JPH0235080A - Novel alcohol acyl transferase and use thereof - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ノイロスポラ属に属する微生物により産生さ
れ、アルコール及び中鎖脂肪酸のＣｏＡ誘導体に作用し
て、中鎖脂肪酸のエステルを生成する新規アルコールア
シルトランスフェラーゼに関する０本発明はさらに、該
酵素の生産能を持つノイロスポラ属の微生物を液体もし
くは固体培地で培養して該酵素を製造する方法にも関す
る。さらにまた、本発明は該酵素を生産する能力を持つ
ノイロスポラ属の微生物を清酒等のアルコール類の製造
に使用して、清酒等に好ましい香りを付与する方法に関
するものでもある。Detailed Description of the Invention (Field of Industrial Application) The present invention is directed to a novel alcohol produced by a microorganism belonging to the genus Neurospora, which acts on alcohol and CoA derivatives of medium-chain fatty acids to produce esters of medium-chain fatty acids. The present invention further relates to a method for producing the enzyme by culturing a Neurospora microorganism capable of producing the enzyme in a liquid or solid medium. Furthermore, the present invention also relates to a method of imparting a desirable aroma to sake, etc., by using microorganisms of the genus Neurospora that have the ability to produce the enzyme in the production of alcohols, such as sake.
（従来の技術）
近年、酒類をはじめとする嗜好飲料に対する消費者の需
要は多様化してきており、香気成分（フレーバー）を含
有する嗜好品が望まれており、合成着香料を用いた嗜好
品も多く販売されている。(Prior art) In recent years, consumer demand for beverages including alcoholic beverages has been diversifying, and luxury products that contain aromatic ingredients (flavors) are desired, and luxury products that use synthetic flavorings are becoming more and more popular. Many are also on sale.
しかし、健康に対する関心が高まっていることから、合
成着香料の使用には消費者の反発が考えられるため、天
然の香気成分を使用することが期待されている。近年、
ピーチ、メロン、バナナ等の香気を生成する微生物が種
々発見されており、これらのフレーバーの組成について
も研究されている（小泉ら；農芸化学会誌、５６，７５
７．１９８２ ； Ｓ、Ｔａｈａｒａ ｅｔ ａｌ
、 Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ−、，３７，２８
５５，１９７３； 特公昭４４−６２１７）。しかし、
これらの生成機構についてはどのような酵素系によるも
のであるかを研究した例が少ない０例えば、微生物の産
生ずる香気成分生成に関与する酵素として、酵母やタラ
トスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）の酢酸イソ
アミルなどの生成に関与するアルコールアセチルトラン
スフェラーゼ及びエステラーゼ等について研究されてい
るに過ぎない（Ｙｏｓｈｉｏｋａ、 Ｋ、 、 Ｈａｓ
ｈｉｓ＋ｏｔｏ、 Ｎ、 、 Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、＋４７．２２８７＋１９８３； Ｙａｍａｋ
ａｗａ、Ｙ、 ｅｔａｌ、＾ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．Ｃｈ
ｅｍ、、４２，２６９，１９７８： ５ｕｏｓａｌａｉ
ｎｅｎ、Ｈ，、Ｊ、Ｉｎ５ｔ、Ｂｒｅｗ、、８７，２９
６．１９８１）−よって、酵母由来以外のアルコールア
シルトランスフェラーゼについては未だ報告がなく、そ
の存在が証明されていない。However, due to the growing concern about health, the use of synthetic flavoring agents is likely to cause consumer opposition, so there are expectations for the use of natural flavoring ingredients. recent years,
Various microorganisms that produce the aromas of peach, melon, banana, etc. have been discovered, and the composition of these flavors is also being studied (Koizumi et al., Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, 56, 75).
7.1982; S, Tahara et al.
, Agric, Biol, Che-, , 37, 28
55, 1973; Special Publication No. 44-6217). but,
There are few studies on the enzymatic system responsible for these production mechanisms.For example, enzymes involved in the production of aroma components produced by microorganisms include the production of isoamyl acetate by yeast and Cladosporium. Only the alcohol acetyltransferase and esterase involved in this have been studied (Yoshioka, K., Has
his+oto, N, , Agric, Biol,
Chem, +47.2287+1983; Yamak
awa, Y, etal, ^gric, Bio1. Ch
em, 42, 269, 1978: 5uosalay
nen, H,,J,In5t,Brew,,87,29
6.1981) - Therefore, there have been no reports yet on alcohol acyltransferases other than those derived from yeast, and their existence has not been proven.
（発明が解決しようとする課題）
そのため、微生物を用いてカプロン酸エチルのような香
気成分を多量に生成させようとしても、前記に示したタ
ラトスポリウムや酵母では香気成分の生成機構の詳細が
不明であること、またその生成量が微量であることから
実用的価値が低い。(Problem to be solved by the invention) Therefore, even if an attempt is made to produce large amounts of aroma components such as ethyl caproate using microorganisms, the details of the production mechanism of aroma components in the aforementioned Talatosporium and yeast are unknown. However, the practical value is low because the amount produced is small.
このような観点から、香気成分を生成する酵素及び香気
成分を多量に生成させる製造方法が望まれている。From this point of view, there is a need for enzymes that produce aroma components and production methods that produce large quantities of aroma components.
（課題を解決するための手段）
そこで、本発明者らは実用的価値をたかめるべく鋭意探
究した結果、香気成分を生成するカビ類に着目し、カビ
の一種であるノイロスポラ属のある菌株がカプロン酸エ
チルのような香気成分を多量に生成することを見出した
。ノイロスポラ属菌のうち、カプロン酸エチルを多量に
産生ずる菌株の選択を行い、ノイロスポラスペシース（
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ、）ＡＴＣＣ４６８９２株
を高カプロン酸エチル産生株として選択した。更に、そ
の香気成分の生成に関与する酵素系を調べることにより
、新規なアルコールアシルトランスフェラーゼが存在す
ることを明らかにし、該酵素の分離、精製に成功した。(Means for Solving the Problems) Therefore, as a result of intensive research to increase its practical value, the present inventors focused on molds that produce aroma components, and found that a strain of the Neurospora genus, a type of mold, was found to be Capron. It was discovered that large amounts of aromatic components such as ethyl acid were produced. Among the Neurospora genus bacteria, strains that produce large amounts of ethyl caproate were selected, and Neurospora specis (
Neurospora sp.) ATCC46892 strain was selected as a high ethyl caproate producing strain. Furthermore, by investigating the enzyme system involved in the production of the aroma component, we revealed the existence of a novel alcohol acyltransferase, and succeeded in isolating and purifying this enzyme.
更に、本菌株を用いて種々の培地でカプロン酸エチルの
生成を検討したところ、モルトエキス培地において最も
多量のカプロン酸エチルを産生させることが可能であり
、同時に該培地における培養により菌体の増殖も増加す
ることが認められ、培養菌体よりアルコールアシルトラ
ンスフェラーゼを大量に採取、精製し、これを利用する
ことにより目的とする香気成分を産生ずることができる
。Furthermore, when we examined the production of ethyl caproate in various media using this strain, we found that it was possible to produce the largest amount of ethyl caproate in malt extract medium, and at the same time, the growth of bacterial cells was improved by culturing in this medium. It has been observed that alcohol acyltransferase increases, and by collecting and purifying a large amount of alcohol acyltransferase from cultured bacterial cells and using it, it is possible to produce the desired aroma component.
また、直鎖状の中鎖脂肪酸のＣｏＡ誘導体に該酵素を作
用させ、それぞれの中鎖脂肪酸に対応したエステルを生
産することにも成功し、本発明を完成した。Furthermore, they succeeded in producing esters corresponding to each medium-chain fatty acid by causing the enzyme to act on CoA derivatives of linear medium-chain fatty acids, thereby completing the present invention.
よって、本発明は新規アルコールアシルトランスフェラ
ーゼ及びその製造方法並びにその用途を提供するもので
ある。Therefore, the present invention provides a novel alcohol acyltransferase, a method for producing the same, and uses thereof.
以下に、本発明により製造される新規アルコールアシル
トランスフェラーゼの物理化学的性質を示す。The physicochemical properties of the novel alcohol acyltransferase produced by the present invention are shown below.
