JPH02502247A - bacillus cell - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 5、 請求の範囲4のバチルス細胞を培養し、そして随意にそれからポリペプチ ドを回収することからなる、ポリペプチドの製造法。[Detailed description of the invention] 5. Cultivating the Bacillus cells of claim 4, and optionally culturing polypeptides therefrom. A method for producing a polypeptide, the method comprising recovering a polypeptide.
6、 請求の範囲5の方法により製造されたポリペプチド。6. A polypeptide produced by the method of claim 5.
浄書(内容に変更なし) 明 細 書 発明の名称 バチルス細胞 発明の分野 本発明は、細胞、そして特にバチルス属(BxcillosgeIs )の細胞 に関する。本発明のバチルス細胞は、異種遺伝子物質で形質転換し、そして異種 ポリペプチドの工業的醗酵および製造に使用することができる。Engraving (no changes to the content) Specification name of invention bacillus cell field of invention The present invention relates to cells, and in particular cells of the genus Bacillus. Regarding. Bacillus cells of the invention are transformed with heterologous genetic material and It can be used for industrial fermentation and production of polypeptides.
における組換え生成物を製造するための発現方式の開発に著しい興味がある。組 換え生成物のための製造宿主としてのB、ズブチリスの利点は、その大きな分泌 能力、その規則的受容性、およびそのよく発展した醗酵および生成物回収技術を 包含する。多くのバチルスのように、B、スブチリスは、大量の蛋白質を生育媒 質中に直接有効に分泌しうる。そのような分泌は、蛋白質が細胞内生成物とくら べて、比較的純粋に製造されるので、生成物回収において費用利益を有する。分 泌はまた、不溶性高水準発現および細胞内蓄積から通常束じる不溶性包含体(i nsoluble 1nclusion bodies)から回収される変性蛋 白質と異って、活性形において非常な高水準まで生成物の蓄積を許容する[ラツ ペン(Ruppen) 、バンド(Bxnd)およびヘンナ−(Henne+) 、1986、バシラス、モレキュラー、ジェネティックス、アンド、バイオテ クノロジー、アプリケーションズ(B1cillnsM@1ecalIr Ge ne目cs u+d Biot!cl+++oloH7Applicstiom s )ニド、エイ、ガネサン、アンド、ジェイ、ホッホ、アカデミツク、プレス (El A、 Ggncsgm ■d J、 Hoch。There is significant interest in developing expression strategies for producing recombinant products in the field. set The advantage of B. subtilis as a production host for transgenic products is its large secretion capacity, its regular acceptability, and its well-developed fermentation and product recovery techniques. include. Like many Bacilli, B. subtilis consumes large amounts of protein in its growth medium. It can be effectively secreted directly into the plasm. Such secretion occurs when proteins interact with intracellular products. All are produced relatively pure and therefore have cost benefits in product recovery. minutes Secretion is also associated with insoluble inclusions (i Denatured proteins recovered from nsoluble 1nclusion bodies) Unlike white matter, it allows the accumulation of products to very high levels in their active form. Pen (Ruppen), band (Bxnd) and henna (Henne+) , 1986, Bacillus, Molecular, Genetics, and Biote Technology, Applications (B1cilnsM@1ecalIr Ge Ne eye cs u+d Biot! cl+++oloH7Applicstiom s) Nido, A, Ganesan, &, J, Hoch, Akademitsu, Press (El A, Ggncsgm ■d J, Hoch.
Acxdemtc Press) :、 423〜432頁]。Acxdemtc Press):, pp. 423-432].
分泌される組換え生成物のための製造宿主としてのB。B as a production host for secreted recombinant products.
スブチリスの使用における主要な問題は、分泌された非対応蛋白質(bsluo logows proteins)を分解する種々のプロテアーゼのこの生体に よる合成および分泌である。A major problem in the use of B. subtilis is that secreted non-corresponding proteins (BSLUO This organism uses various proteases that decompose logows (proteins). synthesis and secretion.
分泌されるプロテアーゼ活性の約90%は、2種の主要なプロテアーゼ、遺伝子 “npr”によりコードされる中性メタロプロテアーゼおよび遺伝子“apr” によりコードされるアルカリ性セリンプロテアーゼ(スブチリシン)に帰因する 。プロテアーゼ分解問題を克服しまたは減少させるための試みにおいて、スキム ミルクプレート上のカゼインの減少した分解を示す低プロテアーゼ変異株をスク リーニングすること[バルバ(Pslvi)等、1983、ジエン(Gene) 、22 : 229〜239];aprおよびnpr遺伝子への突然変異を導 入すること[カワムラ(Kavtmu+i)およびトイ(Doi)、1984( ジエイ、バクチリオル(J、 Bxcjeriol) 160 : 442 〜444;ヤング(Ygng)等、1984、J、 Bxcle+io1. 160 二15〜21 ;ヨーロッパ特許出願EP−A−246678);減少 したプロテアーゼ水準を与える初期遮断胞子形成変異、特に5poOA変株を使 用すること[ウィリアムズ(Willisms)等、1981、Ge1e 1 6 :199〜206 ;7アーネストツク(Fshnestock)およびフ ィッシャー(Fisher) 、1986.1Bacj!riol 165 : 796〜804コを包含する各種の接近が使用されてきた。最近、Ap r −Np r−菌株中に5poOH変異を導入することにより極めて低い水準の分 泌されたプロテアーゼを有する菌株を導く試みがなされた[ Fahnesjo ckおよびFisher 、 1987、アブル、エンブ、マイクロパイオル( Appl、E++マ。Approximately 90% of the secreted protease activity is derived from two major proteases, the gene Neutral metalloprotease encoded by “npr” and gene “apr” attributed to the alkaline serine protease (subtilisin) encoded by . In an attempt to overcome or reduce protease degradation problems, skim Screen low protease mutants showing reduced degradation of casein on milk plates. Leaning [Pslvi et al., 1983, Gene] , 22: 229-239]; Inducing mutations to the apr and npr genes [Kavtmu+i and Doi, 1984 ( J, Bxcjeriol (J, Bxcjeriol) 160: 442 ~444; Ygng et al., 1984, J, Bxcle+io1. 160 215-21; European patent application EP-A-246678); reduction Using early-blocking sporulation mutations, particularly the 5poOA variant, that give increased protease levels, [Williams et al., 1981, Ge1e 1 6:199-206; 7 Ernestock and Fshnestock Fisher, 1986.1 Bacj! riol 165 A variety of approaches have been used, including: 796-804. Recently, Apr. -Np r- By introducing the 5poOH mutation into the strain, extremely low levels of Attempts were made to derive strains with secreted proteases [Fahnesjo et al. ck and Fisher, 1987, Able, Embu, Micropaiol ( Appl, E++ Ma.
Microbiol) 53 : 379〜384 ;国際特許出願WO361 01825;ワンプ(WgB)等、Ge++e69 : 39〜47]。菌株の どれもが分泌されたプロテアーゼについて全く不完全ではなく、そしてそれらが 産生ずる残った微量プロテアーゼ類はなお非対応蛋白質の産生において大きな問 題を賦課する[シャイン(Schein)等、1986、バイオ/テクノロジー (Bio/Tecl+l1oloB) 4 ニア19〜725;ワンプ(W!n g)等、1988、Gene69 : 39〜47] 、たとえば、Apr− Npr−およびApr−Npr−5poOA−株におけるスタフィロコッカス、 プロティンA (StIph71ococcil P「olein^)の産生お よび完全性を比較したとき、分解は後者において減少したが、それにもかかわら ず非常に重要な問題がなお残った[ Fxh+5rtockおよびFisher % 1987コ。Microbiol) 53: 379-384; International patent application WO361 01825; Wamp (WgB) et al., Ge++e69: 39-47]. of bacterial strains None are completely defective in terms of secreted proteases, and they The remaining trace amounts of proteases still remain a major problem in the production of non-compliant proteins. Imposing a problem [Schein et al., 1986, Bio/Technology] (Bio/Tecl+l1oloB) 4 Near 19~725; Wamp (W!n g) et al., 1988, Gene69: 39-47], for example, April- Staphylococci in Npr- and Apr-Npr-5poOA- strains, Production of protein A (StIph71ococcil P ``olein^) When comparing terms and completeness, decomposition decreased in the latter, but nevertheless A very important issue still remains [Fxh+5rtock and Fisher %1987.
