JPH02299597A - 自動補正式検定デバイスおよび検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は流体試料の被分析物を検定る、方法およびデバ
イスに関る、。

参考文献 Ａｏｕｉｄｅｔ、　　Ａ、ら、　　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ
、　　２９（１１）：２００１（１９８３年）。

Ｋｅｔｔｅｒｍａｎ、　　Ｒ，ら、　　Ｊ　Ｃｌ１ｎ　
Ｃｈｅｍ　Ｃｌ１ｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２２　（３）　：　２４５　（１９８４年）。

Ｋｏｖａｒ、　　Ｋ、　Ａ、　　ら、　　Ｃ１１ｎ　Ｃ
ｈｅｍ　Ａｃｔａ、　　１３２（３）：２５７（１９８
３年）。

Ｍａｌｉｓｐｉｎａ、　Ｊ、　Ｐ、ら、　　Ａｎｎ　Ｂ
ｉｏｌ　Ｃｈｉｎ、　　３８（４）：２０７（１９８０
年）。

Ｍｏ５ｈｉｄｅｓ、　Ｊ、Ｓ１Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ
　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２５（９）：５８３　　（１９８７年）。

Ｓｈａｒｍａ、　Ａ、ら、　　Ｃｌ１ｎ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　　２０（３）：１６７（１９８７年）。

発明の背景 各種の体液被分析物を医院もしくは家庭で測定る、検定
法が利用されている。一般にこのような検定法は、使用
者が、臨床検定法、または検定結果の読み取りや解釈に
ついてほとんど訓練されていないか若しくは全く訓練さ
れていないという想定のもとに、簡単に使用できるよう
に設計されている。そのため、この検定法では、被分析
物を添加して、検定結果が反応終点に到達した後に測定
されるワンステップ検定が好まれる傾向がある。

この種の被分析物添加式検定法は、使用者にとって便利
であるとはいえ、一般に正確さと信頼性に欠けている。

特にその測定結果は、特に酵素試薬が関係している場合
の試薬の量と活性および温度条件のような反応条件の変
動の影響を受けやすい。

また、多くの簡単な検定法の正確さおよび信頼性は、被
分析物試料間で変動し得る。また試験試薬の状態にも影
響され得るバックグラウンドの干渉によって制限される
。

一般にワンステップ検定プロトコルに適した診断検定形
式の一つのタイプは、パッドもしくはマトリックスを有
る、吸収パッド式デバイスであり。

このパッドもしくはマトリックスは、試料（ｓａｍｐｌ
ｅｖｏｌｕｍｅ）を吸収して、パッドの表面で検出可能
な被分析物に依存る、化学反応が起こるように設計され
ている。吸収パッド式検定デバイスと検定法の例は、米
国特許第３．９８３．００５号、米国特許第４゜０６９
、０１７号、米国特許第４．１４４．３０６号および米
国特許第４．４４７．５７５号に記載されている。

吸収パッド式検定形式を制限る、ものは１上記の制限に
加えて、パッドを湿らすのに必要な試料の最小体積が、
検定の検出範囲を「飽和る、」被分析物量を含有してい
るということである。特に被分析物の検出が反応パッド
の表面で検出される色の変化に基づいて行われる場合５
例えば反射吸光光度法によって検出される色の変化は、
比較的低い被分析物濃度で発生る、（これは１着色した
反応生成物の濃度の変化を広い濃度範囲で検出できる。

溶液中の同じ反応とは対照的である）。それ故、未希釈
の試料は、吸収パッド式デバイスで有効に定量できる濃
度よりも高い濃度の被分析物を含有している。

このような制限は９例えば血清コレステロール測定用吸
収パッド式検定法の場合に見られる。この被分析物は、
臨床実験室もしくは医院でしばしば検定されるが臨床上
重要である。その理由は。

コレステロールの血中濃度が高いこと、特に低密度リポ
タンパク　（ＬＤＬ）と結合したコレステロールの濃度
が高いことは、冠状動脈疾患、胆管閉塞症および肝臓も
しくは甲状腺の機能不全症を含むいくつかのヒトの重篤
な疾病症状に直接関連がある。

（発明の要旨） 従って１本発明の一般的な目的は、被分析物を試験る、
ための、簡単で信頼性があるデバイスと試験法とを提供
る、ことにある。

本発明の他の目的は、このようなデバイスを使用し、こ
のような方法を利用して被分析物の分析値を測定る、装
置を提供る、ことにある。この装置においては、その分
析値は１反応の阻害と活性効果の損失について補正され
、標準曲線から決定される。

本発明の他の目的は、流体試料中の被分析物の濃度を、
広範囲の被分析物の濃度にわたって測定る、方法とデバ
イスとを提供る、ことにある。

本発明のデバイスは、被分析物を含有る、試料。

例えば体液試料が導入される第１反応領域と第２反応領
域とを備えている。両反応領域は、流体試料を１表面の
温潤によって吸引る、よう設計された多孔性マトリラス
のパッドが好ましい。両反応領域は、流体試料を受入れ
て両反応領域に分配る、貯槽部と接触していてもよい。

第１反応領域は、被分析物を含有る、流体試料が第１反
応領域に添加されたときに、被分析物を有効に利用して
中間反応生成物を生成る、被分析物特異的成分を有る、
。第１反応領域内に存在る、シグナル生成成分は、上記
中間反応生成物を有効に利用して、流体試料中に存在る
、被分析物の濃度に依存る、測定可能な値を有る、シグ
ナル生成物を生成る、。

第２反応領域は、水性流体試料中には存在しない標準化
合物の既知量と、被分析物を含有る、流体試料が第２反
応領域に添加された時に、この標準化合物を有効に利用
して中間反応生成物を生成る、化合物特異的成分とを含
有る、。この領域にはまた。上記のシグナル生成成分が
含有されている。上記の２領域式デバイスによって、バ
ックグラウンドと線形阻害との影響について補正された
標準曲線に基づいて被分析物の濃度を分析る、ことがで
きる。

このデバイスには、さらに第３反応領域が含まれ得る。

この第３領域における反応成分は、第２反応領域と同様
であるが、異なる標準化合物の既知量を含む。３つの反
応領域を有る、デバイスにより、バックグラウンドおよ
び非線形阻害の影響について補正れた標準曲線に基づき
、被分析物の測定が可能となる。

一般的な実施態様では、第１反応領域における被分析物
特異的反応成分と、第２反応領域中の化合物特異性成分
とは、それぞれ、被分析物質および標準化合物と有効に
反応してＨ２Ｏ２を生成る、。

この実施態様におけるシグナル生成成分は、ペルオキシ
ダーゼと、　Ｈ２Ｏ２の存在下でペルオキシダーゼによ
って明確に着色したシグナル反応生成物に変換される単
一染料系もしくは２染料系の基質とを含有している。

Ｈ２０２が中間反応生成物として生成されるこの発明の
好ましい態様では、シグナル生成成分は、さらに、捕捉
剤を含有る、。この捕捉剤は、ペルオキシダーゼ酵素の
存在下でシグナル反応生成物の基質と有効に拮抗して、
　Ｈ２Ｏ２を利用る、ことによってシグナル反応生成物
から区別し得るサイレント反応生成物を生成る、。サイ
レント反応生成物が生成る、と、所定量の被分析物によ
って生成る、シグナル反応生成物の量が比例して減少る
、。

捕捉剤としては、これが存在しない場合に生成る、反応
生成物の約１０〜７０％にまで、生成る、シグナル反応
生成物の被分析物依存量を減少させることが好ましい。

他の態様においては、この発明には、水性流体試料中の
被分析物の量を測定る、装置が包含される。その装置は
２上記形式の検定器具を備え、流体試料を、各反応領域
に分配る、構造部材を含むものが好ましい。各領域にお
けるシグナル値は。

シグナル検出器により、典型的には光学的にモニターる
、ことにより測定される。第２領域、または第２および
第３の領域で測定されたシグナル値は、それぞれ、バッ
クグラウンドと阻害の影響について補正された単一点標
準曲線または２点標準曲線を作成る、のに用いられ９次
いで被分析物の濃度値がこの標準曲線から決定される。

本発明のデバイスと装置とをもちいて２体液流体試料中
の被分析物の濃度を測定る、方法もまた。

開示されている。

本発明の上記およびその他の目的と特徴は、以下の本発
明の詳細な説明を、添付図面を参照して読むことにより
一層明らかになる。

Ａ、検定デバイス 第１図は１本発明の一態様に基づいて製作された検定デ
バイス１０を示す。このデバイスは、第２図に示す繊維
１４のような繊維の網目構造で構成された多孔性マ）　
ＩＪソックス１−ＩＪツブ１２を備えている。この多孔
性の、繊維網目構造物は、ス）　ＩＪツブを通じて表面
の湿潤によって、ス）　ＩＪツブに塗布された流体を吸
引る、よう設計されている。すなわち、ストリップの１
領域に塗布された流体試料が８表面の湿潤によってスト
リップの両端に向かって移行してストリップを湿潤させ
るに至る。

