JPH02501351A - 芳香環含有化合物のための免疫検定 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 芳香環含有化合物のための免疫検定 本発明は芳香族炭化水素のための免疫検定、そのような検定を実施するための試 薬およびそのような方法を実施するための試薬を特徴とするキットに関する。

環境に見い出される化学物質のヒトおよび動物に及ぼす影響については広く興味 が持たれているところである。米国における化学物質規制の歴史においては何が “許容できるか”についての点において厳重さを増している。永久に膨張し続け る科学的知識により燃え上がり、“きれいな環境”をという大衆の叫び声、およ びより清潔で安全な作業場に対する労働者たちおよび管理者の意識により支持さ れ、環境汚染物質および特に芳香族炭化水素を検出する方法および環境中にその ような物質がどの位存在するのかを決定する方法に対する要求が急速に高まって いる。

例えばベンゼン、トルエンおよびキシレンのごときある種の芳香族炭化水素は溶 剤および添加物として広範囲に応用および利用されている。ベンゼンは化学薬品 製造工業のみならず原動機燃料、インク、絵の具、ペンキ、プラスチックおよび ゴムの工業的製造を含む工業の作業場に存在している。さらにこの物質は洗剤、 爆発物、医薬品および染料の製造にも使用される。

国立労働安全性および衛生研究所は米国において２百万Å以上の労働者がヒト白 血病を起こす事が知られているベンゼンにさらされているかもしれないと報告し ている。

さらに、ベンゼンは触媒コンバータを備えた自動車のための無鉛燃料に存在し、 その使用量は増加している。それ故、ベンゼンはガソリンの永続的および注目に 値する成分である。米国内に５０万またはそれ以上存在する地下貯蔵庫からガソ リンが−Ｒに漏出している。今後上水道のガソリン汚染物質の存在または不在の 評価において、迅速な方法で飲用水中のベンゼンを検出する能力がさらに重要に なるであろう。

トルエンおよびキシレンもまた作業場およびいくつかの石油燃料中に存在する。

多くの他の芳香族炭化水素（例えばベンゼン、トルエンおよびキシレンの塩素化 誘導体、ナフタレン、スチレン等々が挙げられる）が種々の環境中に発見されて いる。

現在、作業場および環境に存在する芳香族炭化水素を決定する系としてはガスク ロマトグラフィー、マス分光光度法および高速液体クロマトグラフィーがある。

一般にこれら現在の分析方法は、空気、水、土壌その他の試料の収集、試料の分 析実験室への輸送および高価な装置および試薬を用いた専門家による分析を必要 とする。得られた結果はその後試験を依頼した所へ伝えられなければならない、 この過程は高価につき時間もかかる。

それ故、より簡単で安価でその場所で迅速に実施できる芳香族炭化水素およびそ の誘導体のための他の試験方法が必要とされている。

本発明は免疫検定法により試料中の１つまたはそれ以上の芳香族炭化水素の存在 を検出するための方法、試薬およびキットを提供する。

血清アルブミンまたはガンマグロブリンのごとき血清タンパク質抗原で芳香族炭 化水素を共役抱合せしめることにより抗原ハプテンを作れることが発見されてお り、これらの共役抱合物はそのあと動物に注射でき、既知の方法で抗体が産生さ れるであろうし採取できる。これらの抗体は芳香族炭化水素がまたは抗体を標識 するための種々の既知のマーカーを使用して、環境中の芳香族炭化水素を検出す る種々の免疫検定法に利用されるであろう、いくつかの免疫検定の実施Ｗ５様に おいては芳香族炭化水素または抗体のどちらかが固定される。

本発明の実施にポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両者が使用できる。

抗体は異種特異的であり、官能基がついていてもいなくても芳香環に結合するで あろう。

試料中の芳香族炭化水素環を検出する本発明の実施に際し、使用できる免疫検定 法にはラジオイムノアッセイならびに酵素、蛍光、化学発光および生物センター 免疫検定などが含まれる。

そのような検定には不均一系または均一系がある。

トルエン、トルイジン、２−　（ｐ　−トリル）エチルアミン、ベンゼン、スチ レン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンまたは２−メチルナフタレ ン、ハロゲン化ベンゼン、ビフェニル化合物等々のごとき芳香環を含む化合物の 存在を決定するために本発明の検定法が使用される。

本発明は試料中の芳香族炭化水素環の存在を試験するための免疫検定法を提供す る。そのような免疫検定法においては芳香族炭化水素環（抗原）／抗体反応は反 応生成物の検出を可能にするため、抗原または抗体のどちらかを標識する種々の マーカーを使用した種々の方法により検出できる。さらに、抗原かまたは抗体の 固定化が多くの場合検出を容易にするであろう。

抗原／抗体検定は一般的に不均一系および均一系の２つの範ちゅうに分類できる 。不均一系検定は反応生成物の検出に先だって遊離−標組成物からの結合−標識 組成物の分離が必要とされる。均一系検定はそのような分離工程を必要としない 、検定はさらに（１）例えば、抗原が標識抗体に対し固相抗原と拮抗するか、抗 原が固相抗体に対し標識抗原と拮抗するような拮抗的なものであるか、または（ ２）標識および抗体または抗原の間に直接的な相関がある非拮抗的なものでもあ りうる。

