JPH0242478B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、ベイロネーラ属に属する菌を培養
し、この培養液から新規な制癌性物質TV−110
を製造する方法に関する。
近年、各種の癌患者の治療法において、宿主の
免疫機能を亢進させ、免疫機能の助けを借りなが
ら制癌効果を発現させる治療法が盛んとなつて来
た。かかる療法に使用される薬剤としては、各種
細菌の菌体、菌体培養物から得られる成分、ある
いは担子菌の子実体又はその培養菌体から得られ
る多糖体が知られている。しかし嫌気性菌を培養
し、その培養液から優れた制癌作用を有する成分
の研究は少なく、特にベイロネーラ属に属する菌
を培養し、その培養液から得られる成分並びにそ
の制癌作用については未だ知られていない。
本発明者はヒト口腔内より分離したベイロネー
ラ属に属する菌を培養し、その培養液から菌体を
除去した上清液について、その薬理作用を調べて
いたところ、この上清液から採取される特定の成
分が強い制癌作用を有すること、しかもこれは、
コロニー形成抑制法においては癌細胞の集落形成
阻止作用は極めて小さく、殺細胞による制癌作用
ではなく、宿主介在性あるいは宿主の免疫力を亢
進させ、免疫力の助けを借りながら間接的に制癌
作用を発現させる作用を有するものであること、
更にこの成分は毒性が極めて弱いことを見出し、
本発明を完成した。
本発明で利用される菌としては、ベイロネーラ
属に属するTV−110生産菌であればよく、好適
なものとしては、ベイロネーラ・アルカレツセン
ス、ベイロネーラ・パルブラが挙げられる。具体
的には、例えばベイロネーラ・アルカレツセンス
TF−Ｖ、ベイロネーラ・パルブラTF−Ｖ−１お
よび微生物学の一般常識としてそれらの性質を有
する菌株、すなわち自然変異株あるいは人工的に
改良された菌株等が利用される。
次にベイロネーラ・アルカレツセンスTF−Ｖ
及びベイロネーラ・パルブラTF−Ｖ−１の菌学
的性状を記載すれば以下のとおりである。
Γベイロネーラ・アルカレツセンスTF−Ｖの菌
学的性質
(1) 形態
細胞の形：球形（第１図）
細胞の多形性の有無：なし
運動性の有無：なし
胞子の有無：なし
グラム染色：グラム陰性
(2) 培地における生育状態
TF−ａ寒天平板
外形：円形及び非溶血性
構造：露滴状
表面：平滑
色：乳白色
TF−ａ液体培地
発育の程度：普通
濁り：綿繊維状
ガス：なし
(3) 生理学的性質
硫化水素の生成：−
硫酸塩の還元：−
プロピオン酸の生成：＋
インドールの生成：＋
ウレアーゼ：−
カタラーゼ：＋
乳汁：凝固しない
酸素に対する態度：嫌気性
リパーゼ：−
レシチナーゼ：−
生育の範囲：至適PH７付近（中性）
至適温度35〜40℃
糖からのガスの生成
Ｌ−アラビノース（−）、Ｄ−キシロース
（−）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンノー
ス（−）、Ｄ−フラクトース（−）、Ｄ−ガラ
クトース（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖（−）、
トレハロース（−）、ソルビツト（−）、マン
ニトール（−）、イノシツト（−）、グリセリ
ン（−）、デンプン（−）、サリシン（−）、
ゼラチン（−）、エスクリン（−）、セルビオ
ース（−）、ラフイノース（−）、ラムノース
（−）
Γベイロネーラ・パラブラTF−Ｖ−１の菌学的
性質
(1) 形態
細胞の形：球形（第２図）
細胞の多形性の有無：なし
運動性の有無：なし
胞子の有無：なし
グラム染色：グラム陰性
(2) 培地における生育状態
TF−ａ寒天平板
外形：円形及び非溶血性
構造：露滴状
表面：平滑
色：乳白色
TF−ａ液体培地
発育の程度：普通
濁り：綿繊維状
ガス：なし
(3) 生理学的性質
硫化水素の生成：−
硫酸塩の還元：−
プロピオン酸の生成：＋
インドールの生成：＋
ウレアーゼ：−
カタラーゼ：＋
乳汁：凝固しない
酸素に対する態度：嫌気性
リパーゼ：−
レシチナーゼ：−
生育の範囲：至適PH７付近（中性）
至適温度35〜40℃
糖からのガスの生成
Ｌ−アラビノース（−）、Ｄ−キシロース
（−）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンノー
ス（−）、Ｄ−フラクトース（−）、Ｄ−ガラ
クトース（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖（−）、
トレハロース（−）、ソルビツト（−）、マン
ニトール（−）、イノシツト（−）、グリセリ
ン（−）、デンプン（−）、サリシン（−）、
ゼラチン（−）、エスクリン（−）、セルビオ
ース（−）、ラフイノース（−）、ラムノース
（−）
以上の諸性状をバージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版に照して検討すると、これらの菌株はベイロネ
ーラ・アルカレツセンス（Veillonella
alcalescens）及びベイロネーラ・パルブラ
（Veillonella parvula）
に酷似するので、それぞれ、これに属する菌であ
ると同定し、これらの菌株をベイロネーラ・アル
カレツセンスTF−Ｖ（Veillonella alcalescens
TF−Ｖ）及びベイロネーラ・パルブラTF−Ｖ−
１（Veillonella parvula TF−Ｖ−１）と命名し
て、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ
受託番号微工研菌寄第5876号（FERM−ＰNo.
