JPH02296000A - 血管形成作用を有するタンパク質，そのタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法，そのタンパク質を含む治療用組成物，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定する方法，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定するための免疫学的反応物，そのタンパク質の相同物，および，そのタンパク質の断片 - Google Patents
血管形成作用を有するタンパク質，そのタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法，そのタンパク質を含む治療用組成物，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定する方法，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定するための免疫学的反応物，そのタンパク質の相同物，および，そのタンパク質の断片Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
本発明は、血管形成作用（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃ
ｔｉｏｎ）を有する約１７ＫＤの新規なタンパク質、そ
のタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法、そのタ
ンパク質を含む治療用組成物、哺乳動物のアンジオジェ
ニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎｓ）を検出および／または
測定する方法、哺乳動物のアンジオジェニンを検出およ
び／または測定するための免疫学的反応物。
ｔｉｏｎ）を有する約１７ＫＤの新規なタンパク質、そ
のタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法、そのタ
ンパク質を含む治療用組成物、哺乳動物のアンジオジェ
ニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎｓ）を検出および／または
測定する方法、哺乳動物のアンジオジェニンを検出およ
び／または測定するための免疫学的反応物。
そのタンパク質の相同物（ｈｏｏ＋ｏｌｏｇｓ） 、お
よび、そのタンパク質の断片（ｆ ｒａｇｍｅｎ ｔｓ
）に関する。
よび、そのタンパク質の断片（ｆ ｒａｇｍｅｎ ｔｓ
）に関する。
（従来技術およびその問題点）
フォークマン（Ｊ、 ＦＯＬＫＭＡＮ）は、腫瘍の成長
には相当量の血液供給が必要であり、その供給は血管が
新たに継続的に形成されることによって達成されること
を明らかにするという先駆的業績（ｑ、ν。
には相当量の血液供給が必要であり、その供給は血管が
新たに継続的に形成されることによって達成されること
を明らかにするという先駆的業績（ｑ、ν。
Ｊ、 Ｅｘｐ、’ Ｍｅｄ、、 １３３．２７５（１９
７１））に続いて、その形成は彼が゛’ＩＩＩ瘍血管形
成因子（Ｔｕｎ＋ｏｒ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｆ
ａｃｔｏｒ”（ＴＡＦ）と名づけだ拡散性の物質の存在
に起因することを示唆した。血管形成を促進する複数の
タンパク質が分離された５ｃｉｅｎｃｅ、 （１９８７
）、 ２３５，４４２ 、これらの物質の中、ヒト８原
（ｈｕｍａｎ ｏｒｉｇｉ口）のタンパク質であるアン
ジオジェニンは、バレー（ＶＡＬＬＥＥ）のチームによ
って精製され、その遺伝子がクローン化された。１９８
５年、フェット（Ｊ、 Ｗ、 ＦＥＴＴ）らは、培養さ
れたヒトの癌性腸細胞からヒトのアンジオジェニンを分
離した（Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 （１９８５）、 ２４．
５４８０−５４８６） 、 Ｉｌ！細胞ＨＴ２９は、培
地中にヒトのアンジオジェニンを放出する。これらの無
血清培地からは、０．５μｇ／ｌのヒトのアンジオジェ
ニンが分離された。バレーのチームは当初、ブラッドフ
ォードの方法Ａｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、。
７１））に続いて、その形成は彼が゛’ＩＩＩ瘍血管形
成因子（Ｔｕｎ＋ｏｒ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｆ
ａｃｔｏｒ”（ＴＡＦ）と名づけだ拡散性の物質の存在
に起因することを示唆した。血管形成を促進する複数の
タンパク質が分離された５ｃｉｅｎｃｅ、 （１９８７
）、 ２３５，４４２ 、これらの物質の中、ヒト８原
（ｈｕｍａｎ ｏｒｉｇｉ口）のタンパク質であるアン
ジオジェニンは、バレー（ＶＡＬＬＥＥ）のチームによ
って精製され、その遺伝子がクローン化された。１９８
５年、フェット（Ｊ、 Ｗ、 ＦＥＴＴ）らは、培養さ
れたヒトの癌性腸細胞からヒトのアンジオジェニンを分
離した（Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 （１９８５）、 ２４．
５４８０−５４８６） 、 Ｉｌ！細胞ＨＴ２９は、培
地中にヒトのアンジオジェニンを放出する。これらの無
血清培地からは、０．５μｇ／ｌのヒトのアンジオジェ
ニンが分離された。バレーのチームは当初、ブラッドフ
ォードの方法Ａｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、。
１９７５、７２．２４８−２５４．標準としてＳＡＢを
用いる染色固定法）により、その後、シャピロ（ＳＨＡ
ＰＩＲＯ）らによりＢｊｏｃｈｅｔａ、、 １９Ｂ６．
２５．３５２７．３７３２に記載された方法により、ア
ンジオジェニンの濃度を決定した。そのアミノ酸配列は
、ストリドム（ＳＴｌ？Ｙ［ｌＯＭ） らによって決定
された（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、 （１９８５）。
用いる染色固定法）により、その後、シャピロ（ＳＨＡ
ＰＩＲＯ）らによりＢｊｏｃｈｅｔａ、、 １９Ｂ６．
２５．３５２７．３７３２に記載された方法により、ア
ンジオジェニンの濃度を決定した。そのアミノ酸配列は
、ストリドム（ＳＴｌ？Ｙ［ｌＯＭ） らによって決定
された（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、 （１９８５）。
２４、 ｐ、 ５４８６−５４９４）。
ヒトのアンジオジェニンは、分子量１４．４００ Ｄの
タンパク質である。
タンパク質である。
ヒトの腫瘍細胞から分離されるアンジオジェニンは、１
２３個のアミノ酸を含むタンパク質の１本の鎖から構成
され、以下の配列を有するコＧ Ｉｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｒ ｉｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
”−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
Ａｓｐ−八ｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−５
ｅｒ−１１ｅ−Ｍｅｔ”−Ａｒｇ−八ｒｇ−＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｐ−１１ｅＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ”−１１ｅ
−Ｈｉｓ−ＧＩｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−
