JPH0269664A - フルクトサミンの測定法及び測定用標準溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は体液中のフルクトサミンの測定法並びにこのた
めに好適な標準溶液に関する。

従来技術 糖尿病の物質代謝においては、血液中に存在する過剰の
グルコースによシ蛋白質はグリコシル化される。この際
グルコースのカルボニル基はまず遊離蛋白質アミノ基と
シックの塩基の形成下に反応する。次いでアマトリ転移
によシフルクトサミンが生じ１、これは安定なケトアミ
ン結合を示す。このケトアミン結合の安定性のためにフ
ルクトサミンの半減期は血清蛋白質の半減期と実質的に
同じである。従って、フルクトサミンはいわゆる内在性
糖尿病パラメーターとして好適である。すなわちフルク
トサミンは最近−週間の平均血抛量についての明示を可
能とする。インジケーターとしては従来ＨｂＡ１として
衆わされるグルコシルヘモグロビンがこのために測定式
れ九。このノｑラメ−ターの監視は楯代謝の長期コント
ロールには好適である。グルコシルヘモグロビンはその
長い半減期のために代謝状態の長期的変化のみを明示し
、ヘモグロビン分解の不活性さは短期間における代謝の
変動を認識でせないので、このノ９ラメ−ターは代謝状
態の中期的コントロールのために十分でない。他方、糖
尿病患者における楯代謝は血棚倉の測定により監視され
る。しかしながら、血抛量は強く変動するので、これは
医者に採血の時点の物質代謝状態に関しての情報しか与
えない。

血清中の量による短期間監視とＨｂＡ、。の測定による
長期的コントロールとの間の部分をフルクトサミンとし
てあられされるグリコシル化蛋白質の測定が満次す。血
清フルクトサミン測定が信頼のおける特異的で実施可能
な、糖尿病患者の監視法であるということは種々の研究
により示されている。

フルクトサミンの公知測定法は、例えばジョンソｙ　（
Ｊｏｈｎｓｏｎ　）等、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｓｍ、　Ａｃ
ｔａ（１９Ｂ２）、第１２７巻、第８７〜９５頁に記載
されているように、水性アルカリ性媒体中エノールホル
ムの形で存在し、かつこの形で容易に酸化されるフルク
トサミンを還元型で有色である酸化剤、例えばテトラゾ
リウム塩と反応させることに基づく。この除虫じたホル
マザン色素を測光法によシ測定し、これはフルクトサミ
ンの量に比例する。更に、ＨＰＬＣ分離によるフルクト
サミンの測定法がＪ、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ。

Ｃ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｍ　１９巻（１９８１
）、第８１〜８７頁に記載されている。

正確な測定を可能にするためには、標準溶液で検量線を
作製し、次いで試料溶液における測定の実施の際に得ら
れた値を検量曲線と比較することによシ定めることが必
要である。更に、測定法の精確さ管理及び自動分析機の
較正のためにも公知の含量の標準溶液を使用することは
必要である。この目的に使用される標準溶液は測定すべ
き測定ノ９ラメ−ターを公知濃度で含有していなければ
ならない。パラメーターの濃度は医学的に１賛な測定域
になけれはならない。

襟＊溶液の取シ扱いは簡単でなくてはならず、かつ特に
できるだ￥′ｆ長い安定性を有していなければならない
。

従来公知のフルクトサミン測定用標準′＃液はいくつか
の又は多くのこれらの前提条件を満々してい危い。こう
して、一方では血清フルクトサミン濃度をモデル物質の
形で模造する対照血清もしくは検量血清が使用される。

通常このためには１−デオΦシー１−モルホリノーフル
クトース（ＤＭＦ）が使用嘔れる。この種の第１標準は
例えば一定量のＤＭＦをフルブミン溶液中に秤量するこ
とによシ製造嘔れる。この公知標準溶液の欠点はこのモ
デル物質ＤＭＦが血清フルクトサミンとは異なる構造を
有し、従って全く異なる挙動をし、かつ異なる反応性を
有するので得られた値とＤＭＦで作製した検量線との比
較で得られ次値はあまシにも高い値を示す。従ってこの
ようにして得られた値をＤＭＦ−単位として表わす。