本発明の１つの実施態様においては、試料中の少くとも１つの芳香族炭化水素環 の存在を検出する方法は以下の工程からなる： （ａ）（ｉ　）　芳香族炭化水素環と免疫学的に均等なものまたは芳香族炭化水 素環自身および（ｉｉ＞検出可能な組成物の間で共役抱合物を形成し； （ｂ）　共役抱合物および試料中の芳香族炭化水素環が抗体上の結合部位で拮抗 するような条件下、共役抱合物および芳香族炭化水素環を試験する試料を芳香族 炭化水素と反応性のある抗体と接触せしめ；および （ｃ）　検出可能な組成物に応答する組成物と結合共役抱合物との反応を測定す る事により芳香族炭化水素環の存在を検出する。

いくつかの実施態様においては検出を容易にするなめ抗体が固定化されている。

本発明の他の実施態様においては試料中の少くとも１つの芳香族炭化水素環の存 在を検出する方法は以下の工程からなっている： （ａ）　芳香族炭化水素環またはその免疫学的均等物を固定化し； （ｂ）（ｉ　）　芳香族炭化水素環またはその免疫学的均等物と結合する抗体、 および（ｉｉ）　検出可能な組成物の間で共役抱合物を形成し； （ｃ）　固定化炭化水素および試料中の芳香族炭化水素環が共役抱合物上の結合 部位で拮抗するような条件下、共役抱合物および固定化芳香族炭化水素環が試験 される試料を工程（ａ）の芳香族炭化水素環またはその免疫学的均等物と接触せ しめ；および （ｄ）　結合共役抱合物とそれに対し応答性を持つ組成物との反応を測定する事 により芳香族炭化水素の存在を検出する。

試料中の芳香族炭化水素の存在または不在を検出するための本発明の実施におい て使用される免疫検定法はラジオイムノアッセイならびに酵素、蛍光、化学発光 および生物センサー免疫検定法が含まれる０本発明に従った酵素−結合免疫検定 法（ＥＬＩＳ＾）においては、問題としている芳香族炭化水素環は酵素により直 接的にまたは適当な条件下基質との反応を触媒する酵素−標識抗体を使って間接 的に標識できる。酵素活性は典型的には着色反応生成物の生成を検出する事によ り検出され、即ち、着色終末点は視覚によりまたは分光学的または反射的方法に より容易に検出できるであろう、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキ シダーゼ（ＨＲＰ）およびグルコースオキシダーゼを含むいくつかの酵素が抗原 および抗体の両方へ結合されてきた、ＨＲＰが通常よく使用されそのためのいく つかの基質も入手可能である。視覚による検出のため、基質は通常過酸化水素の ごとき過酸化物の溶液および酸化反応により色が現われるＯ−フ二二レンジアミ ンまたはテトラメチルベンチジンのごとき色原体物質を含んでいる。

本発明で使用される蛍光免疫検定技術においては問題にしている芳香族炭化水素 は蛍光色素により直接または蛍光色素−標識抗体により間接的に標識できる。蛍 光色素とは対照ｌｉ（例えば紫外光）を吸収し、それにより励起され光（例えば 可視光）を出す色素である。

本発明の検定は、立体障害がなく、または抗体との反応に障害がない芳香族炭化 水素環を含む任意の化合物に適用できる。

典型的な芳香族炭化水素環含有化合物としては、トルエン、トルイジン、２−（ ｐ−）リル）エチルアミン、ベンゼン、スチレン、キシレン、エチルベンゼン、 プロピルベンゼンまたは２−メチル−ナフタレン、ハロゲン化芳香族炭化水素等 が挙げられる。

検出される芳香族炭化水素環の量は広範囲にわたる０例えば、この分野に精通す る者は約１兆分の１　（１０−”ｇ）から約百万分の１０００（１０−’ｇ）の 芳香族炭化水素環を検出する本発明に従った免疫検定法を計画できる。

本発明の実施において使用する芳香族炭化水素環に対するモノクローナル抗体は この分野でよく知られている免疫処置およびハイブリドーマ培養技術を用いて作 製できる０本発明の実施において使用する芳香族炭化水素に対するポリクローナ ル抗体ちまたこの分野に精通する者には知られた技術を用いて作られる。土壌試 料中のガソリンの存在の検出のごときスクリーニングの目的で本発明の試験を行 う場合、異種特異的抗体が特に有益であるというのはガソリン中には種々の芳香 族炭化水素が見い出されるからである。

