JPH0283395A - 架橋した蛋白質・ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は架橋した蛋白質・ペプチドの製造方法および該
方法を用いて架橋させた蛋白質・ペプチドに関する。更
に詳しくは、蛋白質・ペプチドおよびフラビン色素を含
む溶液に光を照射することによって架橋した該蛋白質・
ペプチドを製造する方法、および該方法を用いて架橋さ
せた蛋白質・ペプチドに関する。

本発明において蛋白質・ペプチドとは少なくとも１つの
ペプチド結合を有するアミノ酸の重合体を意味する。

［従来技術］ 従来より、酵素等の固定化や安定化、あるいは電子顕微
鏡観察のための試料作製等に、蛋白質の架橋技術が用い
られている。蛋白質の架橋に用いられる試薬としては、
例えばグルタルアルデヒド。

ビスジアゾベンジジン、ヘキサメチレンジイソシアナー
１−．Ｎ、Ｎ“−エチレンビスマレイミド等のような複
数の反応性官能基を有する多価β飾試薬が知られている
。しかしながら、これらの試薬を用いた反応は比較釣部
しい条件で行なわれるため、架橋反応による蛋白質の変
性、酵素の失活等がしばしば認められた。また、これら
の試薬はヒトに対する毒性の強いものが多く、特にビス
ジアゾベンジジンの調製の際に用いるベンジジンは、そ
の強い発癌性が原因で、市販が中止されるに至っている
。

一方、アクリルアミドの重合反応の際に、重合促進剤と
してリボフラビンとＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’テトラメチルエ
チレンジアミンを用いる光重合法が知られている。この
ような反応は、光を当ててはじめて反応が開示されるた
め、反応の調節が容易である等の利点があるにもかかわ
らず、リボフラビン等のフラビン色素を蛋白質の架橋反
応に応用した例は知られていない。

［発明の目的］ 本発明の目的は、蛋白質・ペプチド溶液にフラビン色素
を共存させ、光を照射し、架橋した蛋白質・ペプチドを
製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、以下の説明から一層明らかになる
であろう。

［発明の構成］ 木発明者らは、従来法よりもすぐれた架橋した蛋白質・
ペプチドの製造法を開発すべく鋭意研究した結果、蛋白
質・ペプチド溶液にフラビン色素を共存させ、光を照射
ざぜることにより、驚くべきことに該蛋白質・ペプチド
が架橋されることを見出した。該方法により架橋された
蛋白質・ペプチドは、架橋前のものと同様な高次構造、
活性または物理化学的性質を保持していることを見出し
、本発明に到達したものである。

すなわち、本発明は蛋白質・ペプチド溶液にフラビン色
素を共存させ、光を照射し、架橋した蛋白質・ペプチド
を製造する方法である。また本発明は蛋白質・ペプチド
溶液にフラビン色素を共存させ、光を照射することによ
って得られた架橋された蛋白質・ペプチドを包含する。

また本発明は該蛋白質・ペプチドの有する高次構造、活
性または物理化学的性質を破壊Ｕずに該蛋白質・ペプチ
ドを架＋ｉさぜることを特徴とする。

本発明にあけるフラビン色素としては、下記−最大で表
わされる骨格を有する化合物か使用される。

り より置体的には下記−最大で表わされる化合物が好まし
い。

キシ基、アデノシン−５°−シフＡスフエイト基。

フォスフエイト基、アルキルアミノ基、アルコキシ基、
オキソ基、エステル基、カルボキシルホルミル基，酸ア
ミド基，ニトロ基，シアノ基又）はハロゲンで置換され
ているｃ１〜ＣＩＯのアルキル基が用いられる。好まし
いものは、 Ｒ１及びＲ４においてアルキル基としてはＣ１〜Ｃ５の
直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、メチル基，エチル
基，プロピル基，イソプロピル基。

ブチル基，　ｉｓｏ　−、　ｓｅｃ　−、　ｔｅｒｔ−
ブチル基，ペンチル基，　ｉｓｏ　−、　ｎｅｏ　−、
　ｔｅｒｔ−ペンチル基が用いられる。好ましいものは
メチル基，エチル基又はプロピル基である。