１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｎ−Ｌｙｓ”−＾５ｎ−Ｇｌｙ＾ｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−八ｒｇ−ｒｌｅ
−５ｅｒ−ＬｙｓＳｅｒ−３ｅｒ”−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＬｅｕＨｉ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ
”−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＧｌｎＴｙｒ−Ａｒｇ−へ１ａ−
Ｔｈｒ−八ｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｖａ Ｉ ’ ”−Ａ ｌａ−Ｃｙｓ−
Ｇ Ｉｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇ Ｉｎ−５ｅｒ−１１
ｅ−Ｐｈｅ ’ ｚｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ ’
！’−０１ｌＣ末端アミノ酸はプロリンであり、３つの
ジスルフィド架橋がシスティン２６−８１．３９−９２
および５７−１０７を結合している。
２３個のアミノ酸を含むタンパク質の１本の鎖から構成
され、以下の配列を有するコＧ Ｉｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｒ ｉｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
”−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
Ａｓｐ−八ｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−５
ｅｒ−１１ｅ−Ｍｅｔ”−Ａｒｇ−八ｒｇ−＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｐ−１１ｅＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ”−１１ｅ
−Ｈｉｓ−ＧＩｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−
１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｎ−Ｌｙｓ”−＾５ｎ−Ｇｌｙ＾ｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉ
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−５ｅｒ−ＬｙｓＳｅｒ−３ｅｒ”−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＬｅｕＨｉ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ
”−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＧｌｎＴｙｒ−Ａｒｇ−へ１ａ−
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ｌ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇ Ｉｎ−５ｅｒ−１１
ｅ−Ｐｈｅ ’ ｚｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ ’
！’−０１ｌＣ末端アミノ酸はプロリンであり、３つの
ジスルフィド架橋がシスティン２６−８１．３９−９２
および５７−１０７を結合している。
ヒトのアンジオジェニンの配列は、ヒトの膵臓リボヌク
レアーゼの配列、特にＲＮＡ分解活性に必須のアミノ酸
に関し、３５１％が各々相同である（ｑ 、 ｖ。
レアーゼの配列、特にＲＮＡ分解活性に必須のアミノ酸
に関し、３５１％が各々相同である（ｑ 、 ｖ。
ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、 （１９８５）、 ２４
．５４９４−５４９９． ＫＵＲＡＣＨｒｅｔ ａｌ、
）。ヒトのアンジオジェニンの活性は相当のものがある
。というのは、５０ｎｇすなわち３．５ｐｉｃｏａ＋ｏ
１でラビットの角膜の血管新生（ｖａｓｃｕｌａｒｉ
ｚａｔｉｏｎ）をおこすことができ、３５ｆｅａｅｔｏ
ｍｏｌでニワトリの胚の血管新生を誘導することができ
るからである。
．５４９４−５４９９． ＫＵＲＡＣＨｒｅｔ ａｌ、
）。ヒトのアンジオジェニンの活性は相当のものがある
。というのは、５０ｎｇすなわち３．５ｐｉｃｏａ＋ｏ
１でラビットの角膜の血管新生（ｖａｓｃｕｌａｒｉ
ｚａｔｉｏｎ）をおこすことができ、３５ｆｅａｅｔｏ
ｍｏｌでニワトリの胚の血管新生を誘導することができ
るからである。
ヒトのアンジオジェニンがクローニングにより得られる
ことが知られている。ヒトのアンジオジェニンの情報を
コード化した遺伝子をクローニングすることにより、適
当な発現系（ｅｘρｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓ ｔｅ＋ｍ
ｓ）を利用して、充分な量のアンジオジェニンを得るこ
とができる。しかしこの方法には費用がかかる。
ことが知られている。ヒトのアンジオジェニンの情報を
コード化した遺伝子をクローニングすることにより、適
当な発現系（ｅｘρｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓ ｔｅ＋ｍ
ｓ）を利用して、充分な量のアンジオジェニンを得るこ
とができる。しかしこの方法には費用がかかる。
以上、ヒトのアンジオジェニンと同様の諸特性を有し、
その調製方法が簡易かつ安価である化合物を追求するこ
とが必要である。
その調製方法が簡易かつ安価である化合物を追求するこ
とが必要である。
（発明の目的）
すなわち、本発明の目的は、ヒトのアンジオジェニンと
同様の諸特性を有し、容易に実施されかつ高い収量をも
たらす安価な手段によって取得される新規なタンパク質
をｔ１供することである。
同様の諸特性を有し、容易に実施されかつ高い収量をも
たらす安価な手段によって取得される新規なタンパク質
をｔ１供することである。
本発明の他の目的は、従来技術の方法の欠点を克服した
、上記タンパク質の取得のための新規な方法を蓑供する
ことであり、実際、この新規な方法によれば上記タンパ
ク質を大量にしかも極めて低コストで取得できる。この
ことは、本タンパク質を含む薬剤組成物を工業的に生産
する上で極めて有利な点である。
、上記タンパク質の取得のための新規な方法を蓑供する
ことであり、実際、この新規な方法によれば上記タンパ
ク質を大量にしかも極めて低コストで取得できる。この
ことは、本タンパク質を含む薬剤組成物を工業的に生産
する上で極めて有利な点である。
本発明の他の目的は、上記タンパク質を含む薬剤組成物
を提供することである。
を提供することである。
本発明の他の目的は、生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｆｌｕｉｄｓ）中の哺乳動物のアンジオジェニン、
その相同物およびその断片を検出および測定するための
反応物（Ｂｇｅｎ ｔ）を提供することである。
ａｌｆｌｕｉｄｓ）中の哺乳動物のアンジオジェニン、
その相同物およびその断片を検出および測定するための
反応物（Ｂｇｅｎ ｔ）を提供することである。
本発明の他の目的は、上記流体中の上記タンパク質を検
出および測定するための用具−弐を提供することである
。
出および測定するための用具−弐を提供することである
。
（発明の要約）