このａＫ１＊＊溶液に基づいて、次いで血清フルクトチ
ミンを含有する標準Ｓａを検量する。

この種の（第２〕標準浩液は＋６５℃にひける数日間の
貯蔵の後、強いフルクトサミン濃度の不安定性を示す。

同時にグルコースが存在する際、２００％以上のフルク
トサミン含量の上昇が観察され、これは継続する非酵素
的蛋白質グルコシル化に起因する。グルコーヌ遮断下に
は逆にフルクトサミン値の減少が観察される。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は容易にｓｂ扱かい可能であシ１
．その濃度が容易に測定され、かつその安定性を失なう
ことなく長期間にわたって貯蔵することのできる、血清
フルクトサミン測定のための第１及び第２標準ｍ液を製
造することである。

課題を解決するための手段 この課題は検量のために標ｆｓ洛液として、そのアミノ
酸単位が少なくとも２５％までリジン及び／又はオルニ
チンからなるペプチド又は蛋白質を含有し、かつこのペ
プチド又は蛋白質がを特徴とする、体液中のフルクトサ
ミンき測定するための方法によシ解決する。

本発明方法においてフルクトサミンとは非酵素的にグリ
コシル化された血清蛋白ＩＸ（グリコシル化血清蛋白質
）、例えばグリコシル化アルブミン、イムノグロブリン
又はフィブリノーゲン並ひに非酵素的にグリコシル化さ
れた血液蛋白質、例えばリジン−グリコシル化ヘモグロ
ビン及びグリコシル化赤血球膜蛋白質でおる。

本発明によシ、ノ９ラメーター血清フルクトサミンをグ
リコモル化血清蛋白ｊｊｊＬ類似の形で含有し、かつそ
の血清フルクトサミン値が簡単にＣ／Ｎ−分析によシ礒
認可能である標準ｍ液が提供される。本発明による標準
溶液のもう１つの利点は全く感染の危険性のない完全合
成マ）　ＩＪラックスしてこれを使用することができる
ということである。

このためには俗Ｍを人工的にグリコシル化ペプチド又は
蛋白質を製造し、かつそれぞれ所望の＃度に調節する。

添加量の変化によシ正常の及び病的血清フルクトチミン
濃度に関する標準溶液が供給？れる。グリコシル化ペプ
チド又は蛋白質の製造は例えば、デイ（Ｊ、　Ｆ、　Ｄ
ａｙ　）等著１．ｙ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２
５４　、ｌＩ＆１３．１９７９年、第５９５〜５９７頁
に記載された方法と同様にして行なうことができる。こ
の際、血清アルブミン水溶液をグルコースと２５℃で８
日間恒温保持し、引＠続き遊離グルコースを除去するた
めに透析する。

本発明による方法において、標準＃液としてアミノ酸単
位が少なくとも２５％までリジン及び／又はオルニチン
からなるペプチド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチ
ド又は蛋白質がグリコシル化をで存在する溶液を使用す
る。使用したペプチド又は蛋白質は少なくとも５個のリ
ジンもしくはオルニチン単位を、場合によシ他のアミノ
酸単位と共に有する。有利な実施形においては、ボＩＪ
　ＩＪリジンポリオルニデン又はリジンとオルニチンと
からのコポリマーを使用する。この極のポリアミノ酸は
例えばＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１巻、ｍ５４０頁、１９
５７年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓａ　Ｎ、　Ｙ、及び
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　　第８５巻、１９６２年、
第２６６頁に記載された方法によ）製か可能である。

分子量が約１０００よシ大きいペプチドを使用するのが
有利である。ペプチド又は蛋白質の大きさはあまシ厳密
ではない。しかしながら、この分子はなお可溶性でなく
てはならないので約３００．０００まで、有利には１５
０，０００までの分子量を有する蛋白質を使用すること
ができる。

使用したペプチド又は蛋白質は自体公知法でペプチド又
は蛋白質とグルコースとの恒温保持によシグリコシル化
する。ペプチド又は蛋白質のグリコシル化はすべてのア
ミン側基の５〜６５％がグリコシル化されるまでの時間
で実施するのが有利である。引き続き、反応生成物を十
分に透析する。

ペプチド又は蛋白質としては天然のものでも、合成した
ものでも使用することができる。ポリーＬ−リジン又は
ポリーＬ−オルニチンをグリコシル化型で使用するのが
特に有利であシ、この際フルクトサミン含量は簡単なＣ
／Ｎ−元素分析により測定することができる。

このペプチド又は蛋白質を水性媒体中に酊かす、ベース
ｍ液として人血清を使用することもできる。

この溶液がグルコース不含であるのが有利である、それ
というのもこのようにして長い貯蔵安定性が保証される
。従って、人血清を使用する場合、これをグルコース不
含にしなければならない。これは、人血清をグルコース
不含緩衛液に対して透析することによシ行なわれる。