本発明はまた少くとも１つの芳香族炭化水素環と結合するポリクローナルＩｇＧ 抗体調製試料も提供し、抗体調製試料は以下の工程からなる方法により製造され る：（＆）環を含む炭化水素または免疫学的均等物が結合した生物学的に適当な 担体タンパク質からなる組成物を前もって決定された量宿主に投与し、（ｂ）　 宿主から血清を採取し、および（ｃ）　血清からＩｇＧ抗体を精製する。抗原の 免疫学的均等物は宿主に導入された場合、抗原に対する抗体産生を起こす能力を 持っている０例えば芳香族炭化水素スクリーニング試験のごときある種の実施態 様で好適な異種特異性ポリクローナル抗体調製試料はウサギにおいてトルエン誘 導体、トリル酢酸に対する抗体を発生せしめる事により産生される。使用された 免疫原はウシ血清アルブミン分子に共役抱合されたトリル酢酸からなっている。

得られる抗体はトルエンに結合するだけでなくベンゼン環を含む多くの他の芳香 族炭化水素とも結合し、ベンゼン、トルイジン、２−（ｐ−トリル）エチルアミ ン、スチレン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンおよび２−メチル −ナフタレン等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

本発明に従うと、抗体または芳香族炭化水素は放射活性物質、酵素、蛍光色素ま たは発光物質で標識されるであろう、現在のところ酵素が好適な標識剤である。

抗体または芳香族炭化水素に共役抱合できる任意の酵素を本発明に従う検定で使 用できるが、ペルオキシダーゼが好適な酵素群であり、特に西洋ワサビペルオキ シダーゼが好適である０本発明に従う酵素免疫検定で使用される色原体は酵素お よびその基質の存在下、色調を変えたり、発色できる任意の色原体でありうる。

使用される酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、３．３’、５，５“−テ トラメチルベンチジン（ＴＭＢ）が好適な色原体である。

本発明に従い、ＲＩＡ、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡのごとき任意の適した免疫検定 技術が芳香族炭化水素の検出に使用できるが、好適な免疫検定技術は抗体が固定 化され、検出される芳香族炭化水素が酵素で共役抱合された比色ＥＬＩＳＡ拮抗 免疫検定である。この型の拮抗酵素免疫検定においては抗体上の前もって決定さ れている数の結合部位に対し、前もって決定されている数の共役抱合分子が試料 中の未知の数の芳香族炭化水素分子と拮抗する。そのような比色酵素免疫検定に おいては発色または色変化が起こった時十分な共役抱合物が結合していなければ ならない０発色または色変化は視覚であるいは適当な機器により検出できる。約 百万分の１（１０”ｇ）から約百万分の１０００（１０−３ｇ）の濃度の芳香族 炭化水素が本発明に従う芳香族炭化水素のＥＬＩＳＡで有効である事が確認され た。しかしながら本方法は色が検出できる限りどんな量の芳香族炭化水素にも適 している。

プログラム可能な差速度分光光度計が以下に示す実施例では使用されている。し かしながら、この分野に精通する者は本発明の方法を他の型の分光光度計でも使 用できるように修正する事ができる。同様に、検出可能な反応生成物は発色団に 限定されるわけではなく前に記載したごとく他の標識も含まれる。

本発明の１つの実施態様においては、検定マトリックスは３重抗体層である。ウ サギ７ｇＧはポリスチレンチューブの内側に、この分野に精通する者には知られ ている技術、例えば吸着またはグルタルアルデヒド法（例えば７．　Ｂｏｅｎｉ ｓｈ、生体液のタンパク質、第２４回ゼミナール（１９７６）　、ｐ７４３．　 Ｈ、Ｐ　ｅｅｔｅｒｓ編）を用いて固定する０次に常法を用い、ヤギ抗ウサギＩ ｇＧをウサギＩｇＧに免疫学的に結合せしめ、続いて問題にしている芳香族炭化 水素環と反応する、本発明により調製されたウサギ抗体を免疫学的に結合せしめ る。

本発明は芳香族炭化水素の検定を実施するためのキットをまた提供する。そのよ うなキットの１つの実施態様では以下の組合せからなっている＝（ａ）少くとも １つの芳香族炭化水素と反応する抗体；および（ｂ）（ｉ　）芳香族炭化水素の 免疫学的均等物または炭化水素環それ自身、および（ｉｉ）　検出可能な標識物 質の間の共役抱合物。

検出可能な反応生成物が放射線を放射するか、伝導率変化、発光体、蛍光体また は色原体に応答する酵素を生成する物質であるようなキットにおいては、共役抱 合物の存在下反応できて、発色、色変化、光の放射、蛍光または伝導率の差を起 こす組成物もまた提供されるであろう。

本発明にはまた下記の組合せを特徴とし、少くとも１つの芳香族炭化水素環の存 在を検出する免疫検定を実施するためのキットも含まれる： （ａ）　固定化芳香族炭化水素またその免疫学的均等物；および（ｂ）（ｉ）　 芳香族炭化水素環と結合する、またはその免疫学的均等物と結合する抗体、およ び（ｉｉ　）検出可能な組成物の間の共役抱合物。

