JPH02502794A - 表面活性剤とステロイドから形成される脂質小胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及Ｊ」ど１旦 本発明は脂質小胞技法の分野に関する。更に特定するに、本発明は、表面活性剤 とステロイドおよび、場合によって他の添加剤とから製せられる脂質小胞並びに その製造方法を開示する。

りん脂質を用いて製造されるリポソーム又は脂質小胞は少な（とも１９６５年以 来知られている。概ね３種のりん脂質がある。すなわち、水性層を散在させた脂 質二重層より形成される一連のほぼ球状殻を有する玉葱様構造の多重ラメラ小胞 （ＭＬＶ）　、体系づけられていない大きな水性層を囲繞する脂質二重層膜を有 する大きな（直径＞　０．４５μ好ましくは〉１μ）単ラメラ小胞（ＬＵＶ）お よび、直径が０．２μ未満であるほかはＬＵＶに　・構造が類似している小さな 単うメラ°小胞（ＳＵＶ）である、ＭＬＶの脂質二重層における脂質の量が比較 的多いため、ＭＬＶは親油性物質の封入又は輸送に最良であると認められ、Ｌｔ ＪＶはその大きな水性／脂質容量比の故に親水性分子特に巨大分子の封入に最良 と認められる。

ＳＵｖは小寸法という利点を有し、組繊細胞への比較的容易な接近が可能である けれども、その小容量によって親水性ないし水性物質の送出が痕跡量に限定され る。

既述の如く、初期の脂質小胞の研究はすべて二重層の脂質源としてりん脂質を用 いた。°この選定は、りん脂質が天然膜の主要構造成分であるということに由る 。しかしながら、リポソーム構造にりん脂質を用いることには多（の問題がある 。先ず、単離されたりん脂質は種々の酵素によって分解されやすい、第二に、最 も容易に入手されるりん脂質は天然源例えば卵黄レシチンからのもので、それは 、自触媒過酸化を受けやすい多不飽和アシル饋を含有する。過酸化が生じるとき 、リポソーム構造が破壊して、封入物質の早期解放と毒性過酸化副生物の形成を 惹起する。この問題は水素化によって排除されうるが、水素化はコスト高な方法 であり、それによって出発物質の価格が上がる。第三に、りん脂質を大規模で用 いることに関連した問題は価格である。リポソームの製造に十分純粋な卵黄レシ チン１ｋｇは現在価格が４０゜０００ドルを越えている。これは、はとんどの応 用で出発物質価格としては非常に高すぎる。

りん脂質を使用する際のコスト高と付加的問題の故に、いくつかの研究グループ は脂質小胞の製造時合成両親媒性物質を用いることを試みた００例えば、　Ｌ’ ０ｅａｌのＶａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅとその共同研究者は、りん脂質の代替物と して一連の合成重合体主にポリグリセロール誘導体を用いた。同様に、Ｋｅｌｌ ｙと５ａｎｄｏｚ社の１グループは脂肪族脂質を試みた。

近年、特にＬ’０ｅａｌグループから、表面活性剤を用いてリポソーム様多重ラ メラ脂質小胞に脂質二重層を形成しうろことの表示がいくつかあった０表面活性 剤とりん脂質はいずれも両親媒性であり、親水性ヘッド基に結合した親油性アシ ルないしアルキル基少なくとも１個を有する０表面活性剤のヘッド基はエステル 若しくはエーテル結合により１個ないし２個以上の親油性層に結合しているが、 該基にはポリオキシエチレン、ソルビタンおよびポリグリセロール誘導体の如き 親水性分子が含まれる。市販の表面活性剤として、ＢＲＩＪ系のポリオキシエチ レンアシルエーテル、５ＰＡＮソルビタンアルキルエステルおよび７ＷＥＥＮポ リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられ、すべてはＤｅｌａｗａ ｒｅ州Ｗｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ所在のＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ社から入手される 。

脂質小胞の形成で試みられた表面活性剤のほぼすべては比較的短い（１８以下） 炭素鎖を有する。これは、炭素鎖があまり長く成長すると親油性ないし疎水性領 域が大きくなって密に充填した脂質二重層を容易には形成しないことに由る。

文献に報告された、多重ラメラ脂質小胞の製造にりん脂質ではなく合成表面活性 剤を用いる実験は親水性の小分子ないし大分子の封入能力においていかなる改良 をも示さず、また脂質小胞の安定性も何ら改善されていない、特に、探索される 親水性巨大分子の搬送を達成するのにこの合成物質を以て製造される脂質小胞が 特に有用であるとの表示はない。