5876）及び第5877号（FERM−ＰNo.5877）とし
て寄託した。
本発明の制癌性物質TV−110は、例えば次の
ようにして製造される。
(a) 培養
ベイロネーラ・アルカレツセンス及びベイロ
ネーラ・パルブラの培養は、通常の嫌気性菌の
培養法によつて行われる。すなわち、各種ペプ
トン、牛の脳、心臓抽出物等の窒素源；グルコ
ース、ラクトース等の炭素源；イースト・エク
ストラクト等のビタミン源；Ｌ−シスチン、亜
硫酸ソーダ、チオグリコレート・ナトリウム等
の還元剤；塩化ナトリウム等の無機塩を含む培
地を水酸化ナトリウムでPH７付近、特に好まし
くはPH７に調整したものを用いて嫌気的条件
下、好ましくは35〜40℃の温度で１〜７日間静
置あるいは撹拌培養を行う。特に次の成分を含
む培地（以下TF培地と称する）を使用するの
が好ましい。しかし窒素源として牛の脳、心臓
抽出物のブレイン・ハート・インヒユージヨン
は必ずしも必要でなく、牛の心臓抽出物である
ハート・インヒユージヨン、牛肉エキス、魚肉
エキス、トウモロコシより抽出されたコーンス
テイプリカ等を代用してもよく、また、各種ペ
プトンにおいてプロテオース・ペプトン、フア
イトン・ペプトンは必ずしも必要ではなく、ま
たトリプトケース・ペプトンをポリペプトンで
代用することもできる。なお、寒天を使用しな
いときは撹拌培養を行うのが好ましい。
The present invention involves culturing bacteria belonging to the genus Veillonella and producing a novel anticancer substance TV-111 from this culture solution.
Relating to a method of manufacturing. In recent years, therapeutic methods that enhance the host's immune function and exert anticancer effects with the help of the immune function have become popular in the treatment of various cancer patients. Known drugs used in such therapy include bacterial cells of various bacteria, components obtained from bacterial cell cultures, and polysaccharides obtained from the fruiting bodies of basidiomycetes or their cultured cells. However, there is little research on components that have excellent anticancer effects obtained from the culture solution obtained by culturing anaerobic bacteria, and in particular, there is still little research on the components obtained from the culture solution obtained by culturing anaerobic bacteria belonging to the genus Veilonella and their anticancer activity. unknown. The present inventor cultivated bacteria belonging to the genus Veillonella isolated from the human oral cavity, and investigated the pharmacological effects of the supernatant after removing the bacterial cells from the culture solution. Certain ingredients have strong anticancer effects, and this also means that
In the colony formation suppression method, the effect of inhibiting the formation of cancer cell colonies is extremely small, and instead of a cancer-fighting effect by killing cells, it is an indirect cancer-fighting effect with the help of host-mediated or host immunity. It must have the effect of causing the effect to be expressed;
Furthermore, we discovered that this ingredient has extremely low toxicity.
The invention has been completed. The bacteria used in the present invention may be any TV-110 producing bacteria belonging to the genus Veillonella, and suitable examples include Veillonella alcalescens and Veillonella parvula. Specifically, for example, Veilonera alcaretscens
TF-V, Veillonella parvula TF-V-1, and strains having these properties as common knowledge in microbiology, such as natural mutant strains or artificially improved strains, are used. Next, Veilonera Alcalescens TF-V
The mycological properties of Veillonella parvula TF-V-1 are as follows. Mycological properties of Γveillonella alcalescens TF-V (1) Morphology Cell shape: spherical (Fig. 1) Presence or absence of cell pleomorphism: None Presence or absence of motility: None Presence or absence of spores: None Gram staining : Gram negative (2) Growth status in medium TF-a agar plate external shape: circular and non-hemolytic structure: dewdrop-like surface: smooth color: milky white TF-a liquid medium growth level: normal turbidity: cotton fibrous gas: None (3) Physiological properties Hydrogen sulfide production: - Sulfate reduction: - Propionic acid production: + Indole production: + Urease: - Catalase: + Milk: non-clotting Attitude towards oxygen: anaerobic Lipase: - Lecithinase :- Growth range: Optimum pH around 7 (neutral) Optimum temperature 35-40℃ Generation of gas from sugar L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D- Mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-), maltose (-), sucrose (-),
Trehalose (-), Sorbit (-), Mannitol (-), Inosit (-), Glycerin (-), Starch (-), Salicin (-),
Gelatin (-), esculin (-), cellbiose (-), raffinose (-), rhamnose (-) Mycological properties of Γveillonella palabra TF-V-1 (1) Morphology Cell shape: spherical (secondary Figure) Presence or absence of cell pleomorphism: None Presence or absence of motility: None Presence or absence of spores: None Gram staining: Gram negative (2) Growth status in medium TF-a agar plate external shape: Round and non-hemolytic structure: Dewdrop Surface: Smooth Color: Milky TF-a liquid medium Growth level: Normal turbidity: Cotton fibrous gas: None (3) Physiological properties Hydrogen sulfide production: - Sulfate reduction: - Propionic acid production: + Indole Production of: + Urease: - Catalase: + Milk: Does not coagulate Attitude towards oxygen: Anaerobic Lipase: - Lecithinase: - Growth range: Optimum pH around 7 (neutral) Optimum temperature 35-40℃ Gas from sugar Production L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-), maltose (-), sucrose (-),
Trehalose (-), Sorbit (-), Mannitol (-), Inosit (-), Glycerin (-), Starch (-), Salicin (-),
Gelatin (-), esculin (-), cellbiose (-), raffinose (-), rhamnose (-)
When considered against the edition, these strains are Veillonella alcaretscens.
alcalescens) and Veillonella parvula, we identified these strains as belonging to these strains, and identified these strains as Veillonella alcalescens TF-V (Veillonella alcalescens TF-V).