流体試料は、ストリップの中央に位置る、試料パッド１
５に塗布される。パッドとストリップとは。

試料流体がパッドを通じてストリップに移行る、時に血
球のような不用の粒子を優先的に除去る、よう構成され
ていることが好ましい。

セルロース、酢酸セルロースおよびガラス繊維のマトリ
ックスのごとき繊維マットフィルタに用いられるような
各種の繊維ストリップ材料は、ストリップと使用パッド
用に好適な材料である。その繊維は、所望により、化学
的架橋、熱融着などによって架橋されていてもよい。ま
た、焼結ガラス、溶融ポリマービーズなどのような多孔
性支持体も適切である。これらの湿潤性および間隙の寸
法が１表面湿潤によって水性媒体のマトリックスへの移
動を促進る、ためである。パッドとストリップ用に好適
な一つの材料は１粒子径によって。

流体試料中の非粒子溶質物質から粒子を分離る、作用を
行うガラス繊維フィルター材である。従って１例えばパ
ッドに塗布された血液試料がパッドからはなれてス）　
ＩＪツブを通じて吸引され、試料中の血球の濃度は、移
行る、試料の先端では減少している。

ストリップの代表的な寸法は、長さが約１〜５ｃｍ。

幅が４〜１０ｍｍ、厚さが５０〜５００　ミクロンであ
る。

パッドは９辺の寸法がストリップの幅とほぼ同じで、厚
みは約５〜５００　ミクロンである。

ス）　ＩＪツブには２つの反応パッド１８．２０が取付
けられているが、これらはそれぞれ１本願で第１反応領
域および第２反応領域と呼称されているものである。こ
れらの反応領域は、上記のような繊維マトリックスフィ
ルター材で作製され、水性流体を表面湿潤によって吸引
る、よう設計されている。第２図に示すように、パッド
２０は１代表的なものであるが１層２０ａと２０ｂのよ
うな内層と外層とで構成されている。パッドのこれらの
層は１通常の流体透過性接着剤などによって互いには接
着されている。

第２図について続けて説明る、が、デバイスにおいて、
パッドは膜２３のような膜によってス）　ＩＪツブ１２
の上面から隔てて取付けられている。そしてこの膜は、
試料流体中の選択された流体成分は透過る、が、試料中
の粒子もしくは大きな溶質は透過しない。膜のサイズ排
除限界は、所望の試料成分をパッド内へ通過させ、望ま
しくない物質の通過を妨げるように選択される。例えば
、血液試料中の全血清コレステロール測定用検定デバイ
スでは、膜のサイズ排除限界は、リポタンパク粒子。

例えば８０１粒子とＬＤＬ粒子を通過させるが、赤血球
細胞のような血液細胞を排除る、ように選択される。

この膜としては、パッドの下のストリップ中の濾過され
た赤血球細胞などの色の効果をマスクる、た袷に、淡色
では不透明なものが好ましい。通常の流体透過性の接着
剤などによって、パッドは関連る、膜に接着され、その
膜はス）　ＩＪツブの上面に接着される。

検定の手Ｊｌ、Ｉは次のとおりである。ストリップの中
央に位置る、パッド１５に導入された流体試料が。

表面湿潤によってストリップ１２に吸引され、関連膜を
通じてス）　ＩＪツブの中央から表面の二つの反応領域
へ移動る、が、各反応領域における被分析物の濃度は、
各パッドが被分析物の試料流体で飽和されているので１
本質的に同一である。したがって、ストリップ１２とパ
ッド１５は、流体試料を。

各反応領域へ、各領域内でほぼ同じ被分析物濃度で分配
る、手段を提供る、貯槽として役立っている。

第１反応領域すなわちデバイス１０内の領域１Ｂは。

有効に被分析物と特異的に反応して、第１反応領域の被
分析物の濃度に依存る、濃度を有る、中間反応生成物を
産生ずる１種以上の成分を含有している。この単一もし
くは複数の成分（本願では。

被分析物特異的成分手段と呼ぶ）は、一般に、被分析物
と特異的に反応して中間生成物を生成る、か、あるいは
中間生成物に導く第２反応用の基質として働くことが可
能な被分析物に関連した生成物を生成る、ことができる
。被分析物特異的酵素を含有している。

また、上記中間反応生成物を有効に利用して。

反応領域内の中間生成物の濃度に依存る、測定可能な値
を有る、シグナル生成物を生成る、シグナル生成物が第
１反応領域内に含有されている。中間生成物を利用して
所望のシグナル生成物を生成る、のに必要な単一もしく
は複数の成分を１本願ではシグナル生成成分手段と呼ぶ
。

第２反応領域すなわちデバイス１０のパッド２０は。

検定される水性流体試料中に存在していない標準化合物
の既知量を含有しているが、この化合物としては、この
領域に導入される試料流体に自由に溶解しうるものが好
ましい。また第２領域は、被分析物含有流体試料がこの
領域に添加された時に。

標準化合物を有効に利用して上記の中間反応生成物を生
成る、化合物特異的成分を含有している。

またこの化合物特異的反応成分は１本願では化合物特異
的成分手段と呼ぶ。

第１図〜第３図に示す特定の構造においては。

標準化合物と、化合物特異的成分とは、パッド２゜の異
なる層の２０ａと２０ｂ内に含有され、一般に標重化合
物は下方の層内に存在している。したがって流体試料が
パッドに吸引された時、標準化合物は、試料流体に溶解
して上層に運ばれ、上層で化合物特異的成分と反応る、
。

また、第２反応領域には、標準化合物との反応によって
生成した中間反応生成物を有効に利用してシグナル反応
生成物を生成る、上記のシグナル生成成分が含有されて
いる。このシグナル生成成分すなわちシグナル生成成分
手段は、化合物特異的成分と同じ乾燥層の区画部に含有
されていることが好ましい。

被分析物特異的成分、シグナル生成成分、化合物特異的
成分、および標準化合物の例は、後記のＢ章で示す。ま
た反応パッドとしては、後期Ｅ章で述べるような染料捕
捉剤を含有していてもよい。

第１図に示すデバイスは、それぞれ第３と第４の反応領
域を提供る、２つの追加反応パッド２４゜２６を備えて
いる。本発明の好ましい態様では、第３反応領域すなわ
ちパッド２４は、第２反応領域と同じ成分を含有る、が
、標準化合物の既知量が異なる。第２領域と第３領域の
標準化合物の量は。

試料流体が両頭域に導入された時に異なるものとして検
出可能なシグナル生成物量で、かつ各々が非飽和のシグ
ナル生成物量を生成る、ような量である。

第４反応領域は１本願の被分析物検定法で各種の目的に
貢献る、。あるデバイスにおいては、第４反応領域は第
１反応領域と同様の領域であり。

したがって再現性および検定反応の点検を行う。

他の態様では、第４反応領域は、異なる被分析物を測定
る、ために異なる被分析物特異的成分を含有していても
よいが、この成分は、同じ中間反応生成物を生成る、。

−例を挙げると、第１反応領域は遊離のコレステロール
を測定る、ためにコレステロールオキシダーゼを含有し
、第４領域はグルコースを測定る、ためにグルコースオ
キシダーゼを含有し２両反応ともに中間反応生成物Ｈ２
Ｏ２を生成る、。

他の例では、第１反応領域が、以下に述べるように全血
清コレステロールを測定る、ためにコレステロールエス
テラーゼとコレステロールオキシダーゼを含有し、第４
領域が、Ｂ章で述べるように、遊離のコレステロールを
測定る、ためにコレステロールオキシダーゼのみを含有
している。

第４図は１本発明の他の一般的態様によって作製された
。被分析物を定性的に検定る、自動補正式検定デバイス
２８を示す。デバイス２８は、前記ストリップ１２に類
似の多孔性マトリックスストリップ３０．上記パッド１
５に類似の流体試料パッド３２゜およびそれぞれパッド
１８．２０に類似の２層構造を有る、。第１と第２の反
応パッドすなわち反応領域３４．３６で構成されている
。

第１パツドすなわち第１反応領域は、デバイス１０のパ
ッド１８について先に述べた。被分析物に特異的な成分
すなわち被分析物特異的成分手段と。

シグナル生成成分すなわちシグナル生成成分手段とを含
有している。第１反応パッドは、被分析物を利用してＨ
２Ｏ２のような中間生成物を生成し１次の反応で所望の
シグナル生成物を生成る、ように設計されている。

第２パツドすなわち第２反応領域は、デバイス１０のパ
ッド２０について先にのべたように、標準化合物、化合
物特異的成分すなわち化合物特異的成分手段、およびシ
グナル生成成分すなわちシグナル生成成分手段を含有し
ている。このように、第２反応パッドは、パッド内の標
準化合物を利用してＨ２Ｏ２のような中間生成物を生成
し９次いでこの中間反応生成物を利用して所望のシグナ
ル生成物を生成る、。

