JPH02501354A

JPH02501354A - 人工ｄｎａ塩基対類似体

Info

Publication number: JPH02501354A
Application number: JP63508006A
Authority: JP
Inventors: ラッパポート，ハリー・ピー
Original assignee: テンプル・ユニバーシティ
Priority date: 1987-09-22
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1990-05-17
Also published as: CA1339352C; ATE76876T1; WO1989002921A1; EP0333832A1; DE3871778T2; AU2527688A; DE3871778D1; EP0333832B1; US5126439A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】人よりＮＡ塩基対類似体本発明は１９８７年９月２２日に米国特許庁に出願された米国特許出願第０９９７４４号の一部継続出願である。

ｌ吸へ１１本発明は、新規なりＮＡ塩基対類似体およびこれらの類似体の製造および使用方法に関する。

良東ａ伎丘保護されたデオキシヌクレオチドからオリゴデオキシヌクレオチドを合成するための単純で、しかも迅速な方法の出現は、ミスマツチ塩基対の物理的および生物学的研究（Ａｂｏｕｌ　−ｅｌ＠。

ｅｔ　ｍｌ、Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１４：４８１１，１９８５）、並びに一方の塩基が類似体である塩基対の研究（Ｊ　１ｒｉｃｎｙ、弓−り−、、ＮｕｃｌｅｉｅＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ、１４：６５７９，１９８６）を数多くもたらした。

細胞の遺伝装置において付加的な相補塩基対として機能しうる一対の塩基を作製することができるかどうかの問題は研究されたことがない、相補的塩基対の作製に用いられる基準は安定性、塩基および／またはヌクレオシドからの（デオキシ）ヌクレオシド三リン酸の生化学的合成経路、必須代謝経路の類似体阻害、（デオキシ）ヌクレオシド三リン酸のＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ利用、ＤＮＡポリメラーゼの誤差頻度および誤差修正、並びにミスマツチ塩基対の修復の諸問題を解決すべきである。

初期の頃、ポリメラーゼの誤差頻度（Ｇｏｏｄｓ＊ａｎ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、８８：４２３，１９７４）、ポリメラーゼの誤差修正、およびミスマツチ塩基対の修復について、構造的または定量的データはほとんど役に立たなかった。これらの問題点はかなり明らかにされた（Ｋｒａｍｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ↓、３８：８７９゜１９８４）。相補的塩基対の作製者のための重要な警告は、遺伝情報の複製の最終的な正確さと、異なる塩基間の相互作用の強度と、の関係が物理的に特定できないということである。

ｉ乳ａ４紅本発明の目的は、人工ピリミジンと対合した人ニブリンから成る新しいオリゴデオキシヌクレオチド塩基対を提供することであり、その場合、二本鎖の構造的一体性が保持されるように、人ニブリンは対合した人工ピリミジンの２，４置換基と相互作用する２、６置換基を有する。

本発明の他の目的は、人工ピリミジンと対合した人ニブリンの塩基対を提供することであり、その場合、人ニブリンはＨｌＯ，ＳおよびＮＨ，から選ばれる２、６置換基を有し、その相補的塩基はＨ，Ｏ，ＳおよびＮＨ，から選ばれる２、４置換基を有する人工ピリミジンである。その結果、人ニブリンの６位は第一塩基相互作用として人工ピリミジンの４位と相互作用し、そして人ニブリンの２位は第二塩基相互作用として人工ピリミジンの２位と相互作用し、その際第−および第二塩基相互作用の少なくとも１つはＨ−３であり、さらに、その塩基対がＡ、Ｔ、ＣおよびＧを含む二本鎖遺伝子配列中に存在する場合、その二本鎖の構造的一体性が保持される。

本発明のさらに他の目的は、相補的塩基対として二本鎖遺伝子配列中に組込むための人ニブリンおよび人工ピリミジンとして使用し得る新規化合物を提供することである。

本発明によれば、次式：（式中、Ｒ４は水素、硫黄、酸素またはアミノであり、Ｒ２は水素、酸素、硫黄またはアミノであり、そしてＲ５は水素、））ロゲン、−Ｓ　ＣＨｓ、−ＯＨ、ヒドロキシメチル、アルコキシ、シアノ、メチルアミノ、ニトロ、または非置換であるかもしくはハロゲン置換された炭素原子数１〜３の炭化水素基である）で表される人工ピリミジンが提供される。また、これらの化合体も含まれる。

さらに、本発明によれば、次式：（式中、Ｒ４は水素、硫黄、酸素またはアミノであり、Ｒｔは水素、硫黄、酸素またはアミノである）で表される人ニブリンが提供される。また、本発明によれば、これらの化合物の３−デアザおよび７−デアザ誘導体も含まれる。

従って、本発明はアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の塩基対、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の塩基対、および人工ピリミジンと対合した人ニブリンの塩基対を有する二本鎖遺伝子配列に関し、その場合、二本鎖の構造的一体性が保持されるように、人ニブリンは対合した人工ピリミジンの２．４置換基との相互作用（水素結合および疎水相互作用から選ばれる）を確立する２、６置換基を有する。天然塩基対に存在するように、本発明の人工塩基対は１−プリン位置と３−ピリミジン位置との間に水素結合を有する０本発明の塩基対において、２．６プリン位置または２．４ピリミジン位置の少なくとも１つの置換基は硫黄であり、その硫黄に相補的な置換基は水素である。望ましくは、相補的人工塩基対間に相互作用をもたらす基は硫黄と水素；酸素と水素；酸素とアミノ；または水素と水素である。

人ニブリンおよび人工ピリミジン並びに塩基対としてのそれらの使用は遺伝学に大いなる進歩をもたらす、いくつかの人ニブリンおよび人工ピリミジンは知られていたが、従来技術のこれらの分子は安定した塩基対の形成のために利用されたことはなかった。実際に、従来技術の人工分子は標準塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドの合成を阻害するために、あるいは例えば抗癌剤としてそれらを使用する場合のように、標的ＤＮＡを不安定にするために用いられた。対照的に、本発明の対合した人ニブリンと人工ビリミジンは安定した二本鎖ＤＮＡの維持を可能にするばかりでなく、これらの人工塩基対は天然に存在する塩基対の存在下でさえも互いと優先的に相互作用するであろう。

組換えＤＮＡ技術の出現と共に生じた社会的関心事は、遺伝学的に改変された生物の外界への漏れおよびそれらが環境に及ぼしうる有害な影響である。もしも本発明の人工塩基対を組込んだ組換え生物が漏れ出たり、環境へ放出されたとしても、人工塩基対を構成するのに必要な人ニブリンおよび人工ビリミジン塩基またはヌクレオシドが存在しないために、それらの生物は複製されないであろう。

本発明の人工塩基対を使用すると、たとえば環境へ漏れ出たり放出されたとしても、複製し得ない生物をつくり出すことが可能である０本発明の人工塩基対は自然界の生物または組換えにより改変された宿主生物によって合成され得ないので、組換え生物のゲノムへの本発明人工塩基対の組込みは、人工塩基を外因的に、例えば増殖培地に、供給しない限り、複製を妨げるであろう、その理由は、宿主生物が本発明の人工塩基対を他の物質から合成するための生合成機構をもたず、人工塩基対の外部供給源に完全に依存するからである。同様に幾分かは、培地中の人工塩基の濃度または生物に利用可能な人工塩基の濃度を調節することによって生物の複製速度をｌ！Ｉｌｔ！４することができる。

本発明の人工塩基対の別の利点は、組換え生物の染色体の特定位置からその生物の複製が同時に起こるような組換え生物をつくるために、本発明の人工塩基対を使用し得る点にある。

図ｍ児第１図：（Ａ）塩基対５−メチル−２−ピリミジノン（左側の塩基）および６−チオグアニン（右側の塩基）の概略図、（Ｂ）写真はシトシン／グアニン塩基対から誘導された塩基対５−メチル−２−ピリミジノン／６−チオグアニンを示す、シトシン／グアニン塩基対はＸ１！結晶学によって決定された二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの末端から３つめの塩基対である（Ｄ　１ｃｋｅｒｓｏｎ、ｅｔａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、１４旦ニア６１，１９８１）、シトシン（左側の塩基）のアミノ基は水素（結合距離１．０９人）で置換された。５−メチル基は示されていない、グアニン（右側の塩基）の酸素は硫黄（結合距離１．７人）により置換された。その他の変更は行わなかった。点は硫黄（１，８人）および水素（１，２人）のファンデルワールス半径の程度を示す。

毘１欠腹吋本発明の塩基対は望ましくいくつかの条件を満たすべきである：すなわち（１）塩基対は二本鎖分子の安定性に寄与すべきである。（２）標準塩基対または新規塩基対と比較したとき、新規塩基と標準塩基との塩基対合に対して有意な自由エネルギーの差異が存在すべきである。

塩基対選択の根底にある主な化学的・生物学的理論は次の通りである：すなわち（１）ピリミジンの３−窒素とプリンの１−窒素との間の水素結合は、これらの位置および水分子の水素結合の正味変化が二本鎖形成を変えないように、保持される。（２）気相における分光分析は、硫黄の水素結合力定数が酸素の１７２であり、Ｘ−Ｈ軸と硫黄結合の対称軸の間の最も安定した角度が酸素の４５°の代わりに９０’であることを示唆した。