本発明は、１２５個のアミノ酸を含む配列を有し、以下
の化学式（Ｉ）。
の化学式（Ｉ）。
Ａｌａ’−Ｇｉｎ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｔｙｒ’−Ａｒｇ
−Ｔｙｒ−１１ｅ−■５−Ｐｈｅ”Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｈ１ｓ−Ｔｙｒ”−Ａｓｐ−Ａ ｌａ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ”Ｇｌｙ−Ａｒｇ−＾ｓｎ−Ａｓｐ
−ＧｌｕｚＳ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｍｅ
ｔ３０Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ” −
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ ”Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ４Ｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ
−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ５０Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−１１ｅ−Ｌｙｓ”−＾１ａ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ＆０＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ
１′−Ｔｙｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ”Ａｒ
ｇ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ”−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ″ＯＩ Ｉｅ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｈ１ｓ−Ｌｙｓ １ｌＳ−Ｇ １ｙ−Ｇｌｙ−３
ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ９０Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ” −Ｇ １ｙ−Ａ ｌａ−Ｔｈｒ−Ｇ
１ ｕ−Ａｓｐ ” ’５ｅｒ−八ｒｇ−へａｌ−１１
ｅ−Ｖａｌ ’ ”−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｓｎ” ’Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）１
ｉｓ” ’−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｈｅ
”’１ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−八ｒｇ−Ｈｉｓ”’−Ｏ
Ｈへ 。
−Ｔｙｒ−１１ｅ−■５−Ｐｈｅ”Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｈ１ｓ−Ｔｙｒ”−Ａｓｐ−Ａ ｌａ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ”Ｇｌｙ−Ａｒｇ−＾ｓｎ−Ａｓｐ
−ＧｌｕｚＳ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｍｅ
ｔ３０Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ” −
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ ”Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ４Ｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ
−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ５０Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−１１ｅ−Ｌｙｓ”−＾１ａ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ＆０＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ
１′−Ｔｙｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ”Ａｒ
ｇ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ”−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ″ＯＩ Ｉｅ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｈ１ｓ−Ｌｙｓ １ｌＳ−Ｇ １ｙ−Ｇｌｙ−３
ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ９０Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ” −Ｇ １ｙ−Ａ ｌａ−Ｔｈｒ−Ｇ
１ ｕ−Ａｓｐ ” ’５ｅｒ−八ｒｇ−へａｌ−１１
ｅ−Ｖａｌ ’ ”−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｓｎ” ’Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）１
ｉｓ” ’−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｈｅ
”’１ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−八ｒｇ−Ｈｉｓ”’−Ｏ
Ｈへ 。
で表わされ、その配列中８１個のアミノ酸がヒトのアン
ジオジェニンと共通であり、その分子量がおよそ１７Ｋ
Ｄであるタンパク質に関する。
ジオジェニンと共通であり、その分子量がおよそ１７Ｋ
Ｄであるタンパク質に関する。
上記分子量は、上記ウシのタンパク質の電気泳動による
移動速度を、以下の標準物質の移動速度と比較すること
により評価された：すなわち、ミオグロビン（ＭＷ：
１７．２００） ミオグロビン１＋２（ＭＷ：１４．
６００）、ミオグロビン＾（ＭＷ： ８２４０）、ミオ
グロビン２（Ｈ： ６３８０）、ミオグロビン３（？Ｉ
Ｗ： ２５６０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
移動速度を、以下の標準物質の移動速度と比較すること
により評価された：すなわち、ミオグロビン（ＭＷ：
１７．２００） ミオグロビン１＋２（ＭＷ：１４．
６００）、ミオグロビン＾（ＭＷ： ８２４０）、ミオ
グロビン２（Ｈ： ６３８０）、ミオグロビン３（？Ｉ
Ｗ： ２５６０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
上記１７ＫＤたんばく質の組成には、全酸加水分解によ
る決定によれば、以下のアミノ酸がそれぞれ示された割
合で含まれている： Ｐｈｅ： ６． Ｌｅｕ： ４． ｌｉｅ： ９．
Ｍｅｔ： ２． Ｖａｔ： ４゜Ｐｒｏ： ７＋
Ｓｅｒ： ６＋ Ｔｈｒ： ６＋ Ａｌａ： ４
＋ Ｔｙｒ： ６Ｈｉｓ： ６＋ Ｇｌｕ（Ｇｉｎ）
： １０＋ Ａｓｐ（Ａｓｎ）： １６＋ｌｙｓ：
９＋ 八ｒｇ： １５． Ｇｌｙ： ９