従って、分泌された非対応蛋白質のプロテアーゼ分解の問題を克服する組換えD NA技術における使用のために適当な菌株について現実の要求がある。Therefore, recombinant D There is a real need for suitable bacterial strains for use in NA technology.
我々は、上記問題を克服する菌株を導くための作業をさらに行い、そして今や先 行技術菌株に比しよりよい菌株を見出した。We have done further work to derive strains that overcome the above problems, and are now ahead of the curve. We have found a strain that is better than conventional strains.
本発明は、著しく減少した水準のプロテアーゼを有するバチルス種の細胞を提供 する。The present invention provides cells of Bacillus sp. that have significantly reduced levels of proteases. do.
発明の要約 本発明に従えば、少なくとも表現型Apr−1Np r−,5poOHを示すバ チルス細胞が提供される。Summary of the invention According to the present invention, a strain exhibiting at least the phenotype Apr-1Npr-,5poOH chillus cells are provided.
本発明の第1の態様においては、少くとも表現型Ap r−Np r−および5 poOHを示すバチルス細胞を提供する。In the first aspect of the invention, at least the phenotype Ap r-Np r- and 5 Bacillus cells exhibiting poOH are provided.
変異により無能になしえ、そして突然変異は、機能性蛋白質を産生じないように 遺伝子を不活性化しうる任意の型のものでありえ、そして各々天然に生成しまた は遺伝子工学の方法により導きうる。1種もしくはそれ以上の遺伝子は、この技 術分野においてよく知られている技術を使用して除去しつる。Mutations can cause incompetence, and mutations can prevent them from producing functional proteins. It can be of any type capable of inactivating the gene, and each of the naturally occurring and can be derived by genetic engineering methods. One or more genes can be Remove the vine using techniques well known in the art.
本発明のバチルス細胞は、細胞外プロテアーゼの著しく減少した水準を示し、従 って組換え非対応ポリペプチドの発現のための宿主細胞として顕著な有用性のも のであることが見出された。特に、驚くべきことには、本発明の細胞は、表現型 Apr−1Npr−1SpoOA−を有するこの技術分野において知られている バチルス株に比し細胞外プロテアーゼのより低い水準を示すことが見出された。Bacillus cells of the invention exhibit significantly reduced levels of extracellular proteases and It also has significant utility as a host cell for the expression of recombinant non-competent polypeptides. It was found that In particular, it is surprising that the cells of the invention have a phenotypic known in the art with Apr-1Npr-1SpoOA- It was found to exhibit lower levels of extracellular proteases compared to Bacillus strains.
本発明の細胞は、たとえばコンプレッション(congression)および 出発物質として公然入手しうるセルラインの使用により、以後に記載する技術を 使用して製造しうる。コンプレッションにおいて、非選択性マーカー(たとえば 5poOH)は、供与菌株から製造されたDNAの高濃度において、受容体の競 合細胞の形質転換により、選択性マーカーと受容細胞中に共移転される。それら 条件下に、選択性マーカー(たとえば、栄養要求の除去)を使用して選択される 形質転換体の高比率は、非選択性マーカーを同時に要求したことが認められる。The cells of the invention can be used, for example, for compression and The technique described hereinafter can be carried out by using publicly available cell lines as starting materials. It can be manufactured using In compression, non-selective markers (e.g. 5poOH) competes with the receptor at high concentrations of DNA produced from the donor strain. Transformation of the combined cells results in the co-transfer of the selectable marker into the recipient cells. those selected using selectivity markers (e.g., removal of auxotrophy) under conditions It is observed that a high proportion of transformants co-required a non-selectable marker.
CIMB7.01MB14および01M815株である。CIMB7.01MB14 and 01M815 strains.
本発明はまた、B、スブチリスCI 8M7、C18MI4およびC18M15 を提供する。The invention also relates to B. subtilis CI 8M7, C18MI4 and C18M15. I will provide a.
本発明のバチルス株の特定の例は、以後に記載する如く、菌株CI 8M7、C 18M14またはCI BMI 5と同−又は類似のものである。本発明の細胞 は、他の変異たとえば5poOAの導入の結果として、他の天然に生成する細胞 外プロテアーゼの1種もしくはそれ以上を付加的に欠除しうる。更に、細胞は、 たとえば細胞内セリンプロテアーゼをコーディングする遺伝子(isp)のよう な天然に生成する細胞内プロテアーゼ遺伝子の1種もしくはそれ以上を欠除しう る。Specific examples of Bacillus strains of the invention include strains CI 8M7, C 18M14 or CI BMI 5 or similar. Cells of the invention may occur in other naturally occurring cells as a result of the introduction of other mutations, such as 5poOA. One or more of the exoproteases may additionally be deleted. Furthermore, the cells For example, the gene encoding intracellular serine protease (ISP) deletion of one or more naturally occurring intracellular protease genes. Ru.
細胞は、この技術分野において知られている技術を使用して非対応ポリペプチド をコーディングする遺伝子を発現しつるベクターで形質転換しうる。Cells are isolated from non-compatible polypeptides using techniques known in the art. can be transformed with a vector expressing a gene encoding the .
本発明の第2の態様においては、非対応ポリペプチドをコーディングする遺伝子 を発現しつるベクターで形質転換された表現型Apr−Npr−5poOHを少 くとも示すバチルス細胞を提供する。In a second aspect of the invention, a gene encoding a non-corresponding polypeptide The phenotypic Apr-Npr-5poOH transformed with a vine vector expressing The present invention provides Bacillus cells as shown in Figs.
ベクターは、宿主内で複製する任意のベクター、たとpBc16および誘導体; ラクトバチルス(LICIOblcill++s )レプリコンを含有するベク ター、あるいはそれらに由来するシャトルベクターでありえ、そして特に国際特 許出願WO/8806622中に記載された如きバチルスベクターである。Vectors include any vector that replicates within a host, including pBc16 and derivatives; Vector containing Lactobacillus (LICIOblcil++s) replicon vectors, or shuttle vectors derived from them, and especially those with international characteristics. A Bacillus vector as described in patent application WO/8806622.
本発明の細胞は、任意の原核性ポリペプチド、たとえば細菌性ポリペプチドたと えば酵素たとえばα−アミラーゼ、β−アミラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ 、あるいは任意の真核性ポリペプチド、たとえば哺乳動物ポリペプチドたとえば 酵素たとえばチモシンまたはガストリックリパーゼ;酵素阻害剤たとえばメタロ ブロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP);ホルモンたとえば生長ホルモン;リ ンホカインたとえばインターフェロン;プラスミノーゲンアクチベーターたとえ ば組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)またはプロウロキナーゼ;あ るいは天然、修飾またはキメライムノグロブリンまたはたとえば抗体−酵素また は抗体−毒素キメラのような二重活性を有するそれらの断片をコーディングする 非対応遺伝子の発現のための宿主細胞として特に有用でありうる。The cells of the present invention can contain any prokaryotic polypeptide, such as a bacterial polypeptide. enzymes such as α-amylase, β-amylase or β-galactosidase. , or any eukaryotic polypeptide, such as a mammalian polypeptide, e.g. enzymes such as thymosin or gastric lipase; enzyme inhibitors such as metallo- Tissue inhibitor of brotainase (TIMP); hormones such as growth hormone; interferon; plasminogen activator, etc. tissue plasminogen activator (tPA) or prourokinase; or natural, modified or chimeric immunoglobulins or e.g. antibody-enzyme or encode those fragments with dual activity such as antibody-toxin chimeras. They may be particularly useful as host cells for the expression of unmatched genes.