ＭＬＶの形成に例えどんな出発物質が用いられようと、文献に報告されている実 質上すべての小胞の製造方法は、　Ｂａｎｇｈａｍ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 、１３：　２３８−２５２（１９６５）に記載された最初のＢａｎｇｈａｍ法又 はその小変法のいずれかを用いる。この基本的アプローチは、脂質を、用いられ るいかなるコレステロールをも含む他のりん脂質物質と共に有機溶剤に溶かすこ とによって出発する。有機溶剤は、溶剤除去のため溶解した脂質上に不活性ガス （例えば窒素）流れを通すか或は熱を用いるかのいずれかで蒸発除去される０次 いで、残留物を、概ね電解質および任意の生物学上活性な親水性物質を含む水性 相で緩徐に水和して大きな多重ラメラ脂質膜構造を形成する。いくつかの変法で 、蒸発工程の間、異なるタイプの粒状物質若しくは物理的構造物を用いて親油性 層の性質を変え、且つ脂質残留物の形成を助成する。この粒状物を用いる根拠は 、脂質残留物の物理的構造を変えることによって、水和時、より良好な小胞な形 成しうるということである。最近の二つの論評刊行物５ｚｏｋａ　＆　Ｐａｐａ ｈｄｊｏ−ｐｏｕｌｏｓ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｅｎ ｇ、旦：　４６７−５０８（１９８０）および　Ｄｏｕｓｓｅｔ　＆　Ｄｏｕｓ ｔｅ　−Ｂｌａｚｙ、　Ｌｅｓ■法匹」、編集者Ｐｕ１ｓｉｅｕｘ　＆　　Ｄａ ｌａｔｔｒｅ、　Ｐａｒｉｓ所在のＴｅｃｎｉｑｕｅｓ　ｅｔ　Ｄｏｃｕｍｅｎ ｔａｔｉｏｎ　Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ、　ｐｐ、４１−７３（１９８５）には、Ｍ ＬＶの製造に用いられてきた多くの方法が要約されている。

一度ＭＬＶが製造されたなら、それは、そのプロセスの有効性を決定するのに役 立つ０．封入の有効性に関し二つの共通する測定値は対人質量と捕獲容量である 。対人質量は単に、脂質の単位質量当りの封入物質の質量であり、通常封入物質 ｇ／脂質ｇで示され、或は唯％によって示される。捕獲容量は小胞内に閉じ込め られた水分の測定値である。それは、小胞内の水性部分の量を小胞中の脂質の総 量で除して得た値であり、通常ｍ　１２　／脂質膜で示される。

典型的な物質および方法を用いて製造された多重ラメラ脂質小胞は、親水性物質 に関する通常５〜１５％程度の低い対人質量を有する。加えて、捕獲容量は通常 ２〜４ｍ２／脂質ｇ程度である。しかしながら、親油性物質に関する対人質量は はるかにより良好である。それ故、この標準的手法を用いて製造された多重ラメ ラ脂質小胞は親油性（疎水性）物質を封入するのによいが、親水性封入にはよく ない。

小さな単ラメラ小胞は非常に低い捕獲容量（約０．５ｍ　Ａ　／　ｇ　）を有し 、また親水性物質に関する非常に低い対人質量（０，５〜１％）を有する。しか しながら、脂質二重層が総容量の５０〜８７％を構成するので、ＳＵｖは親油性 物質の少量輸送の点ですぐれている。ＳＵＶの主な利点は非常に少量の親水性物 質を、ＭＬＶ又はＬＵＶが到達し得ない組織に輸送することにある。

多重ラメラ脂質小胞（多重ラメラ小胞の音波処理によって通常製造される小さな 単ラメラ小胞を包含）に関連した他の問題は製造時間と所要経費である。標準的 方法を用いるとき、現行のプロセスは緩徐であり、物質の点で比較的非効率的で あり、また出発物質の高価格故に経費面で大きな問題がある０例えば、今日用い られている方法は多重ラメラ脂質小胞の製造に２〜２０時間かかり、また多重ラ メラ脂質構造を破壊してＳＵＶにするのに必要な音波処理には更に時間がかがる 。この緩徐な処理は脂質小胞のいかなる大規模な使用にも実用的でなく、コスト 高である。

親水性物質の場合大容量を封入し且つ高い対人質量を得ることに問題がある故に 、ＬＵＶが開発された。

ＬＵＶは、巨大分子を含む親水性物質に関し高い封人質〜３５　ｍ　Ａ　／脂質 ｇ）を有するが、しかし相対的水性容量が大きいために、それは、疎水性ないし 親油性物質を封入する点でＭＬＶはど効率的ではない、事実、ＬＵＶは親水性封 入の場合でさえいくつかの問題を有する。

大きな水性中心を囲繞する単一の脂質二重層しかないので、ＬＵＶは他の脂質小 胞よりも安定性が低くなりがちで、また容易に化学的崩壊をきたしやすい、更に 、低い脂質／水性容量比によって、親油性物質の輸送又は該物質による標識にＬ ＵＶを用いることは困難になる。

従って１本発明の目的は、従前知られていたものとは別異の物質を用いた改良脂 質小胞な提供することである。

本発明の別の目的は、他の方法で用いても小胞を形成し得ない物質から脂質小胞 な製造する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、液体および親水性物質に対して高い取込み特性を有し、安 定性又はコスト上の問題を有さない安価な脂質小胞な提供することである。

本発明の更に他の目的は、種々°の親水性ないし親油性物質の搬送に用いること のできる安価な脂質小胞を提供することである。

本発明の叙上ないし他の目的および特徴は本発明の下記概要および説明から明ら かとなろう。

ｌ豆二１１ 本発明の上記目的は、コレステロール様ステロールを含むステロイドを比較的高 い濃度で存在させたときにのみ、画成せる安定な小胞を形成する長い鎖長表面活 性剤の使用によて達成される。理論的には、ステロイドは、表面活性剤分子同士 の間に入ることにより表面活性剤の充填を調節し、それによって脂質二重層を形 成させる適当な鎖配列が可能になる。しかしながら、二重層が形成するという事 実故に、理論は本発明に必要でない。