Ｒ１及びＲ４において置換アルキル基としては、少なく
ともＮ−に直結するメチレンを有し、ヒドロ置換基であ
る。

Ｒ２．　Ｒ３．　ＲＳ及びＲ６の電子供与基としてはア
ルキル基，アルキルアミノ基又はアルコキシ基が適当で
ある。好ましいものは、メチル基，エチル基。

ジメチルアミノ基，メトキシ基又はエトキシ基がある。

Ｒ２，　ＲＬ　ＲＳ及びＲ６の電子吸引基としては、カ
ルボニル基を含む Ｒ−Ｃ−、　　Ｒ−Ｃ−０−、　　−Ｃｏｏｌ七　　−
　Ｃ　Ｈ　０Ｑ 又はＲ−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−Ｒがあり、この場合
Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基などを表わし、 ない置換基としてニトロ基、シアン基又はハロゲンがお
る。ハロゲンとしては−α、　−Ｂｒ又は−Ｉが好まし
い。

更に具体的にはりホフラビン、フラビンアデニンジヌク
レオチド、フラビンモノヌクレオチド。

ルミクロム、ルミフラビン、３Ｎ−カルホキジメチルル
ミフラビン、ロゼオフラビン等で代表される、７．８−
ジメチル−１０−アルキルイソアロキサジン又は７．８
−ジメチル−１−アルキルアロキサジンの誘導体が用い
られる。なかでも３Ｎ−カルポキシメヂルルミフラビン
、リボフラビン、ルミフラビンがとりわけ好ましい。こ
れらのフラビン色素は、１種のみを用いても、２種以上
を併用してもよい。

本発明において照射する光としては、少なくとも用いた
フラビン色素が吸収を有する波長の光を含んでいる光を
用いる必要がある。フラビン色素は一般に３００〜６０
０ｎｍの波長の光の吸収を有しており、この範囲の波長
の光を使用することができる。酸化型フラビンが特異的
な吸収を有する４５０ｎｍ付近の波長を含んでいる光を
用いることが好ましい。また、このような光としてはレ
ーザー光を用いるのが好ましく、アルゴンランプより発
けられる４８８ｎｍの波長を有するレーザー光の使用が
とりわけ好ましい。光照射は、目的とする架）・ｎ度が
得られるのに必要な時間だけ行えばよく、温度上界によ
る蛋白質・ペプチドの変性を防ぐ意味で、必要最小限の
照射にとどめるのが好ましい。

架橋の程度は、加えるフラビン色素の濃度、照射する光
の強度、照射時間等によって、おる程度の調節が可能で
ある。適当な架橋度を有する蛋白質・ペプチドのその他
の蛋白質・ペプチドからの分離精製は常法に従えばよい
が、分子量の違いによって分離が可能なゲル）濾過法を
用いるのが好ましい。

本発明において使用する蛋白質・ペプチドは少なくとも
１つのペプチド結合を有するアミノ酸の重合体で必れば
よく、免疫グロブリンまたは酵素に使用することができ
る。よって免疫グロブリンＧまたはその限定分解物に使
用できる。

本発明における蛋白質・ペプチド溶液は蛋白質・ペプチ
ドを該蛋白質・ペプチドに不活性な水または有機溶媒に
溶解したものであればいかなるものでもよい。

本発明によって得られた蛋白質・ペプチドの架＋ｉ物の
性質は、以下のようにして調べることができる。Ｎ　Ｍ
　Ｒスペクトル、ＣＤスペクトル、蛍光スペクトル等の
機器分析的手法を用いることにより、架橋された蛋白質
・ペプチドの高次構造を栗１玉前の状態と比較すること
ができる。ま１１．−　％該蛋白質・ペプチドが酵素で
ある場合には、その非活性を測定すればよいし、免疫グ
ロブ１ノンヤその限定分解物については、抗原との結合
能や補体の活［生化能を測定すればよい。免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）はそのＦｃ領域と補体蛋白質Ｃｌ　４　
との相互作用については厳密な蛋白質の高次構造が要求
される。従って、たとえばＩ（ＩＧのＦｃフラグメント
を架橋ざぜたものが、補体系の活性化能を有している場
合、架橋によってＦｃフラグメントの高次溝）告は損な
われていないものと考えて良いわけでおる。

［発明の効果］ 以上、本発明によれば、蛋白質・ペプチド溶液にフラビ
ン色素を共存さけ、光を照射し、該蛋白質・ペプチドを
架橋させる方法を提供することか可能になる。また、本
発明の架橋方法を用いれば、活［生を保持したままで酵
素蛋白質を架橋させたり、高次構造を保持したままでＩ
（ＩＧ等の蛋白質を架橋させることが可能となり、従っ
て、工業的に有利な安定な架橋蛋白質の提供が可能にな
る。