本発明の第3の態様においては、本発明の第2の態様に従うバチルス細胞を培養 し、そしてそれからポリペプチドを随意に回収することからなるポリペプチドの 製造法を提供する。In a third aspect of the invention, Bacillus cells according to the second aspect of the invention are cultured. and optionally recovering the polypeptide therefrom. Provide manufacturing method.
本発明の第4の態様においては、本発明の第3の態様に従う方法により産生され るポリペプチドを提供する。In a fourth aspect of the invention, produced by the method according to the third aspect of the invention, The present invention provides a polypeptide comprising:
本発明のバチルス細胞は、非常に低い分泌されたプロテアーゼ活性を有し、従っ て組換え蛋白質の発現のための宿主としての使用のものである。The Bacillus cells of the invention have very low secreted protease activity and therefore It is intended for use as a host for the expression of recombinant proteins.
図面の簡単な記述 本発明は、今や単に例として、そして添付−した図面を参照して記載され、その 第1図は、EMG50、C1MB12.01MB13およびC1MB15の培養 物の上澄液で、静止層中3時間および15時間インキュベートしたSPAのコマ シー染色ゲル(Coom*ssiestrim*d Iel )の写真である。Brief description of the drawing The invention will now be described, by way of example only and with reference to the accompanying drawings, in which: Figure 1 shows the culture of EMG50, C1MB12.01MB13 and C1MB15. SPA frames incubated in the static layer for 3 and 15 hours with the supernatant of This is a photograph of Coom*ssiestrim*dIel.
第2図は、培養の生長を通して各時点で除去したEMG50、C1MB12.0 1MB13およびC1MB15の上澄液の検体のβ−ラクタマーゼ検定の結果の 図である。Figure 2 shows EMG50, C1MB12.0 removed at various time points throughout the growth of the culture. Results of β-lactamase assay of supernatant samples of 1MB13 and C1MB15 It is a diagram.
特定実施態様の詳細な記述 使用したB、スブチリス株を、表1に列挙する。Detailed description of specific embodiments The B. subtilis strains used are listed in Table 1.
nprSspoOHおよび5poOA変異を担っている代表的菌株は、米国、オ ハイオ 43210、コロンブス、484、ウェスト 12番アベニュー、オハ イオ、ステート、ユニバーシティ(0hio 5tate Universit 7 )のバチルス、ジエネテイツク、ストック、センター(Bxcillms Gen!口c 5tock Ce1te )から自由に得ることができる。ap r変異を担う菌株は、たとえばKmvim++r*およびDoL 1984 ( J、 Bxcjzrial l 50 : 424〜444)中に記載された如 きこの技術分野において知られている方法により製造しうる。菌株は、10%グ リセロールを含有するし培地(下記参照)中に、−20℃で慣例的に貯蔵した。Representative strains carrying the nprSspoOH and 5poOA mutations are from the United States and Australia. Hi-O 43210, Columbus, 484 West 12th Avenue, Oha io, state, university 7) Bacillus, genetics, stock, center (Bxcilms) Gen! It can be obtained freely from the mouth c5tock Ce1te). ap Strains carrying the r mutation are, for example, Kmvim++r* and DoL 1984 ( J, Bxcjzreal l 50: 424-444). It can be produced by methods known in the mushroom art. The strain is 10% It was conventionally stored at -20°C in a medium containing lyserol (see below).
表1−使用した菌株 EMG50 野生体 lA289 aroI906 mctB5 5acA3211353 5 poOAΔ677 CIBM5 1ヱ1−1 且九見−1tr且C2al狂 ユ以しセJΔCAT OA34.1 ss副0A34 担じ12 −ロビーB2 μhl−10 A43 5poOA43 trpC2OA135 8を五0A135 υ 上C20A143 ss副0A143 υ上020A144 J副0A1 44 シ上C20B83 ss碧0B83 tr上C20B488 sλ仝0B136 υ上C2OB490 8Gミ0B490 シュC3 0B492 sr副0A43 ST型0B490 v上C20C4875 poOc9V phe−12trpC20D486 sp副0B8Htr 上C20F221 5poOF221 pheA12 trpC20G 485 5poOG14UL trpC22) 媒質 Lブロス しブロスまたは1.5%寒天で固形化したしブロスを、菌株の培養の ための標準媒質として使用した。Table 1 - Strains used EMG50 wild body lA289 aroI906 mctB5 5acA3211353 5 poOAΔ677 CIBM5 1ヱ1-1〔Kumi-1tr〔C2al mad Yuise JΔCAT OA34.1 ss sub 0A34 shoulder 12 - lobby B2 μhl-10 A43 5poOA43 trpC2OA135 8 50A135 υ Upper C20A143 ss sub 0A143 υ upper 020A144 J sub 0A1 44 C20B83 on top ss Ao 0B83 C20B488 on tr sλ仝0B136 υ上C2OB490 8G MI0B490 Shu C3 0B492 sr sub 0A43 ST type 0B490 v top C20C4875 poOc9V phe-12trpC20D486 sp sub0B8Htr Upper C20F221 5poOF221 pheA12 trpC20G 485 5poOG14UL trpC22) Medium L Broth Broth or broth solidified with 1.5% agar is used for culture of bacterial strains. It was used as a standard medium for
それは11当りニドリプトン10g、酵母抽出物5g。It is 10g of nidolipton and 5g of yeast extract per 11.
NaC/ 5gを含有した。そのpmは、濃NaOHを使用して7に調節した 。Contained 5g of NaC. The pm was adjusted to 7 using concentrated NaOH. .
Mo、 Mo最少塩類(Mo minimlseas )を標準媒質として使 用した。Moは11当り: Na2HPO412g;KH2PO46g;NaC / Ig;NH4Cl 2gを含有した。そのpHは、7.4に調節した。Mo, using Mo minimum salts (Mo minimlseas) as the standard medium. used. Mo per 11: Na2HPO412g; KH2PO46g; NaC /Ig; Contained 2g of NH4Cl. The pH was adjusted to 7.4.
それは2倍終濃度に調整し、オートクレーブし、そして使用のために3%寒天で 1:1(容量:容量)混合した。滅菌の後、別に滅菌したグルコースを炭素原と して1%の終濃度まで加え、そして炭素原として1%の終濃度を満足させるため にアミノ酸を、そして50gg/ mlの終濃度に栄養要求を満足させるために アミノ酸を、他に記述した場合を除いて、加えた。It was adjusted to 2x final concentration, autoclaved, and diluted with 3% agar for use. Mixed 1:1 (volume:volume). After sterilization, separately sterilized glucose is used as a carbon source. and added to a final concentration of 1%, and to satisfy the final concentration of 1% as a carbon source. and amino acids to meet nutritional requirements at a final concentration of 50 gg/ml. Amino acids were added unless stated otherwise.
