JPH0234601A - 新規トランスフェリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は肝癌性変化を受けた糖鎖を有する新規なトラ
ンスフェリンに関する。この発明の新規トランスフェリ
ンは、肝癌診断薬としての用途を有する抗肝癌性変異ト
ランスフェリンモノクローナル抗体を作製するための抗
原及びこれを作製する工程中に用いられるポジティブ対
照、並びに肝癌診断キットのスタンダードとしての用途
を有する。

［従来の技術］ 従来より、肝癌の体外での臨床検査方法としては、γ−
グルタミルトランスペプチダーゼやα−フェトプロティ
ン（ＡＦＰ）等のいわゆる腫瘍マーカーを、これらと特
異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体を用いて検出する方法が実用化されている。しかし
ながら、一般に腫瘍マーカーとは腫瘍細胞により生合成
される腫瘍との関係の深い物質（ｃａｎｃｅｒａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）として位置付けら
れており、腫瘍部位のみて産生され正常組織に存在しな
いＩｌ！瘍特異物質又は腫瘍特異抗原は未だ見出されて
いない、従って、Ｊｌｌママ−カー利用した肝癌の検出
方法はその信頼性において十分満足することができない
。

一方、糖タンパク賀の糖鎖の癌性変化が多くの糖タンパ
ク質で解明されている。このような糖タンパク質の例と
して、上記Ａ　Ｆ　Ｐ　（Ｙｏｓｈｉｍａら、Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、　４０４２７６、　’８０．　Ｙａｍａ
ｓｈｉｔａら。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３４６９１．　’８３）　
、上記γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン（木幡陽、　Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ　
１４巻秋号、７７〜８８．１９８５）　、α−アンチト
リプシン及びｄｅｓ−γ−カルボキシプロトロンビンを
挙げることができる。

従って、これらの糖タンパク質の糖鎖をエピトープとす
るモノクローナル抗体は、癌診断薬として用いることが
できる。このようなモノクローナル抗体の例として従来
より公知のＣＡ１９−９、ＣＡ１２Ｓ及びＣ３ＬＥＸ−
１を挙げることかできる。もし肝癌患者体内に、正常人
体内にはほとんどあるいは全く存在しない、癌性変化し
た糖鎖を有する糖タンパク質が存在すれば、その糖タン
パク買を抗原として用いてモノクローナル抗体を作製す
ることにより、肝癌診断薬としての用途を有するモノク
ローナル抗体を得ることができる。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明の目的は、肝癌性変化を受けた糖鎖を
有する新規な糖タンパク賀を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、肝癌患者血清中のト
ランスフェリンの糖鎖が癌性変化を受けていることを見
出し、かつこのような癌性変化を受けた糖鎖を有するト
ランスフェリンの単離及び該糖鎖の同定に成功し、本発
明を完成した。

すなわち、この発明は、下記一般式［Ｉ］［＋１］ない
し［ＩＶＩのいずれかで示される糖鎖、を示しくただし
、Ａｓｎに隣接したＧｌｃＮＡｃにフコースが結合して
いない場合であってＲ１とＲ２とが同時に式（ＩＶＩで
示される糖鎖を示すものを除く）、Ｔｆはトランスフェ
リンタンパク質部分を示す）で示される新規トランスフ
ェリン。

（ただし、Ｒ，とＲ２は、それぞれ独立に下記一般式＋
１ ＋１ ＋１ ＋１ ＋１ 寸 ＋１ ＋１ ［発明の効果］ この発明により、正常人血清中にはほとんど存在しない
（約３〜４％）が肝癌患者血清中には多く存在する（約
３５〜６５％）、癌性変化を受けた糖鎖を有する新規な
トランスフェリンか提供された。本発明のトランスフェ
リンは、肝癌患者血清中には多く存在するが正常人血清
中にはほとんど存在しないのて、本発明のトランスフェ
リンの糖鎖なエピトープとするモノクローナル抗体は肝
癌診断薬として有用である。従って、本発明のトランス
フェリンは、肝癌診断薬としての用途を有する抗肝癌性
変異トランスフェリンモノクローナル抗体を作製するた
めの抗原及びこれを作製する工程中に用いられるポジテ
ィブ対照、並びに診断キットのスタンダードとして有用
である。

