JPH02291277A - 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 悲星上０剋■公量 本発明は、弱毒マレック病ウイルス（以下「弱毒ＭＤＶ
及びＨＶＴ，と略記する）が本来有する遺伝子以外の外
来遺伝子又は異種蛋白遺伝子のクローニング用並びに発
現用のベクターとして弱毒ＭＤＶ及びＨＶＴを用いる組
換え遺伝子作成法、及び斯かる作成法を実施して得られ
る組換え弱毒ＭＤＶ及びＨＶＴに関するものである。更
に詳しくは、生物学的製剤の製造工程下でバイオハザー
ド対策を要する危険かつ強毒な病原微生物やウイルス等
に由来の各種抗原の安全な製造、及び斯かる抗原や逍伝
子諸産物の低コストによる能率的生産に寄与すると共に
、特に、養鶏業、畜産業、獣医学等の分野での実用に於
いて、優れて省力的かつ低廉な診断剤、各種抗原、多価
生ワクチン、多機能ワクチン等を提供するものである。

従來玖亜旦土塁皿１ ［本発明で用いる弱毒マレツク病ウイルスの定義］　：
マレック病ウイルスは、エンベロープを有するＤＮＡウ
イルスであり、ヘルペスウイルス科ガンマヘルペスウイ
ルス亜科に属するガリドヘルペスウイルス１、及びガリ
ドヘルペスウイルス２として分類付けられている（　Ｉ
ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７巻、４７〜５１ペー
ジ、Ｓ．κａｒｇａｒ　１９８２年発行）。

エンベロープで覆われた成熟ウイルス粒子の直径は１５
０〜１８０ｎｎ＋、そして、ヌクレオカブシドは、直径
が約１００ｎｎ＋の正２０面体である。また、その内部
中央部に局在する円錐曲線回転体状の直径５０〜６０ｎ
ｎ＋のヌクレオイドは、分子量約１．Ｏｘ１０　　の線
状二本鎖ＤＮＡを含有する．尚、このウイルスの主な病
原性は、１２〜２０週齢ニワトリヒナに神経病変による
不全麻痺や痙単性ないしは弛緩性麻痺、腫瘍等を生じる
ことにあり、その罹患率並びに死亡率が共に高く、経済
的損失が大きいため、養鶏業界では予防対策として、こ
一十数年来、広く生ワクチンが使用されている。更にま
た、このウイルスは、免疫蛍光法、寒天ゲル沈降法、及
びウイルス中和試験の結果に基づき、次の３つの血清型
に分類されている（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｔ
ＪＳ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ第３０巻、２２５　〜２７７ペ
ージ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ１９８５
年発行；　Ｂ．ＲＯＩ２ＭＡＮ　編ｒＴｈｅ　Ｈｅｒｐ
ｅｓｖ＋ｒｕｓ［第１巻］Ｊ、３３３　〜４３１ページ
、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ１９８２年発行）：工型は
ニワトリに対し多様な病原性又は腫瘍原性を有するマレ
ツク病ウイルス（以下ｒＭＤＶＪと略記する》強毒株、
及び細胞培養下で人工的に非病原性へと変異したマレツ
ク病ウイルス弱毒株；■型は野生のマレツク病ウイルス
弱毒株》；及び■型は非病原性のシチメンチョウヘルペ
スウイルス（以下ｒＨＶＴＪと略記する）本発明に係る
弱毒マレツク病ウイルスは、上記各型のうち、■型に属
する人工的弱毒ＭＤＶ、■型に属ずる野生の弱毒ＭＤＶ
、及び■型に属するＨＶＴを併せて意味する。