ストリップと接着されたパッドとは、被分析物の濃度を
定性分析る、のに使用る、各種の目盛とカラー強度の標
識とを有る、プラスチックのカード４０などに担持され
ている。図示されているデバイスにおいて、パッド３４
は、カラー強度のスペクトルバンド４２で縁取りされ、
スペルトルバンド４２が増大る、カラー強度は、一般に
予想される値の範囲内で増大る、被分析物の濃度値に対
応している。例えば、第４図のデバイスは、コレステロ
ールの測定を目的とる、ものであるが、カラーバントは
、１００〜４００ｍｇ／ａコレステロールに対応る、強
度スペクトルを備えている。目盛４４のような複数の指
示目盛は１図示されているように対応る、被分析物の濃
度を示す。ドツト４５のような外側のドツトの例は濃度
値の５％増分に相当る、。したがって”　１００”、　
”２００″”および”３００″″という濃度値の目盛の
すぐ右側のドツトは、それぞれ“１０５”　。

”　２０５″′および”　３１５　’″の濃度値に対応
る、。スペクトルバンド４２から測定された被分析物の
分析値を補正る、これらドツトの用途については後記の
０章で述べる。

デバイスにおける第２反応領域は、標識５０．５２のよ
うな複数のカラー強度標識で囲まれており。

各々、０〜＋４の範囲の標準補正値に対応る、。

０補正のカラー標識のカラー強度は、最適反応条件下で
、すなわち、カラーを発現る、のに活性な１つ以上の試
薬の活性の損失またはパッドに添加された流体試料によ
るカラー発生反応の阻害によってカラー強度が低下る、
ことなく生成される期待カラー強度である。

各々連続している低い方の強度標識は１反応の阻害およ
び／または酵素の活性の損失の度合が増大した場合に予
想されるカラー強度に対応している。図示された態様に
おいて、各強度目盛は、はぼ５％に相当る、カラー強度
の減少に相当し、すなわち＋４の標識では合計２０％の
阻害に相当る、。

Ｂ、検定成分 第１反応領域で用いられる被分析物特異的成分は、一般
に、被分析物または被分析物から誘導される生成物、あ
る場合には被分析物または被分析物から誘導される生成
物の類似体と有効に、特異的に反応して上記の中間生成
物を生成る、被分析物特異性酵素を含有している。被分
析物特異的成分手段中の成分は、被分析物の存在下で中
間反応生成物を産生ずるのに必要な酵素、コファクター
および（被分析物自体以外の）基質成分のすべてを含有
している。

選択された体液の被分析物に作用して適切な中間反応生
成物を産生ずる。広範囲の酵素もしくは酵素系は公知で
ある。表１は、適切な被分析物オキシダーゼが存在る、
被分析物のいくつかの例を示す。表に示すように、被分
析物自体が、グルコース、尿酸、アミノ酸オキシダーゼ
右よび遊、離の（非エステル結合型）コレステロールの
場合のように、被分析物特異性酵素の基質であってもよ
い。

本願では、被分析物特異性オキシダーゼの試薬はオキシ
ダーゼ酵素のみ含有していてもよい。

あるいは、被分析物は、最初に、主要被分析物特異性酵
素によって変換されて、オキシダーゼ酵素によって認識
される基質を産生じてもよい。この場合、被分析物特異
性オキシダーゼ試薬は、オキシダーゼと、被分析物をオ
キシダーゼの基質に変換る、追加の酵素との両方を含有
している。

エステル化されたコレステロールの場合１例えば、被分
析物特異性オキシダーゼ試薬は、エステル化された形態
のコレステロールを遊離のコレステロールに変換スるコ
レステロールエステラーゼおよび酸素の存在下でコレス
テノンとＨ２Ｏ２とを産生ずるコレステロールオキシダ
ーゼを含有している。

血清トリグリセリド測定用の被分析物特異性第キシダー
ゼ試薬は、トリグリセリドを加水分解してグリセロール
と遊離脂肪酸にる、リパーゼ、グリセロールをＡＴＰの
存在下でグリセロールリン酸に変換る、グリセロールキ
ナーゼ、およびグリセロール−リン酸と反応してジヒド
ロキシアセトン−リン酸とＨ２Ｏ２とを産生ずるグリセ
ロール−リン酸オキシダーゼを含有している。

クレアチニン測定用の被分析物特異性オキシダーゼ試薬
は、クレアチニンを尿素とサルコシンとに変換る、クレ
アチニンアミドヒドロランとに変換る、クレアチニンア
ミドヒドロラーゼと、サルコシンをグリシンとホルムア
ルデヒドとに変換してＨ２Ｏ２を生成る、サルコシンオ
キシダーゼとを含有している。

（以下余白） 表Ｉ 各種の他の被分析物は、被分析物と反応可能な酵素もし
くは酵素系を適切に選択して、適切な基質特異性オキシ
ダーゼで１１２０２を下流で生成させることによって検
定できることは明らかである。あるいは被分析物が、オ
キシダーゼ中の適切な基質と反応可能なオキシダーゼ酵
素であってもよい。

この場合、被分析物特異的オキシダーゼ試薬は。

オキシダーゼ酵素自体ではなく、むしろオキシダーゼ特
異性基質を含有している。

本発明で使用される適切なその他の種類の酵素類には、
ヒドロキシアシルデヒドロゲナーゼ、各種のクレブス回
路デヒドロゲナーゼ類のようなデヒドロゲナーゼ類があ
る。この場合、その中間反応生成物は、還元されたＮＡ
Ｄ、　ＮＡＤＨもしくはＰＡＤである。ＮＡＤＨのよう
な還元されたヌクレオチド補因子は、血液流体試料中に
存在る、ので、試料を反応領域に導入る、前に、補因子
を除去る、必要がある。デバイスがＡ章で述べたように
、試料貯蔵ストリップを備えている場合は、試料が反応
領域に入る前に、試料が移動る、パッドおよび／または
ストリップ内に適切に固定された補因子（コファクター
）酸化剤を含有させることによって。

還元された補因子は触媒的もしくは酵素的に除去され得
る。

各種の他の酵素系としては、被分析物を、被分析物含有
流体試料中には存在せず、かつ検出可能なシグナル生成
物に変換し得る中間反応生成物に変換できるものが適切
である。

反応領域内のシグナル生成反応成分は、一般に。

中間反応生成物と特異的に反応る、酵素および／または
中間反応生成物を利用して検出可能な反応生成物を生成
る、酵素を、１種またはそれ以上含有している。中間反
応生成物としてＨ２Ｏ２を産生ずるオキシダーゼ酵素系
に適切な好ましいシグナル生成成分手段は、ペルオキシ
ダーゼと、　Ｈ２Ｏ２の存在下、ペルオキシダーゼによ
って、明確に着色したシグナル反応生成物に変換される
染料とを含有している。そのペルオキシダーゼ酵素は、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ
。

およびラクトペルオキシダーゼのような過酸化水素酸化
還元酵素であり、この酵素は下記の反応を触媒る、。

供与体＋Ｈ２Ｏ２→酸化供与体＋２Ｈ２Ｏ２供与体に対
る、酵素の特異性は、一般に低く。

いくつかのフェノール類、アミノフェノール類。

ジアミン類およびインドールフェノール類が活性である
。本発明において、供与体もしくは基質試薬は各種の、
公知の化合物もしくは一対の化合物の中から選択される
。この化合物は９反応を受けて、ペルオキシダーゼで触
媒された酸化反応の結果として生成される検出可能な一
般なりロモゲンの反応生成物である。

単一供与体化合物の例としては、０−フェニレンジアミ
ン、アミドピリン（Ａｏｕｉｄｅｔ）　＃よびナフタレ
ン−２，３−ジカルボキシアルデヒド（Ｍａｌａｓｐｉ
ｎａ）がある。一般に９着色反応生成物の形成には、二
量体形成が含まれる。適切な供与体化合物の対の例とし
ては、以下の第一化合物／第二化合物の対が挙げられる
。すなわち、　　５１０ｎｍで吸光極大を示す赤色のキ
ノンイミン発色化合物を生成る、４−アミノアンチピリ
ン（４ＡＡＰ）　／２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロ
ベンセ°ンスルホネー）　　（Ｓｈａｒｍａ）；　４八
八Ｐ／フエノール（Ｋｅｔｔｅｒｍａｎ）：　５１５ｎ
ｍで吸光極大を示すキノンイミン染料を生成る、４ＡＡ
Ｆ’／２．４．６−ドリブロモー３−ヒドロキシ安息香
酸（Ｍｏｓｈｉｄｅｓ）　；４ＡＡＰ／　１１−ヒドロ
キシ安息香酸；および５９０ｎｍで吸光極大を示す化合
物を生成る、３−メチルベンゾチロ アゾリン−２−オンヒドラゾン／３−ジメチルアミノ安
息香酸（Ｋｏｖａｒ）がある。

被分析物を定量測定る、には、生成されるシグナル反応
生成物の量が最初の被分析物の濃度に比例る、ことがも
ちろん重要である。これには次のことが必要である。第
１にシグナル生成物の形成に利用されるＨ２Ｏ２の量が
反応混合物中の被分析物の濃度に依存る、こと、および
第２に生成る、反応生成物の量が、生成る、Ｈ２Ｏ２の
量に依存る、ことである。これらの要件は、被分析物特
異性オキシダーゼ試薬類、ペルオキシダーゼおよび基質
試薬の量を９反応パッド内に最初に導入される被分析物
の量によってのみ必然的に制限される比率で用いること
によって満たすことができる。種々のオキシダーゼ含有
検定系に用いる試薬類の適切な濃度は報告されている（
前記引用文献参照）。下記実施例に記載の血清コレステ
ロール検定デバイス中で用いられている試薬の濃度は代
表的なものである。