［発明の詳細な説明］ トランスフェリンは、ジテロフィリン又は鉄結合性グロ
ブリンとも呼ばれる分子量約８万の糖タンパク質である
。上述のように、本願発明者らは、肝癌患者においては
血液中のトランスフェリンの糖鎖か癌性変化しているこ
とを見出した。肝癌により癌性変化した本発明のトラン
スフェリンは上記一般式［１］により示される、アスパ
ラギン結合型糖鎖を有するものである。一般式［Ｉ］で
示されるものの具体例として、下記実施例において記載
するように単離、同定された下記式［Ｖ］ないし［ＸＶ
］で示されるものを挙げることｃＱｃ！ｌｌ ζ１　　ｑユ ｃａ　　　ｃＱ （り　　　−コ ロ ａＣ ｃＱ　　ｑ り 　　ｃＱ ａ　　ｄ ササ　寸　寸　ササ ＴＴ　　　　　↑　　　　↑　　　　ＴＴ上記式［Ｖ］
ないし［ＸＶ］で示されるトランスフェリンのうち、肝
癌診断薬としてのモノクローナル抗体を誘導するための
抗原として特に好ましいものは式［Ｖ］ないし［Ｘ］で
示されるものである。

この発明のトランスフェリンのうち、フコース分岐を有
するものはＡＡＬレクチン（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎ
Ｌｉａ　　１ｅｃｔ、ｉｎ、　　Ｎ、　　Ｋｏｃｈｉｂ
ｅ　　ａｎｄ　　Ｋ、　　Ｆｕｒｕｋａｗａ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　１９巻、　ｐｐ、　２
８４１−２８４８）に結合され、また、有さないものは
ＤＳＡレクチン（文献：　Ｃｒｏｗｌｙら１Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　８：ｔ　ａ　）に結合される
が正常なトランスフェリンはこれらのレクチンには結合
されない、従って１本発明のトランスフェリンは、ＡＡ
Ｌレクチン又はＤＳＡレクチンとの特異的な結合を利用
して単離することかできる０例えば、肝癌患者血清中か
ら回収したトランスフェリンをＡＡＬレクチン又はＤＳ
Ａレクチンを含むカラムに流通させて本発明のトランス
フェリンのみをカラムに吸着させた後、溶離液で溶出す
ることにより本発明のトランスフェリンな単離すること
かてきる。カラムには、ＡＡＬレクチン又はＤＳＡレク
チンを適当な担体に結合して固相化したものを充填する
ことかできる。レクチンの固相化方法は周知であり、例
えばＹａｓａｓｈｉｔａ。

Ｋｏｃｈｉｂｃ、Ｏ１＋ｋｕｒａ、　Ｌｌｅｄａ　ａｎ
ｄ　ＫｏｂａＬａ、　”ＪＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　、　ｖｏｌ、　２６０．　ｐｐ、　４
６８８−４６９３　（＋９８５）に記載されている。好
ましい担体としてはセファロースビーズを挙げることか
てき固相化するレクチンの濃度は通常２０■ｇ／ｓｌな
いしｌ　ｍｇ／ｌ、好ましくは約３　Ｂ／ｍｌ程度であ
る。

また、カラムに充填する固相化レクチンのｆ（担体を含
む）は特に限定されないか約ｌ−１て十分である。なお
、血清中のトランスフェリンのｍｓ方法は公知であり１
例えば日本生化学会編「続生化学実験講座」８巻血液（
上）４６２〜４６４に記載されている。溶離液としては
、ＡＡＬレクチンの場合には例えば１０■閑のフコース
を含む緩衝液を挙げることかでき、ＤＳＡレクチンの場
合には例えば１％のＮ−アセチル−グルコサミンオリゴ
マーを含む緩衝液を挙げることかできる。

この発明のトランスフェリンを抗原として用いて例えば
マウスのような適当な！ＩＩ物を免疫し、常法であるケ
ーラーとミルシュタインの方法により１本発明のトラン
スフェリンに対して特異的なモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマを作製することかできる。このよう
なハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗
体は肝癌の診断薬として用いることかできる。また、本
発明のトランスフェリンは、このようなハイブリトーマ
を作製する際に用いられるポジティブ対照としての用途
も有する。すなわち、作製されたハイブリトーマにより
産生されるモノクローナル抗体が１本発明のトランスフ
ェリンに特異的に結合するか否かを調べるために用いる
ことができる。