［ウィルス・ベクター開発の必要性コ：ウィルス・ベク
ターの開発は、１９７９年頃から、例えば、ＳＶ４０・
ベクターによるウサギβ−グロビンの産生（Ｎａｔｕｒ
ｅ（Ｌｏｎｄｏｎｌ、第２７７巻、１０８〜１１４ヘー
ジ、１９７９　．　　同上、第２７８巻、３５〜４０ペ
ージ、１９７９）等に於いて散見される．そして、１９
８０年、ＷＨＯ（世界保＃機構》総会が、ワクチンの成
果に基づく世界天然痘根絶を宣言し、種痘の廃止を勧告
して以来、種痘の有効成分であるワクチェアウイルスの
効用が世界的に注目かつ評価されている状況下で、該ウ
イルスをクローニング及び発現ベクターとして利用する
報告がなされた（　Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎ（ＩＳｏｆ　
Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅ＋＋＋ｙ　ｏｆ
　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　［（ＩｓＡ］、第７９巻、４９２
７〜４９３１、１９８２　；同上、第７９巻、７４１５
〜７４１９、１９８２）。更に、ＷＨＯ特別諮問グルー
プは、ワクチェアウイルス等のウィルス・ベクターを用
いる組換えワクチン研究促進計画を可決した（　Ｈａ　
ｔｕ　ｒｅ　［Ｌｏｎｄｏｎｌ、第３１２巻、２９９ペ
ージ、１９８４）。このＷＨＯの提唱は下記を示唆する
ものである：従来使用のプラスミド・ベクター、ファ一
ジ・ベクター、コスミッド・ベクター等の宿主域は、主
に細菌や酵母等であり、狭いという欠点を解消するため
、高等動物細胞を宿主とする広宿主域のウィルス・ベク
ター、例えば、ワクチニアウィルス・ベクターの開発：
２種以上の異種抗原や異種ウイルス等の混合からなる従
来の混合ワクチンに代わるものとして、ワクシニアウイ
ルスゲノムに外来抗原遺伝子を挿入した組換えウイルス
を有効成分として用いる組換え多価ワクチンの開発。上
述のＷＨＯ宣言や提唱等を契機として、現在、種々のウ
ィルス・ベクターに関する基礎研究と開発が各方面で精
力的に展開されている（ウイルス、第３６巻、１〜４１
ページ、１９８６　；　　同上、第３７巻、１〜４０ペ
ージ、１９８７　）。例えば、バピローマ、ボリオーマ
、アデノ、ワクチニア、レトロ、バキュロ、パルボ、カ
リフラワーモザイク、タバコモザイク等の各ウイルスが
、逍伝子クローニングベクターや発現ベクターとして知
られている。

また、斯かるウィルス・ベクターを用いる有用物質の生
産技術としては、例えば、下記が公知である：弱毒ワク
チェアウィルス・ベクターでは欧州公開特許第８３２８
６号（各種抗原の生産）、公表昭６０−５００５１８　
　（各・種抗原の生産》、特開昭６１−２８９８８８（
マラリア抗原の生産）、特開昭６２−４４１７８　＜　
Ｂ型肝炎表面抗原の生産）、特開昭６２−１５１１８６
　（ネコ白血病抗原の生産）、特開昭６２−２９４６９
８　（黒色腫抗原の生産》、公表昭６３−５００００３
　（γインターフェロンの生産》、及び公表昭６３−５
００００５　（ヒト・インターロイキン２の生産）；非
病原性アデノウィルス・ベクターでは公表昭５９−５０
００４２　（ポリオウイルス抗原の生産）、及び特開昭
６２−１２２９６（Ｃベプチド等、所望の蛋白質の生産
》；ウシ・ロタウィルス・ベクターでは公表昭６０−５
０１６３９　（ヒト・ロタウルス抗原の生産》：強毒単
純ヘルペス１型・ベクターでは特開昭６１−１３９０　
（　Ｂ型肝炎表面抗原の生産、及び特開昭６２−２５７
３８５　（強毒単純ヘルペスウイルス１型と２型からな
る弱毒組換えウイルスの作成》；レトロウイルス由来Ｌ
ＴＲでは（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ
）　・ベクター《特表昭６１−５０２９３２　（癌特異
抗原の増幅》；弱毒水痘ウイルスベクター（特開昭６３
−１２２７７　　（エプスタイン・バーウイルス抗原の
生産》；タバコモザイクウィルス・ベクターでは特開昭
６３−１４６３９　　（高等植物細胞の形質転換》等。