LGA、 LGA媒質は、胞子形成熟達[5perulrtion−prol icientコ (Spo 1株を、胞子形成欠如(Spoi 株と区別する ために使用し、Spo+株は37℃で48時間インキュベーションの後に褐色お よび不透明になり、そして5po−株は白色および透明となった[ピボット(P iggoj )、1973、J、 Baete+1o1114 :1241〜 1253]。LGAは、11当り:グルタミン酸2g7乳酸ナトリウム2.8g ;寒天15g:L−アラニン100mg;FeC/3−6H200,98■;M gC1・6H208,3■;MnC1−4HO19,8mg;NH4Cl 5 35mg;Na So 106mg;KH2PO468■;NHNo 96.5mg;Ca(,72219mgを含栄養ステップダウン方法において 使用される媒質であった(下記参照)。それらは11当り: K 2 HP O 414g;KHPO46g;クエン酸トリーナトリウム1g; (NH4)2S 042gを含有する最少塩類培媒に基くものであった。GMIは、滅菌後に加え られた次のもの;0.25%グルコース; 5 m M M g S O4; 0.02%ディフコカサミノ酸;0.1%酵母抽出物;50gg/mlL ) リブトファン;菌株の栄養要求を満足させるための任意の他のアミノ酸補充20 0μg / mlと一緒での最少塩類であった。GM2は、滅菌後に加えられた 次のもの:0.25%グルコース;10mMMgSO4;o、oi%ディフコカ サミノ酸;0.5m M Ca Cl 2 ;栄養要求を満足させるために必 要な他のアミノ酸35μg / mlと一緒での最少塩類であった。LGA, LGA medium is suitable for achieving sporoform maturity [5 perulrtion-prol. icient (Spo) 1 strain is distinguished from the sporulation-deficient (Spoi) strain. The Spo+ strain developed a brown color after 48 hours of incubation at 37°C. and opaque, and the 5po-strain became white and transparent [pivot (P iggoj), 1973, J, Baete+1o1114:1241~ 1253]. LGA per 11: glutamic acid 2g7 sodium lactate 2.8g ;Agar 15g: L-alanine 100mg;FeC/3-6H200,98■;M gC1・6H208,3■;MnC1-4HO19,8mg;NH4Cl 5 35mg; Na So 106mg; KH2PO468; NHNo 96.5mg; Ca (,72219mg in nutritional step-down method) was the medium used (see below). They are 11: K 2 HP O 414g; KHPO46g; trisodium citrate 1g; (NH4)2S It was based on a minimal salt medium containing 0.042 g. GMI is added after sterilization. The following were added; 0.25% glucose; 5 m M g S O4; 0.02% diffcocasamino acid; 0.1% yeast extract; 50gg/mlL) Ributophane; optional other amino acid supplements to meet the nutritional requirements of the strain20 The lowest salt content was 0 μg/ml. GM2 was added after sterilization The following: 0.25% glucose; 10mM MgSO4; o, oi% diffcoca Saminoic acid; 0.5m M Ca Cl 2 ; Necessary to satisfy nutritional requirements The amount of salt was minimal along with 35 μg/ml of other essential amino acids.
3) 染色体DNAの製造 B、スブチリス競合細胞の形質転換のためのDNAを製造するために、供与菌株 を先ずフラスコ21個中のL−培地200 ml中で、37℃において振盪しつ つ1夜生長させた。細胞を遠心分離により取り出し、TES (11当りトリス 6g5EDTA 1.9g、NaCl2.9gからなる、p)18.O)80 ml中で洗滌し、ついでTESS (25%グルコースを含有するTES)7m l中に再懸濁した。リゾチーム20■を加え、そして細胞懸濁液をよく混合し、 ついで37℃において20分間インキュベートした。0.5M EDTA 1.5mlおよび12%SD8 2mlの添加の後に、混合物を65℃において 7分間インキュベートした。冷却した後、5M過塩素酸ナトリウム2.5mlを 加え、そして混合物をフェノールで抽出した。水性層中の染色体DNAを、つい でマニアチス(MgIlixtis)等、1982、モレキュラー、クローニン グ(Molec++ltr CIoniB ) 、ア、ラボラトリ−〜マニュア ル(A I*borNo+7 Mtnaal)、コーノトド、スプリング、ハー バ−、ラボラトリ−(Cold 5prin(Harbour Lxbonto r7)中に記載された如く、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。3) Production of chromosomal DNA B. Donor strain to produce DNA for transformation of S. subtilis competitor cells. was first shaken at 37°C in 200 ml of L-medium in 21 flasks. The seeds were allowed to grow for one night. The cells were removed by centrifugation, and TES (11 Consisting of 6g5EDTA 1.9g, NaCl2.9g, p) 18. O) 80 ml and then TESS (TES containing 25% glucose) 7ml resuspended in l. Add 20μ of lysozyme and mix the cell suspension well. It was then incubated at 37°C for 20 minutes. 0.5M EDTA After addition of 1.5 ml and 2 ml of 12% SD8, the mixture was heated at 65°C. Incubated for 7 minutes. After cooling, add 2.5 ml of 5M sodium perchlorate. and the mixture was extracted with phenol. The chromosomal DNA in the aqueous layer is MgIlixtis et al., 1982, Molecular, Cronin (Molec++ltr CIoniB), A, Laboratory ~ Manual Le (AI*borNo+7 Mtnaal), Konotodo, Spring, Her Bar, Laboratory (Cold 5prin (Harbour Lxbonto) Purified by cesium chloride density gradient centrifugation as described in r7).
コンピテント細胞をドウーリ−(Dooley)等、1971、J、 Bicj eriol 108 : 668の方法の変形により製造した。形質転換され るべき菌株の大量の単一コロニーをL−培地25m1中に接種し、そして30℃ 飄において振盪しつつ1夜生長させた。10m1からの細胞を遠心分離により採 取し、モして600nmにおいて0.4の光学密度(0,D600)まで、25 0m1容フラスコ中の25m1に接種した。培養物を37℃において振盪しつつ インキュベートし、そしてその生長を、1時間間隔で摂取した検体の0D600 を測定することにより追跡した。培養物が生長相の終末に達したとき、10m1 を取り出し、細胞を遠心分離により採取し、そして最少塩類10 ml中に再懸 濁した。それら細胞は、0.2の0D600までGM2の25m1を接種するた めに使用した。この培養物を、37℃において振盪しつつ90分間生長させ、細 胞を遠心分離により採取し、10%グリセロールを含有するGM2 2.5+o l中に再懸濁し、200μm部分に分割し、そして形質転換を要求されるまで一 80℃において貯蔵した。Competent cells were prepared by Dooley et al., 1971, J. Bicj. eriol 108: Manufactured by a modification of the method of 668. transformed A large single colony of the desired strain was inoculated into 25 ml of L-medium and incubated at 30°C. The seeds were allowed to grow overnight with shaking in the air. Cells from 10 ml were harvested by centrifugation. 25 to an optical density of 0.4 at 600 nm (0, D600). 25ml in a 0ml flask was inoculated. Cultures were incubated at 37°C with shaking. 0D600 of the specimens incubated and their growth was ingested at 1 hour intervals. was tracked by measuring. When the culture reaches the end of the growth phase, 10 m1 cells were harvested by centrifugation and resuspended in 10 ml of minimal saline. It got cloudy. The cells were inoculated with 25ml of GM2 to a 0D600 of 0.2. I used it for this purpose. The culture was grown for 90 minutes with shaking at 37°C and Cells were collected by centrifugation and mixed with GM2 2.5+o containing 10% glycerol. Resuspend in 200 μl, divide into 200 μm portions, and incubate until transformation is required. Stored at 80°C.
形質転換のために、それらコンピテント細胞の200μm部分を37℃において 急速に解凍し、染色体DNAと所定濃度において混合し、室温で10分間インキ ュベートし、最少塩類中で洗滌し、再遠心分離し、最少塩類中に再懸濁し、つい で選択性寒天プレート上に拡げ、それを37℃においてインキュベートした。コ ンプレッションにより変異を移転するために設計された菌株構成実験、即ち別個 のDNA断片でのコントランスフォーメーション(contran@fo+mx 口on)において、供与染色体DNAが10μl / mlの終濃度において使 用された。For transformation, 200 μm sections of the competent cells were incubated at 37°C. Rapidly thaw, mix with chromosomal DNA at a given concentration, and ink for 10 minutes at room temperature. Wash in minimal salts, recentrifuge, resuspend in minimal salts, and then resuspend in minimal salts. on selective agar plates, which were incubated at 37°C. Ko Strain construction experiments designed to transfer mutations by compression, i.e. Contransformation with DNA fragment (contran@fo+mx The donor chromosomal DNA was used at a final concentration of 10 μl/ml. was used.