３０作用
エチルアルコールなどの種々のアルコール及びｎ−カプ
ロイルＣｏＡなどの種々の中鎖脂肪酸のＣｏＡ誘導体に
作用し、中鎖脂肪酸のエステルを生成する。30 action It acts on various alcohols such as ethyl alcohol and various CoA derivatives of medium chain fatty acids such as n-caproyl CoA to produce esters of medium chain fatty acids.
ｂ、基質特異性
アシル基の炭素数が４個から１６個のアシルＣｏＡに作
用し、特に６個から１３個のものによく作用する。アセ
チルＣｏＡ、ｎ−プロピオニルＣＯＡ、イソブチリルＣ
ｏＡ及びイソバレリルＣ。b. Substrate specificity Acts on acyl-CoA having 4 to 16 carbon atoms, particularly acyl-CoA having 6 to 13 carbon atoms. Acetyl CoA, n-propionyl COA, isobutyryl C
oA and isovaleryl C.
Ａには作用しないか極めて作用しにくい、アルコールに
対しては、炭素数が１個から８個までの種々のアルコー
ルに作用する。特に、イソブチルアルコールやｎ−ブチ
ルアルコールに対しては、エチルアルコールの場合の３
〜４倍の活性を示す。It does not act on A or has very little effect on alcohol, but it acts on various alcohols having from 1 to 8 carbon atoms. In particular, for isobutyl alcohol and n-butyl alcohol,
~4 times more active.
但し、イソプロピルアルコールに対しては比較的作用し
にくい。However, it is relatively less effective against isopropyl alcohol.
Ｃ６分子量：約３００００ （ゲル濾過法による）ｄ、
至適及び安定ｐＨ
至適ｐＨ８
安定ｐＨ３〜９
Ｃ８至適及び安定温度
至適温度：２５℃
安定温度：４３℃以下
ｆ、阻害剤等の影響
フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）、フッ化フェ
ニールメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）で阻害され、パ
ラクロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）では阻害されない。C6 molecular weight: approximately 30,000 (by gel filtration method) d,
Optimum and stable pH Optimum pH 8 Stable pH 3-9 C8 optimal and stable temperature Optimum temperature: 25°C Stable temperature: 43°C or less (PMSF) and not parachloromercuric benzoate (PCMB).
本発明の酵素は、ノイロスポラ属に属し、前記特性を有
する酵素を生産する微生物を培養し、その培養物から得
ることが出来る。好ましい製造方法の一例を示せば次の
通りである。The enzyme of the present invention can be obtained from a culture of a microorganism that belongs to the genus Neurospora and produces an enzyme having the above characteristics. An example of a preferred manufacturing method is as follows.
スラントに保存しておいたノイロスボラスベシ−Ｘ Ａ
ＴＣＣ４６８９２株をＹＭ培地（１００＋ｌ）を用イテ
３０℃で２日間前培養し、該培養液をガラスフィルター
により濾過後、菌体を集めて蒸留水で洗浄する。さらに
蒸留水を加えて、ホモジナイズした後の菌懸濁液を５％
モルトエキスに蒸留廃液（ＤＳ）を５％添加して調製し
た培地に接種し、３０″Ｃで３〜４日間振とう培養する
０次に１．培養液からガーゼ濾過により菌体を回収し、
凍結乾燥する。Neurosboros Becy stored in the slant
TCC46892 strain was precultured in YM medium (100+l) at 30°C for 2 days, and the culture solution was filtered through a glass filter, and the bacterial cells were collected and washed with distilled water. Furthermore, add distilled water and homogenize the bacterial suspension to 5%.
Inoculate a medium prepared by adding 5% distillation waste (DS) to malt extract and culture with shaking at 30"C for 3 to 4 days. Next 1. Collect the bacterial cells from the culture solution by gauze filtration,
Freeze dry.
凍結乾燥菌体を海砂と共に摩砕し、遠心分離後、無細胞
抽出液（粗酵素）を分離する。粗酵素を後述の実施例で
示すように高速液体クロマトグラフィー等を用いて精製
することにより、精製酵素を得ることができる。The freeze-dried bacterial cells are ground with sea sand, and after centrifugation, a cell-free extract (crude enzyme) is separated. A purified enzyme can be obtained by purifying the crude enzyme using high performance liquid chromatography or the like as shown in Examples below.
なお、ノイロスボラスペシース（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｓｐ、）ＡＴＣＣ４６８９２株は工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌奇策９８８３号（ＦＥＲＭ ｐ
−９８８３）として寄託されている。In addition, Neurospora sp.
sp,) ATCC46892 strain was submitted to the Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology as part of the Microbiology Research Institute No. 9883 (FERM p
-9883).
本発明の酵素を、適当な固体培地で培養したノイロスポ
ラ属の菌から得ることも、可能である。It is also possible to obtain the enzyme of the invention from Neurospora bacteria cultured on a suitable solid medium.
本発明によれば、上記のようにして培養されたノイロス
ポラ属の菌の培養物中に生成した、香気成分を回収して
利用することも出来、あるいは清酒のようなアルコール
飲料その他の醸造製品の製造工程に、ノイロスポラ属の
菌を使用して、目的の製品に直接香気を付与することも
可能である。According to the present invention, the aroma components produced in the culture of Neurospora bacteria cultivated as described above can be recovered and used, or can be used in alcoholic beverages such as sake and other brewed products. It is also possible to use Neurospora bacteria in the manufacturing process to directly impart flavor to the desired product.
〔香気成分の回収１分析方法〕
培養液からの香気成分の回収は、まず、培養液を０．４
５μ糟のメツシュで濾過する。濾過液２ｍｌに対してＮ
ａＣ１０，５ｇ 、酢酸エチル又はペンタン、ヘキサン
、エーテルペンタン等を０６５１加えた後、溶媒抽出法
によって行う、培養液中の香気成分の分析は、該培養液
を食塩飽和下で酢酸エチルを加え、酢酸エチル眉のガス
クロマトグラフィー（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ８３２
０８Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈ）により測定する。[Recovery of aroma components 1 Analysis method] To recover aroma components from the culture solution, first, the culture solution is diluted with 0.4
Filter through a 5μ mesh. N for 2 ml of filtrate
After adding 10.5 g of aC, 0651 ethyl acetate or pentane, hexane, etherpentane, etc., the aroma components in the culture solution are analyzed by the solvent extraction method. Ethyl eyebrow gas chromatography (PERKIN-ELMER832
08Capillary Gas Chromatog
raph).
分析条件；カラム； ＤＢ−ＷＡＸ、 ｔ ０．３２
ｍｌＩｘ３０ｃｍカラム温度；５５℃→２１０−Ｃ
注入、検出温度；２４０℃
キャリヤー：Ｈｅ
流速： １．Ｏｍｌ／ ｓｉｎ （スブリフト比
： １／２０）サンプル量：２μｌ
この方法により分析した結果、カプロン酸エチルが多く
生産されていた（第１図参照）。Analysis conditions; Column; DB-WAX, t 0.32
mlIx30cm column temperature: 55°C → 210°C Injection, detection temperature: 240°C Carrier: He Flow rate: 1. Oml/sin (Sublift ratio
: 1/20) Sample amount: 2 μl As a result of analysis using this method, a large amount of ethyl caproate was produced (see Figure 1).
なお、固体培養を行うことによっても該エステルが多量
に生産された。こうして固体又は液体培養のものより蒸
散したエステルは、冷却法によりドレインとして回収す
る方法、活性炭やボラバック、テナックスなどのポリマ
ーに吸着させて回収する方法（伊藉清ら、 Ｊ、 Ｂｒ
ｅｗ、 Ｓａｃ、 Ｊａｐａｎ、 ８１（３） １８５
−１８８ （１９８６）、１． Ｙａｊｉｍａら、 Ａ
ｇｒｉｃ、 Ｂｊｏｔ、 Ｃｈｅｗ、、 ４５（２）、
３７３−３７７（１９８１）および溝口晴彦ら、 Ｊ
、 Ｂｒｅｗ、 Ｓｏｃ、 Ｊａｐａｎ、 ７９（３）
、 １９８−２０１（１９８４）） 、培養容器内部の
ガスを循環させることによりコンデンサーに集積・回収
する方法（Ｋ、 ５ａｔｏら、 Ｊ、 Ｆｅｒｍｅｎｔ
、 Ｔｅｃｈｎｏｌ、、 ６６（２）、 １７３−１
８０（１９８８））などで分別可能と思われる。Note that the ester was also produced in large amounts by performing solid-state culture. The ester evaporated from the solid or liquid culture can be recovered as a drain using a cooling method, or by adsorption to activated carbon, Borabac, Tenax, or other polymers (Kiyoshi Igo et al., J, Br.
ew, Sac, Japan, 81(3) 185
-188 (1986), 1. Yajima et al., A.
gric, Bjot, Chew,, 45(2),
373-377 (1981) and Haruhiko Mizoguchi et al., J
, Brew, Soc, Japan, 79(3)
, 198-201 (1984)), a method of collecting and collecting gas in a condenser by circulating gas inside a culture container (K, 5ato et al., J, Ferment
, Technol, 66(2), 173-1
80 (1988)).