その他の置換基も、それが二本鎖遺伝子配列分子の基本的機能を破壊したり不安定にしない限り、いろいろな位置で使用することができる。

塩基対として許容される人ニブリンおよび相補的人工ピリミジンの選択は、例えば水素結合および疎水相互作用並びに立体因子のような、結合因子により影響を受ける９例えば、本発明の人工ビリミジンは、大きいヨウ素原子によってしばしば立体安定性の問題が起こるので、４位にヨウ素原子をもつことはない。

塩基対Ａ／Ｔに対する、Ｇ／Ｔを含む二本鎖の会合定数の比（表■）は１７３であり、この値はＡｂｏｕｌ−ｅｌａら（Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ、１３：４８１１．１９８５）がＩＭＮａｃｌ中で測定した値よりも９倍大きい、彼らの値は二状態モデル（ｔｗｏ　５ｔａｔｅ　ｍｏｄｅｌ）の枠組内で融解時に起こる光学密度変化の解釈に基づいている。

Ｍａｒｋｅｙら（Ｂ　ｉｏ　ｏｌ　ｍｅｒｓ、２２：１２４７，１９８３）は、イオン強度が増加する場合、熱エンタルピーがファントホッフ（Ｖａｎ’Ｌ　Ｈｏｆｆ＞エンタルピーと相違することを明らかにした。その結果は、二状態モデルが会合定数の計算に有意な誤差を導入しうろことを示している。Ｇ／Ｃの代わりにＧ／Ｔを含む７−ｈｅｒ同士の会合定数の低イオン強度および１５℃での直接的ＮＭＲ４定は１／２５の値を与えた（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　−ｔｈｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｅｉｅｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１４，９８５．１９８５）、表■からの相当する比は１９℃で１７４２である。Ｇ／Ｔ塩基対が存在する場合の詳細な配列への安定性の非常に強い依存は、室温において安定なオリゴデオキシヌクレオチドＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃから成る二本鎖の結晶により例証され（Ｋ　ｎｅａｌｅ、ｅｔ　ｓ土、、　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ　１ｏｔａ　、１８６：８０５，１９８５）、一方ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−Ｔ −ｃ−ｃの結晶は６℃以上で融解する（Ｈｕｎｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、１９０：６０５，１９８６）、Ｒ的利用により、融解の二状態モデルに基づいた値は安定性の差を過大評価しがちであるが、二本鎖の酸素的連結に基づいた評価は、部分的塩基対合のみを含む二本鎖が基質として作用しうるので、その差を過小評価しがちであると予想される。酵素的連結の結果とＮＭＲ法の結果とが類似すると安心である。

塩基２−ピリミジノンを含む鋳型オリゴデオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて、Ｃｈａｒｅｚｕｋら（Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１４：９５３０，１９８６＞は標準ヌクレオチドが２−ピリミジノンの真向かいに組込まれないという予備的証拠を提示した。

Ｇ／Ｔ塩基対を除外して、表■の結果はＡｂｏｕｌ−ｅｌａらの結果（上記文献参照）と一致する０両者は標準塩基対が標準塩基のミスマツチ（誤対合）塩基対よりもかなり大きな安定性を与えることを示している。塩基対６−チオグアニン１５−メチル−２−ピリミジノンは標準塩基対アデニン／チミンにほぼ等しい安定性を与えた。ｉ＆大の安定性を有するミスマツチ塩基対、グアニン１５−メチル−２−ピリミジノン、は明らかにＤＮＡポリメラーゼ■によって有意な重合が起こるための適当な幾何学的形状を有していない（Ｃｈａｒｌｃｚｕｋらの上記文献参照）、これらの結果は、塩基対６−チオグアニン１５−メチル−２−ピリミジノンが有用な相補的塩基対であるための物理的特性をそなえていることを示唆している。

トリチウムで標識した６−チオグアニンまたはデオキシリポジルー５−メチル− ２−ピリミジノンを用いるＥｓｅｈｅｒｉｅｈｉａｅｏｌｉによる実験は、その（デオキシ）ヌクレオシド三リン酸が合成されたことを示した。極めて少ない量のそれぞれの塩基がＤＮＡに組込まれた。

先に論じた事柄に加えて、その（デオキシ）ヌクレオシド三リン酸は相補的塩基を含む鋳型に対してＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡポリメラーゼの両方の基質であるべきであり、それらの類似体または誘導体は必須代謝経路の有意な阻害剤であってはならない、新規塩基と標準塩基とのミスマツチは酵素により修復可能であるべきである。

人工ビリミジンはうまたは６アザ誘導体でもありうる。５位が炭素原子である場合、それは水素、ハロゲン、−５ＣＨ，。

−ＯＨ、アルコキシ、シアノ、メチルアミノ、ヒドロキシメチル、ニトロ、および非置換またはハロゲン置換された炭素原子数１〜３の炭化水素基のようなラジカルで置換されていてもよい。

人ニブリンは３−デアザまたは７−デアザ誘導体でもありうる。

２．６プリン置換基または２，４ピリミジン置換基の少なくとも１つは硫黄である。チオケト基が人工塩基対の一方の員子のある位置に存在する場合は常に、人工塩基対の他の員子の相補位置に水素が存在する。望ましくは、硫黄−水素相補的置換基のほかに、人工塩基対は酸素−水素、または酸素−アミノ相補的置換基を含むであろう、２．６プリン置換基は同一であっても異なっていてもよく、例えば硫黄と酸素、硫黄とアミノ、または硫黄と硫黄であり得る。同様に、２．４ピリミジン置換基も同一または相異なる置換基であり得る。

適当な人工塩基対は以下のものである：４−チオケト−ピリミジンおよび２−チオケト−プリン２−アミノ−４−チオケト−ピリミジンお、よび２−クトーブリン２−チオケトーピリミジンおよび６−チオケト−プリン２−チオケト−４−アミノ−ピリミジンおよび６−ケト−プリン２−ケト−４−チオゲトービリミジンおよび２−アミノ−プリン２−チオケト−４−チオゲトービリミジンおよびプリン２−ケト−ピリミジンおよび２−アミノ−６−チオケト−プリン４−チオゲトービリミジンおよび２−ケト−プリン４−ケト−ピリミジンおよび２−チオケト −プリン２−ゲトービリミジンおよび６−チオケト−プリンその他の適当な人工塩基対（但し、ピリミジンは１−デアザ誘導体（ピリジン誘導体）でありうるが、プリンは３−デアザ誘導体であり得ない）は次のものである：２−アミノ−ピリミジンおよび２−ケト−６−チオケト−プリンビリミジンおよび２−チオケト −６−チオケト−プリン４−アミノ−ピリミジンおよび２−チオケト−６−クトープリン塩基対中で用いた人ニブリンおよび人工ビリミジンは、当該技術分野で通常の知識を有する者に知られた技法を用いて合成することができる（Ｓ　ｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｅ　ＡｃｉｄＣｈｅｍｉ＝山■工Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｄｓ、、Ｐａｒｔ　１（１９７８）、２（１９７８）ａｎｄ　３　（１９８６）　；　Ｚ　ｏｒｂａｃｈ　、ｅｔ　ａ土、、Ｓ　ｎｔｈｅｔｉｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　１ｎＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｃｈｉｍｉｓｔｒ　、Ｖｏｌ、　１　、（１９６５）を参照されたい）。

所定の塩基の適当なデオキシヌクレオシドは２−デオキシ−３，５−ジー０−ｐ −）ルオイルー〇−エリスローベントジルクロライド（Ｂｈａｔ、Ｓ　ｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ７、Ｚｏｒｂａｃｈ、ｅｔ　！土、、Ｅｄｓ、、Ｖｏ１．１　、ｐ、５２１．１９６８）および適当に保護された塩基から、（１）溶液中でのシリル−水銀法（Ｂ　１ｒｋｏｆｅｒ、ｅｔ　ａ土、、Ａｎ　ｅｗ、ｃｈｅｍ、、７７：４１４，１９６５）または融合法（Ｋｏｔｉｃｋ、ｅｔａｌ、、止ｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、３４：３８０６゜１９６９）　：あるいは（２）立体特異的ナトリウム塩法（Ｋ　ａｚｉｍｉｅｒｃｚｕｋ。

１１±、、Ｌ四皿ａｔ　ｏｆ工ｊ二にセｙ」ン閏山ＩＬシに１廊、す且：６３７９，１９８４）により合成できる。

３−および７−ジアザプリンデオキシヌクレオシドの合成はナトリウム塩法（Ｋａｚｉｓｉｅｒｃｚｕｋらの上記文献）および適当な誘導体（Ｇｉｎｇｉｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１５：１２１７゜１９８７）を用いて行われる。ピリミジンＣ−デオキシヌクレオシドの合成はヌクレオシドを用いて５ａｔｏら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ７、　Ｔ　ｏｗｎｓｅｎｄ　、　ｅｔ　ｓ↓、、Ｅｄｓ、、Ｐａｒｔ　３．ｐ、８１．１９７８）により記載された方法と類似した方法で行われる。

１−デアザピリミジン誘導体（ピリジン誘導体）の合成は標準有機化学を用いて行われる。ピリジン誘導体はその３位に電子置換を与えるために、ルイス酸、Ａｌα、またはＢ　Ｆ　ｓ、もしくは過塩素酸銀の存在下で２−デオキシ−３，５ −ジー０−ｐ−トルオイル−〇−エリスローベントジルクロライドと反応させる。