［実施例］ 以下、実施例をめげて本発明について詳細（こ説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ （光とフラビン色素を用いた蛋白質の架橋）３Ｎ−カル
ボキシメチルミフラビン １１８ｍｍｅｒｉｃｈの方法［Ｐ．　Ｈｅｍｍｅｒｉｃ
ｈ，　Ｈｅｌｖ．　Ｃｈｌｍ。

ＡＣｔａ，　４７，　４７２　（１９６４）］を用いて
ルミフラビンより合成した。ルミフラビン及びリボフラ
ビンはＳｉｇｍａ社のものを用いた。ＩＣＩＧのＦａｂ
及びＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ社
）をＰｏｒｔｅｒの方法［Ｒ．Ｒ．　Ｐｏｒｔｅｒ，　
Ｎａｔｕｒｅ，　１８２，　６７０　（１９５８）］に
従ってパパイン（　Ｓ　ｉ　ｊ；１ｍａ社）分解するこ
とにより調製した。卵白リゾチームはＳｉｇｍａ社のも
のを用いた。

１（ＩＧ，　Ｆａｂフラグメント、　Ｆｃフラグメント
又は卵白リゾチームを、最終濃度０．３ｍｆ（になるよ
うにそれぞれ３６０μｌの生理食塩水に溶解させ、３Ｎ
カルボキシメチルルミフラビン 又はリボフラビンを最終）農度０．２ｍ？になるように
添加する。この水溶液をカラス製のセルに入れて、波長
４８８ｎｍのアルゴンレーザーを約１０秒間照射を行っ
た。レーザーは、ＮＥＣ製ＧＬＧ３３００型レーザ発生
装置を用いて発生させ、０．　５Ｗの出力で照射を行っ
た。レーザー照射後のサンプルについて、還元条件にて
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１
０％）を行ったところ、ＩｇＧ。

Ｆａｂフラグメント、　Ｆｃフラグメント、卵白リゾチ
ム，いずれのサンプルについても、３Ｎ−力ルポキシメ
チルルミフラビン，ルミフラビン、リボフラビン、どの
色素を用いた場合においても、蛋白質同志の架橋が起こ
っていることが確認できた。

結果の一部を、第１，２および３図に示した。

実施例２（架橋された蛋白質の性質〉 前記実施例１で調製したＦｃフラグメントの架橋物につ
いてＮＭＲスペクトルの測定を行ったところ、架橋前の
Ｆｃフラグメントと同様なスペクトルが得られ、架橋に
よりＦｃフラグメントの蛋白質高次構造は破壊されない
ことがわかった。

また、実施例１で得られた架橋反応後のＦｃフラグメン
ト架橋物を含む溶液１０μｌとヒト全補体１０μｍ（Ｃ
ｏｒｄｉｓ　Ｌａｂｏ　Ｉｎｃ．）を混合し、３７℃で
３０分間保温した後、残存する補体活性を補体価測定キ
ット［ＮｅＷワンポイントＣＨ５０（ＫＷ）協和薬品工
業０勾］を用いて測定した。第１表に示したように、上
記Ｆｃフラグメント架橋物はヒトの補体系を活性化する
能力を有してあり、架橋によりＦｃフラグメントの蛋白
質高次構造か破壊されないことが再確認された。また、
実施例１で調製した卵白リゾチームの架橋物は、架橋前
の卵白リゾチームと同様、大腸菌細胞膜を溶解させる活
［生を有しており、架橋により卵白リゾチームの高次構
造も破壊されないことが明らかとなった。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図は、フラビン色素として３Ｎ−力ルボキシメチル
ルミフラビンを用いて架橋させたＩＣＩＧ。 ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントのＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を、第
２図は、同様な方法で架橋させた卵白リゾチームのＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を
、それぞれ示したもので必る。第３図は、フラビン色素
として３Ｎ−力ルボキシメチルルミフラビン、ルミフラ
ビンまたはりボフラビンを用いて架橋させたＦｃフラグ
メントの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る解析結果を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白質・ペプチド溶液にフラビン色素を共存させ、
   光を照射し、架橋した蛋白質・ペプチドを製造する方法
   。 ２、蛋白質・ペプチド溶液にフラビン色素を共存させ、
   光を照射することによって得られた架橋された蛋白質・
   ペプチド。