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to Examples.
ノイロスボラスペシース（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ
） Ａ↑（：０４６８９２株は培養液中に洋梨様のフレ
ーバーを生成するが、この主成分は前記の分析方法によ
り分析したところカプロン酸エチルであった。そこで、
本菌株を用いてカプロン酸エチルを最も多く生産させる
方法として、各種の培地について検討したところ、第１
表及び第２図に示すように、モルトエキス培地がエステ
ルの生成に好適であった。この結果に基づき更に生産条
件を検討したところ、５％モルトエキスにモルトウィス
キー蒸留廃液を５％になるように添加した培地を作製し
、３０°Ｃで培養すると最も多量のカプロン酸エチルが
得られた。Neurospora sp.
) A↑(: The 046892 strain produces a pear-like flavor in the culture solution, and the main component of this was analyzed using the above analysis method and was found to be ethyl caproate.
As a method for producing the highest amount of ethyl caproate using this strain, we investigated various media and found that
As shown in the table and FIG. 2, malt extract medium was suitable for ester production. Based on this result, we further examined the production conditions and found that the highest amount of ethyl caproate could be obtained by creating a medium containing 5% malt extract and adding 5% malt whiskey distillation waste and culturing it at 30°C. Ta.
第１表 培地組成とカプロン酸エチル生成モルトエキス
＋ウィスキー莫留廃液
モルトエキス
ツアペック培地
フォーゲル培地（麦芽Ｉり
（蔗ＩＩり
実施例２ 籠案皇太１跨墨
多量のカプロン酸エチル及びアルコールアシルトランス
フェラーゼを得るために大量培養を行った。すなわち、
本菌株を５％モルトエキス培地で３０度で２日間培養し
た前培養液３００１を５ ｗ ／ ｖ％モルトエキスに
モルトウィスキー蒸留廃液が５％になるように添加して
調製した５０１の培地を滅菌したものに接種し、ジャー
ファーメンタ−を用いて３０℃で２日間通気撹拌した。Table 1 Medium composition and ethyl caproate production Malt extract + Whiskey distillation waste malt extract Zapek medium Vogel medium A large scale culture was carried out to obtain the transferase, i.e.
This strain was cultured in a 5% malt extract medium at 30 degrees for 2 days.The pre-culture solution 3001 was prepared by adding 5 w/v% malt extract to 5% malt whiskey distillation waste liquid, and the 501 medium was sterilized. The mixture was inoculated into a jar fermenter and aerated and stirred at 30°C for 2 days.
培養終了後、培養液をガーゼを用いて濾過し２、約４５
１のカプロン酸エチル（４８ρｐｊｉ）を含有する香気
成分含有液と５８５ｇ （ｉ重Ｊｉ）の菌体が得られた
。この菌体を破砕して該酵素を含有する無細胞抽出液が
蛋白質として１５ｇ得られた。この収量は実験室レベル
の収量より若干おとるが、大量培養でも目的とする培養
液及び培養菌体が得られることが確認された。After culturing, the culture solution was filtered using gauze.
A flavor component-containing liquid containing 1 ethyl caproate (48 pji) and 585 g (i heavy Ji) of bacterial cells were obtained. By disrupting the bacterial cells, 15 g of protein was obtained as a cell-free extract containing the enzyme. Although this yield was slightly lower than the yield at the laboratory level, it was confirmed that the desired culture solution and cultured cells could be obtained even in large-scale culture.
菌体からの粗酵素のｍ製は、培養液（４００ｍｌ）から
菌体を回収・洗浄後（菌体湿重量５〜６ｇ）、凍結乾燥
した。乾燥菌体１ｇに０．０１１メルカプトエタノール
含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） １０ｍｌ
と海砂１０ｇを加え乳鉢中で摩砕する。懸濁液を６５０
ｘｇ、５分間の遠心分離で海砂、未破砕菌体を除いた後
、超遠心分離（１１０５０００ｘ、４０分間）を行い、
その上澄を粗酵素液（無細胞抽出液：ＣＦＥ）として用
いた０次に、カプロン酸エチル合成酵素の活性測定を以
下の方法で行った。すなわち、基質として９９．５χエ
タノール１０μ１１カプロイルＣｏ Ａ （１６，６涌
ｇ／ｍｌ） １０μｌを用い、ＣＦＥ５０μ！、０．０
５Ｍリン酸バフファー（ｐＨ７，５） １９０１１１を
加えて全量を２６０μｌとした後、２５℃で３０分間反
応させた。反応終了後、酢酸エチル（カプロン酸メチル
６０．４ｐｐｍ含有）１２５μｍを加え、酢酸エチル層
に含有される生成カプロン酸エチルをガスクロマトグラ
フィーにより測定した。酵素活性は、２５℃、１時間の
反応において１７７ｇのカプロン酸エチルを生成する場
合を１単位とする。To prepare the crude enzyme from the bacterial cells, the bacterial cells were collected from the culture solution (400 ml), washed (wet weight of the bacterial cells 5 to 6 g), and then freeze-dried. 10 ml of 0.05M phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.011 mercaptoethanol per 1 g of dry bacterial cells
Add 10g of sea sand and grind in a mortar. suspension at 650
After removing sea sand and unbroken bacterial cells by centrifugation at xg for 5 minutes, perform ultracentrifugation (1105000x for 40 minutes)
Using the supernatant as a crude enzyme solution (cell-free extract: CFE), the activity of ethyl caproate synthase was measured by the following method. That is, using 10 μl of 99.5× ethanol and 10 μl of 11 caproyl Co A (16.6 g/ml) as a substrate, CFE 50 μl! , 0.0
After adding 5M phosphate buffer (pH 7.5) 190111 to make the total volume 260 μl, the mixture was reacted at 25° C. for 30 minutes. After the reaction was completed, 125 μm of ethyl acetate (containing 60.4 ppm of methyl caproate) was added, and the produced ethyl caproate contained in the ethyl acetate layer was measured by gas chromatography. Enzyme activity is defined as one unit when 177 g of ethyl caproate is produced in a reaction at 25° C. for 1 hour.
なお、この酵素活性は飽和食塩存在下で阻害されること
なく、むしろ活性が促進された。これは、通常の酵素の
場合とはことなり、この点からも、本酵素の新規性が示
唆される。Note that this enzyme activity was not inhibited in the presence of saturated sodium chloride, but rather was promoted. This is different from the case of ordinary enzymes, and this point also suggests the novelty of this enzyme.
実施例４ ｎ粟夏見在挫
酵素の局在性については、実施例１で示した方法により
培養して得られた菌体を海砂とともに摩砕し、海砂、未
破砕菌体等を除いて得た液を超遠心骨！ （１０５００
ｘｇ、 ４０分間）を行い、上澄と沈澱部に分画して検
討した。各部における酵素活性は、実施例３で示した方
法により行った。結果は、上澄部に約８７％、沈澱部に
約１３％存在しており、該酵素は細胞質に存在している
と考えられる（第２表）。Example 4 Regarding the localization of the n Awanatsumi strain enzyme, the bacterial cells obtained by culturing according to the method shown in Example 1 were crushed together with sea sand, and the sea sand, uncrushed bacterial cells, etc. were removed. Ultracentrifuged bone with the obtained liquid! (10500
xg for 40 minutes), and the supernatant and precipitate were fractionated and examined. Enzyme activity in each part was determined by the method shown in Example 3. The results showed that about 87% of the enzyme was present in the supernatant and about 13% was present in the precipitate, suggesting that the enzyme was present in the cytoplasm (Table 2).
