JPH02501354A - 人工dna塩基対類似体 - Google Patents
人工dna塩基対類似体Info
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- JPH02501354A JPH02501354A JP63508006A JP50800688A JPH02501354A JP H02501354 A JPH02501354 A JP H02501354A JP 63508006 A JP63508006 A JP 63508006A JP 50800688 A JP50800688 A JP 50800688A JP H02501354 A JPH02501354 A JP H02501354A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
人よりNA塩基対類似体
本発明は1987年9月22日に米国特許庁に出願された米国特許出願第099
744号の一部継続出願である。
l吸へ11
本発明は、新規なりNA塩基対類似体およびこれらの類似体の製造および使用方
法に関する。
良東a伎丘
保護されたデオキシヌクレオチドからオリゴデオキシヌクレオチドを合成するた
めの単純で、しかも迅速な方法の出現は、ミスマツチ塩基対の物理的および生物
学的研究(Aboul −el@。
et ml、Nueleie Ac1d Re5earch、14:4811,
1985)、並びに一方の塩基が類似体である塩基対の研究(J 1ricny
、弓−り−、、NucleieAcid Re5eareh、14:6579,
1986)を数多くもたらした。
細胞の遺伝装置において付加的な相補塩基対として機能しうる一対の塩基を作製
することができるかどうかの問題は研究されたことがない、相補的塩基対の作製
に用いられる基準は安定性、塩基および/またはヌクレオシドからの(デオキシ
)ヌクレオシド三リン酸の生化学的合成経路、必須代謝経路の類似体阻害、(デ
オキシ)ヌクレオシド三リン酸のDNAおよびRNAポリメラーゼ利用、DNA
ポリメラーゼの誤差頻度および誤差修正、並びにミスマツチ塩基対の修復の諸問
題を解決すべきである。
初期の頃、ポリメラーゼの誤差頻度(Goods*an、et al、。
Journal of Mo1ecular Biolo 、88:423,1
974)、ポリメラーゼの誤差修正、およびミスマツチ塩基対の修復について、
構造的または定量的データはほとんど役に立たなかった。これらの問題点はかな
り明らかにされた(Kramer、et al、、Cel↓、38:879゜1
984)。相補的塩基対の作製者のための重要な警告は、遺伝情報の複製の最終
的な正確さと、異なる塩基間の相互作用の強度と、の関係が物理的に特定できな
いということである。
i乳a4紅
本発明の目的は、人工ピリミジンと対合した人ニブリンから成る新しいオリゴデ
オキシヌクレオチド塩基対を提供することであり、その場合、二本鎖の構造的一
体性が保持されるように、人ニブリンは対合した人工ピリミジンの2,4置換基
と相互作用する2、6置換基を有する。
本発明の他の目的は、人工ピリミジンと対合した人ニブリンの塩基対を提供する
ことであり、その場合、人ニブリンはHlO,SおよびNH,から選ばれる2、
6置換基を有し、その相補的塩基はH,O,SおよびNH,から選ばれる2、4
置換基を有する人工ピリミジンである。その結果、人ニブリンの6位は第一塩基
相互作用として人工ピリミジンの4位と相互作用し、そして人ニブリンの2位は
第二塩基相互作用として人工ピリミジンの2位と相互作用し、その際第−および
第二塩基相互作用の少なくとも1つはH−3であり、さらに、その塩基対がA、
T、CおよびGを含む二本鎖遺伝子配列中に存在する場合、その二本鎖の構造的
一体性が保持される。
本発明のさらに他の目的は、相補的塩基対として二本鎖遺伝子配列中に組込むた
めの人ニブリンおよび人工ピリミジンとして使用し得る新規化合物を提供するこ
とである。
本発明によれば、次式:
(式中、R4は水素、硫黄、酸素またはアミノであり、R2は水素、酸素、硫黄
またはアミノであり、そしてR5は水素、))ロゲン、−S CHs、−OH、
ヒドロキシメチル、アルコキシ、シアノ、メチルアミノ、ニトロ、または非置換
であるかもしくはハロゲン置換された炭素原子数1〜3の炭化水素基である)で
表される人工ピリミジンが提供される。また、これらの化合体も含まれる。
さらに、本発明によれば、次式:
(式中、R4は水素、硫黄、酸素またはアミノであり、Rtは水素、硫黄、酸素
またはアミノである)
で表される人ニブリンが提供される。また、本発明によれば、これらの化合物の
3−デアザおよび7−デアザ誘導体も含まれる。
従って、本発明はアデニン(A)とチミン(T)の塩基対、シトシン(C)とグ
アニン(G)の塩基対、および人工ピリミジンと対合した人ニブリンの塩基対を
有する二本鎖遺伝子配列に関し、その場合、二本鎖の構造的一体性が保持される
ように、人ニブリンは対合した人工ピリミジンの2.4置換基との相互作用(水
素結合および疎水相互作用から選ばれる)を確立する2、6置換基を有する。天
然塩基対に存在するように、本発明の人工塩基対は1−プリン位置と3−ピリミ
ジン位置との間に水素結合を有する0本発明の塩基対において、2.6プリン位
置または2.4ピリミジン位置の少なくとも1つの置換基は硫黄であり、その硫
黄に相補的な置換基は水素である。望ましくは、相補的人工塩基対間に相互作用
をもたらす基は硫黄と水素;酸素と水素;酸素とアミノ;または水素と水素であ
る。
人ニブリンおよび人工ピリミジン並びに塩基対としてのそれらの使用は遺伝学に
大いなる進歩をもたらす、いくつかの人ニブリンおよび人工ピリミジンは知られ
ていたが、従来技術のこれらの分子は安定した塩基対の形成のために利用された
ことはなかった。実際に、従来技術の人工分子は標準塩基、ヌクレオシド、また
はヌクレオチドの合成を阻害するために、あるいは例えば抗癌剤としてそれらを
使用する場合のように、標的DNAを不安定にするために用いられた。対照的に
、本発明の対合した人ニブリンと人工ビリミジンは安定した二本鎖DNAの維持
を可能にするばかりでなく、これらの人工塩基対は天然に存在する塩基対の存在
下でさえも互いと優先的に相互作用するであろう。
組換えDNA技術の出現と共に生じた社会的関心事は、遺伝学的に改変された生
物の外界への漏れおよびそれらが環境に及ぼしうる有害な影響である。もしも本
発明の人工塩基対を組込んだ組換え生物が漏れ出たり、環境へ放出されたとして
も、人工塩基対を構成するのに必要な人ニブリンおよび人工ビリミジン塩基また
はヌクレオシドが存在しないために、それらの生物は複製されないであろう。
本発明の人工塩基対を使用すると、たとえば環境へ漏れ出たり放出されたとして
も、複製し得ない生物をつくり出すことが可能である0本発明の人工塩基対は自
然界の生物または組換えにより改変された宿主生物によって合成され得ないので
、組換え生物のゲノムへの本発明人工塩基対の組込みは、人工塩基を外因的に、
例えば増殖培地に、供給しない限り、複製を妨げるであろう、その理由は、宿主
生物が本発明の人工塩基対を他の物質から合成するための生合成機構をもたず、
人工塩基対の外部供給源に完全に依存するからである。同様に幾分かは、培地中
の人工塩基の濃度または生物に利用可能な人工塩基の濃度を調節することによっ
て生物の複製速度をl!Ilt!4することができる。
本発明の人工塩基対の別の利点は、組換え生物の染色体の特定位置からその生物
の複製が同時に起こるような組換え生物をつくるために、本発明の人工塩基対を
使用し得る点にある。
図m児
第1図:
(A)塩基対5−メチル−2−ピリミジノン(左側の塩基)および6−チオグア
ニン(右側の塩基)の概略図、(B)写真はシトシン/グアニン塩基対から誘導
された塩基対5−メチル−2−ピリミジノン/6−チオグアニンを示す、シトシ
ン/グアニン塩基対はX1!結晶学によって決定された二本鎖オリゴデオキシヌ
クレオチドの末端から3つめの塩基対である(D 1ckerson、etal
、、Journal of Mo1ecular Biolo 、14旦ニア6
1,1981)、シトシン(左側の塩基)のアミノ基は水素(結合距離1.09
人)で置換された。5−メチル基は示されていない、グアニン(右側の塩基)の
酸素は硫黄(結合距離1.7人)により置換された。その他の変更は行わなかっ
た。点は硫黄(1,8人)および水素(1,2人)のファンデルワールス半径の