培養上澄液中のプロテアーゼ活性を、ブレステジ(Preslidle)等、1 971.1. ilgctetiol 107 : 815〜823により記 載された方法の改変により検定した。培養物は、250m1容フラスコ中の2倍 正常濃度り一培地25m1中で、37℃において振盪しつつ生成させ、そして培 養物の生長はO,D600を測定することにより追跡した。この媒質中で、培養 物はO,D600において4.5の静止相に達した。検体1.5mlを、静止相 への15時間まで、生長相における後から各時点において採取した。それら検体 を、ベンチ・マイクロセントリフユージ(bench m1crc+c*1ri fBe)中1200 Orpmにおいて10分間回転し、細胞を捨て、そして細 胞を完全に除去するために、上澄液を更に10分間再回転した。The protease activity in the culture supernatant was determined by Preslidle et al. 971.1. ilgctetiol 107: Written by 815-823 It was tested by a modification of the method described. Cultures are grown 2x in 250ml flasks. Produced in 25 ml of normal concentration Riichi medium at 37°C with shaking and cultured. Growth of the nutrients was tracked by measuring O,D600. Cultured in this medium The object reached a stationary phase of 4.5 at O,D600. Transfer 1.5 ml of the sample to the stationary phase. Samples were taken at each time point from later on in the growth phase up to 15 hours. those specimens , bench microcentrifuge (bench m1crc+c*1ri Spin for 10 min at 1200 Orpm in fBe), discard cells, and The supernatant was re-spun for an additional 10 minutes to completely remove the cells.
それら上澄液のプロテアーゼ活性は、上澄液150μlをLM)リス/HCI (pi!8)50μtSH2050μ!および2%アゾカゼイン[シグマ、ケミ カル、カンパニー (SrHms Hcmicsl Compsny) 25 0 p Iと混合し、次のアゾカゼイン検定により決定した。この混合物を30 ℃において60分間インキユベートシ、そして反応を冷7%過塩素酸の添加によ り停止させた。混合物をついで、ベンチ・マイクロセントリフエージ中で、12 00Qrpa+において30分間遠心分離した。上澄液1000illをついで 取出し、そしてIOM NaO8150μlと充分に混合した。各混合物の4 36%mにおける吸収を、各検体につき、同じ方法を使用するがアゾカゼイン前 に過塩素酸を加えて製造した0時間ブランクに対し、分光光度計上で測定した。The protease activity of these supernatants was measured using 150 μl of the supernatant (LM) Lis/HCI. (pi!8) 50μtSH2050μ! and 2% azocasein [Sigma, Chemi Cal, Company (SrHms Hcmicsl Compsny) 25 0 pI and determined by the following azocasein assay. Add this mixture to 30 Incubate for 60 min at °C and quench the reaction by adding cold 7% perchloric acid. I stopped it. The mixture was then incubated in a bench microcentrifuge for 12 Centrifuged for 30 minutes at 00Qrpa+. Add 1000ill of supernatant liquid and It was taken out and thoroughly mixed with 150 μl of IOM NaO8. 4 of each mixture Absorbance at 36% m was determined for each specimen using the same method but before azocasein. A 0-hour blank prepared by adding perchloric acid was measured on a spectrophotometer.
菌株のプロテアーゼ水準を、1%ディフコ(Difco)スキムミルクを含有す るし一寒天プレー) (SML、AブL/−ト)上で、37℃において、2〜5 日後に、清澄帯の寸法を比較することによりあらく評価した。The protease levels of the strains were adjusted to 1% with Difco skim milk. Rushiichi Agar Plate) (SML, Aburi L/-T) at 37℃, 2-5 After a day, a rough evaluation was made by comparing the dimensions of the clear zone.
0.75■/mlスタフイ口コツカル・プロティンA(単一バンド純度、シグマ ・ケミカル・カンパニーから)の20μlを培養上澄液の20μlと混合し、そ して37℃において30分間インキュベートした。SPAの分解は、マニアチス (Mcaistis)等、1982に記載された如くに、10%5DS−含有ポ リアクリルアミドゲル上でそれら検体を電気泳動し、そしてコマシー・ブルーで 染色し、モしてSPAバンドの完全性または消失を観察することにより評価した 。0.75■/ml Staphylococcal Protein A (single band purity, Sigma ・Mix 20 μl of the culture supernatant (from Chemical Company) with 20 μl of the culture supernatant; and incubated for 30 minutes at 37°C. Decomposition of SPA is caused by Maniatis maniatis (McAistis et al., 1982). The specimens were electrophoresed on a lyacrylamide gel and with Comassie Blue. It was evaluated by staining and observing the completeness or disappearance of the SPA band. .
表1に列挙したすべての胞子形成−欠除および他の菌株により産生されるプロテ アーゼ活性を、SMLAプレート上の清澄帯の大きさを観察すること、そして物 質および方法中に記載した如<SPA分解試験を行うことの両者により評価した 。すべてのそれら菌株は、37℃における数日間のインキュベーションの後でさ えも清澄帯を導かなかったC1MB5 (Apr” Npr″′株)を除いて、 SMLA上で同じ大きさの清澄帯を導いた。All sporulation-deletion and protein produced by other strains listed in Table 1 The enzyme activity was determined by observing the size of the clear zone on the SMLA plate, and by observing the size of the clear zone on the SMLA plate. The quality was evaluated both by conducting the SPA degradation test as described in the method. . All those strains were recovered after several days of incubation at 37°C. Except for C1MB5 (Apr"Npr"' stock) which did not lead to the Emo Clear Zone, A clear zone of the same size was derived on the SMLA.
が対照菌株EMG50およびlA289と比較して減少した分解を示した。すべ ての他の菌株は、C1MB5のそれを包含して、30分間のインキュベーション の後に、無傷のSPA帯の完全な消失を導いた。ついで培養上澄液のアゾカゼイ ン検定を、いずれかの試験により減少したプロテアーゼ産生を示すと同定された 菌株、即ち0H46(SpoOH) 、l553 (SpoOA−)、C1MB 5 (Ap r−Np r−)について、そして対照菌株lA289について行 った(物質および方法に記載した如く)。結果は第2に与え、対照菌株lA28 9により示される活性のパーセンテージとして表わす。それら検定において使用 した培養上澄液は、静止相へのそれらの導入の2時間後に培養液から製造した。showed reduced degradation compared to control strains EMG50 and IA289. All All other strains, including that of C1MB5, were tested for 30 minutes of incubation. , leading to complete disappearance of the intact SPA zone. Next, culture supernatant Azocasei identified by either test as exhibiting decreased protease production. Strains, namely 0H46 (SpoOH), l553 (SpoOA-), C1MB 5 (Ap r-Np r-) and the control strain lA289. (as described in Materials and Methods). Results are given in the second, control strain lA28 It is expressed as a percentage of the activity indicated by 9. used in those tests Culture supernatants were prepared from the cultures 2 hours after their introduction into the stationary phase.
この時間において、apr npr遺伝子中に変異を担う菌株はlA289に 見出される総プロテアーゼ活性の25%しか示さなかった。5poOH−株は、 プロテアーゼ活性における著しい減少(lA289に見出されるそれの68%) を示した。予想外に、5poOA遺伝子中に変異を担う菌株は、lA289によ り若干高いプロテアーゼ水準(107%)を示した。同様の実験、ファーネスド ック(Fshnestack)およびフィッシャー(Fishet) 、198 7、アプル、エンブ、マイクロパイオル(^pp1. Enマ。At this time, the strain carrying the mutation in the apr npr gene is lA289. It represented only 25% of the total protease activity found. The 5poOH- strain is Significant reduction in protease activity (68% of that found in lA289) showed that. Unexpectedly, the strain carrying the mutation in the 5poOA gene was showed slightly higher protease levels (107%). A similar experiment, Furnaced Fshnestack and Fishet, 198 7. Apple, Enbu, Micropaiol (^pp1. Enma.
Microbiol ) 53 : 379〜384において、対照菌株と比 較して、見出された減少した水準のプロテアーゼ活性が、同じ5poOA−株( I S 53)により導かれた。Microbiol) 53:379-384 compared to the control strain. In comparison, the reduced levels of protease activity found in the same 5poOA-strain ( IS 53).