前記のキットにおいて共役抱合物かまたは抗体は検出を容易にするため固定化さ れるであろう、キットはまた標準物質、緩衝液などのごとき品目も含んでいるで あろう。

本発明に従った免疫検定を使用して芳香族炭化水素の存在が試験できる試料には 例えば活性炭素、空気、水および土壌のごとき特定の試料が挙げられるがそれら に限定されるわけではない。

本発明に従う免疫検定は芳香族炭化水素の検出および／または定量的または半定 量的分析が必要とされるいくつかの領域に応用できる９本試験は作業者が危険な 物質にさらされていないかを個々にモニタリングするため工場作業場のその場所 で実施できる。この場合、空気中に存在する芳香族炭化水素はドウシノーターバ ッジ中に含まれる活性炭素に吸着される。活性炭は以下に記載するごとくメタノ ールで抽出し、本発明の免疫検定により検定する。地下水もまた検定でき、多く の例で抽出工程を必要としない；そのような場合は試験される水の一部を単に抽 出溶液の代わりに検定キットに加えるだけでである。土壌または砂利試料（例え ばガソリンまたはゲロセンで汚染されていることが知られているか疑われている もの）は、活性炭素に対して前に記載した方法と同様の方法により抽出できる。

本明細書で教授したごとく、免疫検定法は現在使用されている伝統的なガスクロ マトグラフィー法に対しいくつかの利点を持っている。利点には、試料を検定す る費用の低減；その場所で評価を行える能力；およびより短い回転時間などが挙 げられる。さらに、そのような免疫検定は迅速にやれるように計画できる（以下 に記載する免疫検定は平均して実施に１０分かかる）。

以下の実施例は本発明をさらに例示するために提供される。

１−　−ν ′おび′ トリル酢酸をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびウシガンマグロブリン（ＢＧ Ｇ）を含む多くのタンパク質に共有結合で結合せしめる。

ハプテンＢＧＧ共役抱金物をウサギおよびマウスの免疫処置に使用する。

−ト１ル　Ｎ−ヒドロ′シコハ　イミ′ＮＨＳニス−に二１逢 ハブテンタンパク質共役抱金物の製造にはｐ−トリル酢酸の活性化を必要とし、 その後活性化ハブテンを所望のタンパク質に結合せしめる。

トリル酢酸はアルドリッチ（Ａ　１ｄｒｉｅｈ）から購入し、改変または精製す る事なく使用した。

プロ　コールニー　１ル　のＮＨ３−エスール１、撹拌子を入れ室温で一夜真空 乾燥したフラスコに、ハブテン（ｐ−トリル酢酸）、ヒドロキシコハク酸イミド および１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（各々モル 比で１：１．１：１．１）を測り入れる。

２、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＞（４Ａモレキユラーシーブ上で乾燥）をフ ラスコに加え０．２Ｍのハブテン溶液を得る。

フラスコに栓をし、室温にて一夜撹拌しながら放置する。

３、さらに精製することなく狙ＮＨＳ−エステルを共役抱合に使用する。

−１ル　のＢＧＧお　ＢＳＡへの丑′　Δ１、活性化ハブテン（ｐ−トリル酢酸 −ＮＨＳエステル）を５−２０マイクロリツトルづつ（反応規模に依存する）、 ０．１Ｍ炭素塩緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解したタンパク質（ＢＧＧまたはＢＳ Ａ）の冷（水浴）撹拌溶液へ添加する。タンパク質濃度は約６０　１００ｍｇ／ ｌＪ！である。活性化ハブテンはゆっくり１−１．５時間以上かけて添加し、終 点では約５０：１のハブテン：タンパク質比となる。

２、共役抱合はタンパク質共役抱合溶液の一部を採り、ＴＮＢＳ滴定によりアミ ン含量を決定してモニターする。失われたアミンのモル数が結合したハブテンの モル数に等しいと考えられる０反応は通常ｉ＆後のハプテン添加後文に３０分進 行せしめる。

３、粗共役抱合物はセファデックスＧ−２５カラム上０．１Ｍ炭素塩緩衝液（ｐ Ｈ８，５）で溶出するクロマトグラフィー、蒸留水に対しての透析（４回）およ び凍結乾燥により精製する。

クロマトグラフィーを行ったタンパク質の一部を少量保存し、ハブテン数を決定 する。

４、ハプテン数は共役抱合前および後のタンパク質試料のＴＮＢＳ滴定によるア ミン含量により決定される。タンパク質濃度はＵＶおよび／またはローリ−タン パク質性により決定される。

調製された共役抱合物のハプテン数は下記の通りであるニーｌｔｈ　Ａ７　ハブ ーン　ンバク′ ｐ−トリル酢酸Ｂ　Ｇ　Ｇ　４４．５　３４０ｍｇｐ−）リル酢酸ＢＳＡ　３２ 　１９０り動１クコλＡ二Ｊヨ ３羽のウサギおよび１ｏ匹のマウスによる動物免疫処置プログラムはｐ−トリル 酢酸ＢＧＧ共役抱合物を用いて始められた。