程度を示す。
毘1欠腹吋
本発明の塩基対は望ましくいくつかの条件を満たすべきである:すなわち(1)
塩基対は二本鎖分子の安定性に寄与すべきである。(2)標準塩基対または新規
塩基対と比較したとき、新規塩基と標準塩基との塩基対合に対して有意な自由エ
ネルギーの差異が存在すべきである。
塩基対選択の根底にある主な化学的・生物学的理論は次の通りである:すなわち
(1)ピリミジンの3−窒素とプリンの1−窒素との間の水素結合は、これらの
位置および水分子の水素結合の正味変化が二本鎖形成を変えないように、保持さ
れる。(2)気相における分光分析は、硫黄の水素結合力定数が酸素の172で
あり、X−H軸と硫黄結合の対称軸の間の最も安定した角度が酸素の45°の代
わりに90’であることを示唆した。
その他の置換基も、それが二本鎖遺伝子配列分子の基本的機能を破壊したり不安
定にしない限り、いろいろな位置で使用することができる。
塩基対として許容される人ニブリンおよび相補的人工ピリミジンの選択は、例え
ば水素結合および疎水相互作用並びに立体因子のような、結合因子により影響を
受ける9例えば、本発明の人工ビリミジンは、大きいヨウ素原子によってしばし
ば立体安定性の問題が起こるので、4位にヨウ素原子をもつことはない。
塩基対A/Tに対する、G/Tを含む二本鎖の会合定数の比(表■)は173で
あり、この値はAboul−elaら(Nueleie Ac1dResear
ch、13:4811.1985)がIMNacl中で測定した値よりも9倍大
きい、彼らの値は二状態モデル(two 5tate model)の枠組内で
融解時に起こる光学密度変化の解釈に基づいている。
Markeyら(B io ol mers、22:1247,1983)は、
イオン強度が増加する場合、熱エンタルピーがファントホッフ(Van’L H
off>エンタルピーと相違することを明らかにした。その結果は、二状態モデ
ルが会合定数の計算に有意な誤差を導入しうろことを示している。G/Cの代わ
りにG/Tを含む7−her同士の会合定数の低イオン強度および15℃での直
接的NMR4定は1/25の値を与えた(Salisbury、et al、、
Journal of −the ChemicalSoeiet Chemi
cal Communications、14,985.1985)、表■から
の相当する比は19℃で1742である。G/T塩基対が存在する場合の詳細な
配列への安定性の非常に強い依存は、室温において安定なオリゴデオキシヌクレ
オチドG−G−G−G−T−C−C−Cから成る二本鎖の結晶により例証され(
K neale、et s土、、 J ournal ofMolecular
B 1ota 、186:805,1985)、一方c−c−c−c−c−T
−c−cの結晶は6℃以上で融解する(Hunter、et al、、Jour
nal ofMolecular Biolo 、190:605,1986)
、R的利用により、融解の二状態モデルに基づいた値は安定性の差を過大評価し
がちであるが、二本鎖の酸素的連結に基づいた評価は、部分的塩基対合のみを含
む二本鎖が基質として作用しうるので、その差を過小評価しがちであると予想さ
れる。酵素的連結の結果とNMR法の結果とが類似すると安心である。
塩基2−ピリミジノンを含む鋳型オリゴデオキシヌクレオチドおよびDNAポリ
メラーゼIのKlenowフラグメントを用いて、Charezukら(Nue
leie Ac1d Re5earch、14:9530,1986>は標準ヌ
クレオチドが2−ピリミジノンの真向かいに組込まれないという予備的証拠を提
示した。
G/T塩基対を除外して、表■の結果はAboul−elaらの結果(上記文献
参照)と一致する0両者は標準塩基対が標準塩基のミスマツチ(誤対合)塩基対
よりもかなり大きな安定性を与えることを示している。塩基対6−チオグアニン
15−メチル−2−ピリミジノンは標準塩基対アデニン/チミンにほぼ等しい安
定性を与えた。i&大の安定性を有するミスマツチ塩基対、グアニン15−メチ
ル−2−ピリミジノン、は明らかにDNAポリメラーゼ■によって有意な重合が
起こるための適当な幾何学的形状を有していない(Charlczukらの上記
文献参照)、これらの結果は、塩基対6−チオグアニン15−メチル−2−ピリ
ミジノンが有用な相補的塩基対であるための物理的特性をそなえていることを示
唆している。
トリチウムで標識した6−チオグアニンまたはデオキシリポジルー5−メチル−
2−ピリミジノンを用いるEseheriehiaeoliによる実験は、その
(デオキシ)ヌクレオシド三リン酸が合成されたことを示した。極めて少ない量
のそれぞれの塩基がDNAに組込まれた。
先に論じた事柄に加えて、その(デオキシ)ヌクレオシド三リン酸は相補的塩基
を含む鋳型に対してRNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの両方の基質であ
るべきであり、それらの類似体または誘導体は必須代謝経路の有意な阻害剤であ
ってはならない、新規塩基と標準塩基とのミスマツチは酵素により修復可能であ
るべきである。
人工ビリミジンはうまたは6アザ誘導体でもありうる。5位が炭素原子である場
合、それは水素、ハロゲン、−5CH,。
−OH、アルコキシ、シアノ、メチルアミノ、ヒドロキシメチル、ニトロ、およ
び非置換またはハロゲン置換された炭素原子数1〜3の炭化水素基のようなラジ
カルで置換されていてもよい。
人ニブリンは3−デアザまたは7−デアザ誘導体でもありうる。
2.6プリン置換基または2,4ピリミジン置換基の少なくとも1つは硫黄であ
る。チオケト基が人工塩基対の一方の員子のある位置に存在する場合は常に、人
工塩基対の他の員子の相補位置に水素が存在する。望ましくは、硫黄−水素相補
的置換基のほかに、人工塩基対は酸素−水素、または酸素−アミノ相補的置換基
を含むであろう、2.6プリン置換基は同一であっても異なっていてもよく、例
えば硫黄と酸素、硫黄とアミノ、または硫黄と硫黄であり得る。同様に、2.4
ピリミジン置換基も同一または相異なる置換基であり得る。
適当な人工塩基対は以下のものである:4−チオケト−ピリミジンおよび2−チ
オケト−プリン2−アミノ−4−チオケト−ピリミジンお、よび2−クトーブリ
ン2−チオケトーピリミジンおよび6−チオケト−プリン2−チオケト−4−ア
ミノ−ピリミジンおよび6−ケト−プリン2−ケト−4−チオゲトービリミジン
および2−アミノ−プリン2−チオケト−4−チオゲトービリミジンおよびプリ
ン2−ケト−ピリミジンおよび2−アミノ−6−チオケト−プリン4−チオゲト
ービリミジンおよび2−ケト−プリン4−ケト−ピリミジンおよび2−チオケト
−プリン2−ゲトービリミジンおよび6−チオケト−プリンその他の適当な人工
塩基対(但し、ピリミジンは1−デアザ誘導体(ピリジン誘導体)でありうるが
、プリンは3−デアザ誘導体であり得ない)は次のものである:2−アミノ−ピ
リミジンおよび2−ケト−6−チオケト−プリンビリミジンおよび2−チオケト
−6−チオケト−プリン4−アミノ−ピリミジンおよび2−チオケト−6−クト
ープリン塩基対中で用いた人ニブリンおよび人工ビリミジンは、当該技術分野で
通常の知識を有する者に知られた技法を用いて合成することができる(S nt
hetic Procedures in Nucleie AcidChem
i=山■工Townsend、et al、、Eds、、Part 1(197
8)、2(1978)and 3 (1986) ; Z orbach 、e
t a土、、S nthetie Procedures 1nNucleic
Ac1d Chimistr 、Vol、 1 、(1965)を参照された
い)。
所定の塩基の適当なデオキシヌクレオシドは2−デオキシ−3,5−ジー0−p
−)ルオイルー〇−エリスローベントジルクロライド(Bhat、S nthe
tic Procedures in Nueleic Ac1d7、Zorb
ach、et !土、、Eds、、Vo1.1 、p、521.1968)およ
び適当に保護された塩基から、(1)溶液中でのシリル−水銀法(B 1rko
fer、et a土、、An ew、chem、、77:414,1965)ま
たは融合法(Kotick、etal、、止ournal or Or ani
c Chemistr 、34:3806゜1969) :あるいは(2)立体
特異的ナトリウム塩法(K azimierczuk。
11±、、L四皿at of工j二にセy」ン閏山ILシに1廊、す且:637