． Ｃｙｓ： ６本発明のある態様においては、
上記タンパク質が、哺乳動物の乳、特にウシの乳、から
抽出により、クローニングにより、もしくは合成法によ
り取得される。
る決定によれば、以下のアミノ酸がそれぞれ示された割
合で含まれている： Ｐｈｅ： ６． Ｌｅｕ： ４． ｌｉｅ： ９．
Ｍｅｔ： ２． Ｖａｔ： ４゜Ｐｒｏ： ７＋
Ｓｅｒ： ６＋ Ｔｈｒ： ６＋ Ａｌａ： ４
＋ Ｔｙｒ： ６Ｈｉｓ： ６＋ Ｇｌｕ（Ｇｉｎ）
： １０＋ Ａｓｐ（Ａｓｎ）： １６＋ｌｙｓ：
９＋ 八ｒｇ： １５． Ｇｌｙ： ９
． Ｃｙｓ： ６本発明のある態様においては、
上記タンパク質が、哺乳動物の乳、特にウシの乳、から
抽出により、クローニングにより、もしくは合成法によ
り取得される。
本発明はさらに、本発明の１７ＫＤタンパク質の断片を
構成するペプチドに関する。特に。
構成するペプチドに関する。特に。
・アミノ酸配列。
Ｇｌｕ−Ａｓｐ”−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｐｒｏ”−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ”
−Ａｒｇ−１ｉｅ−３ｅｒ。
Ｐｒｏ”−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ”
−Ａｒｇ−１ｉｅ−３ｅｒ。
を有し、その１５残基中９残基がヒトのアンジオジェニ
ンの配列５８〜７２と一致するペプチド、・アミノ酸配
列。
ンの配列５８〜７２と一致するペプチド、・アミノ酸配
列。
Ｐｈｅ−八５ｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−１”ｈｅ’ ”−１
１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＨｉｓ目５ を有し、上記１７ＫＤタンパク賞のＣ末端断片に対応す
るペプチド、 ・アミノ酸配列。
１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＨｉｓ目５ を有し、上記１７ＫＤタンパク賞のＣ末端断片に対応す
るペプチド、 ・アミノ酸配列。
Ｇｌｕ−Ａｓｎ” ’−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｔ−旧ｓ”’−Ｐｈｅ＋を有し、その８残基中７残基が
ヒトのアンジオジェニンの配列１０８〜１１５と一致す
るペプチド、・アミノ酸配列。
ｔ−旧ｓ”’−Ｐｈｅ＋を有し、その８残基中７残基が
ヒトのアンジオジェニンの配列１０８〜１１５と一致す
るペプチド、・アミノ酸配列。
１ｉｅ−νａ！ ’ ”−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｕ。
ｌｕ。
を有し、その６残基中４残基がヒトのアンジオジェニン
の配列１０３〜１０８と一致するペプチド、・アミノ酸
配列。
の配列１０３〜１０８と一致するペプチド、・アミノ酸
配列。
Ａｒｇ−Ｔｙｒ−１ｉｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ”−Ｌｅｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−７ｙ、ＩＳ−＾５ｐ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ＋を有し、その１３残基中１１残基がヒトのア
ンジオジェニンの配列５〜１７と一致するペプチド、・
アミノ酸配列。
Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−７ｙ、ＩＳ−＾５ｐ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ＋を有し、その１３残基中１１残基がヒトのア
ンジオジェニンの配列５〜１７と一致するペプチド、・
アミノ酸配列。
Ａｓｎ−Ｔｈｒ４Ｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−）１ｔｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｎ５０−Ｌｙｓ。
ｙ−Ａｓｎ５０−Ｌｙｓ。
を有し、その配列がヒトのアンジオジェニンの配列４３
〜５０と完全に相同であることにより他のものから区別
されるペプチド、 ・アミノ酸配列。
〜５０と完全に相同であることにより他のものから区別
されるペプチド、 ・アミノ酸配列。
１１ｅ−Ｌｙｓ”−八Ｉａ−Ｔｉｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕを
有し、その配列がヒトのアンジオジェニンの配列５３〜
５８と完全に相同であることにより他のものから区別さ
れるペプチド、 ・アミノ酸配列。
有し、その配列がヒトのアンジオジェニンの配列５３〜
５８と完全に相同であることにより他のものから区別さ
れるペプチド、 ・アミノ酸配列。
Ｌｅｕ”−Ａｒｇ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−３ｅｒ”
−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ。
−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ。
を有し、そのｌＯ残基中８残基がヒトのアンジオジェニ
ンの配列６９〜７７と一致するペプチド、および・アミ
ノ酸配列。
ンの配列６９〜７７と一致するペプチド、および・アミ
ノ酸配列。
八ｒｇ”−Ｇｌｙ−Ａｓｐ＋
を有し、内皮細胞レセプタ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって認識されるペプ
チドである。
ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって認識されるペプ
チドである。
本発明はさらに、本発明のタンパク質を、呻乳動物の乳
、特にウシの乳、から抽出することにより取得する方法
に関する。
、特にウシの乳、から抽出することにより取得する方法
に関する。
本発明のある態様においては、上記タンパク質が、陽イ
オン交換クロマトグラフィと、その後の適当な溶出剤に
よる溶出とによって抽出される。
オン交換クロマトグラフィと、その後の適当な溶出剤に
よる溶出とによって抽出される。
本発明のある態様においては、上記溶出剤が、弱有機酸
のアルカリ金属塩、特に酢酸ナトリウムである。
のアルカリ金属塩、特に酢酸ナトリウムである。
本発明のある態様においては、その溶出された分画が再
度、陽イオン交換クロマトグラフィにかけられる。
度、陽イオン交換クロマトグラフィにかけられる。
本発明のある態様においては、上記のように溶出により
分離されたタンパク質が、ゲル濾過カラムによるクロマ
トグラフィで精製される。
分離されたタンパク質が、ゲル濾過カラムによるクロマ
トグラフィで精製される。
本発明のある態様においては、上記のようにして精製さ
れたタンパク質が、乳１リットルあたり０．５ｇ１ｇの
オーダの収率で得られる。
れたタンパク質が、乳１リットルあたり０．５ｇ１ｇの
オーダの収率で得られる。
本発明のある態様においては、前記ウシの乳は、抽出の
前に、脱脂処理される。
前に、脱脂処理される。
本発明のある態様においては、上記脱脂は遠心分離によ
って行なわれる。
って行なわれる。
本発明のある態様においては、上記遠心分離は、温度４
’Ｃにおいて、４０００ｇ（ｇは重力加速度）で３０
分間行なわれる。
’Ｃにおいて、４０００ｇ（ｇは重力加速度）で３０
分間行なわれる。
本発明はさらに、上記１７ＫＤタンパク質および／また
はその１７ＫＤタンパク質の断片もしくはその１７ＫＤ
タンパク質の相同物を、作用物質として含む治療用組成
物に関する。この組成物は特に、血管形成を抑制もしく
は促進することを必要とする疾、Φの治療に用いられる