最初の注射はフロイントの完全アジュバントで調製され、続いての注射（追加免 疫）は不完全フロインドアジュバントで調製された。

几　および １、ニューシーラント白色ウサギ（動物当りの大体の体重は７−８ボンド）を免 疫処置プログラムに使用した。

２、各々の動物に１ケ月当り（３−４週間）２．５Ｂ／ｂ＋＃の抗原が注射され た。

３．７−１０ミリリ・ントルの試験放血が毎月または免疫処置して７−１０日後 になされた。

４、下記の方法を用いて血液から血清が分離された：＊血液を耳静脈から採取し 、室温にて１時開放置する。

＊試料を４℃（冷蔵庫）に４時間冷却して凝固せしめ、遠心分離して血清から細 胞を分離する。

＊血清を血餅から分離し、高速で再び遠心分離して脂質を除く。

５．動物血清は特異抗体の存在をＢＳＡハプテン共役共役物合物原として用いる オフタロニー法によりスクリーニングする。

６、オフタロニー法で陽性の応答を与える抗血清は常法を用い、拮抗的固相ＥＩ Ａにおける阻害層を評価する。

７．４０−５０ミリリツトルの動物血液（１８２３ｙａ１血清）の放血は試験放 血と同じ方法で得られる。

と−組 免疫原を含む注射液は使用する１から３日前に調製する。凍結乾燥した免疫原を 食塩水に溶解する。同量のアジュバント（Ａ初の免疫処置のためにはフロイント 完全を、続いての追加免疫には不完全を）および免疫原−食塩水混合物を混和し 乳化せしめる。２．５Ｂの免疫原を含む１ミリリツトルの乳化剤をウサギの皮膚 のすぐ下に注射する。動物は免疫処置した７−１０日後に放血する。

當　２−　ｔＪ　・　お　′ 逸凰仄１ 下記に記載する試験は抗原に対して向いている抗体上の一定の数の結合部位に対 し、一定の数の酵素標識抗原分子が試料中の未知の数の抗原分子と拮抗している 拮抗酵素免疫検定法である。試料中の抗原分子の数が増加すると、拮抗のため結 合した標識抗原分子の数が減少する。このため、未結合抗原（標識および非標識 ）を除去した後、基質および色原体を添加すると、発色の程度はどのくらいの標 識抗原が免疫学的に結合して残りているかに依存している。試料中の抗原濃度が 増加すると分離後標識された抗原が少なくなり、発色の速度が遅くなる。一定の 量の抗原を含む校正試料〈標準を示す）に対し、試料中の発色の速度の対応をつ けるプログラム可能な差速度分光光度計を以下の検定の実施に使用する。

マド１ツ　スの 検定マトリックスは１２Ｘ７５＋＋＋ｅポリスチレンチユーブ中ウサギＩＢＧ（ ペルーフリーズ、Ｐｅ１−Ｆｒｅｅｚｅ）、抗ウサギＩＥＧ（ペルーフリーズ） および本来の抗体く前記実施例１に従って調製される）からなる３重抗体層であ る。ウサギＩｇＧはポリスチレンチューブの内部へグルタルアルデヒド法（例え ばＢｏｅｎｉｓｅｈ。

前記文献と参照されたい）により結合せしめる。

以下の工程により第２のおよび本来の抗体を免疫学的に結合せしめて３重層とな す、ヤギ抗ウサギ血清（ペルーフリーズ）の１　：５００希釈液は１０＋＊Ｍリ ン酸緩衝液から作製する；１す／論！のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し たｐＨ７，５の０．１５Ｍリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）。この溶液の６ ００マイクロリツトルをピペットで採ってチューブに入れ、室温で一夜インキユ ベートする０次にチューブを脱イオン水で１回洗浄する。

本来の抗体の１　：２０　、ｏｏｏ希釈液をＰＢＳ−ＢＳＡ中で調製し、６００ マイクロリツトルづつチューブへ添加する。チューブをインキュベートし、アス ピレータ−で液を除き、洗浄後、乾燥室へ約２４時間置く、チューブは続いて４ ℃にて保存する。

ウサギ中前記実棒例１に記載したごと＜ＢＳＡまたはＢＧＧに共役抱合されたト ルエン誘導体（バラ−トリル酢酸）に対する本来の抗体を発生しめる。得られた 抗体はすべて芳香環を含有するいくつかの化合物と反応する；例えばトルエン、 トルイジン、２−（ｐ−トリル）エチルアミン、ベンゼン、スチレン、キシレン 、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、２−メチル−ナフタレン。

−・Ｃ−ＨＲＰｆム 昭　ゝお　び・ この分野に精通する者には既知の方法を用い、トリル酢酸分子を酵素西洋ワサビ ペルオキシダーゼに共役抱合せしめる０例えば”抗体の酵素標識”ジャーナル　 オブ　イムノアッセイ（Ｊ　、　ｏｒ　Ｉ　＋ｕ＋ｕｎｏａｓｓａｙ）４巻、３ 号、１９８３年、第１版。