その他に、シグナル生成成分手段として適切なものがあ
る。例えば、中間反応生成物が還元されたヌクレオチド
補因子である場合、シグナル生成成分は、ジアホラーゼ
のような適切な還元酵素と。

還元型に変換されると明確に色が変化る、染料とを含有
し得る。

上記のようにして、標準化合物と化合物特異性成分とが
選択され、所定量のシグナル反応生成物が中間反応生成
物を経て生成る、。標準化合物の選択は、下記の条件に
よって行われる。すなわち。

標準化合物は、標準化合物パッドに導入される流体試料
中に測定可能な量で存在しない。第２に。

標準化合物は、適切な化合物特異性反応手段と反応可能
で、所望の中間反応生成物を生成しなければならない。

さらに、好ましい標準化合物は水に容易に溶解る、か、
または反応領域に含有され得る洗剤などによって容易に
可溶化され、シグナル生成物を生成る、反応がその反応
領域で起こるのを阻害している。中間反応生成物がＨ２
Ｏ２である。

一般的な実施態様における好ましい標準化合物は。

Ｄ−グリシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−アラニンのよう
なり−アミノ酸である。この実施態様における化合物特
異性オキシダーゼ成分は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼで
あり、これは０−アミノ酸類に対して特異的である。

上記の検定成分は、既知体積の検定成分溶液をパッドに
添加し１次いで脱水る、こと（例えば。

凍結乾燥）によって、関連る、反応パッドに含有させる
のが好ましい。標準化合物のパッドの場合。

既知量の標準化合物溶液を一つの層に導入し１次いで化
合物特異性成分とシグナル生成成分とを有る、溶液を第
２の層に導入る、。脱水後、２つの層を上記のようにし
て合わせる。

実施例Ｉと２に記載しているデバイスの例は。

全血清コレステロールを測定る、ために設計されている
。第１反応領域中の被分析物特異性反応成分は、コレス
テロールを血清リポタンパクから遊離の（非エステル結
合型）形状で放出る、コレステロールエステルヒドロラ
ーゼと、遊離のコレステロールをコレスデノンとＩＩＪ
。に変換る、コレステロールオキシダーゼとを含有して
いる。第１反応領域におけるシグナル生成成分は、ペル
オキシダーゼと、　）＋２０２の存在下、ペルオキシダ
ーゼで触媒された酸化反応で透明から着色まで変化る、
単一もしくは複数の染料（下記実施例１参照）とを含有
している。

第２反応領域は、Ｄ−アミノ酸、対応る、アミノ酸オキ
シダーゼ、およびＨ２Ｏ２の存在下シグナル生成物を生
成る、上記シグナル生成成分を既知量で含有している。

試薬類と基準化合物の好ましい濃度は、下記の実施例１
で示す。

全血清コレステロール測定用に設計された３領域デバイ
スの例は、上記のデバイスと同じであるが、異なった所
定量のり一アミノ酸を有る、第３反応領域を備えている
。このデバイスの第４の任意の反応領域は、第１反応領
域中同じ検定成分を含有し、シグナル量の再現性の尺度
の基準を提供る、。

以下の表■は、３つの反応領域に存在る、成分と各領域
で起こる反応を示す。

表■ 成分　　　　　　　領域 コレステロールエステラーゼ゛　　　　　十コレステロ
ールオキシターセ＋ ０−アミノ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　十
　十〇−アミノ酸オキシダーセ゛　　　　　　　　　　
十　十生成したＨ２Ｃｂ　　　　　　　　　　　　　＋
　　十十ベルオキシダーセ゛　　　　　　　　　　＋＋
十染料　　　　　　　　　　　　　　　　十　十　土着
色した染料　　　　　　　　　　　　十　十　干上記の
試験デバイスは、全血清コレステロール。

すなわち遊離の（非エステル結合型）形状でリポタンパ
クと会合る、コレステロールと、リポタンパクと会合る
、コレステロールエステル類とを検定る、ために設計さ
れている。このデバイスは。

第４反応領域を、遊離型のコレステロールと反応る、が
エステル結合型コレステロールとは反応しないように変
化させることによって、遊離コレステロールだけおよび
／またはコレステロールエステル類を検定る、ように変
化させることができる。

このデバイスにおいて、第４領域がコレステロールエス
テラーゼを欠いていることを除いて、第１と第４の反応
領域は同一である。４つの反応領域の組成を以下の表■
に示す。全コレステロール。

遊離コレステロールオヨヒエステル結合型コレステロー
ルの補正値を算出る、ために、４つのシグナル値の操作
を、以下の０章に記載る、。

（以下余白） 表■ コしステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋コレステロールオキシダーゼ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　十
〇−アミノ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　十　　十り−アミノ酸オキシダーセ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　＋生
成した１１２０゜　　　　　　　　　　　　＋　十ペル
オキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＋　　＋＋＋染料　　　　　　　　　　　　　
＋　＋＋＋着色した染料　　　　　　　　　　　＋　＋
＋＋この章に記載る、方法は、自動補正式検定方法で２
領域検定デバイスを用いる。この方法によって行われる
被分析物の測定は、使用者が肉眼で測定る、２領域のカ
ラー強度に基づいた定性的なものでも、以下のＦ章に記
載る、１通常の反射率強度の測定値などによってなされ
る定量的なシグナル値の測定に基づいた定量的なもので
もよい。

まず、第１〜３図に例示しているデバイスを用いた２領
域検定法について記載る、。全血液試料のような体液試
料がパッド１５に塗布され、このパッドからの試料がス
トリップから２つの反応領域に吸引される。

血液試料の場合、血球のような、試料中の粒状物質は濾
過され、細胞を含有しない血清だけがパッドに吸引され
る。

第３図は１代表的な反応結果を例示し、この場合、パッ
ド１８と２０の濃淡の差は、パッド反応がほぼ完了した
後のシグナル反応の最終レベルが異なることを示してい
る。各パッドにおけるシグナル生成物の量は、以下に挙
げるような光学的光反射卑怯のようないくつかの公知の
光学的方法で定量的に測定を行うことができる。そして
、この測定は終点測定よりも時間依存性の動力学的測定
（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍ
ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）で行うことができる。

この測定値は、以下に概略説明している第５図のグラフ
に示すステップを用いて、自動補正された被分析物濃度
を計算る、のに用いられる。第２反応領域で測定された
標準化合物のシグナル量は。

第５図のグラフの縦軸の２で示されている。そして、こ
のシグナル量はこの図の横軸のＣで示される被分析物の
既知濃度に対応る、。この単一の標準化合物の値は図に
示すように、グラフ原点からのびる単一標準曲線を得る
ために用いられる。

被分析物の補正された分析値は、第５図におけるＡで示
すように、第１反応領域から得たシグナルの測定値を標
準曲線上にプロットし、グラフ上で対応る、被分析物濃
度を読み取ることによって。

測定る、ことができる。この被分析物の濃度は。

２つの反応領域における共通のシグナル生成成分の阻害
および／またはこの系における酵素活性の損失による。

シグナルが減少る、影響について自動補正されているこ
とは明らかである。曲線によって示される阻害効果は、
標準曲線が、シグナル値／濃度の両軸の原点を通っての
びる直線グラフである点で直線的効果である。

さらに、一般的に述べれば、第２反応領域で認められる
シグナル値の減少は、下記にあげるいずれかの点で、第
１反応領域に認められるシグナル値にもあてはめられる
。

（ａ）試料の阻害もしくは活性効果の損失は、各反応パ
ッドにおける共通のシグナル生成成分に限定される。

（ｂ）試料の阻害、もしくはシグナル生成成分に当ては
められる活性が損失る、影響は、第１反応領域における
被分析物特異性成分と、第２反応領域における化合物特
異性成分とに１等しく当てはめられる。

第４図に記載されている２領域デバイスを用いて被分析
物濃度の定性的測定法を検討る、。上記のように１体液
試料が中央の試料パッドに塗布され、試料は、パッドか
ら第１と第２の領域３４と３６のそれぞれに移行る、。

所定の反応期間の後、好ましくは反応の終点で、シグナ
ル値（この場合。

カラー強度）を１強度スペクトルバンド４２のカラー強
度領域と対比して、補正されていない被分析物の濃度を
１例えば、被分析物（ｍｇ）　／試料流体（ｄｌ）で表
わして測定る、。

同時に、流体試料が第２のパッドに取りこまれると、シ
グナル反応生成物の反応が引き起こされる。その反応の
最終のカラー強度はパッド中の基準化合物の量に依存し
、そしてこの強度は試料の阻害効果および／または試薬
活性の損失によって低下る、。上記Ａ章で述べたように
１　シグナル量の阻害百分率もしくは減少百分率として
、極大の期待シグナル値の０〜２０％の減少にそれぞれ
対応る、０〜＋４を、カラー強度値に定性的に与えるこ
とができる。カラー強度の上記減少百分率は。