第２表
百分 合成ＥｔＯＣａｐ （ｐＧｉｍｌ） 比
率（％）上清 ６．１３
８７．２
沈”Ｓ Ｏ，９０
１２，８
実施例５ の ・ ・
酵素の分離・精製は実施例４で得た上澄について行った
。まず、上澄部（粗酵素）をＴＳＫゲルブチルトヨバー
ルを用いたカラムクロマトグラフィにより精製した（吸
着； １０ｍＭ ）リス塩酸ｐＦＩ８．０．４０％飽和
硫安含有、溶出条件；４０％飽和−〇％硫安濃度勾配）
、ブチルトヨパールで一部精製された活性区分を更に高
速液体クロマトグラフィーにより精製した。すなわち、
ＴＳにゲルフェニル５Ｐ１４を用いた疎水クロマト（同
上の吸着及び溶出条件）により精製し、活性区分をＴＳ
ＫゲルＤＥＡＥ ５ＰＩＪを用いたイオン交換クロマト
（吸着； １０ｍＭ ）リス塩酸ｐＨ８，０、溶出条件
； １０ｍＭ ）リス塩酸０−ＩＭ食塩濃度勾配等）に
より精製した０以上のようにして高速液体クロマトグラ
フィーにおいて各処理ステップを繰り返し、ゲル電気泳
動により単一バンドとして目的とする酵素が得られた（
第３図参照）なお、本酵素の分子量はゲル濾過法により
約３万と決定された。Table 2 100% Synthetic EtOCap (pGiml) Ratio (%) Supernatant 6.13 87.2 Sediment SO, 90 12,8 Example 5 Separation and purification of the enzyme was performed using the supernatant obtained in Example 4. First, the supernatant (crude enzyme) was purified by column chromatography using TSK Gel Butyl Toyovar (adsorption: 10 mM) Lis-HCl pFI8.0.40% saturated ammonium sulfate content, elution conditions: 40% Saturation - 〇% ammonium sulfate concentration gradient)
The active fraction partially purified with butyltoyopearl was further purified by high performance liquid chromatography. That is,
TS was purified by hydrophobic chromatography using gel phenyl 5P14 (adsorption and elution conditions as above), and the active fraction was purified using TS.
Purified by ion exchange chromatography using K-Gel DEAE 5PIJ (adsorption; 10mM) Lis-HCl pH 8.0, elution conditions; 10mM) Lis-HCl (0-IM NaCl concentration gradient, etc.) and high performance liquid chromatography as above. Each treatment step was repeated and the desired enzyme was obtained as a single band by gel electrophoresis (
(See Figure 3) The molecular weight of this enzyme was determined to be approximately 30,000 by gel filtration.
実施例６ 基１立１１ 前記の分析機器及び方法により各種アシルＣ。Example 6 Group 1 Stand 11 Various acyl Cs can be obtained using the analytical equipment and method described above.
Ａに対する基質特異性を検討したところ、アシル基の炭
素数が４個から１６個のアシルＣｏＡに作用し、特に６
個から１３個のものによく作用した。When we examined the substrate specificity for A, we found that it acts on acyl-CoA whose acyl group has 4 to 16 carbon atoms, and in particular, 6
It worked well on 1 to 13 items.
また、アセチルＣｏＡやｎ−プロピオニルＣｏＡを基質
とする場合は、そのエステルは検出できなかったので、
全く作用しないか極めて作用しに（いものと考えられる
。また、分枝状のアシルＣ。In addition, when acetyl-CoA or n-propionyl-CoA was used as a substrate, the ester could not be detected.
It is considered to have no effect at all or very little effect.Also, branched acyl C.
ＡであるイソブチルＣｏＡ及びイソバレリルＣ。A, isobutyl CoA and isovaleryl C.
Ａに対しても同様に作用しないか極めて作用しにくいも
のであった（第３表、第４図）。Similarly, it did not work or had very little action on A (Table 3, Figure 4).
第３表 基質特異性（種々のアシルＣｏＡ）７セチルＣ
Ｏ＾ ２
ｎ−プロピオニｌ、ＣｏＡ ３ｎ−ブチリルＣ
ｏＡ ４
イソブチリルＣｏ＾ ４
ｎ−ヴアレリルＣｏＡ ５
イソヴ７レリルＣｏＡ ５
ｎ−ｈブａイルＣｏＡ ６
ｎ−エナシトイルＣｏＡ ７
Ｏ（ｐＨ）０（χ）
１３．３ ２１．７
１７．９ ２９．２
６１．２ １００
ロー力ブリリルＣｏＡ
ｎ−ノナノイルＣｏＡ
ｎＪプリルＣｏ＾
クンｆｋノイルＣｏＡ
ラウロイルＣｏ＾
ｎ−）すｆカッイルＣｏＡ
ミリストイルＣｏＡ
ｎ−ペンタｆカッイルＣｏ＾
バルミトイルＣｏＡ
４９．８
ＩＯ１５
３，８７
３，１０
８１，４
エフ、２
６．３２
５．０フ
ルコール以外にも、炭素数が１個から８個までのアルコ
ールに対して作用性が認められ、特に、イソブチルアル
コールやｎ−ブチルアルコールに対しては、エチルアル
コールの場合の３〜４倍の活性を示した。但し、イソプ
ロピルアルコールに対しては比較的作用しにくかった（
第４表参照）。Table 3 Substrate specificity (various acyl-CoAs) 7 cetyl C
O^ 2 n-propionyl, CoA 3n-butyryl C
oA 4 Isobutyryl Co^ 4 n-Valeryl CoA 5 Isobutyryl CoA 5 n-h Butyryl CoA 6 n-Enacytoyl CoA 7 O (pH) 0 (χ) 13.3 21.7 17.9 29.2 61 .2 100 Low force Brylyl CoA n-nonanoyl CoA nJ Pryl Co＾ Kunfk Noyl CoA Lauroyl Co＾ n-) Suf Kyl CoA Myristoyl CoA n-Penta F Kyl Co＾ Valmitoyl CoA 49.8 IO15 3,87 3,10 81.4 F, 2 6.32 5.0 In addition to flucol, it has been found to have activity against alcohols with carbon numbers from 1 to 8, and is particularly active against isobutyl alcohol and n-butyl alcohol. , showed 3 to 4 times the activity of ethyl alcohol. However, it was relatively less effective against isopropyl alcohol (
(See Table 4).
一方、種々のアルコールに対しては、
エチルア
第４表
基質特異性（種々のアルコール）
メチルアルコール
エチル７３コール
ｎ−プロとルアルゴー旙
イソプロピル７８ゴール
ｎ−ブチルアルコール
イソブチルアルコール
ｎ−７ミルフルゴール
イソ７ミルフルゴール
ｎ−へキシルアルゴール
ｎ−へブチルアルコール
ｎ−オクチルフルフール
ｎ−エチｌＴへネジルア蓚スール
１２３ （μ門）
４８．５
４３．７ １
１０．８
Ｉ４６ ＃
２０７＃
１１１”
１２８＃
９３＊＊
３１−２＃
１１．６”
２７．４”
２６０ （８Ｍ）
１２１ ＊
３５．１
４３２稀
５２７＃
３１９”
２７４榊
２４１ 榊
８０．４榊
２６．８”
７３．５”
＃１％トライトンＸ−１００存在下で反応後補正した（
直
実施例７１且夏ｌ豊
酵素活性に及ぼすｐＨの影響を調べるために、ｐＨの幅
を３〜９とし、その活性を測定したところ、第５図に示
すように至適ＰＩ（は８．０であった。また、ＰＨ安定
性については、３〜９の広い範囲で活性は維持されてい
た。On the other hand, for various alcohols, Ethyl alcohol Table 4 Substrate specificity (various alcohols) Methyl alcohol Ethyl 73 call n-pro and Rualgo Asahi isopropyl 78 alcohol n-Butyl alcohol Isobutyl alcohol n-7 milfulgol Iso7 milful Gol n-hexyl algol n-hebutyl alcohol n-octylfurfur n-ethyl T henezyl alcohol 123 (μ) 48.5 43.7 1 10.8 I46 # 207 # 111" 128 # 93** 31-2# 11.6"27.4" 260 (8M) 121 * 35.1 432 rare 527# 319" 274 Sakaki 241 Sakaki 80.4 Sakaki 26.8"73.5"#1% Triton X-100 Post-reaction correction in the presence of (
Direct Example 71 In order to investigate the influence of pH on enzyme activity, the pH range was set to 3 to 9 and the activity was measured. As shown in FIG. 5, the optimum PI (8. The pH stability was 0. Furthermore, the activity was maintained within a wide range of 3 to 9 with respect to pH stability.