Ｅ　、Ｉ　５ｈｉｋａ＠ａを参照されたい、得られる共役抱合物は約ｐＨ７，０ で通常の抗菌剤および０．０５ｇの界面活性剤を添加した５０％子ウシつ児血清 、０．５Ｍ）−リズマ塩基からなるタンパク質媒質に希釈する。

前記の差速度分光光度計を用いる場合、１回の試験の実施に２つの共役抱合物の バイアルが必要である。１つのそのバイアルには前もって決められた量の共役抱 合物およびトリル酢酸が存在しており、それはある一定量の検出される芳香族環 含有化合物（またはベンゼン、トルエンおよびキシレンの混合物−ＢＴＸで示す ）と同一の試験応答を与える。３５ｍｇの１）−トリル酢酸は２１−ｇのトルエ ン（または混合されたＢＴＸ）と同じ応答を与える事が示されている（規定の時 間後の吸光度）、このバイアルは対照または゛Ｒ′Ｒｏアルで表わされる。′Ｒ もって決められた量の共役抱合物を含むがトリル酢酸を含まない他のバイアルは 試料のための′Ｓ“と名付ける。これらの物質は凍結乾燥し、真空下栓をする。

試１区と丸竹− １つの“Ｒ゛バイアルよび１つの゛Ｓ°バイアルをトレー上に置（、０，０９ｇ ）リス緩衝液および０．０２５ｇ界面活性剤（例えばＢｒ１ｊ−３５）からなる 溶解溶液を決められた量用い、凍結乾燥された物質を溶解する。

もし、芳香環含有化合物の存在を試験される物質が例えば活性炭素のごとく抽出 を必要とする場合、小さな容器中法められた量のメタノールと振どうすることに より抽出される。メタノール抽出液を一定量測って゛Ｓ°バイアル中に入れる。

同量の純粋なメタノールを′Ｒ′Ｒｏアルに入れ゛Ｓ°バイアルにおけるメタノ ールの効果を相殺する。”Ｒｏおよび′Ｓ°バイアルの内容物の全部、各々°Ｒ ゛および°Ｓ゛抗体−被覆チューブに移す。

反応混合物を約５分間インキュベートし続いて５回激しく洗浄する。６滴のく約 ２５０μｍ）色原体＜３．３“、５，５“−テトラメチルベンチジン；４０％メ タノール；２０％グリセロール）を各々のチューブに添加する。それから迅速に および正確に、基質溶液（０，０４：過酸化尿素、０．０９Ｍ酢酸ナトリウム、 ０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５，０）を加え各々のチューブの容量を５００−６００ マイクロリツトルの間となす。

渦を巻かせて撹拌し、軽くたたいた後、チューブの発色を前記のコンピュータ一 連結差速度分光光度計によりモニターする。

正確な吸光度の読み取りを確かにするために常法により分光光度計内に間欠性の 混合装置を組み入れる（チューブの底部は表面面積が大きいので発色がより速い ）、２ｏ秒毎に（混合停止＠２．３秒後）吸光度を読み取り、読み取り値は分光 光度計に連結されたコンピューター内に保存される。最初の６つの読み取り値は 無視する。計算は式 ％式％） ［式中、Ｋは実験データから決定される定数であり、ｒは下記の比である： ｒ＝吸光度変化／時間変化（対照） 吸光度変化／時間変化（試料）コ に基づいて計算を実行する。約９回のそのような計算の平均が計算され、連結さ れたコンピューターの液晶ディスプレー上に示される０分光光度計にはまたデー タのハードコピーを得るためプリンターが接続されるであろう、計算が試料の発 色の速度に対する対照の発色の速度の比に基づいているため、温度のごとき多く の因子が検定に影響を与え、インキュベーション時間を長くしても検定の結果に は影響しない；対照および試料の両方ともこれらの因子により等しく影響されな ければならない。

−一・−ム 前記実施例１に従って作られた抗体の種々の芳香族炭化水素に対する反応性は前 記実施例２に既記した一般的方法を用いて決定された。

１１己ａ４１ すべての標準品は試験される純粋な化学薬品を連続的にメタノール（試薬等級） で希釈して作製する。もし物質が結晶形のものは重量／容量法を使用する。もし 化合物が液体の場合、化合物の密度×１０ｓ百万分０ｌ　（ｓｉ’当り９）の関 係を用い実際の量を決定する。続いて所望の濃度（ｍｆｆｉ当りの９またはＩ） Ｉ）１１）が達成されるまで連続的に希釈する。

１２二１ ａ）約６から約１０の３重層抗−トリル被覆ポリスチレンチューブおよび１つの 非被覆ポリスチレンチューブ（非特異的結合を検査するため−ＮＳＢ）の各々に ２５０μｐのユニバーサル希釈液をピペッティングする。

ｂ）前記実施例２に記載された１５０μｌの溶解溶液を各々のチューブに加える 。

ｃ）　５０μ！のトリル酢酸−ＨＲＰ共役共役物金物業希釈液をチューブに加え る。これらの特定の試験のための共役抱合物の作業希釈液は変化するが、希釈は 以下に提供する表示中に示しである。