上記で述べた因子を条件とした場合に第１領域で認めら
れる減少百分率に近似している。

被分析物の濃度値を第１領域の表示から補正せずに測定
した後、その検定値は次のようにして補正される。（ａ
）未補正値の目盛に最も近い濃度の目盛の外側の輪のド
ツトを確認る、。（ｂ）第２反応領域から測定された補
正値に対応して、右方向に０〜４ドツト進める９次いで
（ｃ）進めた最終ドツトに最も近い濃度を測定る、。こ
の方法は、未補正の被分析物の分析値に加算る、趣旨の
もので、その百分率の増大によって、第２反応領域でδ
忍められた阻害の百分率がほぼ補われる。

例えば、未補正の被分析物濃度値ｒ２７０　Ｊと阻害レ
ベル「＋３」とが、２つの反応領域から最初に測定され
たと仮定る、。その時使用者は「２７０」の目盛に最も
近いドツトを選び、このドツトを右方向に３ドツト進め
、最後のドツトに最も近い目盛を選択る、。この場合、
ｒ３１０ｊという被分析物濃度の補正値が与えられる。

この値は、阻害効果がほとんどない状態で測定された場
合の値である。

Ｄ、　　３領域自動補正式検定方法 本発明の検定方法の第２の実施態様は、２つの標準値の
測定によって得られた標準曲線に基づく方法である。こ
の方法では、上記デバイスが用いられており、試料流体
をデバイスに添加した時に。

第２と第３の反応領域が２つの明確な正の基準値を与え
る。第６図を参照すればわかるように、この実施態様の
方法は、バックグランドのシグナル量について補正る、
だけでなく、非直線形で、競争的な酵素阻害効果および
非直線形で非競争的な酵素阻害効果を補償る、。

第６図は、２点の競争的阻害曲線と２点の非競争的阻害
曲線のグラフを示し、各グラフは、検定デバイスの第２
と第３の反応領域から測定された２つの基準値の点（黒
丸印）を通る直線を引くことによって作成される。図か
られかるように、競争的阻害は、高い基質濃度で阻害を
減少させることが特徴であり、基質濃度がゼロの場合は
、この時の阻害の量を反映してグラフの切片が負になっ
ている。

非競争的阻害を競争的阻害と対照してみると。

非競争的阻害は、基質濃度がゼロの場合の切片はゼロで
あり、基質濃度が高い場合には１次第に阻害が大きくな
るのが特徴である。第６図に破線で示す非線形グラフを
作成る、ことは、標準曲線光てはめ法（Ｓｔａｎｄａｒ
ｄｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　）を
用いれば可能であるが、この曲線は、２つの基準の点（
黒丸印）間に引いた直線のグラフによって。

この２点間の領域に近似させることができる。

第１領域は、バックグランドもしくは競争的阻害につい
ても未補正の被分析物濃度値を与える。

この値を標準２点曲線上にプロットしく白丸印）。

対応る、被分析物濃度を横軸（ａ度）の切片から読み取
る。

この方法の重要な特徴によれば、切片から決定される被
分析物の値が、バックグランドと酵素阻害との両方の影
響について補正される。バックグランドの補正は次のこ
とから独自に行われる。すなわち、第１に、バックグラ
ンドに関与る、同じシグナル値が、３つの読み取り値の
各々に存在る、（もしくは存在る、と推測される）。第
２に。

２つの基準点は、基準化合物の既知の濃度によってプロ
ットされるので、バックグランド効果については両方が
補正される。非競争的阻害の効果は。

同程度の非競争的阻害が各反応領域に存在る、と仮定し
て、２点グラフによって独自に補正される。

この方法の第１の例は、全血清コレステロールを測定る
、例であり、これを第７図に示すシグナル値のグラフを
参照して説明る、。この方法に用いられるデバイスは、
第１図に示す４−領域を有し、最初の３領域は表Ｈに示
す反応成分を含有し。

第４領域は、第１領域と同じ成分を含有している。

すなわち、第１の領域と第４の領域とでは、全血清コレ
ステロールを全く同一に測定る、ように設計されており
、第２の領域と第３の領域とでは。

２つの異なる基準点のシグナル値を与えるよう設計され
ている。

この方法は、先に述べたように、血液試料を中央のパッ
ドに添加し１次いで濾過された血清試料を、４つの反応
領域の各々に吸引させて行われる。

反応中の所々でおよび／または各パッド内の反応がほぼ
完了１．た時に、各パッドのカラー強度が。

例えば光学釣元反射率測定法によって測定される。

４つの領域の各々について測定されたシグナル値は、第
７図の左の線に示している。第２と第３の測定値は、予
め選択された異なるコレステロール濃度に対応る、基準
化合物の量と異なり、これらの値は第７図中のｒＳＴＤ
　Ｊで表わされる。そして、これらの値は第７図に示す
２点標準曲線を作成る、のに用いられている。

第１と第４のシグナル測定値は、全コレステロール値の
値であって、同様の値を示すが、平均されて、その平均
値（白丸印で示す）が標準曲線上にプロットされ、対応
る、コレステロール濃度がその曲線から読み取られる。

（以下余白） 遊離の血清コレステロールと全血清コレステロールを測
定る、第２の方法の例を、第８図に示すシグナル値のグ
ラフを参照して説明る、。この方法に用いられるデバイ
スは、第１図に示す４領域の構成のものであり、その４
つの反応領域は、前記表■に示す反応成分を含有してい
る。この方法は前記したのと同様にして行われる。

各４領域について測定されたシグナル値は、第８図の左
の直線に示しである。第２と第３の測定値は、前記のよ
うに１図中の標準曲線を作成る、のに用いられる。第１
と第４の反応領域は、全コレステロール（第１領域）と
遊離コレステロールのみ（第４領域）について生成る、
シグナル値に対応る、領域であるが１図に示すように１
両者の濃度は、各シグナル値を標準曲線にプロットる、
ことによって決定される。

上記の両実施例において、３領域検定法により。

（ａ）標準曲線から測定され、　（ｂ）ＩＩ争的阻害効
果もしくは非競争的阻害効果と９反応パッド中の試薬活
性の損失によるシク゛ナル活性の低下とについて補正さ
れた被分析物の値が得られる。さらに、上記の始めの方
法は、検定法の信頼性の尺度を与える。

Ｅ、捕捉剤 先に考察したように、従来技術の反応パッド検定システ
ムの限界の一つは、検定る、ことができる被分析物の濃
度の範囲が制限されることであり。

これは比較的低い被分析物の濃度でパッド中のカラーの
飽和がおこるためである。

この問題は１本発明の一実施態様において捕捉剤をシグ
ナル反応成分中に含有させることによって解決された。

この捕捉剤は、シグナル反応生成物の基質（すなわち１
元もしくは２元の染料系）と効果的に競合し、第９図に
示すように、　Ｈ２Ｏ２を利用して、シグナル反応生成
物から区別可能なサイレント反応生成物を生成る、。典
型的には、シグナル生成物は、可視光領域の吸光係数が
仕較的高いが、サイレント反応生成物は、無色かもしく
はわずかに着色している。

したがって捕捉剤は、所定量の被分析物によって生成る
、シグナル反応生成物の量、すなわち所定の波長で検出
されるシグナル反応生成物の量を。

比例して減少させる。捕捉剤の量は、生成されるシグナ
ル反応生成物の量を、捕捉剤なしで生成される量の約１
０〜７０％の間にまで減少させる量であることが好まし
い。

捕捉反応の一般原理を第１０図に示すが、この図には、
血清コレステロール検出用検定デバイス内の第一反応領
域における反応成分とこの領域で形成される生成物が示
されている。上記反応領域中の被分析物特異的成分（コ
レステロールエステラーゼとコレステロールオキシダー
ゼ）と、シグナル生成成分（ペルオキシダーゼ、二元染
料系の一次染料と二次染料および捕捉剤）には下線をつ
けである。同じシグナル生成成分が標準化合物反応領域
に含有されている。

第１０図の反応機構中のシグナル生成物が、被分析物に
依存して減少る、ことを第１１図に示す。第１１図は、
第１反応領域に捕捉剤がある場合（自回角印）とない場
合（黒画角印）の両方について。

測定されたシグナル生成物の生成量を血清コレスチロー
ルの関数としてプロットしたグラフである。

第１１図にみられるように、カラーの飽和（５５０ｎｍ
での反射率で測定）は反射率値が約１．１の時に起こる
。

捕捉剤が存在しない場合、３００〜３５０ｍｇ／Ｊの初
期血清コレステロール濃度でこの値に到達る、。したが
って、３００〜３５０ｍｇ／Ｊという値が、シグナル生
成物の変化が検出可能であるという点で定量可能なコレ
ステロールの最高濃度である。

捕捉剤を含有る、系では、生成されるシグナル生成物の
量は、どの点においても被分析物の濃度に比例しており
、捕捉剤が存在しない場合より一般に、６０〜ｂ よれば、数倍広い範囲にわたってコレステロールを定量
できることを示している。