人工デオキシヌクレオシドのαおよびβアノマーの両方が製造される場合には、例えば示差結晶化（Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ７、　Ｔ　ｏｗｎｓｅｎｄ　、　ｅｔ　！土、、Ｅｄｓ、、Ｐａｒｔ　２，１９７８）またはカラムクロマトグラフ！　−（Ｌｕ、ｅｔ　ａｌ、、Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、３ニア。

：２９２３，１９７２）のような標準技法によりそれらを分離することができる。

本発明の人工塩基対の挿入による宿主生物の形質転換は、線状セグメントの形でまたはその核酸を宿主ゲノムに組込むことのできるプラスミドまたはファージの一部として、ＤＮＡを取込ませることによって達成される。宿主細胞の形質転換技術は当業者によく知られており、詳しい説明は省略する。

ＤＮＡは多数の人工相補的塩基対を含むことが好適である。

さらに、人工塩基対を含むＤＮＡは、宿主遺伝子の発現または生存力の有意な破壊が重大なことにならないイントロンのような位置で宿主細胞ゲノムの領域に組込まれるのが好ましい。

好気性または嫌気性の、真核および原核生物が本発明の人工塩基対による形質転換の宿主として用いられる。形質転換された生物は適当な発酵槽内で水性培地にて培養することができる。

一般的に、水性培地は例えばほぼ中性ｐＨで約３７℃に保たれ、炭素源としての炭水化物またはグリセロール、窒素源としての硫酸アンモニウム、カリウム源としてのリン酸カリウム、微量元素、硫酸マグネシウムなどの適当な栄養分を含む、培養培地および条件は宿主生物に応じて変化するであろうが、それらは当該技術分野でよく知られている。

本発明の合成塩基対を含む宿主生物が構築された後、培地中の人工塩基対の濃度を調節することにより、宿主細胞の複製を制御することが可能である。適当な塩基対の濃度はそれぞれの生物および宿主ゲノム中の対合塩基の数により変化しうる。培地中の合成塩基対の最適濃度は当業者により容易に決定されるだろう。

本発明の人工塩基対は、生物の複製が同時的に起こる組換え生物の構築をも可能にする。この技術は制限酵素および連結の標準寸法を用いて、例えばＭｕファージ突然変異体Ｍｕｄ　■（ｌａｅ。

ａｐ）のような人工塩基対の配列を導入することにより達成しうる（Ｃａｓａｄａｂａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｅａ−ｄｅ＋ａ　ｏｒ　５ｅｉｅｎｅｅｓ、７６：４５３０，１９７９）、　ＭｕｄゲノムはＥ、ｃｏｌｉ染色体のほとんどどの位置にでも組込まれ、特定領域にＭｕｄＪを組込んだクローンを選別することができる（Ｃａｓａｄｅｂａｎらの上記文献）０人工塩基の外部供給源の不在下では、複製複合体は染色体中の人工塩基対に到達するときに複製を停止するであろう、結局、培養下の細胞はすべて染色体のこの特異な位置で複製を成し遂げなり中止したりするであろう０人工塩基の添加は、全細胞の複製を同時に同じ場所で開始させるであろう、さらに、この方法は宿主染色体に組込まれる適当なベクターを有する原核生物に適している。同様に、真核生物の染色体には多くの特異な複製開始部位が存在するので、本発明の人工塩基対を保有する組込み型ベクターの使用は、反核生物について上述した方法と同じ方法で、限られた領域の真核生物染色体の合成のコントロールを可能にするであろう。

上記開示は本発明を一般的に説明するものである。より十分な理解は、以下の特定の実施例（例示目的でのみここに提供されるものであり、本発明の範囲を制限するものではない）す９照することにより得られるであろう。

犬里上り− ６−グアニン　５−メ　ルービレミジン−２−ン江α光腹Ａ６ｇ！３ＪＬ用いた化学薬品およびそれらの供給源は次の通りであった：β−デオキシヌクレオシド（Ｓｉｇｍａ社）、ベンゼンチオール（Ｅ　ａｓｔｅｅａｎ社）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ａｌｄｒｉｅｈ社）、２−クロロフェニル−ジクロロホスフェ−）　（Ａ　１ｄｒｉｅｈ社）塩化４．４′−ジメトキシトリチル（Ａｌｄｒｉｅｈ社）、長鎖アルキルアミンコンドロールド・ボア・ガラス（Ｐｉｅｒｃｅ社）、１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−二トロー１．２．４−　）リアゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ社）、シアン化水銀（ＩＩ　）ＣＡ　Ｉｄｒｉｅｈ社）、１−メチルイミダゾール（Ａ　Ｉｄｒｉｅｈ社）、２−ニトロベンズアルドキシム（Ａ　１ｄｒｉｃｈ社）、酢酸ｐ−ニトロフェニル（Ｓｉｇｓａ社）、炭酸銀（Ａ　Ｉｄｒｉｃｈ社）、シリカＷｏｅｌ＋ｓ　Ｔ　Ｓ　Ｃ（Ｉ　Ｎ　ＣＮ　ｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、すべての溶剤は再蒸留し、適当な無水条件下で貯蔵した（Ｓｐｒｏａｔ、ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇ　ａ　ｉ　ｔ　、　Ｍ　、　Ｊ　、　（Ｅ　ｄ　、　）　、　立柱り肚吐−ｅｏｔｉｄｅ　Σ圧肱弦垣、　Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘ４ｏｒｄ、１９８４＞。

用いた酵素およびそれらの供給源は次の通りであった：ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）、ヘビ毒ホスホジェステラーゼ（Ｓｉｇｍａ社）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　ａｂｓ）、Ｓａｌ　ｌ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ　１ｏｌａｂｓ）　。

シル−９Ｈ−プ１ンー６一　−ル　−−シー６−土Ａヱノ２ン士２−アセトアミド−６−クロロ−９８−（２−デオキシ−３，５−ジー０−ｐ− ）ルオイルーＤ−リボフラノシル）プリンのβ−アノマーは既知方法により製造した（Ｒｏａｒｋ、ｅｔ　ａｌ、、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ。

Ｌ、Ｂ、ａｎｄ　Ｔｉｐｓｏｎ　Ｒ，Ｓ、（Ｅｄｓ、）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｔ３５ｏｎｓ、Ｐａｒｔ　２，５８３．１９７８）、保護された６−クロロ誘導体のβ−アノマーはその保護基を除去して、Ａｅｔｏｎらの方法（Ｓ　ｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｑ舶１値υ工、　Ｚ　ｏｒｂａｃｋ、　ｅｔ　ａ　Ｉ　、　、　Ｅ　ｄｓ、　、　Ｖｏｌ　、１．２７２　、１９６８を参照）に従って硫黄化した。得られた物質は、熱水からの結晶化後に、予期した通りの紫外線可視スペクトルを有していた（Ｔｏｎｇ、ｅｔａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、３２：８５９，１９６７）。

２、　１−　シー　−Ｄ−１ボフーノシル−５−ヌル−２−ピリミジノン　−− シリポジルー５−ヌル−２−ビ１ミジノン４−チオチミジンは既知方法により製造した（Ｗｅｍｐｅｎ、ｅｔ　ａｔ、。

Ｇｒｏｓｓｍｅｎ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｒｅ、に、（Ｅｄｓ、）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　−７、Ａ　ｃａｄｅｍｉｅ　Ｐ　ｒｅｓｓ、　Ｘ　ＩＩ　、　Ｐ　ａｒｔ　Ａ　、７５．１９６７）　、デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノンはラネーニッケルで還元することにより４−チオチミジンから製造した。４−チオチミジン５．９ｙ（２２ｍｍｏｌｅ）を、還流冷却器を備えたフラスコ中の蒸留水１８０１１’およびエチルアルコール６０１１に加えた。ラネーニッケル２４ｇを加え、この溶液を還流下で加熱した。Ｒ高の収率を得るために、４−チオチミジン溶液はそれぞれのラネーニッケル調製物と共に滴定し、０．ＩＮ　Ｎａ中のサンプルの光学密度を２６０．３２２および３３４ｎｍで測定した。光学密度は３つの波長すべてにおいて減少した。　３２２ｎｍでの光学密度が３３４ｎ＋ｓでの光学密度に等しいか又はそれより大きくなったとき反応を停止した。初期溶液からの３３４０−での光学密度の減少は最高収率の場合に約６倍であった。この反応はイソプロパツールを用いるシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により追跡した。この化合物に特徴的な青色蛍光スポットが現れた（Ｒｆ＝０．３５）、初期の緑色を帯びた溶液は反応の終わりまでに非常に薄い黄色になった。他の生成物が形成されたので、全部の４−チオチミジンを使用するまで反応を続行しなかった。この懸濁液を熱濾過し、ラネーニッケルを水１５０ｚ１と共に沸騰させた。この溶液を熱いうちに濾過し、合わせたｒ液を蒸発させた。デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノンはＷ　ｏ　ｅ　ｌ−シリカ■を用いる乾式カラムクロマトグラフィーにより精製した。