9,1984)により合成できる。
3−および7−ジアザプリンデオキシヌクレオシドの合成はナトリウム塩法(K
azisierczukらの上記文献)および適当な誘導体(Gingis、e
t al、、Nucleie Ac1d Re5earch、15:1217゜
1987)を用いて行われる。ピリミジンC−デオキシヌクレオシドの合成はヌ
クレオシドを用いて5atoら(Nucleic Ac1d7、 T owns
end 、 et s↓、、Eds、、Part 3.p、81.1978)に
より記載された方法と類似した方法で行われる。
1−デアザピリミジン誘導体(ピリジン誘導体)の合成は標準有機化学を用いて
行われる。ピリジン誘導体はその3位に電子置換を与えるために、ルイス酸、A
lα、またはB F s、もしくは過塩素酸銀の存在下で2−デオキシ−3,5
−ジー0−p−トルオイル−〇−エリスローベントジルクロライドと反応させる
。
人工デオキシヌクレオシドのαおよびβアノマーの両方が製造される場合には、
例えば示差結晶化(Nueleic Ac1d7、 T ownsend 、
et !土、、Eds、、Part 2,1978)またはカラムクロマトグラ
フ! −(Lu、et al、、Or anic Chemistr 、3ニア
。
:2923,1972)のような標準技法によりそれらを分離することができる
。
本発明の人工塩基対の挿入による宿主生物の形質転換は、線状セグメントの形で
またはその核酸を宿主ゲノムに組込むことのできるプラスミドまたはファージの
一部として、DNAを取込ませることによって達成される。宿主細胞の形質転換
技術は当業者によく知られており、詳しい説明は省略する。
DNAは多数の人工相補的塩基対を含むことが好適である。
さらに、人工塩基対を含むDNAは、宿主遺伝子の発現または生存力の有意な破
壊が重大なことにならないイントロンのような位置で宿主細胞ゲノムの領域に組
込まれるのが好ましい。
好気性または嫌気性の、真核および原核生物が本発明の人工塩基対による形質転
換の宿主として用いられる。形質転換された生物は適当な発酵槽内で水性培地に
て培養することができる。
一般的に、水性培地は例えばほぼ中性pHで約37℃に保たれ、炭素源としての
炭水化物またはグリセロール、窒素源としての硫酸アンモニウム、カリウム源と
してのリン酸カリウム、微量元素、硫酸マグネシウムなどの適当な栄養分を含む
、培養培地および条件は宿主生物に応じて変化するであろうが、それらは当該技
術分野でよく知られている。
本発明の合成塩基対を含む宿主生物が構築された後、培地中の人工塩基対の濃度
を調節することにより、宿主細胞の複製を制御することが可能である。適当な塩
基対の濃度はそれぞれの生物および宿主ゲノム中の対合塩基の数により変化しう
る。培地中の合成塩基対の最適濃度は当業者により容易に決定されるだろう。
本発明の人工塩基対は、生物の複製が同時的に起こる組換え生物の構築をも可能
にする。この技術は制限酵素および連結の標準寸法を用いて、例えばMuファー
ジ突然変異体Mud ■(lae。
ap)のような人工塩基対の配列を導入することにより達成しうる(Casad
aban、et al、、Proceedin s of the Natio
nal Aea−de+a or 5eienees、76:4530,197
9)、 MudゲノムはE、coli染色体のほとんどどの位置にでも組込まれ
、特定領域にMudJを組込んだクローンを選別することができる(Casad
ebanらの上記文献)0人工塩基の外部供給源の不在下では、複製複合体は染
色体中の人工塩基対に到達するときに複製を停止するであろう、結局、培養下の
細胞はすべて染色体のこの特異な位置で複製を成し遂げなり中止したりするであ
ろう0人工塩基の添加は、全細胞の複製を同時に同じ場所で開始させるであろう
、さらに、この方法は宿主染色体に組込まれる適当なベクターを有する原核生物
に適している。同様に、真核生物の染色体には多くの特異な複製開始部位が存在
するので、本発明の人工塩基対を保有する組込み型ベクターの使用は、反核生物
について上述した方法と同じ方法で、限られた領域の真核生物染色体の合成のコ
ントロールを可能にするであろう。
上記開示は本発明を一般的に説明するものである。より十分な理解は、以下の特
定の実施例(例示目的でのみここに提供されるものであり、本発明の範囲を制限
するものではない)す9照することにより得られるであろう。
犬里上り−
6−グアニン 5−メ ルービレミジン−2−ン江α光腹
A6g!3JL
用いた化学薬品およびそれらの供給源は次の通りであった:β−デオキシヌクレ
オシド(Sigma社)、ベンゼンチオール(E asteean社)、臭化セ
チルトリメチルアンモニウム(Aldrieh社)、2−クロロフェニル−ジク
ロロホスフェ−) (A 1drieh社)塩化4.4′−ジメトキシトリチル
(Aldrieh社)、長鎖アルキルアミンコンドロールド・ボア・ガラス(P
ierce社)、1−(メシチレン−2−スルホニル)−3−二トロー1.2.
4− )リアゾール(Aldrich社)、シアン化水銀(II )CA Id
rieh社)、1−メチルイミダゾール(A Idrieh社)、2−ニトロベ
ンズアルドキシム(A 1drich社)、酢酸p−ニトロフェニル(Sigs
a社)、炭酸銀(A Idrich社)、シリカWoel+s T S C(I
N CN utritionalB iochemical)、すべての溶剤
は再蒸留し、適当な無水条件下で貯蔵した(Sproat、et al、 、
G a i t 、 M 、 J 、 (E d 、 ) 、 立柱り肚吐−e
otide Σ圧肱弦垣、 I RL Press、0x4ord、1984>
。
用いた酵素およびそれらの供給源は次の通りであった:ポリヌクレオチドキナー
ゼ(Bethesda Re5earch Labs)、ヘビ毒ホスホジェステ
ラーゼ(Sigma社)、T4DNAリガーゼ(B ethesda Rese
arch L abs)、Sal l (New EnglandB 1ola
bs) 。
シル−9H−プ1ンー6一 −ル −−シー6−土Aヱノ2ン士
2−アセトアミド−6−クロロ−98−(2−デオキシ−3,5−ジー0−p−
)ルオイルーD−リボフラノシル)プリンのβ−アノマーは既知方法により製造
した(Roark、et al、、Townsend。
L、B、and Tipson R,S、(Eds、)、Nucleic Ac
1d Chemistr 。
John Wiley ant35ons、Part 2,583.1978)
、保護された6−クロロ誘導体のβ−アノマーはその保護基を除去して、Aet
onらの方法(S nthetic Procedures in Nucle
ie Ac1dq舶1値υ工、 Z orback、 et a I 、 、
E ds、 、 Vol 、1.272 、1968を参照)に従って硫黄化し
た。得られた物質は、熱水からの結晶化後に、予期した通りの紫外線可視スペク
トルを有していた(Tong、etal、、Journal of Or an
ic Chemistr 、32:859,1967)。
2、 1− シー −D−1ボフーノシル−5−ヌル−2−ピリミジノン −−
シリポジルー5−ヌル−2−ビ1ミジノン
4−チオチミジンは既知方法により製造した(Wempen、et at、。
Grossmen、L、、and Mo1dare、に、(Eds、)、Met
hods in Enz −7、A cademie P ress、 X I
I 、 P art A 、75.1967) 、デオキシリポジルー5−メチ
ル−2−ピリミジノンはラネーニッケルで還元することにより4−チオチミジン
から製造した。4−チオチミジン5.9y(22mmole)を、還流冷却器を
備えたフラスコ中の蒸留水18011’およびエチルアルコール6011に加え
た。ラネーニッケル24gを加え、この溶液を還流下で加熱した。R高の収率を
得るために、4−チオチミジン溶液はそれぞれのラネーニッケル調製物と共に滴
定し、0.IN Na中のサンプルの光学密度を260.322および334n
mで測定した。光学密度は3つの波長すべてにおいて減少した。 322nmで
の光学密度が334n+sでの光学密度に等しいか又はそれより大きくなったと
き反応を停止した。初期溶液からの3340−での光学密度の減少は最高収率の
場合に約6倍であった。この反応はイソプロパツールを用いるシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー(TLC)により追跡した。この化合物に特徴的な青色蛍光ス