シグナル反応生成物を被分析物に依存して減少させるに
は、中間反応生成物の捕捉経路での消費が、実際に、シ
グナル反応生成物の生成速度と競合している必要がある
ことは明らかである。捕捉経路での中間反応生成物の消
費速度が低すぎると。

シグナル生成物はほとんど減少しないか全く減少しない
。他方、捕捉経路での中間反応生成物の消費速度が速す
ぎると、少なくとも全捕捉剤が消費されるまで、シグナ
ル生成物はほとんど生成しないか全く生成しない。

中間反応生成物がクエンチングによって著しく速く消費
される系の例は、クエンチング剤としてアスコルビン酸
を使ってＩｔ、０□を急速に分解る、系である。本発明
を裏付けるために行った実験では、Ｈ２０□の分解が非
常に速いので、アスコルビン酸が消費されてしまうまで
事実上シグナル生成物は生成しない。この系の理論的な
挙動は、第１１図に破線で示しである。この場合、シグ
ナル生成物の形成は、クエンチング剤が１１２０□によ
って消費されつくす被分析物の濃度まで事実上抑制され
る。この被分析物の濃度をこえると１反応曲線はこの図
の上方の曲線と類似し、その領域ではシグナル生成物は
、捕捉剤不在下で生成る、。Ｈ２Ｏ２をクエンチる、た
めにカタラーゼを反応パッドに用いた時に同様の結果が
認められた。

したがって迅速クエンチング機構の限界は、第−に、被
分析物が、あるしきい恒量より少ないと検出されないこ
とと、第二に検出可能な被分析物の濃度範囲が、高い値
に移動しているとはいえ。

やはり比較的狭いことである。

・本発明の反応系の一例を第１２図と第１３図に示す。

この場合の染料基質は、二元染料系で、−次基質の４−
アミノアンチピリン（４ＡＡＰ）と二次基質のＮ−エチ
ル−Ｎ−スルホヒドロキシプロピル−ｍ−トルイジン（
ＴＯＯ３）を含有している。Ｈ２Ｏ２の存在下でのペル
オキシダーゼによる触媒反応によって、第１２図の下方
に示す構造を有る、紫色のイミンキノン染料が生成る、
。この化合物は約５５０ｎｍの波長領域に強い吸光度を
有る、。

第１３図には、同じ反応系においてベンゼンジオールの
捕捉染料（１，４−ベンゼンジオールすなわちヒドロキ
ノン）によって起こる反応を示す。図から分かるように
、この場合の捕捉染料は、　４ＡＡＰとの反応について
、　ＴＯＯ３と競合して図の右に示す。

本来、非色原体である生成物を生成る、。生成物の非色
原体性は、非常に電子求引性である環構造キノンの酸素
が環構造の炭素／窒素結合の２重結合性を減少させ、そ
の結果、化合物の可視光領域の吸収に必要な共鳴構造が
効果的に消失していることに起因る、ようである。

捕捉染料が生成されるシグナル生成物の量を減少させる
範囲を支配る、因子には、　ＴＯＯ３とヒドロキシキノ
ンの相対的濃度と、Ｈ２０□とベルオキシダーの存在下
での、これら２成分の４ＡＡＰとの相対的反応性とが含
まれる。一つの系の例では、基質試薬は４ＡＡＰとＴＯ
Ｏ８とを含み、捕捉剤が１，４−ベンゼンジオールで、
捕捉剤の濃度は約０．５〜２　ｍＭ、好ましくは、約１
ｍＭである。

この系で用いられるその他の捕捉剤としては。

Ｈ２Ｏ２とペルオキシダーゼとの存在下、　４ＡＡＰと
反応る、ことが可能で、無色もしくはわずかに着色した
化合物を生成る、各種の置換ベンゼンジオール類とその
類縁化合物が挙げられる。特に、　４ＡＡＰもしくはそ
の誘導体と反応る、ことが可能で、上記のように生成物
の環構造間の共鳴を有効に消失させることができる電子
求引性置換基を有る、化合物が適切である。捕捉剤の例
としては、１．３−ベンゼンジオールと１，４−ベンゼ
ンジオールが挙げられる。

あるいは、上記の２基質系において１捕捉剤は。

ＴＯＯ３との反応について一次基質と競合してシグナル
生成物の生成を減少させてもよい。

その他の一般的な実施態様においては、基質試薬は、典
型的にペルオキシダーゼで触媒される二量体生成反応を
行ってシグナル反応生成物を生成る、単一化合物であり
、捕捉剤はこの二量体反応と競争して、捕捉剤と基質試
薬との結合によってサイレント生成物を形成る、。この
場合、捕捉剤は、上記の単一化合物と反応してサイレン
ト反応生成物を生成る、多数の基質のいずれでもよい。

例えば、０−フェニレンジアミンが単一化合物の基質試
薬として用いられる場合は、捕捉剤はヒドロキノンのよ
うなベンゼンジオールであり得る。

Ｆ、検定装置 その他の局面として９本発明には、水性流体試料中の被
分析物の量を測定る、装置が含まれる。

第１４図は１本発明によって製作された装置５０の概略
図である。

この装置は、ストリップ５４と、第１．第２．第３およ
び第４の反応領域（それぞれ５６．５８．５９および６
０）とを備えた。第１図に記載したのと類似の検定デバ
イス５２を備えている。またこの装置は。

アクチュエータ６４の制御によってスライドる、ことが
でき１反応領域を図中の領域６０が占めている測定位置
に置くデバイスホルダー６２を備えている。

図に示す装置では、シグナル生成物の量が反射分光法で
測定される。この実施態様において、シグナル値を測定
る、手段は、光源６６と反射光検出器６８を備えている
。光源６６は９選択された波長の集束光線７０を測定位
置に送るが、低電力のレーザー、光線が適切なレンズ装
置で集束された単色で非干渉性の光源、　ＬＥＤなどで
あってもよい。検出器６８は、光起電力センサのような
通常の光センサであり、光強度のシグナル値を出力る、
。

検出器６８からのシグナル値は、０章で説明したシグナ
ル値の操作を実行る、デジタルプロセッサ７２に送られ
る。計算手段として、ここで引用されるプロセッサは、
アクチュエータ６４の制御によって、自動的にシグナル
測定る、操作を行うよう設計されたものが好ましい。こ
れらの操作を、第１０図に流れ図形式で示す。最初、ア
クチュエータがプロセッサによって制御され、４つの反
応領域を各反応領域に連続的に置き、そこでシグナル値
が読取られプロセッサのメモリ　（図示せず）に記憶さ
れる。

第１５図中の左側に示すアルゴリズムのステップは前記
の２領域法に用いられ、この場合、第１反応領域が被分
析物の濃度の測定値を与え、第２領域が標準シグナル値
の測定値を与える。上記のアルゴリズムで実行されるス
テップは、（ａ）単一点標準曲線を第２領域の値から作
成し、（ｂ）その標準曲線上に第１領域の値をプロット
し、（ｃ）被分析物の濃度を上記の標準曲線のグラフか
ら決定し１次いで（ｄ）所望の被分析物の濃度値を表示
る、というステップが含まれている。

第１５図中の右側に示すアルコリズムのステップは、２
点標準曲線と被分析物の二重測定とに基づいた上記４領
域法に用いられる。このアルゴリズムで実行されるステ
ップには、（ａ）２点標準曲線を第２と第３の領域の値
から作成し、（ｂ）第１と第４の領域の値の平均値を計
算し、（ｃ）被分析物のシグナル値の平均値を標準曲線
上にプロットし、（ｄ）被分析物の濃度を標準曲線のグ
ラフから決定し９次いで（ｅ）所望の被分析物の濃度値
を表示る、というステップが含まれている。

試料ホルダーを制御し、測定された反射率の値をデジタ
ル化して記録し、そして標準曲線関数を得るのに用いら
れる算術操作と、標準曲線からの被分析物の濃度の決定
とを実行る、ことができるプロセッサの設計は、当業者
にはよく知られていることである。

以下に示す実施例は、全血清コレステロールの定性的な
測定への使用例を示す。これらの実施例は１例示を目的
とる、もので１本発明の範囲を限定る、ものではない。

実施例１ 血清コレステロールの測定：２領域法 第１図に示したのと同様の検定デバイスを以下のように
して作製る、。５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈ
ｕｌｌから入手した１５０ミクロンの厚さの濾紙を２Ｘ
４ｃｍの四角形に裁断る、。これらの四角片の濾紙でデ
バイスの反応領域の上層を作製る、が、その濾紙１枚に
１５０［１／−のコレステロールエステルヒドロラーゼ
、　１００　／ｒｄのコレステロールオキシダーゼ。

８０ｕ／−のペルオキシダーゼ、および、　２０ｍＭの
４−アミンアンチピリン（４−ＡＡＰ）染料と８０ｍＭ
の３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシ安息香酸（ＤＣＨ
ＢＳ）染料（いずれも還元型）を脱イオン水中に含有る
、試薬溶液１０μｌをしみこませる。各反応領域の下層
は。