ラネーニッケル還元からの固体にメタノール１０１１を加えた。この透明溶液３．７ｆ１はＷ　ｏ　ｅ　Ｉ−シリカ■３．７．に加えて自然乾燥させた。デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノンを含む乾燥シリカは、ナイロン製チューブに収容した乾燥Ｗｏｅｌ輸シリカシリカム（長さ２０インチ×直径１インチ）の頂部に加えた。溶剤はイソプロパツールであった。溶剤の最前端をシリカカラムの底に到達させた後、クロマトグラフを終わらせた。ナイロン製チューブは１インチの区画に切断し、それぞれの区画に含まれるシリカをメタノール１０１１で抽出した。各区画からのサンプルはイソプロパツールを用いてシリカゲルＴＬＣにかけた。唯一の蛍光スボツ）　（Ｒｆ＝０．３５）を示した区画からのメタノール抽出物をプールした。適当な区画からのプールしたシリカはメタノールで再抽出し、初めの抽出物と一緒にプールした。濾過後メタノールを蒸発させて小容量となし、残存するシリカ微粒子を遠心により除いた。残りのメタノールを蒸発させ、残留物を熱エチルアルコール１０ｉｌに溶解した。この溶液を一２０℃におき、−晩晶出させた。黄色の上澄みをデカントし、結晶を冷エタノールで洗った。エタノールの容量を４ａｌまで減らし、−２０℃においてさらに晶出させた。シリカゲルＴＬＣは５％未満の夾雑物を示した。

この結晶の溶液の紫外線可視スペクトルは文献記載のスペクトル（Ｌａｌａｎｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、９０ニア６．１９６４）に等しかった。４−チオチミジンから最終生成物までの収率は約２５％であった。

Ｃ８−シー　し　シトのム５　’−０−４，４’−ジメトキシトリチルチミジン、Ｎ−ベンゾイル−５’− 〇−４．４’−ジメトキシトリチルデオキシシチジン、Ｎ−ベンゾイル−５’− ０−４，４’−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン、およびＮ−イソブチリル−５’−０−４，４’−ジメトキシトリチルデオキシグアノシンは標準方法により合成した。（Ｎａｒａｎｇ、ｅｔ　ｓ土、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　＋５ｏｌｏ　、Ｗｕ、Ｅｄ、、Ｖｏｌ。

８８．９０．１９７９）。

１、Ｎ−ペンシイルー−シー６−　オグアノシン予備実験により、Ｎ−イソブチリルおよびＮ−アセチル誘導体はアルカリ加水分解の間あまりに不安定すぎて、有意な収量のＮ−保護ヌクレオシドが得られないことが分かった。無水ピリジンの蒸発により何度も乾燥させたデオキシ−６−チオグアノシン０−５１？（１，７ｍ蒙ｏｌｅ）に無水ピリジン３．３ｔ１と再蒸留クロロホルム６．６ａｌを加えた。４℃において、塩化ベンゾイル１．３５＊１（１２ミリモル）を含む再蒸留クロロホルム４．７ａｌを、Ｃａα、乾燥チューブを備えたフラスコに撹拌しながら滴下した。塩化ベンゾイルの滴下後、全部のデオキシ−６−チオグアノシンを溶解させた。この溶液は黄色であった。この溶液を室温まで上昇させて３時間撹拌した。メタノール／クロロホルム（０，５：９．５ｖ／ｖ）によるこの反応のサンプルのシリカゲルＴＬＣはＵｖ吸収を有する１つのスポットを示し、このスポットは酸および熱にさらすと暗褐色に変化した。このスポットは溶剤の最前端に存在していた０反応溶液を氷６０１１中に注いだ、氷が溶けた後、水性エマルジョンにクロロホルム１０ａｌを加えて振とうした。相分離後、有機相は黄色物質をすべて含んでいた。その有機相を水ＺＯｗｌで３回洗い、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて油状物を得た。

この油状物にピリジン１９１１を加えた。透明な溶液が得られた。

水１．８ｚｆを加えた後、メタノール１９ａｌを加えた。この溶液を４℃におき、ｐＨ１２，４〜１２．５に達するまで２ＮＮａＯＨを徐々に加えた。ｐＨは２ＮＮａＯＨの添加により約１２．４に維持した。

加水分解はメタノール／クロロホルム（１，５，：８．５ｖ／ｖ）を用いてシリカゲルＴＬＣにより追跡した。大部分のＵＶ吸収物質は１つのスポット（Ｒｆ＝０．３）に存在していた。チオキシ−６−チオグアノシンのＲｆは０．１９であった。デオキシ−６−チオグアノシンの有意な製造を避けるために、ＮａＯＨの添加およびその時間に若干の注意が必要であった。反応は２０％酢酸を加えてｐＨ７，８に下げることにより停止させた。中和のために交換樹脂を使用した場合はかなりの損失を被った。この溶液を蒸発させて油状物を得た。

パイロット実験により、Ｎ−ベンゾイル誘導体とジ、トリ、テトラベンゾイル誘導体の熱水に対する溶解度の差を利用して精製するのが便利な方法であると分かった。油状物に水６００ｉＺを加えて、撹拌しながら７０℃に加熱した。液体を不溶性物質からデカントし、４℃においた。沈殿物が形成され、濾過により収した。この水溶液を２５０ｙ／まで蒸発させ、２回目の沈殿物を一過により回収した０合わせた沈殿物のシリカゲルＴＬＣは、９０％以上がＮ−ベンゾイル誘導体であることを示した。

同様な分離方法は、油状物をクロロホルム２０Ｗ１に溶解し、そのクロロホルムを弱塩基性ＮＨ，ＯＨ溶液（ｐＨ１０）で何度も抽出することであった。

Ｎ−ベンゾイル−デオキシ−６−チオグアノシンを含むＲｆ＝０．３のスポットの同定は、完全なアルカリ加水分解後に回収された安息香酸の量の定量分析、およびｐＨ５からｐＨ１２へ変えたときの約３４０ｎ＊から３２０ｎｍへの吸収ピークの特徴的な移動に基づいていた。吸収ピークの移動はチオエステルが存在する場合は起こらない。

２、Ｎ−ベンゾイル−５’−０−４４’−ジメト　シト１　ルー−シー６−　オグアノシンＮ−ベンゾイル−デオキシ−６−チオグアノシン１２５ｕ（０，３２ｍｍｏｌｅ）は無水ピリジンの反復蒸発により乾燥した。無水ピリジン１．２５ｙｆを加え、塩化４．４′−ジメトキシトリチル１７２ｍｇ（０，５＋ｎ１ｏｌｅ）を室温で加えた。２時間後、クロロホルムを用いたシリカゲルＴＬＣはＮ−ベンゾイル −デオキシ−６−チオグアノシンが全く存在しないことを示した。メタノール３社を加えた。１５分後この溶液を冷水６ｍｌに加えた。この水性溶液をクロロホルム５１１１で抽出した。クロロホルム抽出物を水５１で洗い、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶液を２．５ｚｆまで蒸発させ、そのクロロホルム溶液を蛍光指示薬を用いて４枚の分離用シリカゲルプレート（１０００μ、２０　Ｘ　２０ｃｚ）に塗布した。メタノール／クロロホルム（１：９ν／、）が溶剤であった。ジメトキシトリチル誘導体の位置は分析用ＴＬＣにかけ、酸を吹き付けた際に橙色に変わるＵ■吸収スポットを検出することにより決定した。Ｎ−ベンゾイル−５’−０−４，４’−ジメトキシトリチル−デオキシ−６−チオグアノシンを含むシリカのバンドをかき取り、メタノールで溶出した。シリカ粒子は遠心により除いた。メタノール溶液をプールし、蒸発乾固させた。

３、　５’−０−４４’−ジメト　シト１　ルー−シリポジルー５−メ　ルー２ −ピリミジノン β−デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノン０．６３９ｙ（２，５ｍ　ｍｏｌｅ）は無水とリジンの反復蒸発により乾燥した。

無水ピリジン８ｗｌと塩化４．４′−ジメトキシトリチル１．ｈ（３，２ミリモル）を撹拌しながら室温で加えた。すべての物質は３０分までに溶解した。４５分後サンプルはメタノール／クロロホルム（１：９ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルＴＬＣで分析し、反応が完了したことを示した。この誘導体は０．３７のＲＪ値を有していた。メタノール１．２ｉ１を加えて１５分間撹拌した。この溶液を氷冷した水２０１１に注入した。４℃で一晩放置後、淡黄色ガムから水相をデカントした。このガムを酢酸エチル１０１１に溶解した。水相は酢酸エチル８ｙｌで抽出し、最初の酢酸エチル溶液と合わせた。

この酢酸エチル溶液はそれぞれ７ｗｌずつのＮ　ａ　ＨＣＯｓ、水、ＩＭ　Ｎａ αで洗った。酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、デカントし、蒸発させてガムを得た。このガムをクロロホルム４ｗｅＬ：溶解し、短イシリカ力ラム（２０Ｘ７５Ｊ１１）ニ加エタ、０．５％トリエチルアミン／クロロホルム溶液を黄色の物質が溶出する直前までカラムに通した。溶剤をメタノール／クロロホルム（０，２：１０ｖ／ｖ）に変え、１０１１の画分を薬めな９両分はデオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノン誘導体について３２９ｎｍで監視した。

それぞれの画分のサンプルはメタノール／クロロホルム（１：９ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルＴＬＣで分析した。純粋と思われる画分含プールし、真空下で蒸発させた。