ポットが現れた(Rf=0.35)、初期の緑色を帯びた溶液は反応の終わりま
でに非常に薄い黄色になった。他の生成物が形成されたので、全部の4−チオチ
ミジンを使用するまで反応を続行しなかった。この懸濁液を熱濾過し、ラネーニ
ッケルを水150z1と共に沸騰させた。この溶液を熱いうちに濾過し、合わせ
たr液を蒸発させた。デオキシリポジルー5−メチル−2−ピリミジノンはW
o e l−シリカ■を用いる乾式カラムクロマトグラフィーにより精製した。
ラネーニッケル還元からの固体にメタノール1011を加えた。この透明溶液3
.7f1はW o e I−シリカ■3.7.に加えて自然乾燥させた。デオキ
シリポジルー5−メチル−2−ピリミジノンを含む乾燥シリカは、ナイロン製チ
ューブに収容した乾燥Woel輸シリカシリカム(長さ20インチ×直径1イン
チ)の頂部に加えた。溶剤はイソプロパツールであった。溶剤の最前端をシリカ
カラムの底に到達させた後、クロマトグラフを終わらせた。ナイロン製チューブ
は1インチの区画に切断し、それぞれの区画に含まれるシリカをメタノール10
11で抽出した。各区画からのサンプルはイソプロパツールを用いてシリカゲル
TLCにかけた。唯一の蛍光スボツ) (Rf=0.35)を示した区画からの
メタノール抽出物をプールした。適当な区画からのプールしたシリカはメタノー
ルで再抽出し、初めの抽出物と一緒にプールした。濾過後メタノールを蒸発させ
て小容量となし、残存するシリカ微粒子を遠心により除いた。残りのメタノール
を蒸発させ、残留物を熱エチルアルコール10ilに溶解した。この溶液を一2
0℃におき、−晩晶出させた。黄色の上澄みをデカントし、結晶を冷エタノール
で洗った。エタノールの容量を4alまで減らし、−20℃においてさらに晶出
させた。シリカゲルTLCは5%未満の夾雑物を示した。
この結晶の溶液の紫外線可視スペクトルは文献記載のスペクトル(Laland
、et al、、Biochemieal Journal、90ニア6.19
64)に等しかった。4−チオチミジンから最終生成物までの収率は約25%で
あった。
C8−シー し シトのム
5 ’−0−4,4’−ジメトキシトリチルチミジン、N−ベンゾイル−5’−
〇−4.4’−ジメトキシトリチルデオキシシチジン、N−ベンゾイル−5’−
0−4,4’−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン、およびN−イソブチリ
ル−5’−0−4,4’−ジメトキシトリチルデオキシグアノシンは標準方法に
より合成した。(Narang、et s土、、Methods in Enz
+5olo 、Wu、Ed、、Vol。
88.90.1979)。
1、N−ペンシイルー−シー6− オグアノシン予備実験により、N−イソブチ
リルおよびN−アセチル誘導体はアルカリ加水分解の間あまりに不安定すぎて、
有意な収量のN−保護ヌクレオシドが得られないことが分かった。無水ピリジン
の蒸発により何度も乾燥させたデオキシ−6−チオグアノシン0−51?(1,
7m蒙ole)に無水ピリジン3.3t1と再蒸留クロロホルム6.6alを加
えた。4℃において、塩化ベンゾイル1.35*1(12ミリモル)を含む再蒸
留クロロホルム4.7alを、Caα、乾燥チューブを備えたフラスコに撹拌し
ながら滴下した。塩化ベンゾイルの滴下後、全部のデオキシ−6−チオグアノシ
ンを溶解させた。この溶液は黄色であった。この溶液を室温まで上昇させて3時
間撹拌した。メタノール/クロロホルム(0,5:9.5v/v)によるこの反
応のサンプルのシリカゲルTLCはUv吸収を有する1つのスポットを示し、こ
のスポットは酸および熱にさらすと暗褐色に変化した。このスポットは溶剤の最
前端に存在していた0反応溶液を氷6011中に注いだ、氷が溶けた後、水性エ
マルジョンにクロロホルム10alを加えて振とうした。相分離後、有機相は黄
色物質をすべて含んでいた。その有機相を水ZOwlで3回洗い、硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、蒸発させて油状物を得た。
この油状物にピリジン1911を加えた。透明な溶液が得られた。
水1.8zfを加えた後、メタノール19alを加えた。この溶液を4℃におき
、pH12,4〜12.5に達するまで2NNaOHを徐々に加えた。pHは2
NNaOHの添加により約12.4に維持した。
加水分解はメタノール/クロロホルム(1,5,:8.5v/v)を用いてシリ
カゲルTLCにより追跡した。大部分のUV吸収物質は1つのスポット(Rf=
0.3)に存在していた。チオキシ−6−チオグアノシンのRfは0.19であ
った。デオキシ−6−チオグアノシンの有意な製造を避けるために、NaOHの
添加およびその時間に若干の注意が必要であった。反応は20%酢酸を加えてp
H7,8に下げることにより停止させた。中和のために交換樹脂を使用した場合
はかなりの損失を被った。この溶液を蒸発させて油状物を得た。
パイロット実験により、N−ベンゾイル誘導体とジ、トリ、テトラベンゾイル誘
導体の熱水に対する溶解度の差を利用して精製するのが便利な方法であると分か
った。油状物に水600iZを加えて、撹拌しながら70℃に加熱した。液体を
不溶性物質からデカントし、4℃においた。沈殿物が形成され、濾過により収し
た。この水溶液を250y/まで蒸発させ、2回目の沈殿物を一過により回収し
た0合わせた沈殿物のシリカゲルTLCは、90%以上がN−ベンゾイル誘導体
であることを示した。
同様な分離方法は、油状物をクロロホルム20W1に溶解し、そのクロロホルム
を弱塩基性NH,OH溶液(pH10)で何度も抽出することであった。
N−ベンゾイル−デオキシ−6−チオグアノシンを含むRf=0.3のスポット
の同定は、完全なアルカリ加水分解後に回収された安息香酸の量の定量分析、お
よびpH5からpH12へ変えたときの約340n*から320nmへの吸収ピ
ークの特徴的な移動に基づいていた。吸収ピークの移動はチオエステルが存在す
る場合は起こらない。
2、N−ベンゾイル−5’−0−44’−ジメト シト1 ルー−シー6− オ
グアノシン
N−ベンゾイル−デオキシ−6−チオグアノシン125u(0,32mmole
)は無水ピリジンの反復蒸発により乾燥した。無水ピリジン1.25yfを加え
、塩化4.4′−ジメトキシトリチル172mg(0,5+n1ole)を室温
で加えた。2時間後、クロロホルムを用いたシリカゲルTLCはN−ベンゾイル
−デオキシ−6−チオグアノシンが全く存在しないことを示した。メタノール3
社を加えた。15分後この溶液を冷水6mlに加えた。この水性溶液をクロロホ
ルム5111で抽出した。クロロホルム抽出物を水51で洗い、有機相を硫酸ナ
トリウムで乾燥した。この溶液を2.5zfまで蒸発させ、そのクロロホルム溶
液を蛍光指示薬を用いて4枚の分離用シリカゲルプレート(1000μ、20
X 20cz)に塗布した。メタノール/クロロホルム(1:9ν/、)が溶剤
であった。ジメトキシトリチル誘導体の位置は分析用TLCにかけ、酸を吹き付
けた際に橙色に変わるU■吸収スポットを検出することにより決定した。N−ベ
ンゾイル−5’−0−4,4’−ジメトキシトリチル−デオキシ−6−チオグア
ノシンを含むシリカのバンドをかき取り、メタノールで溶出した。シリカ粒子は
遠心により除いた。メタノール溶液をプールし、蒸発乾固させた。
3、 5’−0−44’−ジメト シト1 ルー−シリポジルー5−メ ルー2
−ピリミジノン
β−デオキシリポジルー5−メチル−2−ピリミジノン0.639y(2,5m
mole)は無水とリジンの反復蒸発により乾燥した。
無水ピリジン8wlと塩化4.4′−ジメトキシトリチル1.h(3,2ミリモ
ル)を撹拌しながら室温で加えた。すべての物質は30分までに溶解した。45
分後サンプルはメタノール/クロロホルム(1:9v/v)を用いたシリカゲル
TLCで分析し、反応が完了したことを示した。この誘導体は0.37のRJ値
を有していた。メタノール1.2i1を加えて15分間撹拌した。この溶液を氷
冷した水2011に注入した。4℃で一晩放置後、淡黄色ガムから水相をデカン
トした。このガムを酢酸エチル1011に溶解した。水相は酢酸エチル8ylで
抽出し、最初の酢酸エチル溶液と合わせた。
この酢酸エチル溶液はそれぞれ7wlずつのN a HCOs、水、IM Na