TF-V) and Veillonella parvula TF-V-
1 (Veillonella parvula TF-V-1), and were given accession number FERM-P No. 5876 (FERM-P No. 5876) to the National Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology.
5876) and No. 5877 (FERM-P No. 5877). The anticancer substance TV-110 of the present invention is produced, for example, as follows. (a) Cultivation Veillonella alcalescens and Veillonella parvula are cultured using the usual anaerobic culture method. Namely, nitrogen sources such as various peptones, cow brain, and heart extract; carbon sources such as glucose and lactose; vitamin sources such as yeast extract; reducing agents such as L-cystine, sodium sulfite, and sodium thioglycolate. ; Using a medium containing an inorganic salt such as sodium chloride adjusted to pH around 7, particularly preferably PH 7, with sodium hydroxide, leave it for 1 to 7 days under anaerobic conditions, preferably at a temperature of 35 to 40°C; or Perform agitation culture. In particular, it is preferable to use a medium containing the following components (hereinafter referred to as TF medium). However, as a nitrogen source, it is not always necessary to use brain heart intake, which is an extract of cow's brain or heart. Proteose peptone and phitone peptone are not necessarily necessary among various peptones, and polypeptone can be substituted for tryptocase peptone. Note that when agar is not used, it is preferable to perform agitation culture.
【表】
(b) 培養液から上清液の採取（菌体の除去）上で
得た培養液から菌体を除去して上清液を得る。
菌体の除去は常法、例えば遠心分離、ハイフロ
スーパーゲル等の過助剤を用いる過法を採
用できるが、特に遠心分離法は操作、菌の除去
度合、上清液の収量の点で好ましい。
(c) 制癌性物質TV−110の採取
上で得られた上清液又は培養液に親水性有機
溶媒を加えて、生ずる沈殿物を採取する。この
際の上清液又は培養液はPH２〜７に調整するの
が好ましい。親水性有機溶媒としては、例えば
エタノール、メタノール等のアルコール類、ア
セトン等のケトン類が挙げられるが、アルコー
ル類特にエタノールが最もよい結果を与える。
この親水性有機溶媒はその濃度が30〜80％（容
量比）、好ましくは60％（容量比）前後になる
ように添加するのが好適である。親水性有機溶
媒を加えた後、低温、好ましくは約４〜５℃の
温度で数時間〜数日間放置し、沈殿物の生成を
完結させる。
このようにして生じた沈殿物をデカンテーシヨ
ン、遠心分離、過等の通常の操作で分離する。
次いで、上で得られた沈殿物に10〜40倍量の水
を加え、生ずる水不溶物を遠心分離、過等の通
常の方法で除去する。培養液を使用したときはこ
の処理により菌体が除去される。
上で得られた分離液を透析又は限外過し、そ
の内液を採取し、これを乾燥すれば制癌性物質
TV−110が得られる。
斯くして得られるTV−110は次のような性状
を有する。
(イ) 白灰色〜淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ復水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマ180癌細胞の増殖を阻
止し、免疫賦活作用を有する。
(ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920〜2880、1660〜1630、1550〜
1520、1460〜1370、1240〜1220、1120〜1020お
よび980cm-1の近傍に吸収帯を有する。
(ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸
収末端に強い吸収があり、また247〜268nｍの
近傍に吸収を示す。
(ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性。
(チ) 元素分析値
Ｃ：37％〜41％、Ｈ：４％〜６％、Ｎ：４％
〜７％
(リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は約45％
〜65％（グルコース換算）、およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は約15％〜25
％（牛血清アルブミン換算）である。
(ヌ) 分子量
数1000以上であるが、特定は極めて困難であ
る。
本発明方法cm2得られた制癌性物質TV−110の
薬理作用は次のとおりである。
なお、実施例１で製造されたTV−110をTV−
110（実施例１）、実施例２で製造されたTV−110
をTV−110（実施例２）として示した。
(1) 免疫賦活作用
一群３匹のICR系マウスを用い、制癌性物質
TV−110を生理食塩水に溶解させ、その溶液
0.2mlを腹腔内投与した。投与24時間後に
Perikan Drawing Ink 17 Black（ギユンタ
ー・ワグナー社製）１mlとゼラチン３％含有生
理食塩水２mlを混合して調製したカーボン浮遊
液0.2mlをマウス尾静脈から注入し、注入後１、
５、10および15分後に眼窩からヘパリン被覆へ
マトクリツト毛細管を用いて血液0.02mlを採取
し、直ちに0.1％炭酸ナトリウム水溶液1.6mlに
希釈溶血させ、これを波長675nｍで比色し貧
食係数（phagocytotic index）：Ｋ値を
Halpernらの数式により求めた。
また対照群には生理食塩水0.2mlを投与した。
Ｋ＝log Co−log Ｃ／ｔ−to
（Co＝to時の血中炭末量、Ｃ＝ｔ時の血中炭
末量）
その結果は表−１のとおりである。[Table] (b) Collection of supernatant from culture solution (removal of bacterial cells) Remove bacterial cells from the culture solution obtained above to obtain supernatant.