４、ト１エ　ルアンモニウム５’−０−４４’−ジメト　シト１　ル　−−−シヌクレ　シト−３’−０−（２−クロロフェニルホスフェートすべての化合物は標準方法により製造した（Ｎａｒａｎｇ、ｅｔ　ａ±、。

Ｗｕ、Ｒ，Ｅｄ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　、６８：９０，１９７９）、デオキシ−６−チオグアノシンを用いる方法を実施する場合、すべての疑わしい溶媒は過酸化物について調べることが必要不可欠であった。

Ｄ、リボ−シ　し　゛の４ホスホトリエステル法（Ｓｐｒｏａｔらの上記文献参照）がポリスチレンまたはコンドロールド・ボア・ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅｇｌａｓｓ）の支持体と共に用いられた。６−チオグアニンと５−メチル−２−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの最終合成はガラス支持体を使用した。

６−チオグアニンおよび５−メチル−２−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチドのそれぞれを合成するために、５　’−０−４，４’−ジメトキシトリチル−２′−デオキシグアノシン−３′−〇−スクシネート０．３８ｍｏｌｅを結合させた長鎖アルキルアミンコンドロールド・ボア・ガラス１６１Ｆｇが使用された。この反応溶液は乾燥した保護ヌクレオチド１０μｅ＊ｏｌｅに無水ピリジン８０μｌを加えることにより調製した。このとリジン溶液を１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−二トロー１．２．４−　）リアゾール１３すに加え、１介接１−メチルイミダゾール８μｌを加えた。この溶液を窒素下に室温で支持体に加えた。この反応は支持体を無水ピリジンおよびジクロロメタンで洗うことにより３０分後に終わらせた。ジメトキシトリチル基は２％トリクロロ酢ｖｉ／ジクロロメタンで除去した。支持体をジクロロメタン、次に無水ピリジンで洗った。ヌクレオチド付加の次のサイクルを開始した。

Ｅ、−の、おび６−チオグアニンおよび５−メチル−２−ピリミジノンのアルカリ感受性は、支持体からの開裂およびオリゴデオキシヌクレオチドの脱保護の標準水性方法の使用を排除した。モデル実験は、ＮＨ，ＯＨ溶液がデオキシ−６−チオグアノシンをデオキシグアノシンと数種の少量成分へ５０℃で数時間以内に転化することを証明した。デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノンは室温で強アルカリ性条件にさらした際に数分以内で他の成分に転化され、この化合物はより長時間にわたって数種の成分に変化した。モデル実験は、デオキシ−３′−〇−スクシネート結合およびＯ−クロロフェニルホスフェート結合が無水ピリジン中で５ｙｎ−２−二トローベンズアルドキシメートにより徐々に開裂されることを立証した。イソブチリル基およびベンゾイル基は無水メタノール中でのアンモノリシスにより除去された。

デオキシ−６−チオグアノシンを用いるモデル実験は、１−（メシチレン−２− スルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−）リアゾールがオリゴデオキシヌクレオチドに保護ヌクレオチドを付加する反応条件下で６−チオ基と速やかに反応することを明らかにした。デオキシ−６−チオグアノシンはピリジン中のベンゼンチオールによりメシチレンスルホニル付加物から完全に再生された。予測されたように、メルカプトエタノールとの反応は非常に遅く、２種以上の生成物を与えた。

オリゴデオキシヌクレオチドを有するガラス支持体は真空下にＰ２Ｏ，およびＫＯＨ上で乾燥させた。ベンゼンチオール５５μｌ（ＩＭ）を含む無水ピリジン０．４５ｙｌをこのガラス支持体に乾燥窒素ガス下で加えた０反応バイアルを密閉し、室温で８時間放置した。溶液を除き、ガラス支持体はジクロロメタンＩＭｌで４回洗った。′！Ｓ存するジクロロメタンを真空除去し、ガラス支持体をＰ　２０　ｓおよびＫＯＨ上で乾燥した。

５ｙｎ−２−二トロペンズアルドキシム１６．６＊ｙ（１００，ｔｃ　ｍｏｌｅ）は無水ピリジンの反復蒸発により乾燥した。無水ピリジン２００μｌを窒素雰囲気下で乾燥ニトロベンズアルドキシムに加え、その後乾燥テトラメチルグアニジン３６μｌを加えた。この溶液とガラス支持体を窒素下でバイアルに封入し、室温で５日間放置した。

オリゴデオキシヌクレオチドが溶液へ放出される度合は、その溶液１μｌをジメトキシトリチル基について検定することにより追跡した。酢酸ｐ−ニトロフェニル２７ｍｇは残存するオキシメートイオンを使いきるために、ニトロベンズアルドキシメート溶液に窒素下で加えた。３時間後２０％酢酸１０μ！を含むピリジン１１１を加えた。ｐＨ７〜８であることを確かめるためにｐＨ試験紙で測定した。この溶液をガラス支持体から除き、５０％水性ピリジン］）ｌをガラス支持体に加え、この懸濁液を３０分分間上うした。溶液を取り出して最初のピリジン溶液と一緒に合わせた。この溶液を蒸発乾固させた。

臭化上チルトリメチルアンモニウム９ｕ（２５−−ｏｌｅ）を含む乾燥メタノール１１１を、乾燥したＮ−保護オリゴデオキシヌクレオチドに加えた。この溶液に４℃でＮＨ，ガスを飽和させた。試験管にしっかりと栓をして、暗室に室温で放置した。７８後試験管を４℃で開栓し、溶液を室温で乾燥窒素と共に蒸発させた。

残留物を８０％酢酸１ｘ１に溶解してジメトキシトリチル基を脱離させた。　２０分介接１１１を加え、この水性溶液は水を飽和させたジエチルエーテル２Ｍｌで５回抽出した。水相を２００μｌまで蒸発させた。この溶液は黄色であった。

この溶液をＬＭ　ＮＨ，ＨＣＯ。

で洗浄し次いで蒸留水で洗浄しておいたＤ　ｏｗｅｘ　Ａ　Ｇ　−５０Ｗ　Ｘ２カラム（１，５Ｘ３ｃｚ）に入れた。このカラムは蒸留水で溶出し、０．５ｘｅの画分を集めた０両分は２６０ｎ−でオリゴデオキシヌクレオチドについて監視し、適当な画分をプールした。プールした画分は蒸発乾固させて一２０℃で貯蔵した。

Ｆ、汲に量１表Ｉに示したオリゴデオキシヌクレオチドの２６ｏｎ−での消衰係数は次のように計算した：（１）Ａ−Ｔの消衰係数１０Ｘ１０’Ｍ−’ｃＩＩは５ｏｈｅｒ（ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ＊１ｓＬｒ　、２ｎｄ　Ｅｄ、。

５ｏｂｅｒ、Ｈ，Ａ、（Ｅｄ、）、Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ、クリーブランド、オハイオ州）により示されたデータから計算した。

（２）Ｇｓ−Ｔオリゴヌクレオチドの消衰係数は、６−チオグアニンのヌクレオシドが本質的にｐＨと無関係な８Ｘ１０’Ｍ−’ｃｉ＋の２６ｏｎ−での消衰係数を有するので、１０Ｘ１０’Ｍ−’ｃｍであるとみなされた。（３）５−メチル−２−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの消衰係数は、５−メチル−２−ピリミジノンのデオキシヌクレオチドが本質的に２６０ｎｍで吸収を全く示さないので９．２Ｘ１０’Ｍ−’ｃｍであるとみなされた（Ｌｍ！ａｎｄらの上記文献参照）。

Ｇ、！標識したオリゴデオキシヌクレオチドの濃度は０．１〜０．０１ＭＭの範囲で変化した。キャリアーオリゴデオキシヌクレオチドはＴ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｃ−Ｃ −Ｃ−Ｇ−Ｇであり、その濃度は１〜２μＭであった。その他の成分は０．０６Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）、５＋ｍＭ　Ｍｇ（ｆｆ２．５ｚＭジチオトレイトーｔし、０．５ｚＭ　ＡＴＰ、および０．０６〜０．００５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４リガーゼ／　μｌであった。温度は１９℃であった０ｗＬ衝液、Ｍｇ α２、ジチオトレイトール、およびオリゴデオキシヌクレオチドを一緒に合わせ、次の温度サイクルに付した：すなわち６０〜６５℃で５分、室温で１５分、および氷上で１５分、この０．５ｘｌポリプロピレン製試験管は遠心にかけてすべての水を底部に戻し、その後ＡＴＰとリガーゼを加えた。

８４先１λ氷肱分離用電気泳動は２５１アクリルアミドゲルを使用した（Ｇｏｕｇｈ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ、６：１５５７．１９７９）、ゲルは０．２Ｘ１３Ｘ２９ｃｚであった。サンプルの添加前に、過酸化物および遊離基を除くために上部緩衝液中の１０−３Ｍグルタチオンを用いて電気泳動を行った。　１０−”Ｍグルタチオンはサンプル溶液中に存在していた。サンプルがゲルに入った後、電流を４ｉＡに減らし、染料シアツールキシレンが約９ｃｍ移動した後（１８〜２４時間）電気泳動を終わらせた。オリゴデオキシヌクレオチドのＵＶ吸収帯を切り出し、小片に粉砕し、その後数日間にわたって、０．１Ｍ　ＮＨ，ＨＣＯ，で数回抽出した。