実施例８１度傅Ｕ
酵素活性に及ぼす温度の影響については、第６図に示す
ように作用至適温度は２５℃であった。また熱安定性に
ついては、４３℃までは安定であったが４５℃以上では
失活した。Example 81 Regarding the influence of temperature on enzyme activity, the optimum temperature for action was 25°C, as shown in Figure 6. Regarding thermal stability, it was stable up to 43°C, but lost its activity above 45°C.
実施例９ 里亙ヱ坐ｌ豊
各種阻害剤の酵素活性に及ぼす影響に“ついての結果を
第５表に示す、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ
）やフッ化フェニールメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）
で阻害されることより、活性部位にセリン残基を有する
酵素と考えられる。今までにセリフ酵素としてプロテア
ーゼ、エステラーゼ、エラスターゼなどが知られている
が、トランスフェラーゼでは見つかっていない。また、
パラクロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）では阻害されない
ことからＳＨ酵素ではないと考えられ、酵母のアルコー
ルアシルトランスフェラーゼとは異なっている。これら
のことから本酵素は新規な酵素であることが示唆される
。Example 9 Table 5 shows the effects of various inhibitors on the enzyme activity of diisopropyl fluorophosphate (DFP).
) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
This suggests that the enzyme has a serine residue in its active site. So far, proteases, esterases, and elastases are known as serif enzymes, but no transferases have been found. Also,
Since it is not inhibited by parachloromercuric benzoate (PCMB), it is considered not to be an SH enzyme, and is different from yeast alcohol acyltransferase. These findings suggest that this enzyme is a novel enzyme.
第５表旦割ｍ
阻害剤
無添加
ＤＦＰ（２，８６ｍＭ）
ＰＭＳＦ（３，４５曽Ｍ）
ＰＣＭＢ（０，３２ｍＭ）
無添加
ＤＦＰ （２，８６劇旧
ＰＭＳＦ（３，４５ｓＭ）
ＰＣＭＢ（０，３２鴇Ｍ）
反応時間
３０分
３０分
３０分
３０分
６０分
６０分
６０分
６０分
カブロン酸エチル生成量
７．４８ （ｐｐ饋）
０．２７４
０．３０８
８．５３
８．９６
０．２４７
０．６０１
９．３９
阻害率
０（ヱ）
９６．３
９５．９
１４．０
９７．２
９３．３
４．８０
実施例ＩＯエスー−−ゼ の ９
本酵素はエチルアルコールとカプロイルＣｏＡからカプ
ロン酸エチルを生成させるが、エステラーゼはエチルア
ルコールとカプロン酸からカプロン酸エチルを生成する
ものである。そこで、カプロン酸エチルの生成に菌体の
もついずれの酵素が太き（寄与しているかを調べるため
に基質のモル濃度を同一（カプロイルＣｏＡまたはカプ
ロン酸；７．３ｓＭ、エタノール； ６５９ａ＋Ｍ）に
してＣＦＥと共にそれぞれの酵素に適したｐＨで２５℃
、１時間反応させた。カプロン酸エチル生成に対する寄
与率はアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴａ
ｓｅ）の方が約９８％と圧倒的に高かった。これより、
菌体内においても、該酵素がカプロン酸エチルの生成に
大きく関与していることが示唆された（第６表）。Table 5 DFP without inhibitor (2,86mM) PMSF (3,45sM) PCMB (0,32mM) DFP without inhibitor (2,86 times old PMSF (3,45sM) PCMB (0,32 Reaction time 30 minutes 30 minutes 30 minutes 30 minutes 60 minutes 60 minutes 60 minutes 60 minutes Ethyl cabroate production amount 7.48 (pp) 0.274 0.308 8.53 8.96 0.247 0. 601 9.39 Inhibition rate 0 (ヱ) 96.3 95.9 14.0 97.2 93.3 4.80 Example IO S--9 This enzyme converts ethyl caproate from ethyl alcohol and caproyl-CoA. However, esterase produces ethyl caproate from ethyl alcohol and caproic acid.Therefore, in order to find out which enzyme of the bacterial cell contributes to the production of ethyl caproate, the substrate with CFE at the same molar concentration (caproyl-CoA or caproic acid; 7.3 sM, ethanol; 659a+M) at a pH appropriate for each enzyme at 25°C.
, and reacted for 1 hour. The contribution rate to ethyl caproate production is alcohol acyltransferase (AATa).
se) was overwhelmingly higher at approximately 98%. Than this,
It was suggested that this enzyme is also greatly involved in the production of ethyl caproate within the bacterial cells (Table 6).
第６表
１ ＡＡＴａｓｅ ４８．５
９７．９２ エステラーゼ １．０５
２．１実施例１１ のノイロスポラ に
ニス−各種のノイロスポラ属菌について香気成分の生成
を調べた。使用した菌株はＮｅｕｒｏｉｐｏｒａ ｃｒ
ａｓｓａｒＦｏ ６０６７、同６０６８、同６１７８、
同６９６６、同６９７７、同６９７８、Ｎｅｕｒｏｓｐ
ｏｒａ ５ｉｔｏｐｈｉｌａ ＩＦｏ ４５９６、同６
０６９、同６０７０及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｔｅｔ
ｒａｓｐｅｒｍ ｒＦｏ ６９８２であった。これらの
菌株の中でＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ５ｉｔｏｐｈｉｌａ
ＩＦＯ４５９６、同６０７０及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｔａｔｒａｓｐｅｒｍＩＦＯ６９８２に、同時に培養
していたＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ Ｓｐ。Table 6 1 AATase 48.5
97.92 Esterase 1.05
2.1 Example 11 Neurospora
Varnish: The production of aroma components of various Neurospora bacteria was investigated. The strain used was Neuroipora cr.
assarFo 6067, 6068, 6178,
6966, 6977, 6978, Neurosp
ora 5itophila IFo 4596, same 6
069, 6070 and Neurospora tet
It was rasperm rFo 6982. Among these strains Neurospora 5itophila
IFO4596, IFO6070 and Neurospora
Neurospora Sp was cultured at the same time on tatrasperm IFO6982.
ＡＴＣＣ４６８９２株の生成量よりも低いものであった
が、香気成分の生成が認められた。Although the production amount was lower than that of ATCC46892 strain, production of aroma components was observed.
ノイロスポラスペシーズ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ
）ＡＴＣＣ４６８９２株は、液体培地のみならず固体培
地でもカプロン酸エチルを生産すると思われた。そこで
、固体培地としてα米、ふすま、コーングリッツおよび
ビール粕を用いてフェルンバッハフラスコ中で培養を行
った。Neurospora sp.
) ATCC46892 strain seemed to produce ethyl caproate not only in liquid medium but also in solid medium. Therefore, culture was performed in a Fernbach flask using α rice, bran, corn grits, and beer lees as solid media.
フェルンバッハフラスコに種々の液体培地を３０〜５０
■Ｉ加え、その中に本菌株の胞子を一白金線接種して懸
濁させた後、α米１００ｇを添加してよく混合した。培
養は３０℃に静置して行い、各日数にヘッドスペース中
に生成された香気成分を、吉沢淑。Fill a Fernbach flask with 30-50 mL of various liquid media.
(1) After inoculating the spores of this strain into the mixture with a platinum wire and suspending them, 100 g of α-rice was added and mixed well. Cultivation was carried out by standing at 30°C, and the aroma components produced in the headspace were collected on each day by Yoshizawa Yoshizawa.