。
はその１７ＫＤタンパク質の断片もしくはその１７ＫＤ
タンパク質の相同物を、作用物質として含む治療用組成
物に関する。この組成物は特に、血管形成を抑制もしく
は促進することを必要とする疾、Φの治療に用いられる
。
本発明の治療用組成物は、血管新生が問題となるすべて
の病態、特に外傷（ｗｏｕｎｄｓ） 、癒１ｉ（ｓｃａ
ｂｓ）潰瘍（ｕＩｃｅｒｓ） 、移植（ｇｒａｆ ｔｓ
） 、循環機能不全（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ １ｎｓ
ｕｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）において使用され得る。本
組成物はまた、美容術（皮膚および毛髪／頭皮）におい
ても使用され得る。さらに獣医学の分野、特に乳腺炎（
ｗａｓ ｔｉ ｔｉｓ）の診断および乳牛の選別にも用
いられ得る。
の病態、特に外傷（ｗｏｕｎｄｓ） 、癒１ｉ（ｓｃａ
ｂｓ）潰瘍（ｕＩｃｅｒｓ） 、移植（ｇｒａｆ ｔｓ
） 、循環機能不全（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ １ｎｓ
ｕｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）において使用され得る。本
組成物はまた、美容術（皮膚および毛髪／頭皮）におい
ても使用され得る。さらに獣医学の分野、特に乳腺炎（
ｗａｓ ｔｉ ｔｉｓ）の診断および乳牛の選別にも用
いられ得る。
本発明はさらに、上記１７ＫＤタンパク質に対する抗体
と、抗ペプチド抗体、特に上記したペプチドの少なくと
も１つに対する抗体と、を含む群の中から選択され、そ
の選択された抗体が単独でもしくは混合で用いられる、
哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定
するための免疫学的反応物に関する。
と、抗ペプチド抗体、特に上記したペプチドの少なくと
も１つに対する抗体と、を含む群の中から選択され、そ
の選択された抗体が単独でもしくは混合で用いられる、
哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定
するための免疫学的反応物に関する。
本発明はさらに、抗アンジオジェニン抗体、特に本発明
による１７ＫＤタンパク質に対する抗体もしくは抗ペプ
チド抗体が、適当な条件下で、哺乳動物のアンジオジェ
ニンを含んでいると考えられる生物学的流体と反応し、
その反応が特にＲＩＡ、 ＥＬＩＳＡもしくは免疫螢光
試験等の適当な手段により評価される、哺乳動物のアン
ジオジヱニンを検出および測定する方法に関する。
による１７ＫＤタンパク質に対する抗体もしくは抗ペプ
チド抗体が、適当な条件下で、哺乳動物のアンジオジェ
ニンを含んでいると考えられる生物学的流体と反応し、
その反応が特にＲＩＡ、 ＥＬＩＳＡもしくは免疫螢光
試験等の適当な手段により評価される、哺乳動物のアン
ジオジヱニンを検出および測定する方法に関する。
本発明はさらに、（ａ）必要に応じ単位量づつに分割さ
れてよい適当な量の抗アンジオジェニン抗体。
れてよい適当な量の抗アンジオジェニン抗体。
特に上記１７ＫＤタンパク質に対する抗体、もしくは抗
ペプチド抗体、特に上記したペプチドの少なくとも１つ
に対する抗体と、 （ｂ）必要に応じて含まれてよい、本検出および／また
は測定を実施するための適当な量の緩衝剤、希釈剤およ
び反応物と、 を含む、生物学的流体中の哺乳動物のアンジオジェニン
、特にヒトのアンジオジェニン、を検出および／または
測定するための用具−式に関する。
ペプチド抗体、特に上記したペプチドの少なくとも１つ
に対する抗体と、 （ｂ）必要に応じて含まれてよい、本検出および／また
は測定を実施するための適当な量の緩衝剤、希釈剤およ
び反応物と、 を含む、生物学的流体中の哺乳動物のアンジオジェニン
、特にヒトのアンジオジェニン、を検出および／または
測定するための用具−式に関する。
上記した諸態様の他に、本発明は種々の態様を含んでお
り、その上うな態様が以下の記載において明らかにされ
る。以下、本発明のタンパク質の具体的な調製例と、そ
れについて実施された試験について説明する。その試験
の目的は、（ａ）ヒトのアンジオジェニンと、本発明に
よるウシ起原の１７ＫＤタンパク質との間の相同性を証
明すること、 （ｂ）リボヌクレアーゼとの相同性を証明すること、お
よび （Ｃ）上記ウシ起原の１７ＫＤタンパク質の血管形成に
関する活性を証明すること、 である。
り、その上うな態様が以下の記載において明らかにされ
る。以下、本発明のタンパク質の具体的な調製例と、そ
れについて実施された試験について説明する。その試験
の目的は、（ａ）ヒトのアンジオジェニンと、本発明に
よるウシ起原の１７ＫＤタンパク質との間の相同性を証
明すること、 （ｂ）リボヌクレアーゼとの相同性を証明すること、お
よび （Ｃ）上記ウシ起原の１７ＫＤタンパク質の血管形成に
関する活性を証明すること、 である。
しかし、これら具体例および試験の説明は、単に本発明
の概念を明らかにするためのものであって一１決して本
発明を限定するものと解釈されてはならない。
の概念を明らかにするためのものであって一１決して本
発明を限定するものと解釈されてはならない。
（実施例）
例Ａ：生牛乳ら１７ＫＤタンパク質を抽出すること牛乳
５０Ｉ２を、遠心分！（４０００ｇ −３０ｍ１ｎ −
４°Ｃ）により脱脂し、ＳＰ−セファデックス−Ｃ５０
（１０ｘｌｏｏ ｃｍ） （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカ
ラムを使用してクロマトグラフィにかける。
５０Ｉ２を、遠心分！（４０００ｇ −３０ｍ１ｎ −
４°Ｃ）により脱脂し、ＳＰ−セファデックス−Ｃ５０
（１０ｘｌｏｏ ｃｍ） （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカ
ラムを使用してクロマトグラフィにかける。
上記カラムを、酢酸ナトリウムの０．３５Ｍ溶液（ｐ１
１７）１０ ｆｆｉで洗い、その後、１．５Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ８） ５１で溶出する。得られた溶液を酢
酸ナトリウムの濃度が０．２Ｍになるまで希釈する。
１７）１０ ｆｆｉで洗い、その後、１．５Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ８） ５１で溶出する。得られた溶液を酢
酸ナトリウムの濃度が０．２Ｍになるまで希釈する。
この溶液を、あらかじめ０．２２Ｍの酢酸ナトリウム（
ｐＨ６，５）で平衡化させであるＳ−セファロース・フ
ァート・フロラ（１０ｘ １００ｃｍ）（Ｐｈａｒ＋ｗ
ａｃｉａ）のカラムを使用してクロマトグラフする。同
じ酢酸ナトリウム溶液でカラムを洗ったのち、１２の０
．４Ｍ酢酸ナトリウム溶液でタンパク質を溶出する。
ｐＨ６，５）で平衡化させであるＳ−セファロース・フ
ァート・フロラ（１０ｘ １００ｃｍ）（Ｐｈａｒ＋ｗ
ａｃｉａ）のカラムを使用してクロマトグラフする。同
じ酢酸ナトリウム溶液でカラムを洗ったのち、１２の０
．４Ｍ酢酸ナトリウム溶液でタンパク質を溶出する。
バイオゲルＰ−３０（Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ２Ｏ，４ｘ
１００ｃｍ）のカラムを用い、ゲル濾過クロマトグラフ
ィにより、この溶液から塩を除去する。
１００ｃｍ）のカラムを用い、ゲル濾過クロマトグラフ
ィにより、この溶液から塩を除去する。
そのカラムを水で溶出した後、タンパク質を含む分画を
、フェニル・スパロースＩ（Ｒ５１５（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）のカラムを用い、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈ
ｙ）によって、クロマトグラフィにかける。溶出は、緩
衝剤Ａ（５０ｍＭ燐酸ナトリウム。
、フェニル・スパロースＩ（Ｒ５１５（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）のカラムを用い、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈ
ｙ）によって、クロマトグラフィにかける。溶出は、緩
衝剤Ａ（５０ｍＭ燐酸ナトリウム。
１．７Ｍ硫酸アンモニウム、 ｐＨ７）と、緩衝剤Ｂ（
５０ｍＭの燐酸ナトリウム、 ｐＨ７） とを混合する
ことにより得られる勾配（０分で緩衝剤Ａが１００％。
５０ｍＭの燐酸ナトリウム、 ｐＨ７） とを混合する
ことにより得られる勾配（０分で緩衝剤Ａが１００％。
１５分で緩衝剤Ａが１００％、 ４０分で緩衝剤Ａが０
％）を利用して行った。
％）を利用して行った。
第１図は、１７ＫＤタンパク質がフェニル・スバロース
カラムから溶出される様子を表すグラフである。グラフ
の横軸は時間（分）を示し、縦軸は吸光度を示す。グラ
フ中、ビーク２が純粋な１７ＫＤタンパク質に対応する
。タンパク質の収率は、２５ｍｇ。
カラムから溶出される様子を表すグラフである。グラフ
の横軸は時間（分）を示し、縦軸は吸光度を示す。グラ
フ中、ビーク２が純粋な１７ＫＤタンパク質に対応する
。タンパク質の収率は、２５ｍｇ。
すなわち脱脂された牛乳１２あたり０．５ｍｇであった
。
。
試験
例１：ヒトのアンジオジェニンと１７ＫＤタンパク質と
の相同性 １７ＫＤタンパク質に関して得られたデータによれば、
このタンパク質はヒトのアンジオジェニンと関係がある
。すなわち、８１個のアミノ酸が両方のタンパク質に共
通している。
の相同性 １７ＫＤタンパク質に関して得られたデータによれば、
このタンパク質はヒトのアンジオジェニンと関係がある
。すなわち、８１個のアミノ酸が両方のタンパク質に共
通している。
ウシ起原の１７ＫＤタンパク質を全酸加水分解すること
によって決定されるアミノ酸解析結果を、ヒトのアンジ
オジェニンのアミノ酸解析と比較して示したのが表１で
ある。この表によれば２つのタンパク質は極めてよく似
た組成を有することがわかる。
によって決定されるアミノ酸解析結果を、ヒトのアンジ
オジェニンのアミノ酸解析と比較して示したのが表１で
ある。この表によれば２つのタンパク質は極めてよく似
た組成を有することがわかる。
表
■
＊ ＣｙｓおよびＴｒｐを除く
また、表■は、ヒトのアンジオジェニンの配列とウシ起
原の１７ＫＤタンパク質の配列とを比較して示している
。この表によれば、２つのタンパク質の間には６０％を
超える相同性がある。２つのタンパク質の間の相違はほ
とんどが保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ５ｕ
ｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）の結果である。
原の１７ＫＤタンパク質の配列とを比較して示している
。この表によれば、２つのタンパク質の間には６０％を
超える相同性がある。２つのタンパク質の間の相違はほ
とんどが保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ５ｕ
ｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）の結果である。
６個のシスティン残基が同じ位置に存在するので、その
３次元構造はヒトのアンジオジェニンのそれと近僚した
ものとなる。Ｃ末端領域で対応をとるためには１個のシ
フトが必要である。Ｎ−末端領域およびＣ末端領域のみ
が２つのタンパク質のサイズの違いの原因である（ １
７Ｋ［ｌタンパク質はヒトのアンジオジェニンよりもア
ミノ酸を２個余計に含んでいる）。
３次元構造はヒトのアンジオジェニンのそれと近僚した
ものとなる。Ｃ末端領域で対応をとるためには１個のシ
フトが必要である。Ｎ−末端領域およびＣ末端領域のみ
が２つのタンパク質のサイズの違いの原因である（ １
７Ｋ［ｌタンパク質はヒトのアンジオジェニンよりもア
ミノ酸を２個余計に含んでいる）。
もっとも、ヒトのアンジオジェニンがＮ−末端位置にピ
ログルタミン酸を有しているのに対して、ウシ起原の１
７ＫＤタンパク質はＮ−末端位置に付加的にアラニンを
含んでいる点で、両者は異なる。
ログルタミン酸を有しているのに対して、ウシ起原の１
７ＫＤタンパク質はＮ−末端位置に付加的にアラニンを
含んでいる点で、両者は異なる。
上記の差異は、ヒトのアンジオジェニンの情報をコード
化したｃＤＮＡの配列決定によって明らかにされた、２
４（あるいは２２）個のアミノ酸からなるシグナルペプ
チド（Ｊ、 ＦＥＴＴ ｅｔ ａｌ、＋Ｂｔｏｃｈｅｍ
、、 （１９８５） 、■、 ５４８０）の存在によっ
て説明される。すなわち、このペプチドは、シグナルペ
プチダーゼによる処理で抑制されるが、この酵素はヒト
のアンジオフェニン中の配列 Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−’Ｇｌｕ“１−＾５ｐ−Ａｓｎ、、
、の中のアラニンとグルタミンの間を切断するのである
。他方、ウシ起原の１７ＫＤタンパク質のＮ−末端にア
ラニンが存在する理由は、シグナルペプチダーゼによっ
て切断される結合の位置が変位したことによる。その結
果、１７ＫＤタンパク質のＮ−末端には付加的なアラニ
ンが残り、ヒトのアンジオジェニンの場合に見られるピ
ログルタミンへの修飾は生じない。
化したｃＤＮＡの配列決定によって明らかにされた、２
４（あるいは２２）個のアミノ酸からなるシグナルペプ
チド（Ｊ、 ＦＥＴＴ ｅｔ ａｌ、＋Ｂｔｏｃｈｅｍ
、、 （１９８５） 、■、 ５４８０）の存在によっ
て説明される。すなわち、このペプチドは、シグナルペ
プチダーゼによる処理で抑制されるが、この酵素はヒト
のアンジオフェニン中の配列 Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−’Ｇｌｕ“１−＾５ｐ−Ａｓｎ、、
、の中のアラニンとグルタミンの間を切断するのである
。他方、ウシ起原の１７ＫＤタンパク質のＮ−末端にア
ラニンが存在する理由は、シグナルペプチダーゼによっ
て切断される結合の位置が変位したことによる。その結
果、１７ＫＤタンパク質のＮ−末端には付加的なアラニ
ンが残り、ヒトのアンジオジェニンの場合に見られるピ
ログルタミンへの修飾は生じない。
表■に示された１７ＫＤタンパク質の配列は、従来のタ
ンパク質配列決定法によって決定されたものである。
ンパク質配列決定法によって決定されたものである。
例２：リボヌクレアーゼとの相同性
Ｒ，ラシャロら（Ｂｉｏｃｈｅｓ、、 （１９８６）、
２５．３５２７−３５３２）は、実際に、ウシのりボ
ヌクレアーゼの活性部位の配列残基のすべてがヒトのア
ンジオジェニンに保存されている（ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ
）ことを明らかにした。
２５．３５２７−３５３２）は、実際に、ウシのりボ
ヌクレアーゼの活性部位の配列残基のすべてがヒトのア
ンジオジェニンに保存されている（ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ
）ことを明らかにした。
さらに、ヒトのりボヌクレアーゼの抑制因子がヒトのア
ンジオジェニンの血管形成活性およびリポ核酸分解活性
の両者を抑制することから、アンジオジェニンとリボヌ
クレアーゼとの相同性は機能的に意味のあることがわか
る。
ンジオジェニンの血管形成活性およびリポ核酸分解活性
の両者を抑制することから、アンジオジェニンとリボヌ
クレアーゼとの相同性は機能的に意味のあることがわか
る。
以下に示す結果から上記したことが確認できる（表■参
照）： ・ウシ８原の１７ＫＤタンパク質とウシのりボヌクレア