■、旦ヱ」」≧外五− ヌクレオチドは弱陰イオン交換樹脂Ｓｙｎ　Ｃｈｒｏｐａｋ　ＡＸｌｏｏ、２５０Ｘ４．６ｉ＋ｚ（Ｓｙｎ　Ｃｈｒｏ−社、リンデン、インディアナ州）で、移動相として０．０５Ｆ　ＫＨ２ＰＯ−（１）Ｈ４，５）を用いて分析した。

ヌクレオシドはオクタデシル−シリカカラム２５０Ｘ４．６ｚｚで、移動相として２．５％メタノールおよび０．０２Ｆ　ＫＨｚＰＯ−（ｐＨ５，５＞を用いて分析した。メタノールはデオキシアデノシンの場合に１０％に変えた。この技術を用いることにより、新規なヌクレオチド塩基がオリゴヌクレオチドに含まれることが判明した。

夾痙コ１− ム　１ゴ・フレ　ドの表Ｉは固相ホスホトリエステル法により合成されたオリゴデオキシヌクレオチドを示す、オリゴデオキシヌクレオチドは２５％アクリルアミドゲルの電気泳動により分離した。オリゴデオキシヌクレオチドの電気泳動純度は、５′末端を３２Ｐホスフエートで標識し、２０〜２５％アクリルアミドゲルで電気泳動分析な行うことにより調べた。主要な３２ｐ標識成分が放射能の９０％以上を占め、他の成分は全放射能の２％以上に達しなかった。

民Ｌム　ｔ−１ゴー　シヌクレ　ド１１２５　Ｔ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｃ−Ｃ−＾−Ｔ−Ｃ−Ｃ−ＧＮＰＯＴ−Ｃ−Ｃ −八−Ｃ−Ｃ−Ｃ−＾−（ＮＰＯ）−Ｃ−Ｃ−に６ＴＧ　Ｔ−Ｃ−Ｃ−＾−Ｃ− Ｇ−Ｇ−（６Ｔに）−Ｔ−Ｃ−Ｃ−にＧ　Ｔ−Ｃ−に−＾−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ −Ｃ−Ｃ−ＧＣＴ−Ｃ−に−＾−Ｃ−Ｃ−Ｃ−＾−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ８塩基６−チオグアニンおよび５−メチル−２−ピリミジノンはそれぞれ６７ＧまたはＧｓ、およびＭＰＯまたはＴＩ′Ｉと略記される。

オリゴデオキシヌクレオチドに含まれるヌクレオチド残基の数は、５′末端をｓａｐミルホスフェート識して、その重合体をヘビ毒ホスホジェステラーゼで段階的に減成することにより証明した。オリゴデオキシヌクレオチドのそれぞれの加水分解時に得られた生成物の数は、５０℃での２０〜２５％アクリルアミドゲルによる電気泳動およびオートラジオグラフィーにより決定した。

６−チオグアニンおよび／または５−メチル−２−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの紫外°線可視吸収スペクトルは、ＸおよびＹ位置にアデニンおよびチミンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの吸収スペクトルよりも、３１０〜３５０ｎｍ領域において中性ｐＨで有志に高い吸収を示した。６−チオグアニンは中性ｐＨで２６５０−と３４０ｎ鋤に吸収ピークを有する。β−デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノンは３１４０−に１つの吸収ピークを有する。さらに、β−デオキシリポジルー５−メチル−２−ピリミジノンは紫外線中で蛍光と発する。５−メチル−２−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチドも紫外線のもとて蛍光を発した。

塩　の　・相補的オリゴヌクレオチドの会合定数を決定する伝統的方法は、温度の関数として２６０ｎｍでの光学密度を測定することである。この技法は困ったことに間違った解釈へ導くことがある。

相補的配列の鎖長が短い（１６個より少ない）オリゴヌクレオチドの場合、光学密度の遷移領域は非常に広範囲であり、たとえその二状態モデルが適切であると仮定しても、遷移領域の中間点の温度を選定するにはかなり良いデータを必要とする。初期の研究において合成されたオリゴデオキシヌクレオチドの量に限りがあり且つ二本鎖構造中にオリゴヌクレオチド配列の１７３が一本鎖領域として存在するために、光学密度対温度曲線の分析により会合定数を決定することは実行不可能であった。温度融解曲線の代わりに、酵素的連結方法が相対的会合定数を決定するために開発された。

この方法の基本的な考えは、一対のオリゴデオキシヌクレオチドの二本鎖がキャリアー二本鎖（対象の二本鎖の濃度よりかなり高濃度で存在する）に連結する量を測定することにより、その二本ａｍ造の濃度を決定することであった。キャリアー分子への二本鎖の連結が二本鎖のそれ自体の連結の代わりに選ばれな理由は、数学的モデルの単純さにあった。自己連結の数学的計算は非常に限定された条件下を除いて単純ではない、キャリアーに連結された二本鎖の量は、二本鎖の一方のオリゴデオキシヌクレオチドを５′ホスフエートとして３２ｐで標識することにより追跡しな、キャリアー二本鎖および対象の二本鎖は両方とも相補的な５ ′突出−重鎖領域Ｔ−Ｃ−に−＾を有していた。

−重鎖オリゴデオキシヌクレオチドがキャリアー二本鎖に連結される可能性があるために、この反応の程度を測定することが必要であった。

次の段落に示した条件が認められる場合、時間の関数としてのオリゴデオキシヌクレオチド１の濃度は方程式■：１　、　１ｎ［Ｃ（１，ｔ）／Ｃ（１，０）コ＝−［Ｋ　（１）＋に、（１，２）Ｃａ（２）］Ｆ（ｔ）〔式中、Ｃ（１，０）はオリゴデオキシヌクレオチド１の時間ゼロでの濃度であり、Ｃ（１，ｔ）は時間ｔでの濃度であり、Ｋ　ｄ（１，２）はオリゴデオキシヌクレオチドｌと２との会合定数であり、Ｋ　（１）は−重鎖オリゴデオキシヌクレオチド１がその二本鎖と比較してキャリアー分子に連結する速度を特徴づける会合定数であり、Ｃ（２）は反応時間にわたるオリゴデオキシヌクレオチド２の濃度の平均値であり、成分１および２が異なるオリゴヌクレオチドである場合は１であり、オリゴヌクレオチド１および２が同じである場合は２であり、そしてＦ　（ｔ）は酵素およびキャリアー分子の量に依存するが、オリゴデオキシヌクレオチド１および２の量に無関係である時間の関数である〕で表される。

応用される方程式■に必要な実験条件は次の通りである＝（１）キャリアー分子の自己連結の時間経過が二本鎖の混入量によって有意に乱されないように、十分高濃度のキャリアーが存在する。（２）二本鎖分子の濃度は連結速度が二本鎖の濃度に比例するように低い、（３）二本鎖の濃度は自己連結がキャリアー分子との連結に比べてごくわずかであるように十分低い、（４）オリゴデオキシヌクレオチドの会合速度および二本鎖の解離速度は、反応時間にわたって平衡が保たれるように十分速い、（５）比較される二本鎖のに−が同じである、すなわち、重要な特徴は二本鎖とキャリアー分子の間の５′重複領域であって、二本鎖分子の残りの詳細な配列ではない。

自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド＃２５（表Ｉ）のキャリアー分子への連結の結果を表Ｈに示す０表■からのデータのプロットは明らかに、一本鎖連結が使用した濃度範囲において優勢であることを示した。二本鎖形成はオリゴデオキシヌクレオチドの濃度が１０−’Ｍ以上で検出可能になる。さらに、これらの結果は、キャリアーに連結した標識オリゴデオキシヌクレオチドの量がその存在量に比例するという重要な特徴、すなわち方程式Ｉの妥当性にとって必要な１つの条件を証明している。

表■は、自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド＃２５の会合定数と、オリゴデオキシヌクレオチド対６７　ＧおよびＭ　Ｐ　Ｏ（表Ｉ）の会合定数と、の比を決定するために用いられる例示的データを含む。そのデータは方程式■を用いて分析される。ライン４は一本鎖の連結が優勢であるような＃２５の濃度を有する。

方程式■は以下のようになる：Ｕ、Ｋｓ（２５）Ｆ（ｔ）　＝　−１ｎ［Ｃ（２５，ｔ）／Ｃ（２５，０）］ミ　−ｉｎ［６５９２／１３３６１］＝　、７０６ライン３は二本鎖と一本鎖分子の両方が連結されるような＃２５の濃度を有する。方程式Ｉへの代入は次式を与える：１［１，Ｋ　（２５）Ｆ（ｔ）＋２Ｋｄ（２５，２５）Ｃ，（２５）Ｆ（ｔ）”−１ｎ［５７２４０／１２６０５３コ＝、７８９Ｋ　（２ｓ）Ｆ（ｔ＞は方程式■から知られており、次式：Ｃ（２）□［Ｃ（２，０）−Ｃ（２，ｔ）］／１ｎ［Ｃ（２，０）／Ｃ（２，ｔ）コを用いると、Ｃ（２５）＝１，２ｘｌＯ−’Ｍである。これらの結果を合わせると次のようになる：Ｎ　、　Ｋｄ（２５，２５）　Ｆ　（ｔ）＝３．４８ｘｌＯｓライン１およびライン２に関して同じ解析を行うと、次のようになる：Ｖ、　Ｋｄ（６ＴＧ　、Ｍ　Ｐ　Ｏ）Ｆ　（ｔ）＝２．３８ｘｌＯ’およびＶｌ、　Ｋｄ（２５，２５＞＝１．５Ｋｄ（６７Ｇ、ＭＰＯ）多くの測定は０．６〜０．０５Ｗｅｉｓｓ単位／１０μｌの範囲の２つの異なる酵素濃度で行い、すべてのオリゴデオキシヌクレオチドの濃度はそれぞれの測定において変化させた。相対的会合定数は異なる酵素濃度により、あるいは二本鎖形成が検出された異なるオリゴデオキシヌクレオチド濃度により影響されなかった。