ステロイドはまた、温度が変化するとき熱互変性相転移を緩衝するという有利な 性質を有する。

本発明は、種々のポリオキシエチレン脂肪族エーテルおよびアミン表面活性剤と ２０〜５０重量％のステロイド好ましくはコレステロールの如きステロールとの ブレンドから形成される多重ラメラ脂質小胞を特徴とする０表面活性剤の各々は 、エーテル若しくはアミン結合のいずれかを介しポリオキシエチレン親水性ヘッ ド基をアシル鎖に結合させている０例えば、ポリオキシエチレン（１０）セチル エーテルでは、セチル鎖がアシル鎖であり、ポリオキシエチレン（１ｏ）がヘッ ド基である。

本発明の一つの具体化において、表面活性剤は、ポリオキシエチレン（ｎ）セチ ル（Ｃ，、飽和）エーテル又はポリオキシエチレン（ｎｏ）セ≠ルアミンよりな る群から選ばれる。ここで、ｎおよびｎｏは各々５〜１０範囲である。別の具体 化では、表面活性剤はポリオキシエチレン（ｘ、ｙ又は２）ステアリル（Ｃｐｓ 飽和）、オレイル（Ｃ１，単一二重結合）又はリルイル（Ｃ＋−２二重結合）エ ーテルよりなる群から選ばれ、各々はアシル鎖当り２〜１０のポリオキシエチレ ン単位を有する（ｘ。

ｙおよびＺは２〜１０範囲）、他の具体化では、表面活性剤は、アシル鎖当り５ 〜１０のポリオキシエチレン単位を有するポリオキシエチレン（Ｘ’　、ｙ’又 はｚ’）ステアリル、オレイル又はリルイルアミンよりなる（ｘ’　、ｙ’およ び２°は５〜１９範囲）。

本発明の更に別の具体化では、表面活性剤はポリオキシエチレン（Ｓ）エイコサ モノエノイル（Ｃ，・単一二重結合）又はポリオキシエチレン（１）エイコサジ ェノイル（Ｃｔ、２二重結合）エーテルよりなる群から選ばれ得、Ｓおよびｔは ２〜１０範囲である。アシル基当り５〜１０のポリオキシエチレン単位を有する 対応アミン、びポリオキシエチレン（ｔ゛）エイコサジェノイルアミン（Ｓ″お よびｔ゛は５〜１０範囲）も亦、本発明の脂質小胞に用いることができる。また 、二重結合の特定の位置に依拠した異なる量の不飽和を有するエーテル若しくは アミンの他の、炭素数２０のアシルポリオキシエチレン誘導体を用いることもで きる。

これらの表面活性剤はすべて同じ一般的方法によって脂質小胞に製造することが できる。先ず、表面活性剤とステロイドとを一緒にブレンディングすることによ り親油性相を形成する。もし、他の任意の親油性物質を小胞に編入し或は小胞内 に封入すべきなら、それも亦この時点で親油性混合物に含ませる。好ましい方法 では、ブレンディングを容易にするために、親油性相の温度を表面活性剤の融点 より高く保持するが、特定物質を用いた成る手順ではこれを必要としない場合も ある０次いで、親油性相と過剰の水性相とを、その混合相に十分な混合例えば半 径１ｍｍのオリフィスを通して５〜３０ｍ／ｓｅｃの流量にほぼ等しい液体剪断 、をもたらす剪断条件下で一緒にする。また、表面活性剤の融点より高い温度で 反応を実施することが好ましいが、しかしここでも十分な剪断を用いるなら、そ れは必要でない、もし、脂質小胞内に親水性物質を編入すべきなら、それを親油 性相と一緒にする前に水性相に加えるべきである。

好ましいステロイドは、コレステロール又はヒドロコルチゾンアセフートの如き ステロールであるが、類似した化学的ないし物理的性質を有する任意の他のステ ロイドを用いることができる。ステロイドは膜層の熱互変性相転移を緩衝し、そ れによって蛾適な寸法が確保され且つ高い安定性特に脂質の転移温度近傍での安 定性がもたらされる。ステロイドはまた、脂質二重層の形成に必要である。

成る用途では、脂質小胞に実効陽電荷又は陰電荷をもたらす電荷発生両親媒性物 質を混入することが有用である。好ましい陰電荷発生物質はオレイン酸、りん酸 ジセチル、バルミチン酸、硫酸セチル、レチノイツク酸、ホスファチジン酸、ホ スファチジルセリンおよびこれらの混合物である。小胞に実効陽電荷を与えるた めに、長鎖アミン類例えばステアリルアミン若しくはオレイルアミン、長鎖ピリ ジニウム化合物（例　セチルピリジニウム塩化物）、第四アンモニウム化合物又 はこれらの混合物を用いることができる。好ましい陽電荷物質は、効力のある消 毒剤ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物である。この消毒剤を小胞内の 陽電荷発生物質として用いることにより、小胞の劣化特別の利点がもたらされ、 該剤が特効性殺菌剤担体として機能する。

小胞にはまた、親水性若しくは両親媒性の目標分子も含まれつる。それは、特定 された生物学的箇所で小胞内の封入物質を解放させるために小胞な特定の目標に 方向付けるのに用いられつる。もし、親水性の目標分子が用いられるなら、それ は表面活性剤のポリオキシエチレン部分のＯＨ残基に直接又はスペーサーを介し て結合し得、或は現行の技術手段を用いてバルミチン酸若しくはホスファチジル エタノールアミンの如き分子に結合しつる。スペーサーを用いるときは、目標分 子を該化合物のアシル鎖を介し二分子膜の親水性コアに入り込ませることができ る。好ましい親水性の目標分子には単一クローン性抗体、他の免疫グロブリン、 レクチンおよびペプチドホルモンが含まれる。