ーゼとの相同性（残基の３９％が共通する）が、ヒトの
アンジオジェニンとヒトのりボヌクレアーゼとの相同性
（残基の３４％が共通する）と近似する。
照）： ・ウシ８原の１７ＫＤタンパク質とウシのりボヌクレア
ーゼとの相同性（残基の３９％が共通する）が、ヒトの
アンジオジェニンとヒトのりボヌクレアーゼとの相同性
（残基の３４％が共通する）と近似する。
・４３位置でのＡｒｇ／ｒｌｅ突然変位および２つの保
存的置換（Ａｓｎ−６８の代わりにＡｓｐ−６９が、Ｌ
ｅｕ−１１５の代わりにＰｈｅ−１１９が置換）を除き
、リボ核酸分解活性に関係することが知られているすべ
ての残基が・ヒトのアンジオジェニンとウシ８原の１７
ＫＤタンパク質の両者に保存されており、このことから
、この有意の機能的相同性を維持することが極めて強い
選択圧の下にあることがわかる。
存的置換（Ａｓｎ−６８の代わりにＡｓｐ−６９が、Ｌ
ｅｕ−１１５の代わりにＰｈｅ−１１９が置換）を除き
、リボ核酸分解活性に関係することが知られているすべ
ての残基が・ヒトのアンジオジェニンとウシ８原の１７
ＫＤタンパク質の両者に保存されており、このことから
、この有意の機能的相同性を維持することが極めて強い
選択圧の下にあることがわかる。
ヒトのアンジオジェニンのＬｅｕ−１１５が、ウシ８原
の１７ＫＤタンパク賞ではＰｈｅ−１１６で置換されて
いることは興味深い。例えば、リボヌクレアーゼにおい
てフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）で
置換されると、その活性が１０分の１程度に低下するこ
とが知られている。そこで、もしリボヌクレアーゼ活性
が直接その１７ＫＤタンパク質の生物学的活性に関与し
ているとすれば、１７ＫＤタンパク質にＰｈｅ−１１６
が存在することは、その活性がヒトのアンジオジェニン
の活性よりも高いことを示す証左となるかもしれない。
の１７ＫＤタンパク賞ではＰｈｅ−１１６で置換されて
いることは興味深い。例えば、リボヌクレアーゼにおい
てフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）で
置換されると、その活性が１０分の１程度に低下するこ
とが知られている。そこで、もしリボヌクレアーゼ活性
が直接その１７ＫＤタンパク質の生物学的活性に関与し
ているとすれば、１７ＫＤタンパク質にＰｈｅ−１１６
が存在することは、その活性がヒトのアンジオジェニン
の活性よりも高いことを示す証左となるかもしれない。
・ヒトのアンジオジェニンの３次元構造が、それの膵臓
リボヌクレアーゼＡとの相同性に基づいて、評価された
。突然変位に影響された部位がこの構造の中に再び組み
入れられるかどうかで評価される。この場合、４３位置
でのＡｒｇ／ｌｉｅ突然変位を除き、このタンパク質の
三次元構造に生ずる置換でＪボ核酸分解活性に関係する
あらゆる置換が、保存的置換であることが示される。
リボヌクレアーゼＡとの相同性に基づいて、評価された
。突然変位に影響された部位がこの構造の中に再び組み
入れられるかどうかで評価される。この場合、４３位置
でのＡｒｇ／ｌｉｅ突然変位を除き、このタンパク質の
三次元構造に生ずる置換でＪボ核酸分解活性に関係する
あらゆる置換が、保存的置換であることが示される。
例３；ウシ起原の１７ＫＤタンパク質の生物学的特性ニ
ワトリ即設尿膜試験： この生物学的活性試験は、フェントらによって記載され
たものである（Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 （１９８５Ｌ ２
４．５４８０−５４８６）。その内容は、ウシ８原の１
７ＫＤタンパク質を１０ｎｇから１μｇのオーダで増加
させながら与えることにより、ニット１Ｊ胚の漿尿膜に
見られる血管の形成を評価するものである。１７ＫＤタ
ンパク質を与えて調査した８０個の受精卵の中、５０ｎ
ｇの量のアンジオジェニン（ウシ起源の１７ＫＤタンパ
ク質）の場合には新たな血管の形成が６２個の卵で観察
された。以上の結果から、本発明に係る１７ＫＤタンパ
ク質は器官形成および血管形成に関して効果を有するこ
とがわかる。
ワトリ即設尿膜試験： この生物学的活性試験は、フェントらによって記載され
たものである（Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 （１９８５Ｌ ２
４．５４８０−５４８６）。その内容は、ウシ８原の１
７ＫＤタンパク質を１０ｎｇから１μｇのオーダで増加
させながら与えることにより、ニット１Ｊ胚の漿尿膜に
見られる血管の形成を評価するものである。１７ＫＤタ
ンパク質を与えて調査した８０個の受精卵の中、５０ｎ
ｇの量のアンジオジェニン（ウシ起源の１７ＫＤタンパ
ク質）の場合には新たな血管の形成が６２個の卵で観察
された。以上の結果から、本発明に係る１７ＫＤタンパ
ク質は器官形成および血管形成に関して効果を有するこ
とがわかる。
受精卵は、湿度７０％、温度３８°Ｃのｇ斤卵器に置く
。
。
３日後、殻に穴を開けて、ガス透過性の膜でシールする
。
。
５日日に、１７ＫＤタンパク質の？容液を滲み込ませた
膜のディスクを漿尿膜上に植える。 アンジオジェニ
ンを滲み込ませたディスクに集中する血管の形成を、８
．９．１０日８と双眼顕微鏡で追跡する。
膜のディスクを漿尿膜上に植える。 アンジオジェニ
ンを滲み込ませたディスクに集中する血管の形成を、８
．９．１０日８と双眼顕微鏡で追跡する。
本発明によるウシ８原１７ＫＤタンパク質は、血管形成
を抑制もしくは促進することを必要とする人体の疾患の
治療のために、製薬学的に許容され得る形態で使用され
る。
を抑制もしくは促進することを必要とする人体の疾患の
治療のために、製薬学的に許容され得る形態で使用され
る。
以上本発明をその具体例に基づいて詳細に説明したが、
本発明は明示的に記載されたそれら実施例および通用方
法になんら限定されるものではなく、むしろ、未発明の
概念もしくは範囲を逸脱しない限りにおいて、当業者に
自明の変更、改良を当然に含むものである。
本発明は明示的に記載されたそれら実施例および通用方
法になんら限定されるものではなく、むしろ、未発明の
概念もしくは範囲を逸脱しない限りにおいて、当業者に
自明の変更、改良を当然に含むものである。
第１図は、本発明の１１ＫＤタンパク質の溶出を示すグ
ラフである。
ラフである。
Claims (24)
- （１）１２５個のアミノ酸を含む配列を有し、以下の化
学式（ I ）、 （ I ） 【遺伝子配列があります】 で表わされ、その配列中８１個のアミノ酸がヒトのアン
ジオジェニンと共通であり、その分子量がおよそ１７Ｋ
Ｄであるタンパク質。 - （２）哺乳動物の乳、特にウシの乳、から抽出により取
得される請求項１に記載のタンパク質。 - （３）クローニングにより取得される請求項１に記載の
タンパク質。 - （４）合成法により取得される請求項１に記載のタンパ
ク質。 - （５）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断片
を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その１５残基中９残基がヒトのアンジオジェニ
ンの配列５８〜７２と一致するペプチド。 - （６）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質のＣ末
端断片を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有するペプチド。 - （７）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断片
を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その８残基中７残基がヒトのアンジオジェニン
の配列１０８〜１１５と一致するペプチド。 - （８）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断片