Bacterial cells can be removed by conventional methods, such as centrifugation or filtration using a supernatant such as Hyflo Super Gel, but centrifugation is particularly preferable in terms of operation, degree of bacterial removal, and yield of supernatant. . (c) Collection of anticancer substance TV-110 A hydrophilic organic solvent is added to the supernatant or culture solution obtained above, and the resulting precipitate is collected. At this time, the supernatant liquid or culture solution is preferably adjusted to pH 2-7. Examples of hydrophilic organic solvents include alcohols such as ethanol and methanol, and ketones such as acetone, but alcohols, particularly ethanol, give the best results.
This hydrophilic organic solvent is suitably added at a concentration of 30 to 80% (volume ratio), preferably around 60% (volume ratio). After adding the hydrophilic organic solvent, it is left to stand at a low temperature, preferably at a temperature of about 4 to 5°C, for several hours to several days to complete the formation of a precipitate. The precipitate thus formed is separated by conventional procedures such as decantation, centrifugation, filtration, etc. Next, 10 to 40 times the amount of water is added to the precipitate obtained above, and the resulting water-insoluble matter is removed by a conventional method such as centrifugation or filtration. When a culture solution is used, bacterial cells are removed by this treatment. The separated solution obtained above is subjected to dialysis or ultrafiltration, the inner solution is collected, and if this is dried, an anticancer substance can be obtained.
TV-110 is obtained. TV-110 thus obtained has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) It inhibits the proliferation of Ehrlichi condensate carcinoma, Ehrlichi nodular carcinoma, and Sarcoma 180 cancer cells in mice, and has immunostimulatory effects. (c) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (d) It does not show a clear melting point, and begins to decompose at about 110°C, and significantly decomposes above 200°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is
3500~3300, 2920~2880, 1660~1630, 1550~
It has absorption bands near 1520, 1460-1370, 1240-1220, 1120-1020 and 980 cm -1 . (F) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 has strong absorption at the absorption end and also shows absorption in the vicinity of 247 to 268 nm. (g) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction, Anthrone sulfuric acid reaction, indole-hydrochloric acid reaction, and Lowry-Follin reaction were positive. (H) Elemental analysis values C: 37% to 41%, H: 4% to 6%, N: 4%
~7% (li) Sugar content by phenol sulfuric acid method is approximately 45%
~65% (glucose equivalent), and Lowry
The protein content by the phorin method is approximately 15% to 25%.
% (bovine serum albumin equivalent). (J) Molecular weight: Several thousand or more, but it is extremely difficult to identify. The pharmacological action of the anticancer substance TV-110 obtained by the method of the present invention cm2 is as follows. Note that the TV-110 manufactured in Example 1 was
110 (Example 1), TV-110 manufactured in Example 2
was shown as TV-110 (Example 2). (1) Immunostimulatory effect Using a group of 3 ICR mice, anticancer substances
Dissolve TV-110 in physiological saline, and
0.2 ml was administered intraperitoneally. 24 hours after administration
0.2 ml of carbon suspension prepared by mixing 1 ml of Perikan Drawing Ink 17 Black (manufactured by Guilnter Wagner) and 2 ml of physiological saline containing 3% gelatin was injected into the tail vein of the mouse.
After 5, 10, and 15 minutes, 0.02 ml of blood was collected from the orbit using a heparin-coated capillary tube, immediately diluted with 1.6 ml of 0.1% sodium carbonate aqueous solution, and hemolyzed. index): K value
It was calculated using the formula of Halpern et al. In addition, 0.2 ml of physiological saline was administered to the control group. K=log Co-log C/t-to (Co=to amount of charcoal in the blood, C=blood charcoal amount at t) The results are shown in Table-1.
【表】
この実験から明らかなごとく、対照群に比較
し、本発明のTV−110投与群は網内系マクロ
フアージが活性化され、正常マウスの細胞性免
疫が増大した。
(2) 制癌作用
(a) エールリツヒ腹水型腫瘍に対する抗腫瘍作
用：
ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツ
ヒ腹水型癌細胞をマウス１匹当り１×105個
腹腔内接種した。ついでTV−110を生理食
塩水に溶解させ、その溶液0.2mlを癌細胞接
種後１日目から、１日１回７日間連続腹腔内
投与した。また対照群には生理食塩水0.2
ml／１回を同様に投与した。
その結果は表−２のとおりである。
Ｔ／Ｃ＝投与群の生存日数／対照群の生存日数×100
（％）[Table] As is clear from this experiment, compared to the control group, in the TV-110 administration group of the present invention, reticuloendothelial system macrophages were activated and cell-mediated immunity of normal mice was increased. (2) Anticancer activity (a) Antitumor activity against Ehrlitsu ascites tumor: ICR mice (female, 6 weeks old) were intraperitoneally inoculated with 1 x 10 5 Ehrlitsu ascites cancer cells per mouse. Then, TV-110 was dissolved in physiological saline, and 0.2 ml of the solution was intraperitoneally administered once a day for 7 consecutive days starting from the first day after cancer cell inoculation. In addition, for the control group, saline 0.2
ml/time was administered in the same manner. The results are shown in Table-2. T/C = Survival days of treatment group/Number of survival days of control group x 100
(%)
【表】
この実験から明らかなように、対照群に比
較し、本発明方法で得られたTV−110投与
群には延命効果が認められる。
(b) エールリツヒ結節型腫瘍における抗腫瘍効
果
ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツ
ヒ癌細胞をマウス１匹当り４×106個腋下部
皮下に移植した。ついでTV−110を生理食
塩水に溶解させ、この溶液0.2mlをそれぞれ
癌細胞移植後１日目から、１日１回、７日間
連続腹腔内投与した。また対照群には生理食
塩水0.2ml／１回を同様に投与した。癌細胞
移植後11日目に腫瘍重量を測定した。腫瘍重
量は腫瘍部位の長径ａmmと短径ｂmmをノギス
にて測定し次式によつて求めた。
腫瘍重量＝ａ×b2／２（mg）
その結果は表−３のとおりである。[Table] As is clear from this experiment, a survival effect was observed in the TV-110 administration group obtained by the method of the present invention compared to the control group. (b) Antitumor effect on Ehrlichi nodule-type tumor Ehrlichi cancer cells (4×10 6 cells per mouse) were subcutaneously transplanted into ICR mice (female, 6 weeks old) in the axillary region. Next, TV-110 was dissolved in physiological saline, and 0.2 ml of this solution was intraperitoneally administered once a day for 7 consecutive days starting from the first day after cancer cell transplantation. In addition, to the control group, 0.2 ml of physiological saline was administered once. Tumor weight was measured 11 days after cancer cell transplantation. The tumor weight was determined by measuring the major axis (amm) and minor axis (bmm) of the tumor site using calipers and using the following formula. Tumor weight = a×b 2 /2 (mg) The results are shown in Table 3.