Ｊ、 Ｓｏｃ、 Ｂｒｅｗ、 Ｊａｐａｎ、 ６８（１
）、 ５９−６１ （１９７３）のヘッドスペース法に
準じて、ガスクロマトグラフィー分析した（島原製作所
ＧＣ−４ＣＭ（ＰＦ） 、カラム；１０％ＤＮＰ＋ ｌ
ｓ＋、 Ｃａｒｒｉｅｒ； Ｎｔ、カラム温度；７５℃
、 Ｉｎｊｅｃｔｏｒ温度；１２０°Ｃ１注入１ ；
３ 優１） 、この分析値を同様にして得られたカプロ
ン酸エチル標準溶液での分析値にあてはめて、本菌株に
より生産されたカプロン酸エチルを定量した。J, Soc, Brew, Japan, 68(1
), 59-61 (1973), gas chromatography analysis was performed according to the headspace method (Shimabara Seisakusho GC-4CM (PF), column; 10% DNP + l
s+, Carrier; Nt, column temperature; 75°C
, Injector temperature; 120°C1 injection 1;
3) Ethyl caproate produced by this strain was quantified by applying this analytical value to the analytical value of an ethyl caproate standard solution obtained in the same manner.
その結果、第７表に示すとおり、特にα米において多量
のカプロン酸エチルが生成した。As a result, as shown in Table 7, a large amount of ethyl caproate was produced especially in α rice.
第７表
α米
ｔｏＯ〜２００ ｐｐｍ
ふすま
０ｐｐｍ
コーングリッツ
検出せず
上記（１）の固体培養で、菌株を懸濁させるときに用い
た液体培地（製麹水）の種類とカプロン酸エチル生成量
との関係を第７図に示す０図中、Ａ〜Ｄはそれぞれ、固
体培地（α米１００ｇ）とともに５％モルトエキス培地
３（１＋１、同培地４０＊Ｉ。Table 7 α Rice to O ~ 200 ppm Bran 0 ppm Corn grits not detected In the solid culture described in (1) above, the relationship between the type of liquid medium (malt water) used to suspend the strain and the amount of ethyl caproate produced. The relationship is shown in Figure 7. In Figure 0, A to D are solid medium (100 g of α rice) and 5% malt extract medium 3 (1+1, same medium 40*I).
糖を含まない改変ツアペック培地４０ｍ１．および糖を
含まないフォーゲル最少培地４０１が、製麹水に用いら
れた場合のカプロン酸エチルの生成量を培養日数ととも
に示す。これらの中では、Ｃの改変ツアペック培地が最
適であった。40 ml of sugar-free modified Czapek medium. The amount of ethyl caproate produced when Vogel's minimal medium 401, which does not contain sugar, is used for koji making water is shown together with the number of culture days. Among these, the modified Czapek medium of C. was the best.
（３）豆皮■皿皇影豊
上記（２）の試験により、外部から糖が供給されないほ
うが、カプロン酸エチルの生産量が多くなることが示唆
されたが、さらに糖の種類を変えて製麹水（改変ツアペ
ック培地を使用した）に３種類の糖を各３％含ませた場
合について、７日間培養後に比較試験を行った。その結
果第８表に示すとおり、糖の種類によりカプロン酸エチ
ルの生成量に大差はな（、むしろ糖無添加、すなわち、
α米中の糖を単一糖源とした場合に生成量が多かった。(3) Bean Peel ■ Sarao Eiho The test in (2) above suggested that the amount of ethyl caproate produced was higher when sugar was not supplied from the outside, but it was also A comparative test was conducted after culturing for 7 days in a case where koji water (using a modified Zuapek medium) contained 3% each of three types of sugar. As a result, as shown in Table 8, there is no significant difference in the amount of ethyl caproate produced depending on the type of sugar (in fact, no sugar is added, i.e.,
The amount produced was large when the sugar in α rice was used as the sole sugar source.
なお、カプロン酸エチルの定量は、ヘッドスペース法の
他に、以下に記載するキャピラリー法で固体培養物（麹
）中のカプロン酸エチルについても測定を行った：即ち
、本菌株を培養した固体培養物２０．を５００ ｍｌ容
分液ロートに入れ、ＮａＣ１１３８ｇおよび遺留水１０
０ｍ１を添加し、時々撹拌しながら、室温で１時間放置
した。酢酸エチルを５０Ｉｌｌ添加して１時間振盪した
後、その一部をとって遠心分離した。上澄を０．５１
とり、内部標準として５０．４ｐｐ−のカプロン酸メチ
ルを含む酢酸エチルを１００μｌ追加混合した。生じた
上清（有機溶媒層）４μｍをメガポアカラムで分析した
。なお、温度条件は、７０℃で３分間保持後、毎分１０
℃昇温で１００℃まで上げ、以後毎分２０℃昇温で２０
０″Ｃまで上昇させ、９分間保持した。For quantitative determination of ethyl caproate, in addition to the headspace method, ethyl caproate in the solid culture (koji) was also measured by the capillary method described below. Thing 20. into a 500 ml separatory funnel, add 1138 g of NaC and 10 g of residual water.
0ml was added and left at room temperature for 1 hour with occasional stirring. After adding 50 Ill of ethyl acetate and shaking for 1 hour, a portion was taken and centrifuged. 0.51 of supernatant
Then, 100 μl of ethyl acetate containing 50.4 pp- of methyl caproate was added as an internal standard. 4 μm of the resulting supernatant (organic solvent layer) was analyzed using a megapore column. The temperature conditions are as follows: After holding at 70℃ for 3 minutes,
Raise the temperature to 100℃ by increasing the temperature, then increase the temperature by 20℃ per minute to 20℃.
The temperature was increased to 0″C and held for 9 minutes.
第８表
１ 無添加 １１１ １６．５２ グル
コース ９５．０ １０．７３ スクロース
７４．７ １０．３４ マルトース ９
５．４ １２．８第８図に示すとおり、製麹水の
使用量は３０〜４０ｍ１がよく、製麹水が少ないほど菌
の増殖は抑えられるが、培養日数とともにカプロン酸エ
チルの増加が認められた。Table 8 1 No additives 111 16.52 Glucose 95.0 10.73 Sucrose 74.7 10.34 Maltose 9
5.4 12.8 As shown in Figure 8, the amount of koji-making water used is preferably 30 to 40 ml, and the less koji-making water is used, the more the growth of bacteria is suppressed, but ethyl caproate increases with the number of culture days. It was done.
さらに、第９表に示すとおり、製麹水の量が多くなるｔ
カプロン酸エチル量が城少し、副生成物であるイソアミ
ルアルコールの量が増加する１頃向が見られた。Furthermore, as shown in Table 9, the amount of koji making water increases.
A trend was observed in which the amount of ethyl caproate decreased slightly and the amount of isoamyl alcohol, a by-product, increased.
（キャピラリー法）
製麹水として改変ツアペック培地を使用し、製麹水の使
用量（上記（１）の培養系あたり３０ｍ１．１１０１お
よび５０１）と、カプロン酸エチルおよび目的としない
副生成物の生成量との関係を検討した。(Capillary method) A modified Zuapek medium was used as the koji making water, and the amount of koji making water used (30 ml per culture system in (1) above) and the production of ethyl caproate and unintended by-products were determined. The relationship with quantity was investigated.
２２、３
９、６８
３、１５
１６、７
４８、３
７４、８
さらに、カプロン酸エチルの生成に好ましい窒素源を検
討するため、上記（３）の試験における糖無添加の条件
で、種々の窒素源を窒素量で０．０５％添加して、カプ
ロン酸エチルの生成量を検討した。22, 3 9, 68 3, 15 16, 7 48, 3 74, 8 Furthermore, in order to investigate the preferred nitrogen source for the production of ethyl caproate, various tests were conducted under the conditions of no sugar addition in the test (3) above. A nitrogen source was added at a nitrogen amount of 0.05%, and the amount of ethyl caproate produced was examined.
その結果、第１０表に示すとおり、リン酸塩または硫酸
塩のアンモニア窒素が、好ましい結果を与えた。As a result, as shown in Table 10, phosphate or sulfate ammonia nitrogen gave preferable results.
チルのもろみへの移行または生成の程度を調べた。The degree of transfer or generation of chill to mash was investigated.