親水性の目標分子に加えて、両親媒性の目標分子を用いることもできる０両親媒 性の目標分子は通常表面活性剤分子に化学的には結合せず、むしろ脂質小胞の二 重層ラメラな構成する分子の親油性若しくは疎水性部分と相互作用する。好まし い両親媒性の目標分子は中性グリコ脂質、ガラクトセレブロイド（例えば、肝性 ガラクトシル受容体用）又は、ガングリオシドの如き帯電グリコ脂質である。

本発明の方法を用いて製造される小胞は診断試験例えば免疫学系統の癒着試験に 用いることができる。小胞はまた、可視化例えば免疫反応の存在での膨潤ないし 収縮用又はラジオグラフィーないしＮＭＲ用マーカー若しくは標識として用いる こともできる。

封入しうる親水性物質には、巨大分子、ウィルス、ムルアミルジベブチドおよび リンフ才力インの如き免疫学的補助剤、インシュリン、カルシトニンおよびグル カゴンの如きペプチドホルモン、下謳体ホルモン、血管形成、上皮ないし表皮成 長因子の如き成長因子、インターロイキン−２およびインターフェロンの如きリ ンフ才力イン、ヘモグロビンおよびファクター■の如き血液蛋白、水溶性植物ホ ルモンおよび殺虫剤、ラジオヌクレオチド、放射線診断用造影染料並びに抗生物 質が含まれる。封入しうる親油性物質の例にはステロイドホルモン、有機殺虫剤 、殺菌剤、昆虫忌避剤並びに親油性ビタミンおよび誘導体が含まれる。脂質小胞 に用いつるタイプの物質に関する、より完全なリストはＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ 。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９５：　７０４−７１１（１９７６） の記事に含まれている。

下記説明および例は本発明を更に詳しく例示する。

の　　体　　の會　６ 本発明は、特定のポリオキシエチレンアシルエーテル又はポリオキシエチレンア シルアミンと２０〜５０％（重量／表面活性剤重量）のステロイド好ましくはコ レステロールの如きステロールとから形成される多重ラメラ脂質小胞を特徴とす る０本発明はまた、この多重ラメラ脂質小胞を製造するための方法を特徴とする 。物質お獲容鳳の多重ラメラ脂質小胞が達成されつる。この小胞は、今日用いら れている脂質小胞よりも、巨大分子を含む親水性物質の封入および搬送によく適 合する。更に、最も好ましい物質を用いることにより、この小胞は典型的リポソ ーム又は他の脂質小胞よりもより広いｐ）（範囲を許容するように忠われ、また 酸化系例えばベルオキシグーゼおよび食細胞の超酸化物発生系による攻撃を受け にくい。

多重ラメラ脂質小胞はまた、８発物質の価格がより低いため製造するのに安価で ある。

概括するに、本発明の多重ラメラ脂質小胞は、選定せる表面活性剤とステロイド の親油性相を形成し次いで親油性相と過剰の水性相とを剪断混合条件下で一緒に することにより製造される。もし、小胞形成に電荷発生物質を用いるなら、それ を表面活性剤と水性相との接触前に親油性相に編入する。加えて、封入すべきい かなる親油性物質をも同時に加える。

好ましい具体化では、容易なブレンディングをもたらすために親油性相の温度を 表面活性剤の融点より高く保持する０次いで、この親油性相を、剪断混合装置を 用いて過剰の水性相中に強制接触せしめる。また、加工を容易にするために通常 水性相を表面活性剤の融点より高（保持する。もし、任意の親水性物質を脂質小 胞内に封入するなら、それを水性相と親油性相との混合前に水性相に含ませる。

本発明の物質および方法を用いることの利点の一つは、使用表面活性剤が比較的 低い融点を有するので、５温性である物質を損なわずに封入しうることである。

これは、本方法および物質を多くの活性物質特に生化学的薬剤の封入に用いるこ とを可能にする。

記述の如く、アニオン若しくはカチオン両親媒性物質は小胞に編入されて実効負 電荷又は陽電荷を発生しつる。電荷発生物質は脂質構造を安定化し、迅速な分散 をもたらす、しかしながら、本発明は脂質小胞形成に電荷発生両親媒性物質の編 入を必要としない、この物質から形成される脂質小胞は標準的状況下では凝集し ないので、実効表面電荷の分散効果は他の物質を用いるときほどは必要でない、 しかしながら、電荷発生物質は高い水性容量取込みを達成するのを助成する。電 荷発生両親媒性物質の量は多くなくてよく、小胞に適当な電荷をもたらすのに０ ．５モル％〜５モル％（表面活性剤の濃度を基準）で十分である。

一度親油性相が形成したなら、゛液体剪断混合技法を用いてそれを水和すること が必要である。この種の混合をもたらしつる多種の装置が市販されている。用い ることのできる装置には、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ社製の小流動化装置「フランス」タイププレス又は、高い十分な剪断混合力と 加熱された半粘稠脂質の処理能力を示す任意の他の装置が含まれる。もし、非常 に高い剪断装置を用いるなら、粉末状脂質を、加圧下その標準的融点より低い温 度で微小乳化させることができ、シかもなお本発明の多重ラメラ脂質小胞を形成 することができる。