【表】
この実験から明らかなように、対照群に比
較しTV−110投与群には腫瘍発育抑制効果
が認められる。
(c) ザルコーマ180の癌細胞に対する抗腫瘍効
果
ICR系マウス（雌、５周令）にザルコーマ
180癌細胞をマウス１匹当り１×105個腹腔内
移植した。ついでTV−110を生理食塩水に
溶解させ、その溶液0.2mlを癌細胞移植後１
日目から１日１回、７日間連続腹腔内投与し
た。また対照群には生理食塩水0.2ml／１回
を同様に投与した。
その結果を表−４に示す。[Table] As is clear from this experiment, the TV-110 administration group has a tumor growth suppressive effect compared to the control group. (c) Antitumor effect of Sarcoma 180 on cancer cells.
180 cancer cells were intraperitoneally transplanted at 1×10 5 cells per mouse. Next, TV-110 was dissolved in physiological saline, and 0.2 ml of the solution was administered 1 day after cancer cell transplantation.
The drug was administered intraperitoneally once a day for 7 consecutive days. In addition, to the control group, 0.2 ml of physiological saline was administered once. The results are shown in Table 4.
【表】
この実験から明らかなように、対照群に比
較し、本発明方法で得られたTV−110投与
群には抗腫瘍効果が認められる。
本発明方法で得られた制癌性物質TV−110の
マウスにおける急性毒性（LD50）は腹腔で100
mg／Kg以上である。
以上の薬理実験の結果から明らかなように本発
明方法で得られた制癌性物質TV−110は制癌剤
として有用なものであり、各種の癌疾患に使用さ
れ効果が期待されるものである。
本発明方法で得られたTV−110は常法により
経口、注射、坐薬等の剤形にして使用することが
できる。経口剤としては種々の賦形剤を含んでも
よく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤とするこ
とができる。また、注射剤としては皮下、筋肉
内、静脈注射剤のいずれでもよく、懸濁液、溶液
もしくは使用時溶解させる粉末等の剤形が用いら
れる。また注射剤には局所麻酔剤を含んでいても
よい。
本発明方法で得られたTV−110の投与量は患
者の症状に応じて適宜選択されるが、一般に成人
では0.01〜50mg／Kgを１日１〜数回に分け投与す
るのが好ましく、投与方法としては経口又は皮
下、筋肉内、静脈内もしくは患部への注射による
のが好ましい。
次に本発明の実施例及び製剤例を挙げて説明す
る。
実施例 １
(1) ２容のスクリユーキヤツプ付培養瓶１本に
トリプトケース・ペプトン34ｇ、フアイトン・
ペプトン６ｇ、プロテオース・ペプトン20ｇ、
ブレイン・ハート・インヒユージヨン70ｇ、イ
ースト・エクストラクト６ｇ、食塩15ｇ、グル
コース12ｇ、ラクトース10ｇ、Ｌ−シスチン
0.5ｇ、亜硫酸ソーダ0.2ｇ、チオグリコレー
ト・ナトリウム1.0ｇ、寒天1.4ｇを加え、PH７
に調整した培地２を入れ、120℃で15分間加
圧滅菌したのち、ただちに水冷冷却し、予め同
組成の培地で前培養しておいたベイロネーラ・
アルカレツセンスTF−Ｖ〔受託番号微工研菌寄
第5876号（FERM−ＰNo.5876）〕の前培養液を
培養瓶１本につき100mlの割合で滅菌条件下に
接種し、37℃のふ卵器中で48時間静置培養を行
う。培養終了後、４℃で4000rpm、20分間この
培養液を遠心分離し、菌体を除去して上清液約
1.82を得た。
(2) (1)で得た上清液に５℃で撹拌下にエタノール
2.73を加え、無定形の沈殿物が完全に沈殿す
るまで低温室で放置する。ついで５℃で、
6000rpm、15分間遠心分離し沈殿物を採取し、
エタノールで洗浄し、減圧乾燥して約2.0ｇの
粗粉末を得た。
(3) (2)で得た粗粉末2.0ｇを水60mlに溶解させ、
この際生じる水不溶物を7500rpm、10分間遠心
分離で除去して得た上清液と、水不溶物を水10
mlで２回洗浄した洗浄液とを合した溶液75mlを
蒸留水に対して透析し、内液を凍結乾燥し、白
灰色〜淡褐色のTV−110の粉末1.50ｇを得た。
このものは次の理化学的性質を有する。
(イ) メタノール、エタノール、アセトン、ベン
ゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチル
エーテルに不溶。
(ロ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を
始め、200℃以上で著しく分解する。
(ハ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3500〜3300、2920〜2880、1660〜1630、
1550〜1520、1460〜1370、1240〜1220、1120
〜1020および980cm-1の近傍に吸収帯を有す
る（第３図）。
(ニ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、
吸収末端に強い吸収があり、また247〜268n
ｍの近傍に吸収を示す（第４図）。
(ホ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性。
(ヘ) 元素分析値
Ｃ：37％〜40％、Ｈ：４％〜６％、Ｎ：５
％〜７％
(ト) フエノール硫酸法による糖の含有率は約45
％〜65％（グルコース換算）、およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約15
％〜25％（牛血清アルブミン換算）である。
実施例 ２
(1) ２容のスクリユーキヤツプ付培養瓶１本に
トリプトケース・ペプトン34ｇ、ブレイン・ハ
ート・インヒユージヨン70ｇ、イースト・エク
ストラクト６ｇ、食塩15ｇ、グルコース12ｇ、
ラクトース10ｇ、Ｌ−シスチン0.5ｇ、亜硫酸
ソーダ0.2ｇ、チオグリコレート・ナトリウム
1.0ｇ、寒天1.4ｇを加え、PH７に調整した培地
２を入れ、120℃で15分間加圧滅菌したのち、
ただちに水冷冷却し、予め同組成の培地で前培
養しておいたベイロネーラ・パルブラTF−Ｖ
−１〔受託番号微工研菌寄第5877号（FERM−
ＰNo.5877）〕の前培養液を培養瓶１本につき100
mlの割合で滅菌条件下に接種し、37℃のふ卵器
中で120時間静置培養を行う。培養終了後、４
℃で4000rpm、20分間この培養液を遠心分離
し、菌体を除去して上清液約1.83を得た。
(2) (1)で得た上清液に５℃で撹拌下にエタノール
2.75を加え、無定形の沈殿物が完全に沈殿す
るまで低温で放置する。ついで４℃で、