史に、この標準溶液は検量血清に常用の物質を含有して
いてよい。こうして、例えば澄明化剤、安定剤、分散剤
及び保存剤を添加してよい。

澄明化剤としては例えばペンタエリスリットを使用する
。安定剤としては特に亜鉛及びＥＤＴＡが好適である。

保存剤としては例えばフェノール又は抗生物質を使用す
ることができる。史に専門家に公知の助剤を使用するこ
ともできる。

本発明によシ使用した標準溶液の製造は個々の成分の混
合によシ行なわれ、場合によシーの調節を緩衝系の添加
によシ行なう。

通常、更にこの標＊溶液を濾過して細菌不含とし、長時
間の貯蔵のために凍結乾燥することができる。

特に有利彦実施形においては、本発明による標準を酸性
溶液中、有利に６を下まわる一値、特に有利にはＯ〜４
の間の絹値で貯蔵するのが有利である。意外にも、この
標準溶液は凍結乾燥を必要とせず、かつこの標準溶液を
長時間にわたってｆ＃液の形で貯蔵することができる程
良好に安定性である。必ｐ々−値は無機又は有機酸、例
えば塩酸、クエン酸又は酢酸の象加によシ、又は緩衝剤
の添加によシ達せられる。

本発明によシ使用した標準溶液は著しく安定であり、急
勾配の検量級奢提供するので、正確で、鋭敏なフルクト
サミンの測定が可能である。

本発明による方法で得られたフルクトチミン濃度の値と
、原検量のために使用される他の公知法によシ得られ穴
値との比較は、本発明による方法が非常に簡単に実施さ
れ、かつ１４ｃｍグルコーヌー組込みによシ５１認され
た原検量と良好に一致するということを示す。

更に、本発明の課題は体液中のフルクトサミンを測定す
るための標準溶液であシ、この溶液はアミノ酸単位が少
なくとも２５％までリジン及び／又はオルニチンからな
るペプチド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチド又は
蛋白質がグリコシル化型で存在することｔＷ徴とする。

本発明によシ提供された標準溶液は天然に存在するフル
クトサミンと同じ構造を有し、こうして同じ反応性を有
する。従って、本発明による標準溶液は第２像準溶液及
び対照血清の原標準化のために、並びにフルクトサミン
測定の検量のための標準溶液として好適である。

実施例 次に５１！施ガにつき本発明の詳細な説明する。

例１ ポリリジン−フルクトサミンの製造 ２５０ｍ１丸底フラスコ中にポリーＬ−リジン（装造業
者：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ、　、***；平均分子
量３９０００）５００Ｍｇ及びＤ（→−グルコース１２
００■を秤量し、氷酢酸５ＱｍＡで懸濁させる。室温で
１時間攪拌し、これによシ均質な懸濁液が得られた。そ
の後、ゆつ〈シとピリジン５０成を摘部し、このＭ濁液
を室温で８日間攪拌し、引き続き脱塩水６００１Ｒｔ中
に注いだ。この際、透明な溶液が得られ、これを１ＣＩ
ＲＩＫＩ！縮し＋、次イテ、０．０２％ＨＣＪ　３００
　ｒｓｌテ３５０１に満たし、再び１０μに濃縮する。

この工程を０．０２％ＨＣｊで、ピリモノ臭が消えるま
で、６回線シ返した。引き続き、更に６回脱塩水で濾液
が中性になるまで洗浄した。水溶液５ＱｍＪの容量から
生成物を凍結乾燥させた。

得られた生成物のグリコシル化度をＣ／Ｎ−比を介して
元素分析によシ測定する。リジン単位に関してＣ／Ｎ比
は６．０であり、グリコシル化リジン単位に関しては６
．０である。

この例にンいてはグリコシル化度はすべてのリジン側基
の６０％である。

例２ 人血清をベースとする対照血清において、種橿の検ｌｌ
ｌ１ｆ＃液をフルクトサミンテストにおいて検量した。

試薬は次の組成を有した：０．２Ｍ炭酸塩緩衝液中非イ
オン系分散剤２．２％、ウリカーゼ４Ｕ／Ｎ、ニトロテ
トラゾリウムブルー（ＮＢＴ）　５　ｍ　ｍｏｌ　／　
ｌ　−Ａ　１０．３０種々のフルクトサミン含量の人血
清試料各５０μノをそれぞれ試薬１０００μｌと混合し
、吸光度上昇を試薬９僅に対して５４６ｎｍ、３７０Ｃ
で１０分〜１５分の間で測光機で測定した。