Ｇｅｌｍａｎ社から人手した５０ミクロン厚のガラス繊
維フィルターから裁断した同じ寸法の四角片で作製る、
。この層には、１０μβの０．１５ｍＭ　Ｏ−プロリン
をしみこませる。

第２反応領域の四角片には、　２５Ｕ／ｄのＤ−アミノ
酸オキシダーゼ、　８０ｕ／ｍｌ！のペルオキシダーゼ
、および、　２０ｍＭの４−アミノアンチピリン（４−
ＡＡＰ）染料と８０ｍＭの３．５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシ安息香酸（ＤＣＨＢＳ）染料（いずれも還元型）
を脱イオン水中に含有る、試薬溶液１０μβをしみこま
せる。次に。

各反応領域の下層には、上記したのと同様に１０μｌの
０．１５ｍＭ　Ｏ−プロリンをしみこませる。

減圧下で乾燥した後、これらの下層を関連る、上層の四
角片に対して置き、２つの反応領域を。

Ｗｈａｔｍａｎ社から入手したガラス繊維フィルターの
５０ミクロン厚［３ｘ２Ｑ＋＋＋ｍのストリップの両側
に付け。

１ミクロンの大きさの微細孔を有る、ポリカーボネート
膜をストリップとの間に入れる。

全血の試料をヒトの被検体から通常の方法で採取し、ス
トリップ上の３つの反応領域を湿潤させるのに充分な量
をストリップに塗布る、。このストリップを９０秒間ま
たは発色が認められなくなるまで室温で保持る、。

被分析物関連のシグナルを９反射分光法を用い。

５００ｎｍの照射波長で読取る。第２反応領域の値を。

第２領域に生理食塩水をしみこませて（すなわち。

この場合血清成分による阻害が避けられる）得たシグナ
ル値と比較して、血清成分の阻害による阻害百分率を測
定した。

予め決められた標準曲線から血清コレステロール濃度を
決定る、ために、第１反応領域からの値を用いる。この
標準曲線は非イオン性界面活性剤中の既知濃度のコレス
テロール溶液の所定体積を。

第１反応領域と同じ成分を有る、反応パッドに添加る、
ことによって作成される。次に曲線から計算されたコレ
ステロールの濃度は、第２領域の阻害値を用いて血清阻
害効果について補正される。

実施例２ 血清コレステロールの測定：３領域法 検定デバイスは、３つの反応領域が上記表■に示す成分
を含有る、ことを除いて実施例１で用いた装置と同様で
ある。血清試料を導入し９反応シグナル値を実施例１と
同様にして測定る、。

第１．第２．第３および第４の反応領域の値（第８図の
左側に１．　２．　３および４と標識を付けた）を上記
と同様にして５００ｎｍで測定した。第２と第３領域の
シグナル値を、第８図に示すように対応る、標準化合物
の濃度にプロットして、非競争阻害をあられす標準曲線
を得る。第１領域からのシグナル値をこの曲線上にプロ
ットし、補正された被分析物の濃度を濃度軸上の対応る
、位置から読み取る。

第４反応領域は、コレステロールエステラーゼを除いて
、第１領域の全成分を含有している。したがって、この
第４領域から得たシグナル値は。

遊離の血清コレステロールだけを反映る、。その理由は
、流体試料中のエステル化されたコレステロールは、利
用る、ために放出されないからである。この領域から得
たシグナル値を、第８図に示すように２点標準曲線上に
プロットして、被分析物の遊離血清コレステロールの濃
度を決定る、。

エステル化されたコレステロールの濃度は（１〜４）の
シグナル値から決定る、ことができる。

上記のことから１本発明の種々の目的と特徴がいかに合
致しているか明らかである。被分析物の試験デバイスは
、使用法が簡単で、典型的に単一の流体試料をフィルタ
ーストリップ上に置くだけでよい。この試験デバイスを
、シグナルを読取って計算る、装置の部品として用いる
ので、使用者が、試料を扱ったり、または計算る、ステ
ップを追加る、ことなしに、所望の被分析物の濃度値が
得られる。

得られた被分析物の濃度値は、バックグランドについて
補正された標準曲線に基づいたものである。すなわち１
　この検定法は７通常のストリップ型もしくは固体の支
持大径の検定法に不正確さとばらつきをもたらす、試薬
の鮮度と状態、試料の組成、および温度のような反応条
件について自動補正されている。さらに、補正され標準
化された検定値を計算る、のに、２つのシグナル値だけ
しか必要でない。

本発明では、特定の実施態様と使用法を参考として説明
したが１種々の変更と変形が本発明から逸脱る、ことな
〈実施され得ることは理解される。

（以下余白） （発明の要約） 流体試料中の被分析物の濃度を決定る、ための検定デバ
イス（１０）と、方法とが提供される。上記デバイスは
、流体試料を受け入れる少なくとも２つの反応領域（１
８，２０）を有し、各反応領域は１反応中間生成物を検
出可能な反応生成物に変換る、同一のシグナル生成成分
を含有る、。中間生成物がＨ２Ｏ。である場合、シグナ
ル生成成分はさらに捕捉剤化合物を含有し得る。この捕
捉剤化合物は。

検出可能なシグナル生成物の基質と競争的に反応してサ
イレント反応生成物を生成し、生成る、検出可能な反応
生成物の量を比例的に減少させる。

２つの反応領域を有る、デバイスの一実施態様では、第
２の領域で生成る、シグナルは、試薬活性の損失に関連
してシグナルが減少る、影響および直線的な阻害効果に
ついての補正を行う標準曲線を作成る、ために用いられ
る。３つの反応領域を有る、一実施態様では、第２およ
び第３領域で生成されるシグナル生成物は、２点標準曲
線を作成る、ために用いられる。２点標準曲線は、試薬
活性の損失に関連してシグナルが減少る、影響および非
直線的阻害効果についての補正を行う。各実施態様にお
いて第１領域から得られるシグナル値が標準曲線上にプ
ロットされて、補正された被分析物の濃度値が決定され
る。