6000rpm、15分間遠心分離し沈殿物を採取し、
エタノールで洗浄し、減圧乾燥して約1.6ｇの
粗粉末を得た。
(3) (2)で得た粗粉末1.6ｇを水50mlに溶解させ、
この際生じる水不溶物を7500rpm、10分間遠心
分離で除去して得た上清液と、水不溶物を水10
mlで２回洗浄した洗浄液とを合した溶液65mlを
蒸留水に対して透析し、内液を凍結乾燥し白灰
色〜淡褐色のTV−110の粉末1.0ｇを得た。
このものは次の理化学的性質を有する。
(イ) メタノール、エタノール、アセトン、ベン
ゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチル
エーテルに不溶。
(ロ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を
始め、200℃以上で著しく分解する。
(ハ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3500〜3300、2920〜2880、1660〜1630、
1550〜1520、1460〜1370、1240〜1220、1120
〜1020および980cm-1の近傍に吸収帯を有す
る。
(ニ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、
吸収末端に強い吸収があり、また247〜268n
ｍの近傍に吸収を示す（第６図）。
(ホ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性。
(ヘ) 元素分析値
Ｃ：38％〜41％、Ｈ：４％〜６％、Ｎ：４
％〜６％
(ト) フエノール硫酸法による糖の含有率は約45
％〜65％（グルコース換算）、およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約15
％〜25％（牛血清アルブミン換算）である。
製剤例 １
実施例１で得られた粉末５mgをバイアル瓶に充
填した。これは使用時滅菌生理食塩水又はリドカ
イン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液として用
いる。
製剤例 ２
実施例２で得られた粉末５mgをバイアル瓶に充
填した。これは使用時滅菌生理食塩水又はリドカ
イン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液として用
いる。[Table] As is clear from this experiment, an antitumor effect was observed in the TV-110 administration group obtained by the method of the present invention compared to the control group. The acute toxicity ( LD50 ) of the anticancer substance TV-110 obtained by the method of the present invention in mice is 100
mg/Kg or more. As is clear from the results of the above pharmacological experiments, the anticancer substance TV-110 obtained by the method of the present invention is useful as an anticancer agent, and is expected to be effective when used for various cancer diseases. TV-110 obtained by the method of the present invention can be used orally, by injection, in the form of suppositories, etc. by a conventional method. Oral preparations may contain various excipients and may be in the form of capsules, tablets, powders, or granules. The injection may be subcutaneous, intramuscular, or intravenous, and may be in the form of a suspension, solution, or powder to be dissolved before use. The injection may also contain a local anesthetic. The dosage of TV-110 obtained by the method of the present invention is appropriately selected depending on the patient's symptoms, but in general, for adults, it is preferable to administer 0.01 to 50 mg/Kg in one to several divided doses a day. Preferred methods include oral, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or injection into the affected area. Next, the present invention will be explained by giving examples and formulation examples. Example 1 (1) 34 g of tryptocase peptone and phyton
6g of peptone, 20g of proteose peptone,
Brain Heart Injection 70g, Yeast Extract 6g, Salt 15g, Glucose 12g, Lactose 10g, L-Cystine
Add 0.5g, sodium sulfite 0.2g, sodium thioglycolate 1.0g, agar 1.4g, pH 7
Add medium 2 adjusted to
Inoculate the pre-culture solution of Alcalescens TF-V [accession number FERM-P No. 5876] at a rate of 100 ml per culture bottle under sterile conditions, and incubate the eggs at 37℃. Perform static culture in a vessel for 48 hours. After culturing, centrifuge the culture solution at 4000 rpm for 20 minutes at 4°C to remove the bacterial cells and remove the supernatant.