それらの結果およびその他(下記参照)は、菌株lA289それ自体が、最も普 通に使用されるB、スブチリス株と比較して、低いプロテアーゼ産生者であるこ とを示lA289 1000H4668 1S53 107107CI 25(N、 B、検定は静止相中への導入の2時間後に培養上澄液について 行い、結果はlA289活性のパーセンテージとして表わした)。Those results and others (see below) indicate that strain IA289 itself is the most common. It is a low protease producer compared to commonly used B. subtilis strains. Indicates 1A289 1000H4668 1S53 107107CI 25 (N, B, assays were performed on culture supernatants 2 hours after introduction into the stationary phase) results were expressed as a percentage of 1A289 activity).
apr npr遺伝子中に変異(即ちapr−npr−)を担う菌株CIMB 5はアゾカゼイン検定において極めて低いプロテアーゼ活性を示したけれども、 SPA分解試験の結果は5poOA−および5poOH−株の両方がSPA分解 に含まれる1種もしくはそれ以上の微少プロテアーゼの減少された水準を有しな ければならないことを示唆した。従って、sp。apr Bacterial strain CIMB carrying a mutation in the npr gene (i.e. apr-npr-) Although 5 showed extremely low protease activity in the azocasein assay, The results of the SPA degradation test showed that both 5poOA- and 5poOH- strains degraded SPA. have reduced levels of one or more microproteases contained in suggested that it should be done. Therefore, sp.
Apr−Npr−株の改善された誘導体を構成するための試みがなされた。Attempts have been made to construct improved derivatives of the Apr-Npr- strain.
5poOHおよび5poOA変異を、コンプレッション(物質および方法参照) により、01MB5に移転させた。01MB5の競合細胞を、物質および方法に 記載した如くに製造し、そして物質および方法にまた記載された如くに、菌株0 H46およびl553の染色体DNAで、10μg / mlのDNA濃度にお いて形質転換(別々に)した。形質転換混合物を、Phe+形質転換について選 択するために、リジンおよびトリプトファンを補充した最少塩類寒天のプレート に載せた。100のそのような形質転換体を、5poOAまたは5poOH変異 の同時獲得につき試験するために、LGA上に再すし引きした。The 5poOH and 5poOA mutations were compressed (see Materials and Methods). I moved it to 01MB5. 01MB5 competitor cells to Materials and Methods Strain 0 was prepared as described and as also described in Materials and Methods. H46 and l553 chromosomal DNA at a DNA concentration of 10 μg/ml. and transformed (separately). Transformation mixture was selected for Phe+ transformation. plates of minimal salt agar supplemented with lysine and tryptophan to I posted it on. 100 such transformants were transformed into 5poOA or 5poOH mutants. To test for the simultaneous acquisition of
代表的Phe 5po−株は、Ap r−Np r−8poOH−三重変異体 の場合において、01MB7と、そしてApr−Npr−5poOA三重変異体 の場合においてCIMBIIと呼ばれた。SMLAプレート上にすし引きしたと き、01MB7もCIMBIIも清澄帯を導かず、それらが共にaprおよびn pr変異を保持していることを指示している。A representative Phe 5po- strain is the Ap r-Np r-8poOH- triple mutant. 01MB7 and the Apr-Npr-5poOA triple mutant In this case it was called CIMBII. Sushi pulled on SMLA plate However, neither 01MB7 nor CIMBII lead to clear zones, and they both lead to apr and n This indicates that the pr mutation is retained.
分泌されるプロテアーゼの水準に影響する変異を担うのに加えて、01MB5. 01MB7およびCIMBllはすべて、遺伝子iSpによってコードされる主 要細胞内セリンプロテアーゼに影響する挿入変異を担っている。挿入されそして iSpを不活性化する断片は、プラスミドpc194のクロランフェニコール耐 性遺伝子を担っている。Cmr遺伝子はまた、プラスミドpPOD2400、そ れら低プロテアーゼ菌株(後記参照)において分泌される非対応蛋白質の分解を 比較するために後プラスミド、上に担われている。それら菌株の染色体中の同じ Cmr遺伝子の存在は、形質転換に引続くプラスミドの完全化を導くであろう。In addition to carrying mutations that affect the levels of secreted protease, 01MB5. 01MB7 and CIMBll are all primary genes encoded by the gene iSp. Responsible for insertional mutations that affect essential intracellular serine proteases. inserted and The fragment that inactivates iSp is a chloramphenicol-resistant fragment of plasmid pc194. It carries the sex genes. The Cmr gene is also expressed on plasmid pPOD2400, which Degradation of non-compatible proteins secreted by these low protease strains (see below) To compare, the plasmid is carried on. the same in the chromosomes of those strains The presence of the Cmr gene will lead to completion of the plasmid following transformation.
Cm 遺伝子を欠くが5poOAまたは5poOH遺伝子中に変異を担う01 MB5の誘導体が、従って次の如く構成された。01 that lacks the Cm gene but carries a mutation in the 5poOA or 5poOH gene A derivative of MB5 was therefore constructed as follows.
01MB5の競合細胞を、LyS 形質転換体につき選択するために、フェニル アラニンおよびトリプトファンを補充した最少塩類寒天上の選択を有する菌株l 553の染色体DNAで形質転換した。100のそのような形質転換体を、クロ ランフェニコール感受性に同時に形質転換されたそれを同定するために、クロラ ンフェニコールを含有するし一寒天上にすし引きした。1つのそのような菌株は 、SMLAプレート試験によりaprCIMB12と称された。同じ方法をつい で、01MB5から01MB7およびCIMBIIを構成するために上記した如 くに、C1MB12からAp r−Np r−8poOA−およびApr−Np r−5poOH−株を構成するために使用した。クロランフェニコール感受性A p r−Np r−5poOA−およびAp r−Np r−8poOH−株は 、それぞれC1MB13および01MB14と称された。To select for 01MB5 competitors for LyS transformants, phenyl Strains with selection on minimal salt agar supplemented with alanine and tryptophan 553 was transformed with chromosomal DNA. 100 such transformants were cloned. Chlora to identify those co-transformed with lamphenicol sensitivity. It was sushi-dried onto shiitake agar containing nphenicol. One such strain is , designated aprCIMB12 by SMLA plate testing. Follow the same method So, to configure 01MB5 to 01MB7 and CIMBII, do as described above. In particular, Ap r-Np r-8poOA- and Apr-Np from C1MB12 was used to construct the r-5poOH- strain. Chloramphenicol sensitivity A p r-Np r-5poOA- and Ap r-Np r-8poOH- strains , were designated C1MB13 and 01MB14, respectively.
例3 Apr−Npr−1Apr−Npr−8poOA−およびAp r−N p r−5poOH−株についてのプロテアーゼ活性の決定 01MB5.01MB7、CIMBII、C1MBI3.01MB14および対 照株を生長させ、そして物質および方法に記載した如くに、プロテアーゼ活性を 決定するために、アゾカゼイン検定を行った。結果を表3に5poOA−1Ap r−Npr−5poOHおよび対照株の培養上澄液中のプロテアーゼ活性 菌株 プロテアーゼ活性 lA289 100 0H4668 1S53 114 01MB5 25 01MB7 13 CIMBI 1 61CIMB13 50 CIMB14 16 (N、B、検定は定常期への導入の2時間後に培養物の上澄液について行い、結 果はlA289活性のパーセンテージで表わした)。Example 3 Apr-Npr-1Apr-Npr-8poOA- and Apr-N Determination of protease activity for the pr-5poOH- strain 01MB5.01MB7, CIMBII, C1MBI3.01MB14 and the protease activity was determined as described in Materials and Methods. To determine, an azocasein assay was performed. The results are shown in Table 3. Protease activity in culture supernatants of r-Npr-5poOH and control strains Strain Protease activity lA289 100 0H4668 1S53 114 01MB5 25 01MB7 13 CIMBI 1 61CIMB13 50 CIMB14 16 (N, B, assays were performed on culture supernatants 2 hours after introduction into stationary phase; Results are expressed as percentage of 1A289 activity).