しかしながら、上述の公知技術は、ワクチン用抗原の生
産に係る生物学的製剤分野に於いては未だ実験的試行の
段階にある。

即ち、これ等の生産技術は、生産収率や純度等に関し不
十分であり、同時に、斯かる技術により得られる生産物
が適用されるヒト、家禽、家畜、愛玩動物等に対する該
生産物の安全性と有効性が確認されていない。そのため
、未だ、ウィルス・ベクターにより生産された生物学的
製剤は公認かつ実用化されておらず、現実には商業ベー
スに乗っていない．例えば、ワクチニアウィルス・ベク
ターは、上述の通り、種々の有用物質の生産に利用され
てはいるが、ベクターとしてのワクチニアウイルスの欠
点は、該ウイルスそれ自体が有する神経病原性による公
知の重篤な副反応、即ち、種痘後脳炎誘発の危険性にあ
る。従って、該ベクターの組換え体とその産物は、安全
性の保証に関し十分ではない．更に、該ウイルスに対す
る抗体保有者や免疫獲得動物等に於いては、生ワクチン
の有効成分としての斯かるウイルス組換え体の増殖が抑
制又は阻止されるため、現状では、生ワクチンとしての
普遍的効果は期待されない．換言すれば、生ワクチンの
効果の発現は、有効成分である斯がる組換え体が被接種
対象に於いて増殖することを前提としているなめ、該ウ
イルスが十分には増殖できない上述抗体保有者や免疫獲
得動物等では生ワクチンの効果が完全に発揮されず、善
感ないしは有効性の保証される被接種対象域が狭く限定
されることになるので、斯かる生ワクチンは背遇的予防
接種には必ずしも適当でない．また、鱗翅目キンウワバ
科（醇胆肛並心　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　）の核多角
体病ウイルスゲノムを用いるバキュロウィルス・ベクタ
ーにより、既に、種々の有用物質の生産が実験的に試行
されている＜　Ｂ　ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ　ｌｏｖｙ、第
８巻、第６号、４７〜５５ページ、１９８ｇ）　：例え
ばヒト・α及びβインターフェロン、ヒト・インターロ
イキン２、パラインフルエンザウイルス赤血凝集素一ノ
イラミニダーゼ、インフルエンザウイルス赤血凝集素等
、エイズウイルス各種抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、大腸菌
β−ガラクトシダーゼ等約３５種の抗原や酵素類．しか
しながら、斯かる生産物の安全性と有効性の兼備につい
て未だ十分には確証されておらず、また、ほとんどの報
告が昆虫の細胞培養を用いる狭い宿主域での結果に止ま
り、大量生産に於ける該ベクターの適合性ないしは効用
について未検討であるため、バキュロウィルス・ベクタ
ーは未だ、産業上利用の域には到達していない。

以上から明らかな通り、ウィルス・ベクターに係る従来
技術の難点と欠陥とを解消することは、医療や畜産等の
産業上のみならず、全世界に於ける保健の向上と普及並
びに食糧資源の確保の促進を図る上で、極めて重要かつ
有益であり、必須の課題であると言っても過言ではない
。