酵素濃度およびオリゴデオキシヌクレオチド濃度の変化からの相対的会合定数の独立性は、二本鎖とオリゴデオキシヌクレオチドとの平衡状態が連結の間中保たれていたことを強く示唆している。オリゴデオキシヌクレオチド濃度がらの相対的会合定数の独立性および表Ｈに示した結果は、基質濃度がそのＫｍに比べて低かったことを示している。

キャリアー分子に連結される標識オリゴデオキシヌクレオチドの量が非連結オリゴデオキシヌクレオチドの量に比べて少ない場合、非連結オリゴデオキシヌクレオチドＣ（ｔ）のカウントにおける不確実性は連結された量と同じか又はそれより大きいと異議を唱えるかも知れない、連結された量をＣ（ｔ）に加えることによりＣ（ｏ）が得られる。しがしながら、それは方程式に現れる量：１ｎ［Ｃ（ｔ）／Ｃ（ｏ）］であり、差Ｃ（ｏ）　−Ｃ（ｔ）がＣ（０）に比べて小さい場合、次のようになる：１ｎ［Ｃ（ｔ）／Ｃ（ｏ）コ＝　［Ｃ（ｏ）−Ｃ（ｔ）］／Ｃ（ｏ）ここでＣ（ｏ）　−Ｃ（ｔ）は実際に測定された放射能の量である。

Ｃ（ｔ）における不確実性はＣ（０）にのみ現れる。

自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド６７Ｇ−ＭＰＯ（表Ｉ）の相対的会合定数を測定することは、５′末端をリン酸化すのオリゴデオキシヌクレオチドを速やかに分解する活性を含んでいたので、実行できなかった。

連結反応に用いた配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼＳａｔ　Ｉの添加、および完結した連結反応の部分への１５０＋＊Ｍの塩化ナトリウムの添加は、連結された標識オリゴデオキシヌクレオチドの損失および連結されなかった標識オリゴデオキシヌクレオチドの増加をもたらした。

民１１アーへの　−ゴー　シ　し　ド　２５の゛オリゴデオキシヌクレオチド、０５　９．２ｘｌＯコ　５．８ｘｌＯコ、０２５　４．５ｘｌＯコ　３．５ｘｌＯコ、０１２５　２．７ｘｌＯコ　１．４ｘｌＯコ、００６２５　１．５ｘｌＯコ　４．２ｘｌＯ５，００３１２５５，２ｘｌＯ”　３．２ｘｌＯ”５′リン酸化された（”Ｐ）オリゴデオキシヌクレオチド＃２５（表Ｉ）はキャリアー分子Ｔ−Ｃ−Ｇ−＾−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃ−ｃに連結させた。その連結反応混合物は表示した濃度の標識オリゴデオキシヌクレオチド、０．０６Ｍ　Ｔｒｉｓ　Ｈ α（ｐＨ７，５）、５ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、５　毅Ｍ　ＭｇＣｂ、Ｉ　ＡＩ　Ｍ　５　’リン酸化キャリアーオリゴデオキシヌクレオチド、および０．６Ｗｅｉｓｓ単位７１０μＮのＴ４　ＤＮＡリガーゼを含んでいた。温度は１９℃であった。サンプルは８０％ホルムアミドで１対４に希釈し、２μ！サンプルを１２．５％アクリルアミド、７Ｍ尿素ゲルでの電気泳動により５０℃で分析した。オリゴデオキシヌクレオチド＃２５およびはしご状の連結オリゴデオキシヌクレオチドの位置を定めるためのオートラジオグラフィー後に、適当な領域を切り出して、カウントした。

肚ヤ１アーへの　２ゴー　シヌ　し　ドの゛オリゴデオキシヌクレオチドＩ　Ａ−ＴＨ′（０，４ｘｌＯ−’Ｍ）　１０５７７　１３５０ＧＳ−Ｔ’（０，７ｘｌＯ−７Ｍ）２　Ａ−Ｔ”（０，４ｘｌＯ−’Ｍ）　１１６３２　８７５３　Ａ　−’Ｆ　（０，８５ｘｌＯ−）Ｍ　）　５７２４０　６８８１３４　Ａ　−１”　（０，１３ｘｌＯ−’Ｍ）　６５９２　６７６９表示したオリゴデオキシヌクレオチドはキャリアー分子Ｔ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｃ−Ｃ−（ニーＣ−Ｇに連結させた。星印は′Ｐで５′リン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを表す、オリゴデオキシヌクレオチドの配列は表１に示す、連結反応混合物は表示したオリゴデオキシヌクレオチド、０．０６Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈα（ｐＨ７，５）、５−Ｍジチオトレイトール、０．５ｓＭ　ＡＴＰ、５−ＭＭｇα２．１ＭＭ　５’リン酸化キヤリアーオリゴデオキシヌクレオチド、いた０反応温度は１９℃であり、反応時間は６０分であった０反応のアリコートを８０％ホルムアミドで１対４に希釈し、２ μｌサンプルを１０％アクリルアミド、７Ｍ尿素ゲル上で５０℃で電気泳動にかけた。を気泳動はシアツールキシレン染料が約７ｃｘ泳動したとき終わらせた。

オートラジオグラフィー処理を行ってオリゴデオキシヌクレオチドの位置を定めた後、適当な領域のゲルを切り出して、カウントした。

艮Ｌ ■刃！ムＬ釦定玉− オリゴマー対　会合定数　Ｋ（Ａ、Ｔ／Ｔ、Ａ＞に対する値（Ａ−Ｃ／Ｔ−Ｇ）　Ｋ（Ｃ７０）　５±２（Ａ−Ｔ　／Ｔ−Ｇ　）　Ｋ（ＴＨ／ｃＳ）　１±、５（Ａ−Ｔ／Ｔ−Ｇ）　Ｋ（Ｔ／Ｇ）　１／（９＋３＞（Ａ− Ｔ’／Ｔ−Ｇ）　Ｋ（ＴＨ／Ｇ）　１／（２５＋５）（Ａ−Ｃ／Ｔ−Ｇ　）　Ｋ（Ｃ／ＧＳ）　１／３０（Ａ−Ｔ”／Ｔ−Ａ）　Ｋ（ＴＨ／Ａ）　１／４０（Ａ −Ｃ／Ｔ−Ａ）　Ｋ（Ｃ／Ａ）　１／４０向に、第二オリゴマーは３′→５′の方向に書かれている。

“は二本鎖連結の量が相補的オリゴデオキシヌクレオチドの不在下で見られる量の実験的不確実性の範囲内にあることを示す。

罠臣匠ｌ塩　５−メ　ルー２−ピリミジノン　６−　グアニンの」ユコ土戸！塩基対５−メチル−２−ピリミジノン／６−チオグアニン（ＭＰＯ／６ＴＧ）を含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成する。その合成二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは唯一の制限酵素部位に相当する一本鎖５′末端を有する０合成二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、Ｔ４リガーゼ触媒反応を用いて、二本鎖ＤＮＡベクターのプラスミドまたはファージの唯一の制限部位へｉｎ　ｖｉｔｒｏで挿入する。二本鎖合成オリゴデオキシヌクレオチドのベクターＤＮＡへの挿入は、挿入が行われる領域においてベクターＤＮＡの塩基配列により特定されたタンパク質機能の不活性化を起こす、失われたタンパク質機能、例えばβ−ガラクトシダーゼ酵素、は感染細胞内でのベクターの複製にとって不可欠なものではない、外来ＤＮＡの添加により形質転換しうるＥ、ｅｏｌｉ株は、合成二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを保有するベクターにさらされる。　Ｅ、ｃｏｌｉ株は細胞内の複製ベクターの存在がそのベクターを含まない細胞から識別できるように選ばれる。さらに、Ｅ、ｃｏｌｉ株は非必須タンパク質機能の有無の検出を可能にする特徴をもつ。形質転換細胞はＭＰＯ／６ＴＧの塩基および／または（デオキシ）ヌクレオチドの存在下で生育させる。細胞およびそれらのベクター（非必須タンパク質機能をもたない）を何世代にもわたって複製させた後、ベクターを単離する。その後、ベクターＤＮＡに含まれるオリゴデオキシヌクレオチドは塩基対Ｍ　Ｐ　Ｏ／６Ｔ　Ｇの存在について分析される。

一般的には、Ｍｅｓｓ’＋ｎｇ（Ｍ２Ｓ　ｅｌｏｎｉｎ　／ｄｉｄｅｏｘ　ｓｅ　ｕｅｎｅｉｎＩ　ｎ５ｔｒｕｅｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