ｄ）１００μｌの１００％メタノールを標準チューブの半分およびＮＳＢチュー ブにピペッティングする。これはゼロ量または尋人結合（即ち最大発色）を表わ す、他のチューブの中へ、交叉反応を試験する芳香族炭化水素を含む標準溶液を １００μｌピペツトにて加える。

ｅ）チューブに蓋をしく芳香族化合物は疎水性であり、検定混合物は水性である ので注意）、５分間インキュベートする。

ｆ＞　５分間のインキュベーションの後、溶液をデカントし、チューブをプラス チック製しぼり出しびんにて５回激しく洗浄する。

ｇ）　よく振って完全にチューブから水を振り落とす０等量の基質および色原体 をガラスバイアルに添加し、うす巻きを起こして撹拌し、迅速に各々のチューブ に５００μ！の混合物を添加する。

ｈ）　５から約１０分放置して発色せしめ１ｍＮのｌＮＨ２ＳＯ。

で反応を終結せしめる（色が青から黄色に変わる）、チューブは４５０ｎ−で読 み取る。

以下に記載する芳香族炭化水素の前記実施例１に従って作製された抗体試料との 反応性が試験された。試験法およびその規模は本質的に前に記載した通りである 。下記の芳香族炭化水素が抗体と反応する事が検出された：ベンゼン、キシレン 、トルエン、スチレン、トルイジン、２−＜ｐ−）リル）エチルアミン、エチル ベンゼン、２−メチル−ナフタレンおよびプロピルベンゼン。

４−　スクロマト　−フイーとの相関 芳香族炭化水素混合物からなる試料を前記実施例２で概説した一般法ならびに通 常のガスクロマトグラフィー技術を用いて分析し、その芳香族炭化水素の存在を 決定した。実施例２の免疫検定を用いた分析は、この分野に精通する者にはよく 知られている技術である回帰分析により決定され、通常のガスクロマトグラフィ ー技術を用いた分析と良く相関した。相関係数は０．９８９と決定された。

回帰分析に使用された試料は（ｉ＞ガソリンの連続希釈物および（ｉｉ）　ガソ リンを加え前記実施例にて記載したごとくメタノールで抽出された砂利および粘 土を含む土壌試料である。

回帰分析で使用された抗体調製物は前記実施例１に従って調製された。

５−モノ　ローナル　イ：Ｗ モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　の古典的方法に従 い、トリル酢酸が結合したＢＳＡのごとき抗原をマウス膵臓に注射して調製され た。２から３週間後マウスを殺し、膵臓を取り、消化しリンパ球細胞を抽出した 。マイクロタイタープレート上抗体活性のリンパ球をスクリーニングを含む選択 過程はコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイル（Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ） の教え通りに実施した。スクリーニング過程で選択されたリンパ球は各々マウス 骨髄腫細胞と各々融合せしめてハイブリドーマを形成する。各々のバイプリドー マはその後マウスの胃中に注射する。注射された各々のマウスは約２週間後に殺 し、その間にその胃により産生された腹水液を回収する。各々の別々の腹水のバ ッチから芳香環含有化合物と結合できる異ったモノクローナル抗体が回収される 。

固相、酵素結合拮抗的免疫検定を使用した本実施例は本発明を使用する単に１つ の実施例にすぎない、実施例に記載された実際の過程の変化はこの分野に精通す る者には明らかであろう。

