１２はＡｇ
／Ａｇ（ｌ電極部、３はオーバーコート、２はメディエ
ータおよび導電性物質よりなる層、５は酵素、樹脂より
なる層を示す。

（以下、余白） 表４ 表５ （以下、 余白） ＊ＲＶ６３０　：ポリエステル樹脂（東洋紡製バイロン
、Ｔｇ＝７°Ｃ 当該酵素センサの特性は、実施例１の酵素センサと比較
し、感度の面で優れていた。これは、下地電極を設ける
ことにより電極抵抗が小さくなりＩＲドロップが、小さ
くなったためであると考えられる。この事により、電極
間ばらつきも小さくなる可能性がある。

〔発明の効果〕

本発明の酵素センサ用電極はその製作法としてスクリー
ン製作法を使用しているため、天険生産が可能であるば
かりでなく製作した電極間のばらつきも小さい、これは
、電極部製作とメゾイエ・−夕固定化の工程を同一工程
としたことによるものと考えられる。

また、本発明の酵素センサは応答性が速く、ダイナミッ
クレンジが広い。

なお、本発明の酵素センサは酵素の固定化法として感光
性樹脂による包括固定法を用いた場合、フォトリソ技法
と組合わせることにより必要な部分にのみ酵素の固定化
が可能となり、２種類以上の酵素が容易に固定化され、
従って摺合化酵素センサの製作も可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の酵素センサ用電極の一実
施例の斜視図であり、第３図は本発明の酵素センサの一
実施例の斜視図であり、第４図は第３図の酵素センサの
のｘ−ｘ’における断面部である。 １・・絶縁基板 ２・・メディエータおよび導電性物質よりなる電極部（
作用４ｉ） ２°・・メディエータおよび導電性物質よりなる電極部
（対極） １２・・Ａｇ／ＡｇＣ１電極部 ３・・オーバーコート ４・・下地電極部 ５・・酵素よりなる層 第３図 第４図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）メディエータおよび導電性物質よりなる電極部を
   スクリーン印刷法にて絶縁基板上に設けてなる酵素セン
   サ用電極。
2. （２）請求項（１）記載の酵素センサ用電極の電極部上
   に酵素を固定化してなることを特徴とする酵素センサ。