方法は、雑波ら、 Ｊ、 Ｂｒｅｗ、 Ｓａｃ、 Ｊａ
ｐａｎ、−Ｖｏｌ、７３（Ｎｏ、４）、 ２９５−３０
０ （１９７Ｂ）に記載されている小仕込試験法によっ
た。基本仕込配合は、次のとおりである。The method is described by Zunami et al., J. Brew, Sac, Ja.
pan, -Vol, 73 (No, 4), 295-30
According to the small batch test method described in 0 (197B). The basic mixing ratio is as follows.
水麹 籾温 仲添 留添
α米（ｇ） ２５ ５５ ８０麹米（ｇ
） １０ １０ ２０汲水（曽１）
５５ ７．５ ９１．５ １５４水温（”Ｃ）１５
１５ ９ ７計
Ｎ）１．Ｈ，ＰＯ４
（ＮＬ）ｔｓＯ４
ａＮＯｆｆ
無添加
４．５３ ３５．６ １００４、 ２８
３３． ０ ９２． ７１．３９ ６．
５３ １Ｂ、３２．３４ ６．２９
１７．７清酒の製造に用いる麹としてノイロスポ
ラ菌を生やしたものを用い、醗酵過程でのカプロン酸工
麹の組み合わせは次のようにした。Mizukoji Paddy temperature Nakazoe Ruzoe α rice (g) 25 55 80 Koji rice (g)
) 10 10 20 pumping water (Zeng 1)
55 7.5 91.5 154 Water temperature ("C) 15
15 9 7 total N)1. H, PO4 (NL) tsO4 aNOff No additive 4.53 35.6 1004, 28
33. 0 92. 71.39 6.
53 1B, 32.34 6.29
17.7 The koji used in the production of sake was one in which Neurospora bacteria were grown, and the combination of caproic acid-engineered koji during the fermentation process was as follows.
１、対照
２、麹米の半分をノイロスポラ菌麹米＋グルク１００（
４０＋ｇ）十酸性プロテアーゼ（１４日）に置き換えた
もの
３、対照十ノイロスポラ菌体
４、麹米のかわりにノイロスポラ菌麹米＋グルク１００
１００（８０十酸性プロテアーゼ（１４日目〕を用いた
もの
５、対照十ノイロスポラ菌麹米（α米の一部）なお、「
グルタ１００Ｊは清酒用糖化酵素であるグルコアミラー
ゼ製剤（天野製薬（株）製）の商標名である。1. Control 2. Half of the koji rice was mixed with Neurospora koji rice + Gluk 100 (
40+g) Deca acidic protease (14 days) replaced with 3, control ten Neurospora cells 4, Neurospora koji rice + Gluk 100 instead of koji rice
100 (80 using acidic protease (14th day) 5, control 10 using Neurospora koji rice (part of α rice)
Gluta 100J is the trademark name of a glucoamylase preparation (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), which is a saccharifying enzyme for sake.
２５日間の発酵の間における００２減量および醗酵の完
成度は、ノイロスポラ菌を存在させたもろみと対照との
間に大きな差はなかった。もろみの分析結果および香り
の官能評点を第１１表に示す。ノイロスポラ菌を用いた
Ｎｏ、２とＮｏ、 ３のもろみは、対照と比べて大差
はないか、または高い官能評点を得た。また、もろみ中
のカプロン酸エチルは、特にノイロスポラ薄を用いたＮ
ｏ。There was no significant difference in 002 weight loss and fermentation completion during the 25 days of fermentation between the mash in which Neurospora was present and the control. Table 11 shows the analysis results of the mash and the sensory evaluation of aroma. The mash of No. 2 and No. 3 using Neurospora bacteria was either not significantly different or had a high sensory rating compared to the control. In addition, ethyl caproate in the mash is especially important for N
o.
５に明確な増加傾向が見られた。A clear increasing trend was seen in 5.
第１１表
平凡
実施例１４ ゛ への１
甘口清酒を製造する際の四段仕込みの麹（または甘酒）
にノイロスポラ菌を使用し、清酒の香りの向上を試験し
た。Table 11 Ordinary Example 14 ゛ to 1 Four-stage preparation of koji (or amazake) when producing sweet sake
We used Neurospora bacteria to test the improvement of the aroma of sake.
アルコール１７．８％、日本酒度−８、酸２゜２５、ア
ミノ酸１．７の成分をもつ、発酵終了直前のもろみを２
００ｍ１ずつ７本の小仕込み用の容器に分注し、下記１
〜７の四段仕込み成分を添加したのち、さらに最終エタ
ノール濃度が２０％になるように９５％エタノールを添
加して、ＩＱ’Ｃで３日間？装置した。2. The mash just before the end of fermentation has a composition of 17.8% alcohol, -8 sake content, 2.25 acids, and 1.7 amino acids.
Dispense 00ml into 7 small preparation containers and add the following 1.
After adding the four-step preparation ingredients in ~7, 95% ethanol was further added so that the final ethanol concentration was 20%, and IQ'C was used for 3 days? The device was installed.
ノイロスポラ菌麹 ２０ｇ（１０％）
普通麹（対照） ２０ｇ（１０％）無添加
普通麹の甘酒＊ １０ｇ（５％）
６、普通麹の甘酒＊
２０ｇ （１０％）
合は、香り高くすっきりした清酒が生じ、特にＮｏ、７
の成分を用いて四段仕込みした清酒は、Ｎ０１６ものに
比べて明らかに優れていた。Neurospora fungus koji 20g (10%) Ordinary koji (control) 20g (10%) Additive-free ordinary koji amazake* 10g (5%) 6. Ordinary koji amazake* 20g (10%) If combined, aromatic and refreshing sake occurs, especially No. 7
The sake brewed in four stages using these ingredients was clearly superior to the No. 16 sake.
さらに、各もろみ２６０！！１の試料にＮ ａ ＣＩを
０．１０ｇ加え酢酸エチル１２５μ！で抽出し、キャピ
ラリー法でカプロン酸エチルの定量を行い、第１２表の
結果を得た。この結果から、いずれの場合にもノイロス
ポラ麹を使用すると酒質に不都合な影響なしに、香り華
やかですっきりとまとまった清酒が製造できることが分
析値のうえからも確認された。In addition, each moromi costs 260! ! Add 0.10g of N a CI to sample 1 and add 125μ of ethyl acetate! ethyl caproate was quantitatively determined using a capillary method, and the results shown in Table 12 were obtained. From these results, it was confirmed from the analytical values that in any case, using Neurospora koji allows the production of clear-cut sake with a bright aroma without adversely affecting the quality of sake.
生成した各もろみを８０００ｒｐｍＸ１０分間遠心分離
し、上清をきき酒による官能テストで評価した。その結
果、ノイロスポラ菌麹を添加した場第１２表
Ｎｏ、 カプロン酸エチル（ｐｐ帽）１
１．５２
２ ０．６１３
３ ０．７５８
４ ０．５５２
５ ０．７５６
６ ０．７３５
７ １．１７
甘酒中 ノイロスポラ菌９ ４．５２普通菌麹
検出せず
（発明の効果）
本発明によれば、大量培養した場合でもカプロン酸エチ
ルを多量に含有する培養液と菌体が得られたことより、
この培養液をそのまま或いは吸着、蒸留などの精製工程
を経た後、天然の着香料として使用することができる。Each of the produced mash was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was evaluated in a sensory test using sake. As a result, when Neurospora fungus koji was added, Table 12 No. Ethyl caproate (pp cap) 1
1.52 2 0.613 3 0.758 4 0.552 5 0.756 6 0.735 7 1.17 Amazake Neurospora 9 4.52 Common fungus koji
No detection (effect of the invention) According to the present invention, a culture solution and bacterial cells containing a large amount of ethyl caproate were obtained even when cultured in large quantities.
This culture solution can be used as a natural flavoring agent as it is or after undergoing purification steps such as adsorption and distillation.