好ましい剪断混合装置は、四つの接線噴射投入口をもつ円筒形混合室を有する。

二つの投入口は親油性相の溶液を入れるのに用いられ、他の二つは水性相の投入 口として機能する。各相に一つとなるよう二つのポンプがあり、各々のポンプに 対向ノズルが取付けられている。

これは射出速度、相同士の比および任意時の室内量の調節を可能にする。水性相 および親油性相は、高い圧力で円筒形室に接線方向で注入され、室周囲に２相の 回転とその結果２相間の剪断を惹起する。室は、接線投入口の平面に対し垂直な 軸線方向に位置づけられた排出管を有し、これによって室内に形成された脂質小 胞の取出しが可能になり、また剪断混合装置を連続プロセスで機能させることが 可能になる。この装置および本発明の物質を用いるとき、脂質小胞は、慣用手順 を用いたときの時間（ｈｒ）単位ではな（、秒単位で形成される。

一度多重ラメラ脂質小胞が形成したなら、音波処理若しくは機械的剪断により、 寸法を変化させ或は構造を修正することができる。これを実施するための装置お よび一般的手順は当業者に知られており、またリポソーム分野で普通に用いられ ている。

本発明の多重ラメラ脂質小胞な薬剤送達系として用いる場合、それらをどのよう にして用い得るかに関し特に制限はない０例えば、小胞を直接懸濁液に、エーロ ゾルの形で、局所に、或はゲルで分散させることができる。

凝集反応試験或は他のあるタイプのマーカー用途用に使用する場合、直接小胞に 吸収される水性染料か或は親油性染料のいずれかを使用することができる。

発明の多重ラメラ脂質小胞は、薬剤或は高分子送達系としての用途に加えて、他 の用途を相当に有する０例えば、小胞は、注入された物質の免疫応答を向上させ るために、補助薬として使用することができる。加えて、高い水性容積により、 発明の多重ラメラ脂質小胞をモイスチャライザー或はスキンクリームとして用い て有利な結果を得ることができる。高い捕獲容積／脂質比は、従来のスキンケア クリームから利用可能なものに比べて発明の小胞を使用して水分を一層多く皮膚 に与えるものである。

発明は下記の制限するものでない例から一層明らかになるものと思う。

例二り 本例では、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテルを種々の温度のコレステ ロールによって試験して脂質小胞を形成するかどうかを調べた。

麦−−１ 試験番号　　１．　２．　３．　４．　５．　６゜Ｂ５６（ＭＬ）　　　　　０ ．５　　０．５　　０．５　　０．５　　０．５　　０．５ＣＨＯＬ（ＭＧ）　 　　　０．０　　２６　　５２　　７８　　９２　　１３０水（ＭＬ）　　　２ ．０　２．０　２．０　２．０　２．０　２．０表１は試験する成分の濃度を掲 記する０表において８５６と表示する界面活性剤はＢｒ１ｊ５６であり、プラウ エア、ウイルミントン、ＩＣＩアメリカズインコーボレーテッド製であり、水に 可溶性である。ＣＨＯＬなる表示はコレステロールを表わし、界面活性剤とブレ ンドするその量をｍｇで挙げる。この界面活性剤はセチルエーテル、特にポリオ キシエチレン（１０）セチルエーテルであり、融点３１℃を有する。ｌ−６で表 示する各々の試験は異なる量のコレステロールを有していた。他の濃度及び手順 は全て試験から試験に変えていない。

界面活性剤及びコレステロールを４０”Ｃに過熱してブレンドし、親油性相を形 成した。次いで、親油性相を１ｍｌの注射器に入れ、三方ストップコックより水 性相を収容する５ｍｌ注射器に強制射出して塩化ナトリウム１５０ｍＭを含有す る５ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７，４）２ｍｌにした。ホスフェート緩衝液 もまた４０℃であった。親油性相を水性相に注入するプロセスにかかった時間は ５秒より短かかった。生成した混合物を次いで直径約１　ｍｍのオリフィスに強 制的に通して線流量およそ１０ｃｍ／秒で第２の５ｍｌ注射器に入れた。混合物 を２つの５ｍｌ注射器の間で連続して前後に動かして脂質小胞を作るのに必要な 混合を与えた０次いで、物質をフィコール／ハイパツク勾配２＋ｎｌを有するチ ューブに移し、スビンコ（Ｓｐｉｎｃｏ）　Ｕ　３超遠心機で１５．Ｑ　ＯＯｒ ｐｍにおいて１０分間遠心分離した。この工程は非包被水性物質と脂質とを分離 する０次いで、遠心管に２０ゲージ針を刺して液体を注射器で抜き出すことによ って水性下澄液（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ　）を取り出した。

低コレステロールレベル、例えば０〜１０重量％のコレステロールを使用する場 合に、脂質小胞は観察されず、分離した後に、脂質の薄膜が水性相の上面上に観 察された。しかし、コレステロール２０％において、薄膜及び脂質小胞の混合物 の生成が観察され、それより高いコレステロール濃度（３０，４０及び５０％） では、脂質は実質的に全て脂質小胞の形であった。これは、小胞に水を相当吸収 することによって達成された。この実験は、本発明、特には十分なコレステロー ルを親油性相に加入することの方法及び手順を用いて、それらを用いなければ脂 質小胞を形成しない物質から小胞な作り得ることを例示する。