αで洗った。酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、デカントし、蒸発させ
てガムを得た。このガムをクロロホルム4weL:溶解し、短イシリカ力ラム(
20X75J11)ニ加エタ、0.5%トリエチルアミン/クロロホルム溶液を
黄色の物質が溶出する直前までカラムに通した。溶剤をメタノール/クロロホル
ム(0,2:10v/v)に変え、1011の画分を薬めな9両分はデオキシリ
ポジルー5−メチル−2−ピリミジノン誘導体について329nmで監視した。
それぞれの画分のサンプルはメタノール/クロロホルム(1:9v/v)を用い
たシリカゲルTLCで分析した。純粋と思われる画分含プールし、真空下で蒸発
させた。
4、ト1エ ルアンモニウム5’−0−44’−ジメト シト1 ル −−−シ
ヌクレ シト−3’−0−(2−クロロフェニルホスフェート
すべての化合物は標準方法により製造した(Narang、et a±、。
Wu、R,Ed、、Methods in Enz 5olo 、68:90,
1979)、デオキシ−6−チオグアノシンを用いる方法を実施する場合、すべ
ての疑わしい溶媒は過酸化物について調べることが必要不可欠であった。
D、リボ−シ し ゛の4
ホスホトリエステル法(Sproatらの上記文献参照)がポリスチレンまたは
コンドロールド・ボア・ガラス(Controlled poreglass)
の支持体と共に用いられた。6−チオグアニンと5−メチル−2−ピリミジノン
を含むオリゴデオキシヌクレオチドの最終合成はガラス支持体を使用した。
6−チオグアニンおよび5−メチル−2−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌ
クレオチドのそれぞれを合成するために、5 ’−0−4,4’−ジメトキシト
リチル−2′−デオキシグアノシン−3′−〇−スクシネート0.38mole
を結合させた長鎖アルキルアミンコンドロールド・ボア・ガラス161Fgが使
用された。この反応溶液は乾燥した保護ヌクレオチド10μe*oleに無水ピ
リジン80μlを加えることにより調製した。このとリジン溶液を1−(メシチ
レン−2−スルホニル)−3−二トロー1.2.4− )リアゾール13すに加
え、1介接1−メチルイミダゾール8μlを加えた。この溶液を窒素下に室温で
支持体に加えた。この反応は支持体を無水ピリジンおよびジクロロメタンで洗う
ことにより30分後に終わらせた。ジメトキシトリチル基は2%トリクロロ酢v
i/ジクロロメタンで除去した。支持体をジクロロメタン、次に無水ピリジンで
洗った。ヌクレオチド付加の次のサイクルを開始した。
E、−の、おび
6−チオグアニンおよび5−メチル−2−ピリミジノンのアルカリ感受性は、支
持体からの開裂およびオリゴデオキシヌクレオチドの脱保護の標準水性方法の使
用を排除した。モデル実験は、NH,OH溶液がデオキシ−6−チオグアノシン
をデオキシグアノシンと数種の少量成分へ50℃で数時間以内に転化することを
証明した。デオキシリポジルー5−メチル−2−ピリミジノンは室温で強アルカ
リ性条件にさらした際に数分以内で他の成分に転化され、この化合物はより長時
間にわたって数種の成分に変化した。モデル実験は、デオキシ−3′−〇−スク
シネート結合およびO−クロロフェニルホスフェート結合が無水ピリジン中で5
yn−2−二トローベンズアルドキシメートにより徐々に開裂されることを立証
した。イソブチリル基およびベンゾイル基は無水メタノール中でのアンモノリシ
スにより除去された。
デオキシ−6−チオグアノシンを用いるモデル実験は、1−(メシチレン−2−
スルホニル)−3−ニトロ−1,2,4−)リアゾールがオリゴデオキシヌクレ
オチドに保護ヌクレオチドを付加する反応条件下で6−チオ基と速やかに反応す
ることを明らかにした。デオキシ−6−チオグアノシンはピリジン中のベンゼン
チオールによりメシチレンスルホニル付加物から完全に再生された。予測された
ように、メルカプトエタノールとの反応は非常に遅く、2種以上の生成物を与え
た。
オリゴデオキシヌクレオチドを有するガラス支持体は真空下にP2O,およびK
OH上で乾燥させた。ベンゼンチオール55μl(IM)を含む無水ピリジン0
.45ylをこのガラス支持体に乾燥窒素ガス下で加えた0反応バイアルを密閉
し、室温で8時間放置した。溶液を除き、ガラス支持体はジクロロメタンIMl
で4回洗った。′!S存するジクロロメタンを真空除去し、ガラス支持体をP
20 sおよびKOH上で乾燥した。
5yn−2−二トロペンズアルドキシム16.6*y(100,tc mole
)は無水ピリジンの反復蒸発により乾燥した。無水ピリジン200μlを窒素雰
囲気下で乾燥ニトロベンズアルドキシムに加え、その後乾燥テトラメチルグアニ
ジン36μlを加えた。この溶液とガラス支持体を窒素下でバイアルに封入し、
室温で5日間放置した。
オリゴデオキシヌクレオチドが溶液へ放出される度合は、その溶液1μlをジメ
トキシトリチル基について検定することにより追跡した。酢酸p−ニトロフェニ
ル27mgは残存するオキシメートイオンを使いきるために、ニトロベンズアル
ドキシメート溶液に窒素下で加えた。3時間後20%酢酸10μ!を含むピリジ
ン111を加えた。pH7〜8であることを確かめるためにpH試験紙で測定し
た。この溶液をガラス支持体から除き、50%水性ピリジン])lをガラス支持
体に加え、この懸濁液を30分分間上うした。溶液を取り出して最初のピリジン
溶液と一緒に合わせた。この溶液を蒸発乾固させた。
臭化上チルトリメチルアンモニウム9u(25−−ole)を含む乾燥メタノー
ル111を、乾燥したN−保護オリゴデオキシヌクレオチドに加えた。この溶液
に4℃でNH,ガスを飽和させた。試験管にしっかりと栓をして、暗室に室温で
放置した。78後試験管を4℃で開栓し、溶液を室温で乾燥窒素と共に蒸発させ
た。
残留物を80%酢酸1x1に溶解してジメトキシトリチル基を脱離させた。 2
0分介接111を加え、この水性溶液は水を飽和させたジエチルエーテル2Ml
で5回抽出した。水相を200μlまで蒸発させた。この溶液は黄色であった。
この溶液をLM NH,HCO。
で洗浄し次いで蒸留水で洗浄しておいたD owex A G −50W X2
カラム(1,5X3cz)に入れた。このカラムは蒸留水で溶出し、0.5xe
の画分を集めた0両分は260n−でオリゴデオキシヌクレオチドについて監視
し、適当な画分をプールした。プールした画分は蒸発乾固させて一20℃で貯蔵
した。
F、汲に量1
表Iに示したオリゴデオキシヌクレオチドの26on−での消衰係数は次のよう
に計算した:(1)A−Tの消衰係数10X10’M−’cIIは5oher(
CRCHandbook of Bioche*1sLr 、2nd Ed、。
5ober、H,A、(Ed、)、The Chemical Rubber
Company、クリーブランド、オハイオ州)により示されたデータから計算
した。
(2)Gs−Tオリゴヌクレオチドの消衰係数は、6−チオグアニンのヌクレオ
シドが本質的にpHと無関係な8X10’M−’ci+の26on−での消衰係
数を有するので、10X10’M−’cmであるとみなされた。(3)5−メチ
ル−2−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの消衰係数は、5−メ
チル−2−ピリミジノンのデオキシヌクレオチドが本質的に260nmで吸収を
全く示さないので9.2X10’M−’cmであるとみなされた(Lm!and
らの上記文献参照)。
G、!
標識したオリゴデオキシヌクレオチドの濃度は0.1〜0.01MMの範囲で変
化した。キャリアーオリゴデオキシヌクレオチドはT−C−G−^−C−C−C
−C−G−Gであり、その濃度は1〜2μMであった。その他の成分は0.06
M Tris−Hcl(pH7,5)、5+mM Mg(ff2.5zMジチオ
トレイトーtし、0.5zM ATP、および0.06〜0.005Weiss
単位のT4リガーゼ/ μlであった。温度は19℃であった0wL衝液、Mg
α2、ジチオトレイトール、およびオリゴデオキシヌクレオチドを一緒に合わせ
、次の温度サイクルに付した:すなわち60〜65℃で5分、室温で15分、お
よび氷上で15分、この0.5xlポリプロピレン製試験管は遠心にかけてすべ
ての水を底部に戻し、その後ATPとリガーゼを加えた。
84先1λ氷肱
分離用電気泳動は251アクリルアミドゲルを使用した(Gough。
et al、、Nucleic Ac1d Re5eareh、6:1557.