なお、肝癌診断薬として用いるためには、モノクローナ
ル抗体は癌性変化した糖鎖をエピトープとするものでな
ければならない、モノクローナル抗体か癌性変化した糖
鎖をエピトープとしているか否かは、正常なトランスフ
ェリンとの結合性を調べることにより知ることができる
。

また、この発明のトランスフェリンは、複数のトランス
フェリンを含む混合物の状態てあっても単独の場合と同
じ有用性を有する。さらに、トランスフェリンから分離
された糖鎖のみであっても有用性を有する。すなわち、
分離された糖鎖なアルブミンのようなタンパク質等の適
当な担体に結合したものも上記有用性を有する。

［実施例］ 参考例１ 糖鎖構造決定に用いた肝癌患者４名の血清中のタンパク
値 肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ）患者４名の肝癌組織の所見、血清中のタンパク質
特に癌マーカー値は表１に示すとおりであった。肝癌の
マーカーとして広く診断に用いられているＡＦＰの値は
約２９口００．１０，０００．３０，０００．２００，
０００　ｎｇ／ｍｌとモデルになり得る偵てあった。ト
ランスフェリン場はいずれも２００〜３００　ｍｇ／旧
程度であった。

なお、総タンパク量は比色法、トランスフェリンイ１は
８ｇ素免疫法、ＧＯＴ、ＧＯＰは酵素活性測定法、ＡＦ
Ｐ、ＣＥＡは酵素免疫測定法で測定し実施例１ 析 （１）トランスフェリンの調製 患者及び健常人の血清５１から抗トランスフェリン抗体
（Ｅ−Ｙラボラトリ−社製）を固相化したアフィニティ
クロマトグラフィーにより高純度にトランスフェリンを
分離精袈した０分離したトランスフェリンは蒸留水で透
析後、凍結乾燥した。

（２）トランスフェリンからアスパラギン結合型糖鎖の
遊離 凍結乾燥したトランスフェリンを密閉した試験管で試料
３Ｂについて０．３　ｍｌの無水ヒドラジンを加えて１
００℃、８時間反応させた。この反応生成物の未反応の
ヒドラジンを留去し、最後に減圧下で硫酸に吸収させる
ことにより除去し、部分Ｎ−アセチル化少糖として得た
。

（３）アスパラギン結合型糖鎖のＮ−アセチル化このよ
うにして得た少糖に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３１
と無水酢酸３００ＩＬ＋を加え、糖鎖のｊｉ離アミノ基
をＮ−アセチル化した。

さらに、糖タンパク賀のタンパク部分の崩壊によるアミ
ノ酸の除去をペーパークロマトグラフィーで行なった。

（４）少糖群の還元末端標識 屹固した少糖群に０℃下で１００終１の０．０８　Ｎ水
酸化ナトリウムを加えてｐＨｌｌにｉｔし、ＮａＢ’１
１４（２５ｓＣｉをジメチルスフホキシト３１に溶解）
を２０１Ｌｌ加え、攪拌し、３０℃で４時間反応させた
０反応終了後、ＩＮ酢酸を数滴加え、余分の）ｌａＢコ
Ｈ４を分解させ、０．５　ｍｌのＤｏｗｅｘ　５ＯＷ−
Ｈ◆（バイオラド社製）カラムにて脱塩した。ホウ酸は
メチルアルコールを加えて除き、常法に基づきベーパー
クロマトグラフィーにより　１Ｈ標識少糖を得た。

（５）トリチウム標識少糖群の高圧ろ紙電気泳動トリチ
ウム［３Ｈ］標識少糖をＷｈａｔｍａｎ　Ｎｏ。

：１Ｍ１ｌｌのろ紙（ワットマン社製）のろ紙にスポッ
トし、ピリジン−酢＃緩衝液（ｐＨ５，４）にて高圧ろ
紙心気泳動装置（シャントン・サザン社製、モデルＬ−
２４）を用いて７３Ｖ／ｃ層、１時間の条件て泳動を行
なった。