箆ｌ 、本例では、脂質小胞について染料及び水の吸収を測定した。ポリオキシエチレ ン（２）オレイルエーテル界面活性剤であるＢｒ１ｊ９３を小胞用のベース材料 として使用した。セチルエーテルの飽和Ｃ３，炭素鎖と異なり、このＣ＋ａ炭素 鎖は１つの二重結合を有し不飽和である。界面活性剤は室温において液体である 。

表２は試験した材料の濃度を示す０例１の場合のように、これらの値はコレステ ロール０〜５０重量％に相当する。染料は水滴性染料であるカルセインであり、 これを水性相の一部として混入する。

試験番号　１　２．　３．　４．　　５．　　６゜Ｂ９３ｆＭＬｌ　　　Ｏ，５ ０，５０，５０，５０，５０，５ＣＨＯＬ（ＭＧ）　　０．０　４２　８４　１ ２６　１６８　２１０水［ＭＬ）　　１．０１．０　１．０１．０　１．０　１ ．０力ル士イン（ＭＧＩｏ、２　　　０．２　　　０．２　　　０．２　　　　 　０．２　　　　　０．２脂質小胞を形成するのに用いた手順は例１に記載する 手順と同じであった。

試験番号　　１．　２．　３．　４．　５．　　６゜下部容積ｆＭＬ１１．６　 １．５　１．５　１．０　０．９５　０．９５層容積（ＭＬＩ　　Ｏ，９１，０ １，０１，５１，６１，６水吸収量ｆＭＬ］　Ｏ８４０，５０，５１，０１，１ １，１表３はこの試験の結果を示す、下部容積列は、コレステロールを増大する につれて、水が小胞に移行されるため、下澄液容積が減少し、脂質小胞容積が増 大することを示す０例１の場合のように、コレステロール数値２０％において、 脂質小胞と薄い脂質フィルムとの混合物が観察された。コレステロールが２０％ より少ない場合、薄膜のみが発生し、コレステロールが２０％より多い場合、脂 質小胞のみが観察され、遊離の脂質は観察されなかった。染料が脂質小胞に吸収 される結果は、分光光度測定して、正確に水吸収数値に一致し、コレステロール の割合を増大するにつれて包被される染料は一層多くなる。

轟−−４ 界面活性剤　　　　　コレステロール±　　　混合物；リオ年ジエチレン＋１０ ）セチルエーテル　　　　　　　　　　　　　　溶液ざリオキシエチレン（１０ ）士チルエーテル　　　　　　＋　　　　　　脂質小胞ｆりオキシエチレン（２ ）　ステ１リルエーテル　　　　−　　　　　　　ゲルざリオキシエチレン（２ ）　ステ７リルエーテル　　　　＋　　　　　　脂質小胞ざすオキシエチレン（ ４１ステアリルエーテル　　　　−　　　　　　　ゲルざりオキシエチレン（４ ）　ステ７リルエーテル　　　　＋　　　　　　脂質小胞寥すオキシエチレン（ １０）ステ７リルエーテル　　　　−　　　　　　　ゲルポリオキシエチレン（ １０）ステ７リルエーテル　　　　＋　　　　　　　リ　ポ　ソームポリオキシ エチレン（２０）ステ１リルエーテル　　　　−　　　　　　　ゲルざりオキシ エチレン（２０）ステ７リルエーテル　　　　＋　　　　　　　ゲルポリオキシ エチレン（２）　オレイルエーテル　　　　　　　　　　　　　分離バルク相ポ リオキシエチレン（２）　オレイルエーテル　　　　　＋　　　　　　脂質小胞 ポリオキシエチレン（５）　オレイルエーテル　　　　　　　　　　　　　分離 バルク相ポリオキシエチレン（５）　オレイルエーテル　　　　　＋　　　　　 　脂質小胞ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル　　　　　　　　　　 　　　分離バルク相ざリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル　　　　　＋ 　　　　　　　脂質小胞ポリオキシエチレン（５）　オレイルアミン　　　　　 　　　　　　　　　濁った溶液ポリオキシエチレン（５）　オレイル１ミン　　 　　　　＋　　　　　　　脂質小胞ざリオキシエチレン（２）　オレイル７ミン 　　　　　　　　　　　　　　濁っ　た溶液ポリオキシエチレン（２）　オレイ ルアミン　　　　　　＋　　　　　　濁った溶液倒−ジ 本例は発明の範囲内の種々の異なる分子を用いて脂質小胞を形成し得ることを例 示する０本例では、コレステロール３０重量％が存在するか或は存在しないかの 他は同じ手順を用いて、種々の十分な多数の物質を小胞形成について試験した０ 表４は試験した物質及び結果を描記する。

負の符号（−）はコレステロールを使用しなかったことを意味し、正の符号（＋ ）はコレステロールを３０％（重量／重量界面活性剤）を使用したことを意味す る。

本例から明らかな通りに、コレステロールのようなステロールを十分な量で加え ることにより界面活性剤の性質を変え、脂質小胞を形成させることができる。こ の変化は従来知られている物から予想されない。

これらの例は発明を例示するものであることを意味し、発明を制限することを意 味しない０発明は請求の範囲に記載する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成元年９月１２日 特許庁長官　吉　１）文　教　殿 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＩＪＳ８８１００７２２２、発明の名称　表面活 性剤とステロイドから形成される脂質小胞３、特許出願人 住　所　　アメリカ合衆国　０８３６ｏ　ニューシャーシー。