I got 1.82. (2) Add ethanol to the supernatant obtained in (1) at 5℃ while stirring.
2.73 and leave in a cold room until the amorphous precipitate is completely settled. Then at 5℃,
Centrifuge at 6000 rpm for 15 minutes and collect the precipitate.
It was washed with ethanol and dried under reduced pressure to obtain about 2.0 g of coarse powder. (3) Dissolve 2.0g of the coarse powder obtained in (2) in 60ml of water,
The water-insoluble matter generated at this time was removed by centrifugation at 7500 rpm for 10 minutes, and the supernatant liquid obtained was removed.
75 ml of a solution obtained by combining the washing solution obtained by washing twice with 1.0 ml of water was dialyzed against distilled water, and the inner solution was freeze-dried to obtain 1.50 g of a whitish gray to light brown powder of TV-110. This material has the following physical and chemical properties. (a) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (b) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 110°C, and significantly decomposes above 200°C. (c) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3500-3300, 2920-2880, 1660-1630,
1550~1520, 1460~1370, 1240~1220, 1120
It has absorption bands near ~1020 and 980 cm -1 (Figure 3). (d) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 is
There is strong absorption at the absorption end, and 247~268n
It shows absorption near m (Figure 4). (e) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
Lowry-Follin reaction was positive. (F) Elemental analysis values C: 37% to 40%, H: 4% to 6%, N: 5
%~7% (g) Sugar content by phenol sulfuric acid method is approximately 45
% to 65% (glucose equivalent), and protein content by Lowry-Follin method is approximately 15%
% to 25% (in terms of bovine serum albumin). Example 2 (1) In one 2-volume culture bottle with screw cap, 34 g of Tryptocase peptone, 70 g of Brain Heart Injection, 6 g of yeast extract, 15 g of table salt, 12 g of glucose,
Lactose 10g, L-cystine 0.5g, Sodium sulfite 0.2g, Sodium thioglycolate
Add 1.0 g of agar and 1.4 g of agar, add medium 2 adjusted to pH 7, autoclave at 120°C for 15 minutes, and then
Veillonella parvula TF-V was immediately cooled with water and precultured in a medium with the same composition.
-1 [Accession number FERM-
P No. 5877)] preculture solution per culture bottle.
ml under sterile conditions and statically cultured in an incubator at 37°C for 120 hours. After culturing, 4
This culture solution was centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes at ℃ to remove the bacterial cells and obtain a supernatant liquid of approximately 1.8 mL. (2) Add ethanol to the supernatant obtained in (1) at 5℃ while stirring.
2.75 and leave at low temperature until the amorphous precipitate is completely settled. Then at 4℃,
Centrifuge at 6000 rpm for 15 minutes and collect the precipitate.
It was washed with ethanol and dried under reduced pressure to obtain about 1.6 g of crude powder. (3) Dissolve 1.6g of the coarse powder obtained in (2) in 50ml of water,
The water-insoluble matter generated at this time was removed by centrifugation at 7500 rpm for 10 minutes, and the supernatant liquid obtained was removed.
65 ml of the solution obtained by washing twice with 1.0 ml of the washing solution was dialyzed against distilled water, and the inner solution was freeze-dried to obtain 1.0 g of white-gray to light brown TV-110 powder. This material has the following physical and chemical properties. (a) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (b) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 110°C, and significantly decomposes above 200°C. (c) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3500-3300, 2920-2880, 1660-1630,
1550~1520, 1460~1370, 1240~1220, 1120
It has absorption bands near ~1020 and 980 cm -1 . (d) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 is
There is strong absorption at the absorption end, and 247~268n
It shows absorption near m (Fig. 6). (e) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
Lowry-Follin reaction was positive. (f) Elemental analysis values C: 38% to 41%, H: 4% to 6%, N: 4
%~6% (g) Sugar content by phenol sulfuric acid method is approximately 45
% to 65% (glucose equivalent), and protein content by Lowry-Follin method is approximately 15%
% to 25% (in terms of bovine serum albumin). Formulation Example 1 5 mg of the powder obtained in Example 1 was filled into a vial. When used, it is dissolved in sterile physiological saline or a solution containing 0.5% lidocaine and used as an injection solution. Formulation Example 2 5 mg of the powder obtained in Example 2 was filled into a vial. When used, it is dissolved in sterile physiological saline or a solution containing 0.5% lidocaine and used as an injection solution.