を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その６残基中４残基がヒトのアンジオジェニン
の配列１０３〜１０８と一致するペプチド。 - （９）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断片
を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その１３残基中１１残基がヒトのアンジオジェ
ニンの配列５〜１７と一致するペプチド。 - （１０）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断
片を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その配列がヒトのアンジオジェニンの配列４３
〜５０と完全に相同であることにより他のものから区別
されるペプチド。 - （１１）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断
片を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その配列がヒトのアンジオジェニンの配列５３
〜５８と完全に相同であることにより他のものから区別
されるペプチド。 - （１２）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断
片を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、その１０残基中８残基がヒトのアンジオジェニ
ンの配列６９〜７７と一致するペプチド。 - （１３）請求項１〜４の何れかに記載のタンパク質の断
片を構成し、以下のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります】 を有し、内皮細胞レセプタによって認識されるペプチド
。 - （１４）請求項１もしくは請求項２に記載のタンパク質
を、哺乳動物の乳、特にウシの乳、から抽出することに
より取得する方法。 - （１５）前記抽出が、陽イオン交換クロマトグラフィと
、その後の適当な溶出剤による溶出によって行なわれる
請求項１４に記載の方法。 - （１６）前記溶出剤が、弱有機酸のアルカリ金属塩、特
に酢酸ナトリウム、である請求項１４もしくは請求項１
５に記載の方法。 - （１７）その溶出された分画を再度陽イオン交換クロマ
トグラフィにかけ、さらに再度適当な溶出剤により溶出
する請求項１４〜１６の何れかに記載の方法。 - （１８）前記溶出剤が、弱有機酸のアルカリ金属塩、特
に酢酸ナトリウム、である請求項１７に記載の方法。 - （１９）得られた産物が、ゲル濾過カラムによるクロマ
トグラフィで精製される請求項１４〜１８の何れかに記
載の方法。 - （２０）前記乳は、最初に、遠心分離によって脱脂され
る請求項１４に記載の方法。 - （２１）請求項１〜４の何れかに記載の１７ＫＤタンパ
ク質、および／または請求項５〜１３の何れかに記載の
１７ＫＤタンパク質の断片、もしくはその１７ＫＤタン
パク質の相同物を、作用物質として含む治療用組成物。 - （２２）請求項１〜４の何れかに記載の１７ＫＤタンパ
ク質に対する抗体と、抗ペプチド抗体、特に請求項５〜
１３の何れかに記載のペプチドの中の少なくとも１つに
対する抗体、とを含む群の中から選択され、その選択さ
れた抗体が単独でもしくは混合で用いられる、哺乳動物
のアンジオジェニンを検出または測定するための免疫学
的反応物。 - （２３）抗アンジオジェニン抗体、特に請求項２２に記
載の１７ＫＤタンパク質に対する抗体もしくは抗ペプチ
ド抗体が、適当な条件下で、哺乳動物のアンジオジェニ
ンを含んでいると考えられる生物学的流体と反応し、そ
の反応が特にＲＩＡ，ＥＬＩＳＡもしくは免疫螢光試験
等の適当な手段により評価される、哺乳動物のアンジオ
ジェニンを検出および測定する方法。 - （２４）必要に応じ単位量づつに分割されてよい適当な
量の抗アンジオジェニン抗体、特に請求項２２に記載の
１７ＫＤタンパク質に対する抗体もしくは抗ペプチド抗
体と、 必要に応じ含まれてよい、本検出および／または測定を
実施するための適当な量の緩衝剤、希釈剤および反応物
と、 を含む、生物学的流体中の哺乳動物のアンジオジェニン
、特にヒトのアンジオジェニン、を検出および／または
測定するための用具一式。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1117161A JPH02296000A (ja) | 1989-05-10 | 1989-05-10 | 血管形成作用を有するタンパク質，そのタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法，そのタンパク質を含む治療用組成物，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定する方法，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定するための免疫学的反応物，そのタンパク質の相同物，および，そのタンパク質の断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1117161A JPH02296000A (ja) | 1989-05-10 | 1989-05-10 | 血管形成作用を有するタンパク質，そのタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法，そのタンパク質を含む治療用組成物，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定する方法，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定するための免疫学的反応物，そのタンパク質の相同物，および，そのタンパク質の断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02296000A true JPH02296000A (ja) | 1990-12-06 |
Family
ID=14704966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1117161A Pending JPH02296000A (ja) | 1989-05-10 | 1989-05-10 | 血管形成作用を有するタンパク質，そのタンパク質を哺乳動物の乳から分離する方法，そのタンパク質を含む治療用組成物，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定する方法，哺乳動物のアンジオジェニンを検出および／または測定するための免疫学的反応物，そのタンパク質の相同物，および，そのタンパク質の断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02296000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013051572A1 (ja) | 2011-10-04 | 2013-04-11 | 雪印メグミルク株式会社 | 感覚改善剤 |
-
1989
- 1989-05-10 JP JP1117161A patent/JPH02296000A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013051572A1 (ja) | 2011-10-04 | 2013-04-11 | 雪印メグミルク株式会社 | 感覚改善剤 |
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