パインランド、イースト　ランデイス　アベニュー名　称　　マイクロ　ベシキ ュラー　システムズ。

インコーホレイテッド 住　所　　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　　　　　１　通１、第３頁第２ 行において「いくつかあった」とあるあとに「（米国特許第４，２１７．３４４ 号参照）」を加入します。

２、第３頁第１Ｏ行において「アシルエーテル」とあるのを「アルキルエーテル 」と補正します。

３、第８頁第５行および１８行の２箇所において「アシル鎖」とあるのをいずれ も「アルキル鎖」と補正します。

４、第９頁第１行において「アシル基」とあるのを「アルキル基」と補正します 。

請求の範囲 ｌ　（補正）、ステロイドの不存在において小胞を形成し面活性剤： ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエーテル（ｎは５〜１ｏの範囲である）；ポリ オキシエチレン（ｎ′）セチルアミン（ｎ’は５〜ｌＯの範囲である）：ポリオ キシエチレン（Ｘ）ステアリルエーテル（Ｘは２〜１ｏの範囲である）；ポリオ キシエチレン（ｙ′）ステアリルアミン（ｘ’は５〜１ｏの範囲である）：ポリ オキシエチレンオレイル（ｙ）エーテル（ｙは２〜１ｏの範囲である）；ポリオ キシエチレン（ｙ′）オレイルアミン（ｙ′は５〜１０の範囲である）：ポリオ キシエチレン（２）リルイルエーテル（２は２〜１ｏの範囲である）：ポリオキ シエチレン（２′）リルイルアミン（ｚ’は５〜ｌＯの範囲である）：ポリオキ シエチレン（＄）エイコサモノニノイルエーテル（Ｓは２〜１０の範囲である） ：ポリオキシエチレン（Ｓ′）エイコサモノエノイルアミン（ｓ’は５〜１０の 範囲である）：ポリオキシエチレン（１）エイコサジェノイル（ｔ　！！　２〜 １０の範囲である）及びポリオキシエチレン（ｔ′）エイコサジェノイルアミン （ｔ’は５〜１ｏの範囲である） 及びコレステロール、ヒドロコルチゾンアセテート及びこれらの混合物及び化学 的類似体物からなる群より選ぶステロイド約２０〜５０％ を含む多重ラメラ脂質小胞。

２、削除 ３、削除 ４（補正）、更にオレイン酸、ジセチルホスフェート、パルミチン酸、セチルス ルフェート、レチン酸、ボス７、アチジン酸、ホスファチジルセリン、長鎖アミ ン、長鎖ピリジニウム化合物、第四アンモニウム化合物或はこれらの混合物から なる群より選ぶ電荷発生両親媒質を含む請求の範囲第１項記載の脂質小胞。

５−１２．削除 １３（補正）。

Ａ、下記からなる群より選ぶ界面活性剤：ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエー テル（ｎは５〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレン（ｎ′）セチルアミン （ｎ’は５〜１ｏの範囲である）、ポリオキシエチレン（Ｘ）ステアリルエーテ ル（Ｘは２〜１ｏの範囲である）、ポリオキシエチレン（Ｘ′）ステアリルアミ ン（ｘ’は５〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレン（ｙ）オレイルエーテ ル（ｙは２〜１ｏの範囲である）、ポリオキシエチレン（ｙ′）オレイルアミン （ｙ’　は５〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレン（２）リルイルエーテ ル（２は２〜１ｏの範囲である）、ポリオキシエチレン（Ｚ′）リルイルアミン （ｚ’　は５〜１ｏの範囲である）：ポリオキシエチレン（Ｓ）エイコサモノエ ノイルエーテル（Ｓは２〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレン（Ｓ′）エ イコサモノエノイルアミン（ｓ’は５〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレ ン（１）エイコサジニノイル（ｔは２〜１０の範囲である）及びポリオキシエチ レンＣｔ’　）エイコサジニノイルアミン（ｔ’は５〜１０の範囲である）：と コレステロール、ヒドロコルチゾンアセテート及びこれらの混合物及び化学的類 似体からなる群より選ぶステロイド約２０〜５０重量％とをブレンドして親油性 相を形成し、その間該親油性相の温度を該界面活性剤の温度より高く保ち、該界 面活性剤はステロイドの不存在において剪断条件下で小胞な形成することができ ないものであり、 Ｂ、親油性相と水性相とを剪断混合条件下で組み合せ、分離し得るラメラ相を形 成せず、それによって小胞な形成する 工程を含む界面活性剤物質の多重ラメラ脂質小胞の製造方法。

１４、削除 １５、削除 １６（補正）、更にオレイン酸、ジセチルホスフェート、パルミチン酸、セチル スルフェート、レチン酸、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、長鎖アミ ン、長鎖ピリジニウム化合物、第四アンモニウム化合物或はこれらの混合物から なる群より選ぶ電荷発生両親媒質を含む請求の範囲第１３項記載の方法。