第１図は本発明で用いるベイロネーラ・アルカ
レツセンスTF−Ｖの形態を示す顕微鏡写真、第
２図は同ベイロネーラ・パルブラTF−Ｖ−１の
形態を示す顕微鏡写真、第３図は実施例１で製造
された本発明の制癌性物質TV−110の赤外線吸
収スペクトル、第４図は同物質の紫外線吸収スペ
クトル、第５図は実施例２で製造された本発明の
制癌性物質TV−110の赤外線吸収スペクトル、
第６図は同物質の紫外線吸収スペクトルを示す。
Figure 1 is a photomicrograph showing the morphology of Veillonella alcalescens TF-V used in the present invention, Figure 2 is a photomicrograph showing the morphology of Veillonella parvula TF-V-1, and Figure 3 is Example 1. 4 shows the ultraviolet absorption spectrum of the anticancer substance TV-110 of the present invention produced in Example 2. FIG. 5 shows the anticancer substance TV-110 of the present invention produced in Example 2. 110 infrared absorption spectra,
FIG. 6 shows the ultraviolet absorption spectrum of the same substance.
Claims (1)
110生産菌を培養して得た培養液又は上清液に親
水性有機溶媒を加えて生ずる沈澱物を採取し、こ
れに水を加えて水不溶物を除去し、次いでこれを
透析又は限外濾過することを特徴とする次の性
状、 (イ) 白灰色〜淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ復水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマ180癌細胞の増殖を阻
止し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920〜2880、1660〜1630、1550〜
1520、1460〜1370、1240〜1220、1120〜1020お
よび980cm-1の近傍に吸収帯を有する。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸
収末端に強い吸収があり、また247〜268nｍの
近傍に吸収を示す。 (ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性。 (チ) 元素分析値 Ｃ：37％〜41％、Ｈ：４％〜６％、Ｎ：４％
〜７％ (リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は約45％
〜65％（グルコース換算）、およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は約15％〜25
％（牛血清アルブミン換算）である。 を有する制癌性物質TV−110の製造法。 ２ 親水性有機溶媒がアルコールである特許請求
の範囲第１項記載の制癌性物質TV−110の製造
法。 ３ 親水性有機溶媒をその濃度が30〜80％（容量
比）になるように培養液又は上清液に加えること
を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記
載の制癌性物質TV−110の製造法。 ４ ベイロネーラ属に属する制癌性物質TV−
110生産菌がベイロネーラ・アルカレツセンスで
ある特許請求の範囲第１〜３項いずれかの項記載
の制癌性物質TV−110の製造法。 ５ ベイロネーラ属に属する制癌性物質TV−
110生産菌がベイロネーラ・パルブラである特許
請求の範囲第１〜３項いずれかの項記載の制癌性
物質TV−110の製造法。[Claims] 1. Anticancer substance belonging to the genus Veillonella TV-
110 A hydrophilic organic solvent is added to the culture solution or supernatant obtained by culturing the producing bacteria, the resulting precipitate is collected, water is added to this to remove water-insoluble materials, and then this is subjected to dialysis or ultrafiltration. The following properties are characterized by filtration: (a) White-gray to light brown powder. (b) It inhibits the proliferation of Ehrlichi condensate carcinoma, Ehrlichi nodular carcinoma, and Sarcoma 180 cancer cells in mice, and has immunostimulatory effects. (c) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (d) It does not show a clear melting point, and begins to decompose at about 110°C, and significantly decomposes above 200°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is
3500~3300, 2920~2880, 1660~1630, 1550~
It has absorption bands near 1520, 1460-1370, 1240-1220, 1120-1020 and 980 cm -1 . (F) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 has strong absorption at the absorption end and also shows absorption in the vicinity of 247 to 268 nm. (g) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction, Anthrone sulfuric acid reaction, indole-hydrochloric acid reaction, and Lowry-Follin reaction were positive. (H) Elemental analysis values C: 37% to 41%, H: 4% to 6%, N: 4%
~7% (li) Sugar content by phenol sulfuric acid method is approximately 45%
~65% (glucose equivalent), and Lowry
The protein content by the phorin method is approximately 15% to 25%.
% (bovine serum albumin equivalent). A method for producing the anticancer substance TV-110. 2. The method for producing the anticancer substance TV-110 according to claim 1, wherein the hydrophilic organic solvent is alcohol. 3. Anticancer properties according to claim 1 or 2, characterized in that a hydrophilic organic solvent is added to the culture solution or supernatant at a concentration of 30 to 80% (volume ratio). Method for producing substance TV-110. 4 Anticancer substance belonging to the genus Veillonella TV-
4. The method for producing the anticancer substance TV-110 according to any one of claims 1 to 3, wherein the 110-producing bacterium is Veillonella alcalescens. 5 Anticancer substance belonging to the genus Veillonella TV-
The method for producing the anticancer substance TV-110 according to any one of claims 1 to 3, wherein the 110-producing bacterium is Veillonella parvula.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022278A JPS57139090A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tv-110, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022278A JPS57139090A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tv-110, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57139090A JPS57139090A (en) | 1982-08-27 |
| JPH0242478B2 true JPH0242478B2 (en) | 1990-09-21 |
Family
ID=12078288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56022278A Granted JPS57139090A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tv-110, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57139090A (en) |
Families Citing this family (1)
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| WO2019157003A1 (en) * | 2018-02-06 | 2019-08-15 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer and immune disorders using veillonella bacteria |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5622279A (en) * | 1979-07-31 | 1981-03-02 | Fujitsu Ltd | Buffer managing system |
-
1981
- 1981-02-19 JP JP56022278A patent/JPS57139090A/en active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5622279A (en) * | 1979-07-31 | 1981-03-02 | Fujitsu Ltd | Buffer managing system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57139090A (en) | 1982-08-27 |
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