放射活性のパターンはラジオクロマトスキャナー（パラ
カード社製、モデル７２０１）で検出した。中性糖鎖画
分及び酸性糖鎖画分を各ピーク毎に蒸留水にて抽出し、
回収した。

（６）アスパラギン結合型糖鎖のゲルろ過クロマトグラ
フィー 酸性少糖類は末端のシアル酸をシアリダーゼ（大金＝油
社製）処理（５０ミリ単位、１８時間）により除いた。

中性少糖及びシアリダーゼ処理酸性少糖をＢｉｏ　Ｇｅ
ｔ　Ｐ−４（アクリルアミドとＮ、Ｎ−メチレンビスア
クリルアミドの共重合体をビーズ状に成形した親水性ゲ
ル、バイオラド社製）、直径２．Ｏｃ■Ｘ高さ１００ｃ
■にかけ溶出させた。ゲルろ過クロマトグラフィーは５
５℃恒温、流速１８１／時で行ない、溶出液は１．８■
ｌづつ分画した。溶出パターンはトリチウムを目印にシ
ンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ　７
０００、ベックマン社製）にて記録した。

（７）レクチンカラムによる少糖の分離分画得られた少
糖を先ずＣｏｎＡカラム（ファルマシア社製）にかけ、
吸着する画分と非吸着画分に分けた。吸着画分の溶出は
５ｍＭα−メチルＤマンノシドで行なった。

次にそれぞれ得られた画分をＡＡＬカラム（東大医科研
生物有機研究室）にかけ、非吸着画分、弱い吸着画分、
吸着画分に分け、ＣｏｎＡ吸着画分からフラクションＩ
　（ＡＡＬ非吸着）、フラクションＩＴ（ＡＡＬ吸着）
を得た。

次にＣｏｎＡ非吸着画分をＡＡＬで３画分に分けたそれ
ぞれをＤＳＡカラム（東大医科研生物有機研究室）にか
け、フラクションＩＩＩ、ｒｖ、　ｖを得た。さらに、
ＤＳＡカラムの非吸着画分及び遅延画分をＥ−ＰＨＡカ
ラム（ホウネン社製）にかけ、フラクションＶｌ、■、
■、　ＩＸを得た。フラクションＩＶ及び■については
アーモンドαフコシダーゼ■の存在下でさらにＤＳＡカ
ラムにかけた。

これらの手順及び溶出パターンが図１に示されている。

なお、ＡＡＬカラム、ＤＳＡカラム及びＥ−ＰＩＩＡカ
ラムからの溶出に用いた溶離液は、それぞれ５　ｍＭフ
コース、１％Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマー、Ｔ
ｒｉｓ−バッファーであった。また、各画分は１■ｌず
回収した。

（８）トリチウム少糖のエキソグリコシダーゼによる逐
次分解 糖鎖内における糖残基の配列順序及びアノマー構造を決
定するために、β−ガラクトシダゼによる逐次分解を行
なった０反応は、肺炎双球菌のβ−ガラクトシダーゼ（
東大医科研生物有機研究室）２ミリ単位を、乾固した糖
鎖に０．１５　Ｍクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ６，ｏ　
ｆ３０μｌ）中で加え一晩反応させることにより行なっ
た０反応液には細菌の増殖を抑えるため１滴のトルエン
を加えた。

反応後は沸騰水で３０秒間加熱して酵素反応を停止させ
た。

このβ−ガラクトシダーゼによる逐次分解分析の結果を
図２に示す８図２中、実線で描かれた曲線はβ−ガラク
トシダーゼ分解により遊離したガラクトースの数を示し
ており、破線の曲線からは放射能標識産物の構造を知る
ことができる。これらの結果を表２にまとめて示す。