結果は5poOH変異の導入が、定常期中で2時間であった選択した時点におい て、Apr−Npr−株の分泌されたプロテアーゼ活性を約半分に減少したこと 示している。The results show that the introduction of the 5poOH mutation occurred at the selected time point, which was 2 hours into the stationary phase. The secreted protease activity of the Apr-Npr- strain was reduced by about half. It shows.
しかしながら、apr npr 5poOA三重変異株(即ちAp r−N p r−5poOA−)は、予想外に高いプロテアーゼ水準を示した。However, apr npr 5poOA triple mutant (i.e. Apr-N pr-5poOA-) showed unexpectedly high protease levels.
多くのB6゛スブチリス発現系について、高収率への分泌された生成物の蓄積は 、定常期中での延長された期間を、多分必要とする。定常期中で4時間および1 8時間生長させた培養物の上澄液中のプロテアーゼ活性を、従って菌株CIMB 5.01MB7、lA289および第2の対照株、これはEMG50であり−I A289に比し分泌されたプロテアーゼのその水準において、普通に使用される B、スブチリス株のより典型的な原始栄養性株につき決定した。結果を表4に与 える表4 Apr−Npr−1Apr−Npr−菌株 プロ テアーゼ活性定常期中4時間 定常期中18時間 EMG50 100 1001A289 12 23CIMB5 6 10C10Cl 2.5 2.6(N、 B、結果はEMG50活性のパーセ ンテージとして表わす) それらの結果は、Apr−Npr−5poOH−三重変異株が、apr np r二重変異株の分泌されたプロテアーゼ活性の半分以下を定常期中4時間で、そ して約1/4のみを定常期中18時間後に導いたことを示している。結果はまた 、菌株lA289が比較的低いプロテアーゼ水準を導くことを確証している。For many B6 subtilis expression systems, accumulation of secreted product to high yields is , possibly requiring an extended period in the stationary phase. 4 hours and 1 during stationary phase The protease activity in the supernatant of cultures grown for 8 hours was therefore determined by strain CIMB. 5.01MB7, IA289 and a second control strain, which is EMG50-I At its level of secreted protease compared to A289, commonly used B. Determined for a more typical prototrophic strain of S. subtilis strains. The results are given in Table 4. Table 4 Apr-Npr-1Apr-Npr-strain Tease activity 4 hours during stationary phase 18 hours during stationary phase EMG50 100 1001A289 12 23CIMB5 6 10C10Cl 2.5 2.6 (N, B, result is a percentage of EMG50 activity ) These results showed that the Apr-Npr-5poOH- triple mutant Less than half of the secreted protease activity of the r double mutant strain is reduced during the stationary phase for 4 hours. This shows that only about 1/4 of the results were derived after 18 hours during the stationary phase. The result is also , confirming that strain IA289 leads to relatively low protease levels.
SPA分解試験を、菌株EMG50、C1MB12(Apr−Npr−)、C1 MB13 (Apr−Npr−5poOA−)およびCIMB 15 (Ap r−Npr−5poOH−株CIMB 14の原始栄養性誘導体)の培養上澄液 を使用して行った。静止相中で3時間および15時間の培養物の上澄液を使用し た。図1は、この実験から生じたコマシー染色SDS/アクリルアミドゲルの写 真である。電気泳動した検体は、次の如くであった:レーン1、分子量マーカー ;レーン2、未処理SPA、レーン3、EMG50上澄液と3時間インキュベー トしたSPA;レーン4、C1MB12上澄液と3時間インキュベートしたSP A、レーン5、CI M B 15上澄液と3時間インキュベートしたSPA、 レーン6、C1MB13上澄液と3時間インキュベートしたSPA。The SPA degradation test was performed using strains EMG50, C1MB12 (Apr-Npr-), C1 MB13 (Apr-Npr-5poOA-) and CIMB15 (Ap Culture supernatant of r-Npr-5poOH- (prototrophic derivative of strain CIMB 14) It was done using . Supernatants of 3 and 15 h cultures in stationary phase were used. Ta. Figure 1 shows a copy of the Comassie-stained SDS/acrylamide gel resulting from this experiment. True. The electrophoresed samples were as follows: lane 1, molecular weight marker; ; lane 2, untreated SPA; lane 3, incubation with EMG50 supernatant for 3 hours. Lane 4, SP incubated with C1MB12 supernatant for 3 hours A, lane 5, SPA incubated with CI M B 15 supernatant for 3 hours; Lane 6, SPA incubated with C1MB13 supernatant for 3 hours.
レーン7、EMG50上澄液と15時間インキュベートしたSPA、レーン8、 C1MB12上澄液と15時間インキュベートしたSPA;レーン9、C1MB 15上澄液と15時間インキュベートしたSPA、レーン10、C1MB13上 澄液と15時間インキュベートしたSPAoEMG50上澄液とのインキュベー ションは、無傷のSPAバンドの完全な消失を導く。C1MB12上澄液とのイ ンキュベーションは、微量の無傷のSPAしか残さず、他方CIMB13および C1MB15上澄液の両方は、試験した両方の時点で、CIMBのそれより低い 分解を与える。顕著な結果は、C1MB15上澄液が、両方の時点においてC1 MB13のそれより低いSPA分解を明らかに生じるということである。レーン 4.5および6のゲルスキャンニングは、静止相への導入の3時間後に取った培 養上澄液によるSPA分解の範囲を定量化するために、ジョイス/レーベル・ク ロモスキャン(Jo7ce /Loebel Cbromoscxn) 3ゲル スキヤナーを使用して行った。結果は、CIMB123およびC1MB13上澄 液とのインキュベーションがSPAのそれぞれ93%および64%の分解を生じ 、他方C1MB15上澄液とのインキュベーションがSPAの33%の分解しか 生じなかったことを示した。lane 7, SPA incubated with EMG50 supernatant for 15 hours, lane 8; SPA incubated with C1MB12 supernatant for 15 hours; lane 9, C1MB SPA incubated with 15 supernatant for 15 hours, lane 10, on C1MB13 Incubation of clear solution with SPAoEMG50 supernatant incubated for 15 hours tion leads to complete disappearance of the intact SPA band. Incubation with C1MB12 supernatant Incubation left only traces of intact SPA, while CIMB13 and Both C1MB15 supernatants are lower than that of CIMB at both time points tested. Give a decomposition. A striking result is that the C1MB15 supernatant at both time points It clearly results in lower SPA degradation than that of MB13. lane 4. Gel scans in 5 and 6 were performed on media taken 3 hours after introduction into the stationary phase. To quantify the extent of SPA degradation by the culture supernatant, we Lomoscan (Jo7ce/Loebel Cbromoscxn) 3 gel This was done using a scanner. Results are for CIMB123 and C1MB13 supernatants. Incubation with SPA resulted in 93% and 64% degradation of SPA, respectively. , while incubation with C1MB15 supernatant resulted in only 33% degradation of SPA. It was shown that this did not occur.
タマーゼの産生および分解におけるAp r−Np r−1Apr−Npr−5 poOA−およびAp r−Np r−3poOH−株の挙動を比較するために 、プラスミドpPOD2400を菌株CIMB12、C1MB13.01MB1 5およびEMG50中に形質転換した。Ap r-Np r-1Apr-Npr-5 in tamase production and degradation To compare the behavior of poOA- and Apr-Npr-3poOH- strains , plasmid pPOD2400 was transferred to strains CIMB12, C1MB13.01MB1 5 and EMG50.
pPOD2400はバンド(Band)等、1983、Gene26 : 31 3〜315のプラスミドpCPP4に由来し、そして複製機能およびPUBII Oのカナマイシン抵抗性を、β−ラクタマーゼがα−アミラーゼ転写および翻訳 開始信号を使用してB、スブチリス中に発現されるように、バチルスα−アミラ ーゼの信号配列を有する枠内に融合するE、コリTEMβ−ラクタマーゼの成熟 コーディング領域からなる雑種遺伝子と一緒で担っている。pPOD2400 is from Band et al., 1983, Gene26: 31 3-315 is derived from the plasmid pCPP4 and has replication functions and PUBII β-lactamase and α-amylase transcription and translation contribute to kanamycin resistance in O. B. subtilis as expressed in B. subtilis using the initiation signal. Maturation of E. coli TEM β-lactamase fused in frame with the signal sequence of the E. coli TEM β-lactamase. It is carried along with a hybrid gene consisting of a coding region.