1979)、ゲルは0.2X13X29czであった。サンプルの添加前に、過
酸化物および遊離基を除くために上部緩衝液中の10−3Mグルタチオンを用い
て電気泳動を行った。 10−”Mグルタチオンはサンプル溶液中に存在してい
た。サンプルがゲルに入った後、電流を4iAに減らし、染料シアツールキシレ
ンが約9cm移動した後(18〜24時間)電気泳動を終わらせた。オリゴデオ
キシヌクレオチドのUV吸収帯を切り出し、小片に粉砕し、その後数日間にわた
って、0.1M NH,HCO,で数回抽出した。
■、旦ヱ」」≧外五−
ヌクレオチドは弱陰イオン交換樹脂Syn Chropak AXloo、25
0X4.6i+z(Syn Chro−社、リンデン、インディアナ州)で、移
動相として0.05F KH2PO−(1)H4,5)を用いて分析した。
ヌクレオシドはオクタデシル−シリカカラム250X4.6zzで、移動相とし
て2.5%メタノールおよび0.02F KHzPO−(pH5,5>を用いて
分析した。メタノールはデオキシアデノシンの場合に10%に変えた。この技術
を用いることにより、新規なヌクレオチド塩基がオリゴヌクレオチドに含まれる
ことが判明した。
夾痙コ1−
ム 1ゴ・フレ ドの
表Iは固相ホスホトリエステル法により合成されたオリゴデオキシヌクレオチド
を示す、オリゴデオキシヌクレオチドは25%アクリルアミドゲルの電気泳動に
より分離した。オリゴデオキシヌクレオチドの電気泳動純度は、5′末端を32
Pホスフエートで標識し、20〜25%アクリルアミドゲルで電気泳動分析な行
うことにより調べた。主要な32p標識成分が放射能の90%以上を占め、他の
成分は全放射能の2%以上に達しなかった。
民L
ム t−1ゴー シヌクレ ド
1125 T−C−G−^−C−C−C−^−T−C−C−GNPOT−C−C
−八−C−C−C−^−(NPO)−C−C−に6TG T−C−C−^−C−
G−G−(6Tに)−T−C−C−にG T−C−に−^−C−G−G−G−T
−C−C−GCT−C−に−^−C−C−C−^−C−C−C−G8塩基6−チ
オグアニンおよび5−メチル−2−ピリミジノンはそれぞれ67GまたはGs、
およびMPOまたはTI′Iと略記される。
オリゴデオキシヌクレオチドに含まれるヌクレオチド残基の数は、5′末端をs
apミルホスフェート識して、その重合体をヘビ毒ホスホジェステラーゼで段階
的に減成することにより証明した。オリゴデオキシヌクレオチドのそれぞれの加
水分解時に得られた生成物の数は、50℃での20〜25%アクリルアミドゲル
による電気泳動およびオートラジオグラフィーにより決定した。
6−チオグアニンおよび/または5−メチル−2−ピリミジノンを含むオリゴデ
オキシヌクレオチドの紫外°線可視吸収スペクトルは、XおよびY位置にアデニ
ンおよびチミンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの吸収スペクトルよりも、3
10〜350nm領域において中性pHで有志に高い吸収を示した。6−チオグ
アニンは中性pHで2650−と340n鋤に吸収ピークを有する。β−デオキ
シリポジルー5−メチル−2−ピリミジノンは3140−に1つの吸収ピークを
有する。さらに、β−デオキシリポジルー5−メチル−2−ピリミジノンは紫外
線中で蛍光と発する。5−メチル−2−ピリミジノンを含むオリゴデオキシヌク
レオチドも紫外線のもとて蛍光を発した。
塩 の ・
相補的オリゴヌクレオチドの会合定数を決定する伝統的方法は、温度の関数とし
て260nmでの光学密度を測定することである。この技法は困ったことに間違
った解釈へ導くことがある。
相補的配列の鎖長が短い(16個より少ない)オリゴヌクレオチドの場合、光学
密度の遷移領域は非常に広範囲であり、たとえその二状態モデルが適切であると
仮定しても、遷移領域の中間点の温度を選定するにはかなり良いデータを必要と
する。初期の研究において合成されたオリゴデオキシヌクレオチドの量に限りが
あり且つ二本鎖構造中にオリゴヌクレオチド配列の173が一本鎖領域として存
在するために、光学密度対温度曲線の分析により会合定数を決定することは実行
不可能であった。温度融解曲線の代わりに、酵素的連結方法が相対的会合定数を
決定するために開発された。
この方法の基本的な考えは、一対のオリゴデオキシヌクレオチドの二本鎖がキャ
リアー二本鎖(対象の二本鎖の濃度よりかなり高濃度で存在する)に連結する量
を測定することにより、その二本am造の濃度を決定することであった。キャリ
アー分子への二本鎖の連結が二本鎖のそれ自体の連結の代わりに選ばれな理由は
、数学的モデルの単純さにあった。自己連結の数学的計算は非常に限定された条
件下を除いて単純ではない、キャリアーに連結された二本鎖の量は、二本鎖の一
方のオリゴデオキシヌクレオチドを5′ホスフエートとして32pで標識するこ
とにより追跡しな、キャリアー二本鎖および対象の二本鎖は両方とも相補的な5
′突出−重鎖領域T−C−に−^を有していた。
−重鎖オリゴデオキシヌクレオチドがキャリアー二本鎖に連結される可能性があ
るために、この反応の程度を測定することが必要であった。
次の段落に示した条件が認められる場合、時間の関数としてのオリゴデオキシヌ
クレオチド1の濃度は方程式■:1 、 1n[C(1,t)/C(1,0)コ
=−[K (1)+に、(1,2)Ca(2)]F(t)〔式中、C(1,0)
はオリゴデオキシヌクレオチド1の時間ゼロでの濃度であり、C(1,t)は時
間tでの濃度であり、K d(1,2)はオリゴデオキシヌクレオチドlと2と
の会合定数であり、K (1)は−重鎖オリゴデオキシヌクレオチド1がその二
本鎖と比較してキャリアー分子に連結する速度を特徴づける会合定数であり、C
(2)は反応時間にわたるオリゴデオキシヌクレオチド2の濃度の平均値であり
、成分1および2が異なるオリゴヌクレオチドである場合は1であり、オリゴヌ
クレオチド1および2が同じである場合は2であり、そしてF (t)は酵素お
よびキャリアー分子の量に依存するが、オリゴデオキシヌクレオチド1および2
の量に無関係である時間の関数である〕で表される。
応用される方程式■に必要な実験条件は次の通りである=(1)キャリアー分子
の自己連結の時間経過が二本鎖の混入量によって有意に乱されないように、十分
高濃度のキャリアーが存在する。(2)二本鎖分子の濃度は連結速度が二本鎖の
濃度に比例するように低い、(3)二本鎖の濃度は自己連結がキャリアー分子と
の連結に比べてごくわずかであるように十分低い、(4)オリゴデオキシヌクレ
オチドの会合速度および二本鎖の解離速度は、反応時間にわたって平衡が保たれ
るように十分速い、(5)比較される二本鎖のに−が同じである、すなわち、重
要な特徴は二本鎖とキャリアー分子の間の5′重複領域であって、二本鎖分子の
残りの詳細な配列ではない。
自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド#25(表I)のキャリアー分子への連
結の結果を表Hに示す0表■からのデータのプロットは明らかに、一本鎖連結が
使用した濃度範囲において優勢であることを示した。二本鎖形成はオリゴデオキ
シヌクレオチドの濃度が10−’M以上で検出可能になる。さらに、これらの結
果は、キャリアーに連結した標識オリゴデオキシヌクレオチドの量がその存在量
に比例するという重要な特徴、すなわち方程式Iの妥当性にとって必要な1つの
条件を証明している。
表■は、自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド#25の会合定数と、オリゴデ
オキシヌクレオチド対67 GおよびM P O(表I)の会合定数と、の比を
決定するために用いられる例示的データを含む。そのデータは方程式■を用いて
分析される。ライン4は一本鎖の連結が優勢であるような#25の濃度を有する
。
方程式■は以下のようになる:
U、Ks(25)F(t) = −1n[C(25,t)/C(25,0)]ミ
−in[6592/13361]
= 、706
ライン3は二本鎖と一本鎖分子の両方が連結されるような#25の濃度を有する
。方程式Iへの代入は次式を与える:1[1,K (25)F(t)+2Kd(
25,25)C,(25)F(t)”−1n[57240/126053コ=、
789
K (2s)F(t>は方程式■から知られており、次式:C(2)□[C(2
,0)−C(2,t)]/1n[C(2,0)/C(2,t)コを用いると、C
(25)=1,2xlO−’Mである。これらの結果を合わせると次のようにな
る:
N 、 Kd(25,25) F (t)=3.48xlOsライン1およびラ
イン2に関して同じ解析を行うと、次のようになる:
V、 Kd(6TG 、M P O)F (t)=2.38xlO’および
Vl、 Kd(25,25>=1.5Kd(67G、MPO)多くの測定は0.