表２ 表２ （続き） Ｒ，：　４ＧｌｃＮＡｃ　Ｂ　ｌ　→４Ｇ１ｃＮＡｃＲ
ｔ　：　４ＧｌｃＮＡｃ　Ｂ　１−１４　（ｆｕｃ　ａ
　ｌ　−ｅ６）Ｇ１ｃＮＡｃ上記のようにして決定され
たトランスフェリンの構造、各レクチンカラムへの吸着
性及び全トランスフェリン中の存在割合（モル％）を表
３にまとめて示す、なお、表３中、Ｆ（Ｔ、ＮＡ等は患
者又は正常人の個人名のイニシャルを示す６表３に示さ
れるように、正常人では９６％又は９７％を占める、表
３の１１番上に示される正常トランスフェリンが、肝癌
患者では３７％〜６３％に減少し、表３の１１番目以下
に示される異常トランスフェリン（本発明トランスフェ
リン）が出現する。従って、本発明トランスフェリンを
定量することにより、肝癌の診断を行なうことができ表 （続き） ａｌ 一１４Ｇ１ｃＮＡｃ ａｌ β −１４Ｇ１ｃＮＡｃ ａｌ β 一１４ＧＩＣＮＡＣ ａｌ β −１４ＧＩＣＮＡＣ （９）少糖群のメチル化分析 上記糖鎖構造の同定に誤りがないことを確認するために
、各種レクチンカラムによる分画化を行なう前の少糖群
について常法に基づきメチル化分析を行なった。結果を
表４に示す。

表４に示されるように、β−ガラクトシダーゼ逐次分解
分析結果と矛盾する結果は得られず、上記のようにして
同定された糖鎖構造が正確であることが確認された。

実１ｔｆｔ４引ｌ 癌性トランスフェリンの分離 肝癌患者の血液から分離したトランスフェリン１μｇを
、０．１％ウシ血清アルブミン含有蒸留水に渚解し、固
定化ＡＡＬ−セファロースカラム（１ｍｌ、内径？、５
　ｎ＋ｍ）又は固定化ＤＳＡ−セファロースカラム（１
ｍｌ、内径７．５＋＋ｍ）上にマウントした。２℃に３
０分保持した後、ＡＡＬレクチン−セファロースカラム
中の試料を５ｍｌの０．１％ウシ血清アルブミン含有リ
ン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４３で、次いで５０ｍＭのフ
コースを含む同緩衝液で室温で溶出した。このアフィニ
ティクロマトグラフィーの結果を図３のＡ及びＢに示す
。図３のＡ及びＢにおいて、最初のピークは正常トラン
スフェリン、２番目のピークはこの発明のトランスフェ
リンのうちフコースの糖鎖を有するものの混合物である
。一方、ＤＳＡレクチン−セファロースカラム中の試料
を、０．１％ウシ血清アルブミン含有１０＋ＩＪ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩＦＪ衝液、ｐＨ７，４で２℃で溶出し１次
いで１％Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマー混合物を
含む緩衝液で室温で溶出し、次いで０、ＩＮの酢酸で溶
出した。結果を図３のＣ及びＤに示す。図３のＣ及びＤ
の最初のピークは正常トランスフェリン、２番目のピー
クはＣ−２，４分枝構造糖鎖を有するこの発明のトラン
スフェリン、３番目のピークは、Ｃ−２，６分枝構造を
有するこの発明のトランスフェリンを示す、なお、トラ
ンスフェリン含量はそれぞれの両分１ｍｌを常法のＥＬ
ＩＳＡにより測定した。また、図３のＡおよびＣは肝癌
患者ＨＴからのトランスフェリンについての結果を、図
３のＢｉ５よびＤは肝癌患者ＨＨからのトランスフェリ
ンについての結果を示す。

【図面の簡単な説明】

図１は各種レクチンカラムを用いたトランスフェリンの
ＷＭ鎖の分離及びレクチンカラムクロマトグラフィーの
溶出パターンを示す図、図２は分離された糖鎖について
のβ−ガラクトシダーゼ逐次分解分析の結果を示す図で
ある。 図３は肝癌患者の血中トランスフェリンからこの発明の
トランスフェリンを分離するアフィニティクロマトグラ
フィ の結果を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿１とＲ＿２は、それぞれ独立に下記一般
   式［II］ないし［IV］のいずれかで示される糖鎖、を示
   し（ただし、Ａｓｎに隣接したＧｌｃＮＡｃにフコース
   が結合していない場合であってＲ＿１とＲ＿２とが同時
   に式［IV］で示される糖鎖を示すものを除く）、Ｔｆは
   トランスフェリンタンパク質部分を示す） で示される新規トランスフェリン。 ▲数式、化学式、表等があります▼［II］ ▲数式、化学式、表等があります▼［III］ ▲数式、化学式、表等があります▼［IV］