検量のためには次の溶液を使用した： ａ）フルクトサミン含量をあらかじめＣ／Ｎ−元素分析
によシ決定し穴ポリリジンフルクトチミン溶液； ｂ）１４Ｃ−グルコースとの恒温保持及び引き続き完全
な透析を行なつｆｃ後シンナレーションカク／ター中で
フルクトサミン含量を測定したポリリジンフルクトサミ
ン溶液； ｃ）　　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、第３
２巻、第３６８〜３７０頁（１９８６年）にょｌ）　１
４ｃ　−グルコースを用いて試験管内グリコシル化する
ことによシフルクトサミン含ｉを測定した人血清アルブ
ミン溶液 これら異々る標準溶液及び対照血清の結果を第１表にま
とめる。この結果は、呈色試験においてグリコシル化ポ
リリジンが生理学的に現われるフルクトサミンと同じ反
応性を有するということを示す。

第１表 例６ 本発明による標準溶液の安定性を種々の濃度の酸の添加
によシ実験した。このためには例１によシ製造したポリ
リジンフルクトサミンの溶液を相応する酸中に済かした
。非希釈溶液テスト列を６週間−１８℃で、他の非希釈
洛液テスト列を３週間３５℃で貯蔵した。引き続き、フ
ルクトサミン再検出を測定した。結果を第２表にまとめ
た。温度負荷下での３週間の貯蔵の後にも、検出可能な
フルクトサミン含量は実質的にほとんど変化しないこと
が示された。

第２表 例４ Ｊ　＋７−　Ｌ　−リシン−Ｌ−フェニルアラニンーフ
ルクトプミンの製造 例１と同様にしてポリーＬ−リジンーＬ−フェニルアラ
ニン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ社、平均分子量４６０
００）とグルコースとを反応場せる。

元素分析を用いて、ｃ／Ｎ−比からグリコシル化度６８
．５％が得られる。

例５ ポリーＬ−オルニチンーフルクトサミンの製造 例１と同様にしてポリーＬ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅｍｉｅ社、平均分子ｆｆ１３２０００）とグルコ
ースとを反応させる。

例６ ４！ｊ−Ｌ−オルニチン−Ｌ−ロイシン−フルクトサミ
ンの製造 例１と同様にしてポリーＬ−オルニチンーＬ−ロイシン
、１　：　１　（Ｓｉｇｍａ　ｃｂｅｍｉｅ社、平均分
子量３５０００）とグルコースとを反応ぢせる。

例７ 種々の負荷度のボＩＪ　−Ｌ　−ＩＪリシンフルクトサ
ミンの製造 例１と同様にしてポリーＬ−リジン（ＳλｇｍａＣｂｅ
ｍｉｅ社、平均分子［３９０００）とグルコースとを反
応させる。

室温で１５時間の反応時間において、元素分折からのＣ
／Ｎ−比により、５．１％までグリコシル化てれている
生成物が得られる。室温での６４時間の反応時間におい
て元素分析からのＣ／Ｎ−比によ！５８．１　％までグ
リコシル化された生成物が得られる。室温で１２０時間
の反応時間において、元素分析からのＣ／Ｎ−比によ、
０１４．８％までグリコシル化でれた生成物が得られる
。

例８ 低分子量のポリーＬ−リジンーフルクトサミンの製造 例１と同様にしてポリーＬ−リジｙ　（ＳｉｇｍａＣｈ
ｅｍｉｅ社、平均分子量３３００）をグルコースと反応
させる。

元素分析からのＣ／Ｎ−比によ多生放物は４９％までグ
リコシル化されている。

例９ 高分子ｍポリ−Ｌ−リジン−フルクトサミンの製造 例１によシボリーム−リジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｅ社、平均分子１ｔ１０２０００）をグルコースと反応
させる。

元素分析からのＣ／Ｎ−比によれば２８％までグリコシ
ル化されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、体液中のフルクトサミンを測定する方法において、
   検量のための標準溶液として、アミノ酸単位が少なくと
   も２５％までリジン及び／又はオルニチンからなるペプ
   チド又は蛋白質を含有し、かつこのペプチド又は蛋白質
   がグルコシル化型で存在する溶液を使用することを特徴
   とするフルクトサミンの測定法。 ２、体液中のフルクトサミンを測定するための標準溶液
   において、アミノ酸単位が少なくとも２５％までリジン
   及び／又はオルニチンからなるペプチド又は蛋白質を含
   有し、かつこのペプチド又は蛋白質がグリコシル化型で
   存在することを特徴とするフルクトサミン測定用標準溶
   液。