それ故、本発明は付随する請求の範囲にのみ制限されると考えられなければなら ない。

国際調査報告 １′瞳晴電”・〜“−１１１１″１曹１°・″′−コＦＣτ／Ｉ！Ｓεε１０１ ９２’−国際調査報告 ＵＳεε０２９２９ Ｓ＾　２３０２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少くとも１つの芳香環含有化合物と結合するポリクローナルＩｇＧ抗体調製 試料。 ２．ポリクローナルＩｇＧ抗体調製試料が約１０−１２ｇから約１０−３ｇの芳 香環を結合する能力がある請求の範囲第１項記載のポリクローナルＩｇＧ抗体調 製試料る３．芳香環含有化合物が１つまたはそれ以上の２−（ｐ−トリル）エチ ルアミン、トルエン、トルイジン、ベンゼン、スチレン、キシレン、エチルベン ゼン、プロピルベンゼンまたは２−メチル−ナフタレンからなる請求の範囲第１ 項記載のポリクローナルＩｇＧ抗体調製試料。 ４．ポリクローナルＩｇＧ抗体調製試料が任意の２−（ｐ−トリル）エチルアミ ン、トルエン、トルイジン、ベンゼン、スチレン、キシレン、エチルベンゼン、 プロピルベンゼンまたは２−メチル−ナフタレンを結合する請求の範囲第１項記 載のポリクローナルＩｇＧ抗体調製試料。 ５．抗体調製試料がベンゼン、トルエンおよびキシレンを結合する請求の範囲第 １項記載のポリクローナルＩｇＧ抗体調製試料。 ６．試料中の少くとも１つの芳香環含有化合物の存在を検出する方法で、その方 法は下記（ａ）−（ｃ）の工程を含む：（ａ）（ｉ）芳香環含有化合物またはそ の免疫学的均等物と（ｉｉ）検出可能な標識物質との間で共役抱合物を形成し； （ｈ）共役抱合物および芳香環含有化合物を試験する試料と前記芳香環含有化合 物と反応する抗体とを、共役抱合物および試料中の芳香環含有化合物が抗体上の 結合部位に対して拮抗するような条件下接触せしめ；および（ｃ）結合共役抱合 物を検出可能な物質に応答する組成物で測定することにより芳香環含有化合物の 存在を検出する。 ７．抗体が固定化されている請求の範囲第６項記載の方法。 ８．抗体が請求の範囲第１項に従う抗体調製試料である請求の範囲第６項記載の 方法。 ９．抗体調製試料がモノクローナル抗体調製試料である請求の範囲第６項記載の 方法。 １０．検出できる物質が、色、色変化、光の放射または放射線、蛍光、または伝 導率の差を産み出すように応答する組成物または刺激物の存在下反応できる請求 の範囲第６項記載の方法。 １１．検出できる物質が酵素からなり、それが応答する組成物が色原体からなる 請求の範囲第６項記載の方法。 １２．酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであり、色原体が３，３′，５，５′ −テトラメチルベンジジンである請求の範囲第１１項記載の方法。 １３．芳香族炭化水素が２−（ｐ−トリル）エチルアミン、トルエン、トルイジ ン、ベンゼン、スチレン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンまたは ２−メチル−ナフタレンの１以上からなる請求の範囲第６項記載の方法。 １４．試料がガソリン、灯油または燃料油またはそれらにより汚染されている物 質からなる請求の範囲第６項記載の方法。 １５．試料中の少くとも１つの芳香環含有化合物の存在を検出する方法で、その 方法は下記（ａ）−（ｄ）の工程からなる：（ａ）芳香環含有化合物およびその 免疫学的均等物を固定し；（ｂ）（ｉ）芳香環含有化合物またはその免疫学的均 等物と結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な標識物質の間で共役抱合物を形 成し； （ｃ）共役抱合物および芳香環含有化合物が試験される試料と芳香環含有化合物 または工程（ａ）の免疫学的均等物を、固定化芳香環含有化合物または工程（８ ）の免疫学的均等物および試料中の芳香環含有化合物が共役抱合物上の結合部位 に対して拮抗するような条件下接触せしめ；および（ｄ）試料中の芳香環含有化 合物の存在を検出する。 １６．抗体調製試料が請求の範囲１項に従った抗体調製試料である請求の範囲第 １５項記載の方法。 １７．抗体調製試料がモノクローナル抗体調製試料である請求の範囲第１５項記 載の方法。 １８．検出できる標識物質が、色、色変化、光の放射または放射線、蛍光、また は伝導率の変化を産み出すように応答する組成物または刺激物の存在下反応でき る物質からなる請求の範囲第１５項記載の方法。 １９．検出可能な標識物質が酵素からなり、その存在がそれを色原体と反応せし める事により検出される請求の範囲第１５項記載の方法。 ２０．酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼおよび色原体が３，３′，５，５′− テトラメチルベンジジンである請求の範囲第１５項記載の方法。 ２１．芳香環含有化合物が少くとも２−（ｐ−トリル）エチルアミン、トルエン 、トルイジン、ベンゼン、スチレン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベン ゼンまたは２−メチル−ナフタレンの１つからなる請求の範囲第１５項記載の方 法。 ２２．試料がガソリン、灯油または燃料油またはそれらにより汚染された物質で ある請求の範囲第１５項記載の方法。 ２３．少くとも１つの芳香環含有化合物の存在を検出するための免疫検定を実施 するためのキットで、キットは下記の組合せからなる： （ａ）芳香環含有化合物に結合できる抗体調製試料；および（ｂ）芳香環含有化 合物またはその免疫学的均等物および検出可能な標識物質の共役抱合物。 ２４．検出可能な標識物質が色、色変化、光の放射または放射線、蛍光、または 伝導率の変化を産み出すように応答する組成物または刺激物存在下反応できる物 質からなる請求の範囲第２３項記載のキット。 ２５．抗体調製試料が固定化されている請求の範囲第２４項記載のキット。 ２６．少くとも１つの芳香環含有化合物の存在を検出する免疫検定を実施するた めのキットであって、下記の組合せ：（ａ）芳香環含有化合物またはその免疫学 的均等物；および（ｂ）（ｉ）芳香環含有化合物に結合するまたはその免疫学的 均等物に結合する抗体と（ｉｉ）検出可能な標識組成物との間の共役抱合物 がらなるキット。 ２７．芳香環含有化合物またはその免疫学的均等物が固定化されている請求の範 囲第２６項記載のキット。 ２８．検出可能な組成物が色、色変化、光の放射または放射線、蛍光、または伝 導率の変化を産み出すように応答する組成物または刺激物の存在下反応でききる 物質からなる請求の範囲第２６項記載のキット。