また、本発明の酵素を製造する能力を存するノイロスポ
ラ属の苗を、清酒等の醸造製品の製造工程で使用して、
直接製品に香気を付与することが可能である。さらに、
菌体より酵素を抽出、精製し得られた酵素を固定化して
効率良く純度の高いカプロン酸エチルなどの香気成分を
製造することができる。さらに、精製されて構造が決定
された酵素を組み換えＤＮＡ技術により、酵母、カビ等
に導入することにより、新しいタイプの醗酵飲料を製造
することができる。Furthermore, seedlings of the genus Neurospora that have the ability to produce the enzyme of the present invention can be used in the production process of brewed products such as sake,
It is possible to impart fragrance directly to the product. moreover,
By extracting and purifying enzymes from bacterial cells and immobilizing the resulting enzymes, aromatic components such as ethyl caproate with high purity can be efficiently produced. Furthermore, a new type of fermented beverage can be produced by introducing a purified enzyme whose structure has been determined into yeast, mold, etc. using recombinant DNA technology.
第１図は、カプロン酸エチルの生成を示すガスクロマト
グラフィー図であり、
第２図は、各種培地におけるカプロン酸エチルの生成を
示す図であり、
第３図は、ゲル電気泳動パターンを示す図であり、
第４図は、各種のアシルＣｏＡにおける比活性を示す図
であり、
第５図は、酵素活性に及ぼすＰＨの影響を示す図であり
、
第６図は、酵素活性に及ぼす温度の影否を示す図であり
、
第７図は、固体培養で、ノイロスポラ菌株を懸濁させる
ために用いる液体培地の種類とカプロン酸エチル生成量
との関係を示すグラフであり、そして
第８図は、固体培養で、ノイロスポラ菌株を懸濁させる
ために用いる液体培地の容量とカプロン酸エチル生成量
との関係を示すグラフである。
第２ 図
種々の培地でのカプロン酸エチルエステル生成図面の浄
書（内容に変更なし）
纂３
図
テロヅロビン（乙１．．９，０００）
’７エ’）−ｒン（４４０，０００）
刀クラーゼＥ２３２．ｏｏｏ）
う７テートデｌ：にロケ°゛ナーぜ’（／４０，０００
）アルジミン（６７，０００）
Ａ Ａ Ｔ ＱＳｅ
竜ｄ区
アシル不の方青１文
第６図
温度の影響
温度
（°Ｃ）
氷７
凹
塙脣Ｂ汐Figure 1 is a gas chromatography diagram showing the production of ethyl caproate. Figure 2 is a diagram showing the production of ethyl caproate in various media. Figure 3 is a diagram showing gel electrophoresis patterns. FIG. 4 is a diagram showing the specific activity of various acyl-CoA, FIG. 5 is a diagram showing the influence of PH on enzyme activity, and FIG. 6 is a diagram showing the influence of temperature on enzyme activity. Figure 7 is a graph showing the relationship between the type of liquid medium used to suspend Neurospora strains in solid culture and the amount of ethyl caproate produced; , is a graph showing the relationship between the volume of a liquid medium used to suspend a Neurospora strain and the amount of ethyl caproate produced in solid culture. Figure 2: Engraving of caproic acid ethyl ester production drawings in various media (no changes in content) Figure 3: Terodurobin (Otsu 1..9,000) '7E')-run (440,000) Katana crase E232. ooo) U7 Tatedel: Filmed on location in °゛naze' (/40,000
) Aldimine (67,000) A A T QSe Ryu d ku Ashiru Fu no kata Ao 1 Sentence Figure 6 Temperature influence Temperature (°C) Ice 7 Ukahan 脣B 汐
Claims (1)
フェラーゼ： ａ、作用 アルコール及び中鎖脂肪酸のＣｏＡ誘導体 に作用し、中鎖脂肪酸のエステルを生成する；ｂ、基質
特異性 アシル基の炭素数が４個から１６個のアシ ルＣｏＡに作用し、特に６〜１３個のものによく作用す
る； アセチルＣｏＡ、ｎ−プロピオニルＣｏＡ、イソブチリ
ルＣｏＡ及びイソバレリルＣｏＡ、に対しては作用しな
いか極めて作用しにく い； 炭素数が１個から８個までのアルコールに 対して作用性が認められ、特にイソブチルアルコール、
ｎ−ブチルアルコールに対しては、エチルアルコールの
場合の３〜４倍の活性を示す； イソプロピルアルコールに対しては比較的 作用しにくい； ｃ、分子量：約３００００； ｄ、至適及び安定ｐＨ 至適ｐＨ８ 安定ｐＨ３〜９； ｅ、至適及び安定温度 至適温度：２５℃ 安定温度：４３℃以下 ｆ、阻害剤等の影響 フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）、フッ化フェ
ニールメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）で阻害され、パ
ラクロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）では阻害されない。 ２、ノイロスポラ属に属し、請求項１記載の新規アルコ
ールアシルトランスフェラーゼを産生する微生物を培養
し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする
アルコールアシルトランスフェラーゼの製造方法。 ３、請求項１記載の新規アルコールアシルトランスフェ
ラーゼを生産するノイロスポラ属に属する微生物を培養
して、培養物中に中鎖脂肪酸エステルを生産させる方法
。 ４、微生物を液体培地中で培養する、請求項３記載の方
法。 ５、液体培地が、モルトエキス培地である、請求項４記
載の方法。 ６、微生物を固体培地培養する、請求項３記載の方法。 ７、固体培地がα米またはふすまを含む、請求項６記載
の方法。 ８、清酒製造工程における固体培養物中に、請求項１記
載の酵素を製造する微生物を存在せしめ、それにより該
培養物中にカプロン酸エチルを生産させて、清酒に好ま
しい香りを与える、請求項６記載の方法。 ９、請求項１記載の酵素を使用して、中鎖脂肪酸エステ
ルを製造する方法。[Claims] 1. A novel alcohol acyltransferase having the following properties: a. Acts on CoA derivatives of active alcohols and medium-chain fatty acids to produce esters of medium-chain fatty acids; b. Acts on acyl-CoA having 4 to 16 carbon atoms, and particularly acts well on acyl-CoA with 6 to 13 carbon atoms; has no effect or very strong effect on acetyl-CoA, n-propionyl-CoA, isobutyryl-CoA, and isovaleryl-CoA. Difficult to use; active against alcohols with 1 to 8 carbon atoms, especially isobutyl alcohol,
Shows 3 to 4 times more activity against n-butyl alcohol than ethyl alcohol; Relatively less active against isopropyl alcohol; c. Molecular weight: approx. 30,000; d. Optimum and stable pH. Optimal pH 8 Stable pH 3-9; e, Optimum and stable temperature Optimum temperature: 25°C Stable temperature: 43°C or less and not inhibited by parachloromercuric benzoate (PCMB). 2. A method for producing alcohol acyltransferase, which comprises culturing a microorganism belonging to the genus Neurospora and producing the novel alcohol acyltransferase according to claim 1, and collecting the enzyme from the culture. 3. A method for producing a medium-chain fatty acid ester in the culture by culturing a microorganism belonging to the genus Neurospora that produces the novel alcohol acyltransferase according to claim 1. 4. The method according to claim 3, wherein the microorganism is cultured in a liquid medium. 5. The method according to claim 4, wherein the liquid medium is a malt extract medium. 6. The method according to claim 3, wherein the microorganism is cultured on a solid medium. 7. The method according to claim 6, wherein the solid medium contains alpha rice or bran. 8. A claim in which a microorganism that produces the enzyme according to claim 1 is present in a solid culture in the sake manufacturing process, thereby producing ethyl caproate in the culture and imparting a desirable aroma to the sake. The method described in 6. 9. A method for producing a medium chain fatty acid ester using the enzyme according to claim 1.
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|---|---|---|---|
| JP5761989A JP2833769B2 (en) | 1988-04-02 | 1989-03-09 | Novel alcohol acyltransferase and its use |
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|---|---|
| JPH0235080A true JPH0235080A (en) | 1990-02-05 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0574941A2 (en) * | 1992-06-18 | 1993-12-22 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Alcohol acetyltransferase genes and use thereof |
| US6223625B1 (en) | 1997-09-12 | 2001-05-01 | Unisia Jecs Corporation | Torque transmitting and torsion damping apparatus for use in motor vehicles |
-
1989
- 1989-03-09 JP JP5761989A patent/JP2833769B2/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0574941A2 (en) * | 1992-06-18 | 1993-12-22 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Alcohol acetyltransferase genes and use thereof |
| US6223625B1 (en) | 1997-09-12 | 2001-05-01 | Unisia Jecs Corporation | Torque transmitting and torsion damping apparatus for use in motor vehicles |
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