6〜0.05Weiss単位/10μlの範囲の2つの異なる酵素濃度で行い、
すべてのオリゴデオキシヌクレオチドの濃度はそれぞれの測定において変化させ
た。相対的会合定数は異なる酵素濃度により、あるいは二本鎖形成が検出された
異なるオリゴデオキシヌクレオチド濃度により影響されなかった。
酵素濃度およびオリゴデオキシヌクレオチド濃度の変化からの相対的会合定数の
独立性は、二本鎖とオリゴデオキシヌクレオチドとの平衡状態が連結の間中保た
れていたことを強く示唆している。オリゴデオキシヌクレオチド濃度がらの相対
的会合定数の独立性および表Hに示した結果は、基質濃度がそのKmに比べて低
かったことを示している。
キャリアー分子に連結される標識オリゴデオキシヌクレオチドの量が非連結オリ
ゴデオキシヌクレオチドの量に比べて少ない場合、非連結オリゴデオキシヌクレ
オチドC(t)のカウントにおける不確実性は連結された量と同じか又はそれよ
り大きいと異議を唱えるかも知れない、連結された量をC(t)に加えることに
よりC(o)が得られる。しがしながら、それは方程式に現れる量:
1n[C(t)/C(o)]
であり、差C(o) −C(t)がC(0)に比べて小さい場合、次のようにな
る:
1n[C(t)/C(o)コ= [C(o)−C(t)]/C(o)ここでC(
o) −C(t)は実際に測定された放射能の量である。
C(t)における不確実性はC(0)にのみ現れる。
自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド67G−MPO(表I)の相対的会合定
数を測定することは、5′末端をリン酸化すのオリゴデオキシヌクレオチドを速
やかに分解する活性を含んでいたので、実行できなかった。
連結反応に用いた配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼSat Iの添加、お
よび完結した連結反応の部分への150+*Mの塩化ナトリウムの添加は、連結
された標識オリゴデオキシヌクレオチドの損失および連結されなかった標識オリ
ゴデオキシヌクレオチドの増加をもたらした。
民1
1アーへの −ゴー シ し ド 25の゛オリゴデオキシヌクレオチド
、05 9.2xlOコ 5.8xlOコ、025 4.5xlOコ 3.5x
lOコ、0125 2.7xlOコ 1.4xlOコ、00625 1.5xl
Oコ 4.2xlO5,0031255,2xlO” 3.2xlO”5′リン
酸化された(”P)オリゴデオキシヌクレオチド#25(表I)はキャリアー分
子T−C−G−^−c−c−c−c−c−cに連結させた。その連結反応混合物
は表示した濃度の標識オリゴデオキシヌクレオチド、0.06M Tris H
α(pH7,5)、5mMジチオトレイトール、0.5mM ATP、5 毅M
MgCb、I AI M 5 ’リン酸化キャリアーオリゴデオキシヌクレオ
チド、および0.6Weiss単位710μNのT4 DNAリガーゼを含んで
いた。温度は19℃であった。サンプルは80%ホルムアミドで1対4に希釈し
、2μ!サンプルを12.5%アクリルアミド、7M尿素ゲルでの電気泳動によ
り50℃で分析した。オリゴデオキシヌクレオチド#25およびはしご状の連結
オリゴデオキシヌクレオチドの位置を定めるためのオートラジオグラフィー後に
、適当な領域を切り出して、カウントした。
肚
ヤ1アーへの 2ゴー シヌ し ドの゛オリゴデオキシヌクレオチド
I A−TH′(0,4xlO−’M) 10577 1350GS−T’(0
,7xlO−7M)
2 A−T”(0,4xlO−’M) 11632 8753 A −’F (
0,85xlO−)M ) 57240 688134 A −1” (0,1
3xlO−’M) 6592 6769表示したオリゴデオキシヌクレオチドは
キャリアー分子T−C−G−^−C−C−C−(ニーC−Gに連結させた。星印
は′Pで5′リン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを表す、オリゴデオキ
シヌクレオチドの配列は表1に示す、連結反応混合物は表示したオリゴデオキシ
ヌクレオチド、0.06M Tris−Hα(pH7,5)、5−Mジチオトレ
イトール、0.5sM ATP、5−MMgα2.1MM 5’リン酸化キヤリ
アーオリゴデオキシヌクレオチド、いた0反応温度は19℃であり、反応時間は
60分であった0反応のアリコートを80%ホルムアミドで1対4に希釈し、2
μlサンプルを10%アクリルアミド、7M尿素ゲル上で50℃で電気泳動にか
けた。を気泳動はシアツールキシレン染料が約7cx泳動したとき終わらせた。
オートラジオグラフィー処理を行ってオリゴデオキシヌクレオチドの位置を定め
た後、適当な領域のゲルを切り出して、カウントした。
艮L
■刃!ムL釦定玉−
オリゴマー対 会合定数 K(A、T/T、A>に対する値
(A−C/T−G) K(C70) 5±2(A−T /T−G ) K(TH
/cS) 1±、5(A−T/T−G) K(T/G) 1/(9+3>(A−
T’/T−G) K(TH/G) 1/(25+5)(A−C/T−G ) K
(C/GS) 1/30(A−T”/T−A) K(TH/A) 1/40(A
−C/T−A) K(C/A) 1/40向に、第二オリゴマーは3′→5′の
方向に書かれている。
“は二本鎖連結の量が相補的オリゴデオキシヌクレオチドの不在下で見られる量
の実験的不確実性の範囲内にあることを示す。
罠臣匠l
塩 5−メ ルー2−ピリミジノン 6− グアニンの」ユコ土戸!