４、“　の“　な舌゛日 第１図は１本発明の一態様によって構成されるストリッ
プ形検定デバイスを示す。

第２図は、第１図の２−２線による。第１図のデバイス
の拡大断面図を示す。

第３図は、第１図に示すストリップで得られた代表的な
カラー強度の試験結果を示す。

第４図は１本発明の他の態様に基づいた。被分析物の定
性測定に用いられる検定デバイスを示す。

第５図は５本発明の方法により、単一点標準曲線から被
分析物の濃度を計算る、のに用いるシグナル／濃度のグ
ラフを示す。

第６図は１本発明の方法の他の態様に基づいて１２点標
準曲線から被分析物の濃度を計算る、のに用いるシグナ
ル／濃度のグラフを示す。

第７図は、全血清コレステロールを測定る、４領域検定
法の使用を示す。

第８図は、全血清コレステロールと遊離血清コレステロ
ールとを測定る、４領域検定法の使用を示す。

第９図は、捕捉剤を含有る、本発明の態様における。一
般的反応成分と生成される生成物とを示す。

第１０図は、第９図に示す成分を含有る、装置で血清コ
レステロールを測定る、だめの反応機構を示す。

第１１図は、捕捉剤が存在しない場合（黒画角印）と存
在る、場合（内凹角印）のコレステロール濃度の関数と
しての反射率の測定値のグラフを示す。

第１２図は、Ｈ２Ｏ。とペルオキシダーゼの存在下で着
色反応生成物を生成る、２つの染料成分の反応を示す。

第１３図は、捕捉剤の存在下で第１２図の反応と競合し
て無色の反応生成物を生成る、捕捉反応を示す。

第１４図は７本発明によって製作された検定装置の概略
図である。

第１５図は１本発明の単一点標準曲線法と２点標準曲線
法を用いて全被分析物濃度を測定る、ために、第１４図
の装置内のプロセッサが実行る、動作の流れ図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性流体試料中の被分析物の濃度を測定するための
   検定デバイスであって、 第１反応領域および第２反応領域を有し、 該第１反応領域が、被分析物を含有する流体試料を添加
   したときに、被分析物を有効に利用して中間反応生成物
   を生成する被分析物特異的成分手段と；該中間反応生成
   物を有効に利用して、該流体試料中に存在する被分析物
   の濃度に依存する測定可能な値を有するシグナル反応生
   成物を生成するシグナル生成成分手段とを有し；そして
   、該第２反応領域が、 該水性流体試料中には存在しない標準化合物の既知量と
   ；被分析物を含有する流体試料を添加した時に、標準化
   合物を有効に利用して該中間反応生成物を生成する化合
   物特異的成分手段と；該中間反応生成物を有効に利用し
   て、該第２反応領域に存在する標準化合物の濃度に依存
   する、測定可能なシグナル値を有するシグナル反応生成
   物を生成するシグナル生成成分手段と；を有する； 検定デバイス。 ２、前記反応領域が、表面の湿潤によって、流体試料を
   反応領域に吸引するように設計された多孔性マトリック
   スの領域であり；さらに流体試料を受け入れて該反応領
   域に分配するための貯槽部を、２つの反応領域に接触し
   て備えている、請求項１に記載のデバイス。 ３、前記第２反応領域が２層で構成され、その一方が標
   準化合物を含有し、そして他方が前記化合物特異的成分
   手段を含有する、請求項２に記載のデバイス。 ４、前記第２反応領域に存在するのとは異なる量の前記
   標準化合物と、前記化合物特異的成分手段と、前記シグ
   ナル生成成分手段とを有する第３反応領域をさらに備え
   た、請求項１に記載のデバイス。 ５、前記被分析物特異的反応手段が、被分析物と有効に
   反応して中間反応生成物Ｈ＿２Ｏ＿２を生成し；前記化
   合物特異的成分手段が、標準化合物と有効に反応してＨ
   ＿２Ｏ＿２を生成し；そして、前記シグナル生成成分が
   、ペルオキシダーゼ酵素と、Ｈ＿２Ｏ＿２の存在下でペ
   ルオキシダーゼ酵素によって前記シグナル反応生成物に
   変換され得る基質試薬とを有する；請求項１に記載のデ
   バイス。 ６、前記シグナル生成成分が、さらに捕捉剤を含有し、
   該捕捉剤が、ペルオキシダーゼ酵素の存在下で、基質試
   薬と有効に競合し、Ｈ＿２Ｏ＿２を利用することによっ
   てシグナル反応生成物とは区別可能なサイレント反応生
   成物を生成し、その結果、所定量の被分析物により生成
   するシグナル反応生成物の量が比例して減少する、請求
   項５に記載のデバイス。 ７、前記捕捉剤が、前記シグナル反応生成物の量を、被
   分析物の濃度の関数として、捕捉剤が存在しない場合に
   生成するシグナル反応生成物の量の約１０〜７０％にま
   で減少させるのに有効な量で、前記マトリックス中に存
   在する、請求項６に記載のデバイス。 ８、前記基質試薬が、Ｈ＿２Ｏ＿２およびペルオキシダ
   ーゼの存在下で結合してシグナル反応生成物を形成する
   第１および第２の化合物で構成され、そして、前記捕捉
   化合物が、Ｈ＿２Ｏ＿２とペルオキシダーゼとの存在下
   で、第１化合物との反応において第２化合物と競合し、
   前記サイレント反応生成物を生成する、請求項６に記載
   のデバイス。 ９、前記標準化合物がＤ−アミノ酸であり、そして、前
   記化合物特異的成分手段がＤ−アミノ酸オキシダーゼを
   含有する、請求項５に記載のデバイス。 １０、前記被分析物特異的成分手段がコレステロールエ
   ステルヒドロラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ
   を包含する、血清コレステロール測定用の、請求項５に
   記載のデバイス。 １１、コレステロールオキシダーゼを含有するがコレス
   テロールエステラーゼを含有せず、そして前記化合物特
   異的成分手段を含有する第３反応領域をさらに備えた、
   全血清コレステロールおよび遊離血清コレステロールの
   両者を測定するための、請求項５に記載のデバイス。 １２、水性流体試料内の被分析物の量を測定するための
   装置であって、 検定デバイス、シグナル検出器およびプロセッサ手段を
   包含し、 該検定デバイスが、第１、第２および第３反応領域およ
   び分配手段を有し、水性流体試料内の被分析物の濃度を
   測定する検定デバイスであり、該第１反応領域が、（ａ
   ）被分析物を含有する流体試料を添加したときに、被分
   析物を有効に利用して中間反応生成物を生成する被分析
   物特異的成分手段と；該中間反応生成物を有効に利用し
   て、該流体試料中に存在する被分析物の濃度に依存する
   測定可能な値を有するシグナル反応生成物を生成するシ
   グナル生成成分手段とを有し；該第２反応領域が、（ｂ
   ）該水性流体試料中には存在しない標準化合物の既知量
   と；被分析物を含有する流体試料を添加した時に、標準
   化合物を有効に利用して該中間反応生成物を生成する化
   合物特異的成分手段と；該中間反応生成物を有効に利用
   して、該第２反応領域に存在する標準化合物の濃度に依
   存する測定可能なシグナル値を有するシグナル反応生成
   物を生成する該シグナル生成成分手段とを有し；該第３
   反応領域が、（ｃ）第２領域内の標準化合物の量とは異
   なる量の該標準化合物と、該化合物特異的成分手段と、
   該シグナル生成成分手段とを有し；該分配手段が、（ｄ
   ）該流体試料を該３つの反応領域の各々に、各反応領域
   における被分析物の濃度が実質的に同一となるように分
   配する手段であり該シグナル検出器が該３つの各反応領
   域のシグナル値を測定するためのシグナル検出器であり
   ；該プロセッサ手段が、（ａ）標準化合物の濃度と測定
   されたシグナル値との関係、および（ｂ）そのように決
   定された関係を用いて第１反応領域の被分析物の濃度、
   を３つの反応領域のシグナル値から決定するプロセッサ
   手段である； 装置。 １３、前記反応領域が、表面の湿潤によって、前記流体
   試料を反応領域に吸引するよう設計された多孔性マトリ
   ックスの領域であり、そして前記分配手段が、流体試料
   を受け入れて該反応領域に分配するための貯槽部を、３
   つの領域に接触して備えている、請求項１２に記載の装
   置。 １４、前記シグナル検出器が、各領域を光線で照らすた
   めの光源と、照らされた領域からの光の反射率の強度を
   測定するための光線検出器とを備えている、請求項１２
   に記載の装置。 １５、前記プロセッサ手段が、（ａ）第２および第３反
   応領域で測定されたシグナル値を用いて、標準化合物の
   濃度および測定されたシグナル値との補正された関係を
   決定し、そして、（ｂ）第１反応領域で測定されたシグ
   ナル値と、被分析物の濃度および測定されたシグナル値
   の補正された関係とを用いて、流体試料中の被分析物の
   濃度を決定するように設計されている、請求項１４に記
   載の装置。 １６、水性流体試料中の被分析物の量を測定する方法で
   あって、 第１および第２の反応領域に流体試料を分配する工程； 該第１および第２の反応領域のシグナル値を測定する工
   程； 該第２反応領域の測定されたシグナル値から補正係数を
   決定する工程；および 該第１反応領域の測定されたシグナル値および補正係数
   から、上記２つの反応領域において、阻害および活性損
   失の影響について補正された被分析物の濃度値を測定す
   る工程； を包含し； 該第１反応領域が、被分析物を含有する流体試料を添加
   したときに、被分析物を有効に利用して中間反応生成物
   を生成する被分析物特異的成分手段と；該中間反応生成
   物を有効に利用して、該流体試料中に存在する被分析物
   の濃度に依存する測定可能な値を有するシグナル反応生
   成物を生成するシグナル生成成分手段とを有し； 該第２反応領域が、該水性流体試料中には存在しない標
   準化合物の既知量と；被分析物を含有する流体試料を添
   加した時に、標準化合物を有効に利用して該中間反応生
   成物を生成する化合物特異的成分手段と；該中間反応生
   成物を有効に利用して、該第２反応領域に存在する標準
   化合物の濃度に依存する測定可能なシグナル値を有する
   シグナル反応生成物を生成するシグナル生成成分手段と
   ；を有する； 方法。 １７、前記シグナル値が色を基とした値であり、前記補
   正ファクターが第２領域において期待される最適カラー
   強度の減少の割合（％）で示され、そして、補正された
   被分析物の濃度の決定が、前記第１領域のカラー強度か
   ら決定された未補正の被分析物濃度に上記補正ファクタ
   ーを加えて行われる、被分析物の濃度を定性測定するた
   めの、請求項１６に記載の方法。 １８、前記第２反応領域からの測定されたシグナル値が
   単一点標準曲線を作成するのに使用され、そして、補正
   された被分析物の濃度が、第１反応領域から得られたシ
   グナル値を上記標準曲線上にプロットすることによって
   決定される、被分析物の濃度を定性測定するための、請
   求項１６に記載の方法。 １９、前記流体試料が、異なる既知量の標準化合物を含
   有することを除いては第２領域と同様の第３反応領域に
   分配され、該第２および第３の領域で測定されたシグナ
   ル値が２点標準曲線を作成するのに用いられ、そして補
   正された被分析物の濃度が第１反応領域からのシグナル
   値を上記標準曲線上にプロットすることによって決定さ
   れる、被分析物の濃度を定性測定するための、請求項１
   ６に記載の方法。 ２０、前記被分析物特異的成分手段が、コレステロール
   被分析物の存在下で中間反応生成物のＨ＿２Ｏ＿２を生
   成するためのコレステロールエステルヒドラーゼおよび
   コレステロールオキシダーゼを含有し、前記化合物特異
   的成分手段が標準化合物と有効に反応してＨ＿２Ｏ＿２
   を生成し、そして、前記シグナル生成成分手段がペルオ
   キシダーゼと、Ｈ＿２Ｏ＿２の存在下でペルオキシダー
   ゼによって明確に着色したシグナル反応生成物に変換さ
   れる染料とを含有する、血清コレステロールを測定する
   ための、請求項１９に記載の方法。