１７−２４．削除 国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエーテル（ｎは５〜１０の範囲である）及 びポリオキシエチレン（ｎ′）セチルアミン（ｎ′は５〜１０の範囲である）か らなる群より選ぶ界面活性剤、 及びステロイド約２０〜５０％ を含む多重ラメラ脂質小胞。
2. ２．前記ステロイドがステロールを含む請求の範囲第１項記載の脂質小胞。
3. ３．前記ステロイドをコレステロール及びヒドロコルチゾンアセテートからなる 群より選ぶ請求の範囲第１項記載の脂質小胞。
4. ４．更に電荷発生両親媒質（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）を含む請求の範囲第１項記 載の脂質小胞。
5. ５．ポリオキシエチレン（ｘ）ステアリルエーテル（ｘは２〜１０の範囲である ）、ポリオキシエチレン（ｘ′）ステアリルアミン（ｘ′は５〜１０の範囲であ る）、ポリオキシエチレンオレイル（ｙ）エーテル（ｙは２〜１０の範囲である ）、ポリオキシエチレン（ｙ′）オレイルアミン（ｙ′は５〜１０の範囲である ）、ポリオキシエチレン（ｚ）リノレイルエーテル（Ｚは２〜１０の範囲である ）及びポリオキシエチレン（ｚ′）リノレイルアミン（ｚ′は５〜１０の範囲で ある）からなる群より選ぶ界面活性剤、 及びステロイド約２０〜５０％ を含む多重ラメラ脂質小胞。
6. ６．前記ステロイドがステロールを含む請求の範囲第５項記載の脂質小胞。
7. ７．前記ステロイドをコレステロール及びヒドロコルチゾンアセテートからなる 群より選ぶ請求の範囲第５項記載の脂質小胞。
8. ８．更に電荷発生分子を含む請求の範囲第５項記載の脂質小胞。
9. ９．ポリオキシエチレン（Ｓ）エイコサモノエノイルエーテル（ｓは２〜１０の 範囲である）、ポリオキシエチレン（ｓ′）エイコサモノエノイルアミン（ｓ′ は５〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレン（ｔ）エイコサジエノイル（ｔ は２〜１０の範囲である）及びポリオキシエチレン（ｔ′）エイコサジエノイル アミン（ｔ′は５〜１０の範囲である）からなる群より選ぶ界面活性剤。 及びステロイド約２０〜５０％ を含む多重ラメラ脂質小胞。
10. １０．前記ステロイドがステロールを含む請求の範囲第９項記載の脂質小胞。
11. １１．前記ステロイドをコレステロール及びヒドロコルチゾンアセテートからな る群より選ぶ請求の範囲第９項記載の脂質小胞。
12. １２．更に電荷発生分子を含む請求の範囲第９項記載の脂質小胞。
13. １３．Ａ．ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエーテル（ｎは５〜１０の範囲であ る）及びポリオキシエチレン（ｎ′）セチルアミン（ｎ′は５〜１０の範囲であ る）からなる群より選ぶ界面活性剤とステロイド２０〜５０重量％とをブレンド して親油性相を形成し、その間該親油性相の温度を界面活性剤の融点よりも高く 保ち、Ｂ．親油性相と水性相とを剪断混合条件下で組合わせる 工程を含む多重ラメラ脂質小胞の製造方法。
14. １４．前記ステロイドがステロールを含も請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．前記ステロイドをコレステロール及びヒドロコルチゾンアセテートからな る群より選ぶ請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．更に電荷発生両親媒質を含む請求の範囲第１３項記載の方法。
17. １７．Ａ．ポリオキシエチレン（ｘ）ステアリルエーテル（ｘは２〜１０の範囲 である）、ポリオキシエチレン（ｘ′）ステアリルアミン（ｘ′は５〜１０の範 囲である）、ポリオキシエチレン（ｙ）オレイルエーテル（ｙは２〜１０の範囲 である）、ポリオキシエチレン（ｙ′）オレイルアミン（ｙ′は５〜１０の範囲 である）、ポリオキシエチレン（Ｚ）リノレイルエーテル（ｚは２〜１０の範囲 である）及びポリオキシエチレン（ｚ′）リノレイルアミン（ｚ′は５〜１０の 範囲である）からなる群より選ぶ界面活性剤とステロイド２０〜５０重量％とを ブレンドして親油性相を形成し、その間該親油性相の温度を界面活性剤の融点よ りも高く保ち、Ｂ．親油性相と水性相とを剪断混合条件下で組合わせる 工程を含む多重ラメラ脂質小胞の製造方法。
18. １８．前記ステロイドがステロールを含む請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記ステロイドをコレステロール及びヒドロコルチゾンアセテートからな る群より選ぶ請求の範囲第１７項記載の方法。
20. ２０．更に電荷発生両親媒質を含む請求の範囲第１７項記載の方法。
21. ２１．Ａ．ポリオキシエチレン（ｓ）エイコサモノエノイルエーテル（ｓは２〜 １０の範囲である）、ポリオキシエチレン（Ｓ′）エイコサモノエノイルアミン （Ｓ′は５〜１０の範囲である）、ポリオキシエチレン（ｔ）エイコサジエノイ ル（ｔは２〜１０の範囲である）及びポリオキシエチレン（ｔ′）エイコサジエ ノイルアミン（ｔ′は５〜１０の範囲である）からなる群より選ぶ界面活性剤と ステロイド２０〜５０重量％とをブレンドして親油性相を形成し、その間該親油 性相の温度を界面活性剤の融点よりも高く保ち、 Ｂ．親油性相と水性相とを剪断混合条件下で組合わせる 工程を含む脂質小胞の製造方法。
22. ２２．前記ステロイドがステロールを含む請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．前記ステロイドをコレステロール及びヒドロコルチゾンアセテートからな る群より選ぶ請求の範囲第２１項記載の方法。
24. ２４．更に電荷発生両親媒質を含む請求の範囲第２１項記載の方法。