塩基対5−メチル−2−ピリミジノン/6−チオグアニン(MPO/6TG)を
含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成する。その合成二本鎖オリゴデオ
キシヌクレオチドは唯一の制限酵素部位に相当する一本鎖5′末端を有する0合
成二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、T4リガーゼ触媒反応を用いて、二本
鎖DNAベクターのプラスミドまたはファージの唯一の制限部位へin vit
roで挿入する。二本鎖合成オリゴデオキシヌクレオチドのベクターDNAへの
挿入は、挿入が行われる領域においてベクターDNAの塩基配列により特定され
たタンパク質機能の不活性化を起こす、失われたタンパク質機能、例えばβ−ガ
ラクトシダーゼ酵素、は感染細胞内でのベクターの複製にとって不可欠なもので
はない、外来DNAの添加により形質転換しうるE、eoli株は、合成二本鎖
オリゴデオキシヌクレオチドを保有するベクターにさらされる。 E、coli
株は細胞内の複製ベクターの存在がそのベクターを含まない細胞から識別できる
ように選ばれる。さらに、E、coli株は非必須タンパク質機能の有無の検出
を可能にする特徴をもつ。形質転換細胞はMPO/6TGの塩基および/または
(デオキシ)ヌクレオチドの存在下で生育させる。細胞およびそれらのベクター
(非必須タンパク質機能をもたない)を何世代にもわたって複製させた後、ベク
ターを単離する。その後、ベクターDNAに含まれるオリゴデオキシヌクレオチ
ドは塩基対M P O/6T Gの存在について分析される。
一般的には、Mess’+ng(M2S elonin /dideox se
ueneinI n5truetion Manual、Bethesda
Re5earch Laboratories。
ガイサースバーグ、メリーランド州、1986)のM13ファージおよびプラス
ミドクローニング方法論が用いられるであろう、12個以上の残基を有する相補
的オリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホトリエステル法および/またはホスフ
ァイト−トリエステル法(Gait、M、J 、(Ed、)、Oli odeo
x nucleotide S nthe−sis、 I RL Press、
オックスフォード、1984)を用いて合成される。二本鎖オリゴデオキシヌク
レオチドは塩基対5−メチル−2−ピリミジノン/6−チオグアニン(MPO/
67G)を含むであろう。二本鎖オリゴマーの各末端の一本鎖領域は、その二本
鎖オリゴマーがベクターの5a1iクロ一ニング部位へ連結されるように、S@
l i制御部位突出配列(5’)TCGAをもつであろう。
次に、ファージM 1:3ap18の複製型およびプラスミドpU C8(また
は18)は5a11で切断し、線状化したベクターの5′ホスフエートをアルカ
リホスファターゼを用いて除く。
10μ!容量の標準連結反応混合物は2Fmoleの線状M13mp18または
pUC8(もしくは18)および10〜30pmoleの相補的オリゴデオキシ
ヌクレオチドを使用する。短いオリゴマーの会合定数は低いので、高濃度の相補
的オリゴマーが必要である。ベクターへのコンカテマー<m状体)の起こりうる
組込みは不利なことではない。
連結後のM13+mp18およびpu C8(または18)による形質転換は両
方ともE、coliのDH5α株(Bethesda Re5earch La
bo−ratories)または同様の菌株を用いる0M13mp18の場合、
D H5a細胞はM13ファージS染のためにF′株を必要とするのでE、c。
1i JM107株(Yariseh−Perron、et al、、Gene
、33:103,1985)と共にまかれるであろう。
M13mplHの場合、培地は標準成分のほかにMPOおよび67Gの塩基およ
び/または(デオキシ)ヌクレオシドをO,OOIM〜0.0001Mの濃度で
含むであろう、白色プラークからのコロニーは単離して、MPOおよび67Gを
含む培地上で精製する。
M13sp18ファージはMPOおよび67Gを添加した標準培地で生育する細
胞から産生されるであろう、ファージからの一本鎖DNAはフェノール法(Ma
niatis、et al、、Mo1ecular C1oninA Labo
rator Manual、Co1d Spring Harbor、1982
)により分離される。
pUC8または18を用いる場合、このプラスミドにさらした後、形質転換工程
からの細胞は50μ3/11のアンピシリンとO,OOIM〜O,OOOIMの
濃度のMPOおよび6TGの塩基および/または(デオキシ)ヌクレオシドを添
加した標準培地にまく、白色コロニーを精製し、その細胞は核酸を標識するため
に32Pホスフエートの存在下で生育させる。プラスミドは標準方法(Mani
atisらの上記文献)を用いて細胞から分離する。
ファージDNAおよびプラスミドDNAを解析する際に、プラスミドは5all
制限酵素で消化し、アクリルアミドゲル電気泳動それに続くラジオオートグラフ
ィーによるバンドの位置決定を用いて、pUC8の大きい方のDNAから小さい
オリゴデオキシヌクレオチドを精製する。小さいオリゴデオキシヌクレオチドは
ゲルから溶出して、ホスホジェステラーゼで消化する(Maniitisらの上
記文献)、その消化物は強陰イオン交換体によるHPLC(例えばWhatma
n PXS −1025SAX 4.6a250ww)で0.007F KHz
PO4(pH4,0)から0.5F Kα、0.25FK82PO−(pH4,
5)までの線状匂配を用いて分析する。MPOおよび6TGのオー七ンティック
5′デオキシヌクレオチドも消化物と一緒に流す0MPOおよび67Gの添加ヌ
クレオチドのピークと同一である22pのピークの出現は、塩基対MPO/6T
Gがin vivoにおいて複製されたことを証明している。
さらに、M13mp18−重鎖DNAはオリゴデオキシヌクレオチド合成用の普
遍プライマー(Universal printer)をもつ鋳型として使用さ
れるであろう、2つの反応混合物が用いられる。1つはMPOおよび67Gデオ
キシヌクレオチドの5′トリホスフエートをさらに含む、塩基6 T Gおよび
/またはMPOがファージのクローニング部位に存在するならば、ポリメラーゼ
が標準塩基のみを含む反応混合物中で鋳型のMPOまたは67G塩基と出会う場
合、DNA合成は終わりになるかまたはその速度が実質的に遅くなるであろう。
しかし、MPOおよび67Gデオキシヌクレオチド5′トリホスフエートを含む
反応混合物中ではクローニング部位を通ってDNA合成が続けられるであろう、
標準ヌクレオシド5′トリホスフエートのうちの1種はアルファ32pを含む、
2つの反応混合物中で合成されたオリゴデオキシヌクレオチドのアクリルアミド
ゲル電気泳動による分析は、より大きいオリゴデオキシヌクレオチドがMPOお
よび6TG5’)リホスフェートを含まない混合物中よりも、それらを含む混合
物中で生産されることを示すであろう、対照として、MPO/6TG塩基対の代
わりにグアニン/シトシンまたはアデニン/チミン塩基対を含む合成相補的オリ
ゴデオキシヌクレオチドとの比較がなされるであろう。
本発明は今や十分詳しく説明してきたが、当分野で通常の知識を有する者には、
多くの変更および修飾が本発明の精神および範囲な逸脱することなくなし得るこ
とが明らかであるだろう。
FIG、jA
FIG、 /B
手続補正書Gカ
平成 2年よ月/gd:
特許庁長官 吉 1)文 毅 殿
1、事件の表示
PCT/US88103214
2、発明の名称
人口DNA塩基対類似体
3、補正をする者
事件との関係 特許出段状
住所
名 称 テンプル・ユニバーシティ
4、代理人
住 所 東京都千代田区大手町二丁目2番1号新大手町ビル 206区
5、補正命令の日付 平成 2年 1月30日 (発送日)6、補正の対象
(1)出願人の代表音名を記載した国内書面(2)委任状及び翻訳文
(3)タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告
、暴夢言噸嘩−1’141111M−^−1シkal−−H−1−一(PCT/
i二:Sεε/C二12m4SA 2L6:2
Claims (5)
- 1.アデニン(A)とチミン(T)、シトシン(C)とグアニン(G)、および 人工ビリミジンと対合した人工プリンの塩基対を有する二本鎖遺伝子配列であっ て、該人工プリンは対合した人工ビリミジンの2,4置換基と水素結合および疎 水相互作用から選ばれる相互作用を確立する2,6置換基を有し、該相互作用の うちの1つはH−Sであり、そして標準塩基対または人工塩基対と比べた場合、 人工プリンまたは人工ビリミジンと標準塩基との塩基対合に対して有意な自由エ ネルギーの差異が存在し、それにより該二本鎖の構造的一体性が保たれることを 特徴とする上記の二本鎖遺伝子配列。
- 2.塩基対を含むA、T、C、Gの二本鎖遺伝子配列であって、該塩基対の一方 の塩基はH、O、SおよびNH2から選ばれる2,6置換基を有する人工プリン であり、その相補的塩基はH、O、SおよびNH2から選ばれる2,4置換基を 有する人工ピリミジンであり、それにより人工プリンの6位が第一塩基相互作用 として人工ビリミジンの4位と相互作用し、且つ人工プリンの2位が第二塩基相 互作用として人工ビリミジンの2位と相互作用し、その際第一および第二塩基相 互作用の少なくとも1つはH−Sであり、それにより該二本鎖の構造的一体性が 保たれることを特徴とする上記の二本鎖遺伝子配列。
- 3.第一塩基相互作用はH−Sであり、第二塩基相互作用はH−S、H−Oおよ びNH2−Oより成る群から選ばれる、請求項2記載の二本鎖遺伝子配列。
- 4.第二塩基相互作用はH−Sであり、第一塩基相互作用はH−S、H−Oおよ びNH2−Oより成る群から選ばれる、請求項2記載の二本鎖遺伝子配列。
- 5.アデニン(A)とチミン(T)、シトシン(C)とグアニン(G)、および 人工ビリミジンと対合した人工プリンの塩基対〔但し、該人工プリンは対合した 人工ビリミジンの2,4置換基と水素結合および疎水相互作用から選ばれる相互 作用を確立する2,6置換基を有し、該相互作用のうちの1つはH−Sであり、 そして標準塩基対または人工塩基対と比べた場合、人工プリンまたは人工ビリミ ジンと標準塩基との塩基対合に対して有意な自由エネルギーの差異が存在する〕 を有する二本鎖遺伝子配列を含む生物の複製速度を、該生物に利用可能な人工プ リンおよび人工ビリミジンの濃度を調節することにより制御する方法。
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