かくして、pPOD2400は、β−ラクタマーゼがα−アミラーゼ信号配列を 使用してB、スブチリスから有効に分泌されるが、低プロテアーゼ株においてさ えも、B、スブチリスの分泌されたプロテアーゼにより生長相の終りにおいて急 速に分解することを見出したウールマン(Ulmxnn)等、1985.1.B mcje+iol 162 : 176〜182により記載されたプラスミド pKTH78に非常に似ている。pPOD2400を、チャン(Chang)お よびコーエン(Cohen)、1979、モレク、ジエン、ジエネト(Mole c、Gen、Genel) 168 : 111〜115のプロトプラスト形質 転換方法を使用し、0.9%溶性デンプン、0.4%ゼラチン、0.04%仔牛 血清アルブミンおよび300μg / mlカナマイシンを含有(Cbangお よびCohenにより記載された成分に加えて)するDM3媒質上の選択で、菌 株CIMB12、C1MB13.01MB15およびEMG50中に形質転換し た。プラスミドミニ製゛剤は、マニアチス(Mxniajis)等、1982に 記載された如き代表的カナマイシン抵抗性形質転換体上で遂行し、そしてアガロ ースゲル電気泳動を、それら形質転換体中のプラスミドの完全性を確認するため に使用した。pPOD2400を担う各菌株の1つの代表的形質転換体を、3% グルコースおよび10μg / mlカナマイシンを加えた(プラスミドの保持 を確実とするため)L−培地中の200 mll容器器内培養物25m1中で生 長させ、振盪しつつ37℃でインキュベートした。検体1 mlをそれら培養物 の生長を通して各時点で取り出し、0D600を増殖密度の指標として測定し、 細胞をアゾカゼインプロテアーゼ検定につき記載した如くに遠心分離により除去 し、そして上澄液をスミス(Swith)等、1986、J、 Blcjtri ol 169 : 3321〜3328により記載された如くにβ−ラクタマ ーゼ活性につき検定した。β−ラクタマーゼ検定の結果を、図2にグラフ的に示 した。すべての4菌株は約7時間後の生長相の終末に到達し、そして図2はすべ ての4菌株についてβ−ラクタマーゼ活性はこの時間付近でそれらのピーク値に 到達する。pPOD2400を担うEMG50は、最低のβ−ラクタマーゼ活性 を産生じた。このプラスミドを担う01MB12およびC1MB13はEMG5 0に比し著しく大きな活性を導いて、活性は9時間までの時点で、01MB12 よりC1MB13の方が僅かに大きい。従って、5poOA変異の存在は、Ap r−Np r−珠玉のβ−ラクタマーゼ分解において僅かな減少しか与えなか った。それらの結果と対照的に、図2から、5p00H変更の存在はβ−ラクタ マーゼ分解における劇的な減少を導くことが明らかであり:β−ラクタマーゼ活 性は、試験したすべての時点において01MB12またはC1MB13のそれに 比し、C1MB15の上澄液中で劇的に高いことが見出された。最後の時点、接 種の24時間後そして静止相中で約17時間後において、CIMB15上澄液中 のβ−ラクタマーゼ活性は、他の菌株のいずれかのそれより約4倍高かった。こ の時点において、培養物の希釈を、各培養物中の細胞を含有するプラスミドの% を決定するために、L−寒天および10μg / mlカナマイシンを含有する し一寒天の両方のプレートに載せた。結果は、C1M15と他の菌株との間のβ −ラクタマーゼ活性における差がプラスミド安定性における差により説明しえな いことを示した。Thus, pPOD2400 allows β-lactamase to carry out the α-amylase signal sequence. B. subtilis is effectively secreted by B. subtilis, but in low protease strains The secreted proteases of the potato, B. subtilis Ulmxnn et al., 1985.1. B mcje+iol 162 : Plasmids described by 176-182 Very similar to pKTH78. pPOD2400 was purchased by Chang or and Cohen, 1979; c, Gen, Genel) 168: Protoplast traits of 111-115 Using the conversion method, 0.9% soluble starch, 0.4% gelatin, 0.04% calf Contains serum albumin and 300μg/ml kanamycin (Cbang or and in addition to the components described by Cohen and B. Transformed into strains CIMB12, C1MB13.01MB15 and EMG50. Ta. A plasmid mini-preparation agent was described by Mxniajis et al., 1982. Performed on representative kanamycin resistant transformants as described and agarose - gel electrophoresis to confirm the integrity of the plasmid in those transformants. used for. One representative transformant of each strain carrying pPOD2400 was incubated at 3% Glucose and 10 μg/ml kanamycin were added (plasmid retention In order to ensure that and incubated at 37°C with shaking. 1 ml of specimen was cultured were removed at each time point throughout growth and measured at 0D600 as an indicator of proliferation density; Cells were removed by centrifugation as described for the azocasein protease assay. and the supernatant was purified by Smith et al., 1986, J. Blcjtri. ol 169: β-lactama as described by 3321-3328 The samples were assayed for enzyme activity. The results of the β-lactamase assay are shown graphically in Figure 2. did. All four strains reached the end of the growth phase after about 7 hours, and Figure 2 shows that all The β-lactamase activities of all four strains reached their peak values around this time. reach. EMG50 carrying pPOD2400 has the lowest β-lactamase activity was produced. 01MB12 and C1MB13 carrying this plasmid are EMG5 01MB12 led to significantly greater activity than 0, and the activity was up to 9 hours. C1MB13 is slightly larger. Therefore, the presence of the 5poOA mutation indicates that Ap r-Np Provides only a slight decrease in the β-lactamase degradation of r-Np It was. In contrast to those results, from Figure 2 we can see that the presence of the 5p00H modification It is clear that this leads to a dramatic decrease in β-lactamase degradation: β-lactamase activity. The gender was that of 01MB12 or C1MB13 at all time points tested. In comparison, it was found to be dramatically higher in the supernatant of C1MB15. Last point, contact in the CIMB15 supernatant after 24 hours of seeding and about 17 hours in stationary phase. The β-lactamase activity of was about 4 times higher than that of any of the other strains. child At the time point, dilute the cultures to the % of plasmid containing cells in each culture. containing L-agar and 10 μg/ml kanamycin to determine Shiichi put it on both plates of agar. The results show that the β between C1M15 and other strains - Differences in lactamase activity cannot be explained by differences in plasmid stability. It was shown that
Npr−二重変異に導入することにより、即ち両方の主要な分泌されるプロテア ーゼを欠くことにより構成された。遺伝子apr npr 5poOH中に 変異を担う新規三重変異菌株は、3種の別々の試験、即ちアゾカゼイン加水分解 、スタフイロコツカル・プロティンAの分解およびE、コリTEMβ−ラクタマ ーゼの分解において、非常に低い分泌されるプロテアーゼ活性を有することが示 された。By introducing the Npr-double mutant, i.e. both major secreted protea It was constructed by lacking an enzyme. Gene apr npr in 5poOH The novel triple mutant strain carrying the mutation was tested in three separate tests, namely azocasein hydrolysis. , Degradation of Staphylococcal Protein A and E. Coli TEM β-lactama It has been shown to have very low secreted protease activity in degrading proteases. It was done.
FIG、1 浄書(内容に変更なし) 接種後時間 FIG、 2 手続補正書(自発) 平成1年8刀23日FIG.1 Engraving (no changes to the content) Time after vaccination FIG. 2 Procedural amendment (voluntary) 1999 8th Sword 23rd
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