ガイサースバーグ、メリーランド州、１９８６）のＭ１３ファージおよびプラスミドクローニング方法論が用いられるであろう、１２個以上の残基を有する相補的オリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホトリエステル法および／またはホスファイト−トリエステル法（Ｇａｉｔ、Ｍ、Ｊ　、（Ｅｄ、）、Ｏｌｉ　ｏｄｅｏｘ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅ−ｓｉｓ、　Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９８４）を用いて合成される。二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは塩基対５−メチル−２−ピリミジノン／６−チオグアニン（ＭＰＯ／６７Ｇ）を含むであろう。二本鎖オリゴマーの各末端の一本鎖領域は、その二本鎖オリゴマーがベクターの５ａ１ｉクロ一ニング部位へ連結されるように、Ｓ＠ｌ　ｉ制御部位突出配列（５’）ＴＣＧＡをもつであろう。

次に、ファージＭ　１：３ａｐ１８の複製型およびプラスミドｐＵ　Ｃ８（または１８）は５ａ１１で切断し、線状化したベクターの５′ホスフエートをアルカリホスファターゼを用いて除く。

１０μ！容量の標準連結反応混合物は２Ｆｍｏｌｅの線状Ｍ１３ｍｐ１８またはｐＵＣ８（もしくは１８）および１０〜３０ｐｍｏｌｅの相補的オリゴデオキシヌクレオチドを使用する。短いオリゴマーの会合定数は低いので、高濃度の相補的オリゴマーが必要である。ベクターへのコンカテマー＜ｍ状体）の起こりうる組込みは不利なことではない。

連結後のＭ１３＋ｍｐ１８およびｐｕ　Ｃ８（または１８）による形質転換は両方ともＥ、ｃｏｌｉのＤＨ５α株（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）または同様の菌株を用いる０Ｍ１３ｍｐ１８の場合、Ｄ　Ｈ５ａ細胞はＭ１３ファージＳ染のためにＦ′株を必要とするのでＥ、ｃ。

１ｉ　ＪＭ１０７株（Ｙａｒｉｓｅｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、３３：１０３，１９８５）と共にまかれるであろう。

Ｍ１３ｍｐｌＨの場合、培地は標準成分のほかにＭＰＯおよび６７Ｇの塩基および／または（デオキシ）ヌクレオシドをＯ，ＯＯＩＭ〜０．０００１Ｍの濃度で含むであろう、白色プラークからのコロニーは単離して、ＭＰＯおよび６７Ｇを含む培地上で精製する。

Ｍ１３ｓｐ１８ファージはＭＰＯおよび６７Ｇを添加した標準培地で生育する細胞から産生されるであろう、ファージからの一本鎖ＤＮＡはフェノール法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８２）により分離される。

ｐＵＣ８または１８を用いる場合、このプラスミドにさらした後、形質転換工程からの細胞は５０μ３／１１のアンピシリンとＯ，ＯＯＩＭ〜Ｏ，ＯＯＯＩＭの濃度のＭＰＯおよび６ＴＧの塩基および／または（デオキシ）ヌクレオシドを添加した標準培地にまく、白色コロニーを精製し、その細胞は核酸を標識するために３２Ｐホスフエートの存在下で生育させる。プラスミドは標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓらの上記文献）を用いて細胞から分離する。

ファージＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを解析する際に、プラスミドは５ａｌｌ制限酵素で消化し、アクリルアミドゲル電気泳動それに続くラジオオートグラフィーによるバンドの位置決定を用いて、ｐＵＣ８の大きい方のＤＮＡから小さいオリゴデオキシヌクレオチドを精製する。小さいオリゴデオキシヌクレオチドはゲルから溶出して、ホスホジェステラーゼで消化する（Ｍａｎｉｉｔｉｓらの上記文献）、その消化物は強陰イオン交換体によるＨＰＬＣ（例えばＷｈａｔｍａｎ　ＰＸＳ　−１０２５ＳＡＸ　４．６ａ２５０ｗｗ）で０．００７Ｆ　ＫＨｚＰＯ４（ｐＨ４，０）から０．５Ｆ　Ｋα、０．２５ＦＫ８２ＰＯ−（ｐＨ４，５）までの線状匂配を用いて分析する。ＭＰＯおよび６ＴＧのオー七ンティック５′デオキシヌクレオチドも消化物と一緒に流す０ＭＰＯおよび６７Ｇの添加ヌクレオチドのピークと同一である２２ｐのピークの出現は、塩基対ＭＰＯ／６ＴＧがｉｎ　ｖｉｖｏにおいて複製されたことを証明している。

さらに、Ｍ１３ｍｐ１８−重鎖ＤＮＡはオリゴデオキシヌクレオチド合成用の普遍プライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｎｔｅｒ）をもつ鋳型として使用されるであろう、２つの反応混合物が用いられる。１つはＭＰＯおよび６７Ｇデオキシヌクレオチドの５′トリホスフエートをさらに含む、塩基６　Ｔ　Ｇおよび／またはＭＰＯがファージのクローニング部位に存在するならば、ポリメラーゼが標準塩基のみを含む反応混合物中で鋳型のＭＰＯまたは６７Ｇ塩基と出会う場合、ＤＮＡ合成は終わりになるかまたはその速度が実質的に遅くなるであろう。

しかし、ＭＰＯおよび６７Ｇデオキシヌクレオチド５′トリホスフエートを含む反応混合物中ではクローニング部位を通ってＤＮＡ合成が続けられるであろう、標準ヌクレオシド５′トリホスフエートのうちの１種はアルファ３２ｐを含む、２つの反応混合物中で合成されたオリゴデオキシヌクレオチドのアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、より大きいオリゴデオキシヌクレオチドがＭＰＯおよび６ＴＧ５’）リホスフェートを含まない混合物中よりも、それらを含む混合物中で生産されることを示すであろう、対照として、ＭＰＯ／６ＴＧ塩基対の代わりにグアニン／シトシンまたはアデニン／チミン塩基対を含む合成相補的オリゴデオキシヌクレオチドとの比較がなされるであろう。

本発明は今や十分詳しく説明してきたが、当分野で通常の知識を有する者には、多くの変更および修飾が本発明の精神および範囲な逸脱することなくなし得ることが明らかであるだろう。

ＦＩＧ、ｊＡＦＩＧ、　／Ｂ手続補正書Ｇカ平成　２年よ月／ｇｄ：特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３２１４２、発明の名称人口ＤＮＡ塩基対類似体３、補正をする者事件との関係　特許出段状住所名　称　テンプル・ユニバーシティ４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　平成　２年　１月３０日　（発送日）６、補正の対象（１）出願人の代表音名を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文（３）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告、暴夢言噸嘩−１’１４１１１１Ｍ−＾−１シｋａｌ−−Ｈ−１−一（ＰＣＴ／ｉ二：Ｓεε／Ｃ二１２ｍ４ＳＡ　２Ｌ６：２

Claims

【特許請求の範囲】

１．アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）、および人工ビリミジンと対合した人工プリンの塩基対を有する二本鎖遺伝子配列であって、該人工プリンは対合した人工ビリミジンの２，４置換基と水素結合および疎水相互作用から選ばれる相互作用を確立する２，６置換基を有し、該相互作用のうちの１つはＨ−Ｓであり、そして標準塩基対または人工塩基対と比べた場合、人工プリンまたは人工ビリミジンと標準塩基との塩基対合に対して有意な自由エネルギーの差異が存在し、それにより該二本鎖の構造的一体性が保たれることを特徴とする上記の二本鎖遺伝子配列。
２．塩基対を含むＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇの二本鎖遺伝子配列であって、該塩基対の一方の塩基はＨ、Ｏ、ＳおよびＮＨ２から選ばれる２，６置換基を有する人工プリンであり、その相補的塩基はＨ、Ｏ、ＳおよびＮＨ２から選ばれる２，４置換基を有する人工ピリミジンであり、それにより人工プリンの６位が第一塩基相互作用として人工ビリミジンの４位と相互作用し、且つ人工プリンの２位が第二塩基相互作用として人工ビリミジンの２位と相互作用し、その際第一および第二塩基相互作用の少なくとも１つはＨ−Ｓであり、それにより該二本鎖の構造的一体性が保たれることを特徴とする上記の二本鎖遺伝子配列。
３．第一塩基相互作用はＨ−Ｓであり、第二塩基相互作用はＨ−Ｓ、Ｈ−ＯおよびＮＨ２−Ｏより成る群から選ばれる、請求項２記載の二本鎖遺伝子配列。
４．第二塩基相互作用はＨ−Ｓであり、第一塩基相互作用はＨ−Ｓ、Ｈ−ＯおよびＮＨ２−Ｏより成る群から選ばれる、請求項２記載の二本鎖遺伝子配列。
５．アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）、および人工ビリミジンと対合した人工プリンの塩基対〔但し、該人工プリンは対合した人工ビリミジンの２，４置換基と水素結合および疎水相互作用から選ばれる相互作用を確立する２，６置換基を有し、該相互作用のうちの１つはＨ−Ｓであり、そして標準塩基対または人工塩基対と比べた場合、人工プリンまたは人工ビリミジンと標準塩基との塩基対合に対して有意な自由エネルギーの差異が存在する〕を有する二本鎖遺伝子配列を含む生物の複製速度を、該生物に利用可能な人工プリンおよび人工ビリミジンの濃度を調節することにより制御する方法。