ａ題を　ゞ　るための手「 本発明者等は、前述の従来技術の課題を克服するなめ、
鋭意研究を重ねた結果、従来のものに比べ優れて有用な
ウィルス・ベクターの開発を達成レな。即ち、本発明は
遺伝学的に強毒株へ復帰変異しない安定な弱毒化された
ウイルスを用いるため、生物学的製剤の製造工程下での
バイオハザードの観点から安全、低コストでの大量生産
が容易生産物が生ワクチン等の有効成分として安全かつ
有効、更に、斯かる製剤の使用・実用に際し低廉かつ省
力的であるという利点をもたらす、ウィルス・ベクター
を用いる組換え遺伝子作成法及び組換えウイルスの作出
を達成しな。斯かる達成は、弱毒マレック病ウイルス、
Ｈｖ’ｒ　　ｏｉ株及ＭＤＶ　　Ｃ２株の各ウイルスゲ
ノムＤＮＡにつき夫々ウィルス・ベクターとしての卓抜
した有用性を発見したことに基づく．驚くべきことに、
上述ＤＮＡに於ける外来遺伝子挿入に適した領域を解析
かつ探索すると共に、斯かる領域に外来遺伝子を挿入連
結により作出しな組換えウイルスは、ベクターであるウ
イルスが本来所有の抗原のみならず、挿入連結された外
来遺伝子が産生の抗原をも併せて有することを発見した
．しかも、これ等の抗原が、動物、特に鳥類由来の初代
〜約３代継代の細胞培養を宿主しとて用いる該組換えウ
イルスの培養下で、低コストで能率的に大量産生できる
ことを見出だした。また、上記培養宿主は、未確認の癌
原性因子やその他の為害作用因子等を有する疑いのある
癌化した細胞株やセルラインではないので、安全であり
、生ワクチンの製造に好適であることも見出した。更に
、斯かる紐換えウイルスが生物学的製剤の製造に適した
弱毒ウイルス株として安全性が保証される共に、不活化
ワクチンや診断剤の抗原として有用であるばかりでなく
、体液性並びに細胞性免疫を誘導し感染防御を図るため
の多価生ワクチンの有効成分として安全性と有効性とを
優れて兼備していることをも見出だした。

本発明は、これ等の知見に基づき完成されたものである
． 即ち、本発明によれば、以下の第（１）項から第（３）
項に記載の組換え遺伝子作成法、並びに第（４）項から
第（５）項に記載の組換え弱毒マレック病ウイルスが併
せて提供される：《１）弱毒マレック病ウイルスゲノム
ＤＮＡをウィルス・ベクターとして用いることを特徴と
する組換え遺伝子作成法； （２）ウィルス・ベクターが、外来遺伝子クローニング
ベクター、又は外来遺伝子発現ベクターである第１項に
記載の組換え遺伝子作成法；（３）ウィルス・ベクター
としての弱毒マレック病ウイルスゲノムＤＮＡに外来遺
伝子を挿入連結する部位が、該ウイルスの遺伝子プロモ
ーター配列の下流領域である第１項又は第２項に記載の
組換え遺伝子作成法； （４）弱毒マレック病ウイルスの遺伝子プロモーター配
列の下流領域に挿入連結された一種以上の外来遺伝子を
有することを特徴とする組換え弱毒マレック病ウイルス
；及び 《５》弱毒マレック病ウイルスがＨＶＴ　　０１株、又
はＭＤＶ　　Ｃ２株である第４項に記載の組換え弱毒マ
レック病ウイルス． 本発明の構成は、次の通りである： （Ｉ＞ウィルス・ベクターとして用いるウイルス株の遺
択：ウィルス株の選択は、最終的に得られる組換えウイ
ルスについて生ワクチン製造用ウイルス株としての適格
性の保証を得ること、及び斯かる組換えウイルスを有効
成分とする生ワクチンの安全性と有効性を併せて確保す
ることを前提として、長年に亘り蓄積された豊富なデー
タに基づく緻密かつ厳密な評価に基づき行う。即ち、先
ず、安全性確保の観点から、ウィルス・ベクターとして
、弱毒化が確実なウイルス株の使用が望ましい。例えば
、前述［定義］の通り、マレック病ウイルス各血清型の
うち、■型に属する人工的弱毒ＭＤＶ、■型に属する野
生の弱毒ＭＤＶ、及び■型に属するＨＶＴである各ウイ
ルス株を夫々、使用できる．特に、上記各ウイルス株の
うち、マレック病生ワクチンの有効成分として各国管理
当局が製造認可済ないしは公認の弱毒株の使用が好まし
い。例えば、日本の農林水産省が認可済みのＨＶＴ　　
０１株（日本獣医師会雑誌、第２７巻、２０〜２４、１
９７４年）、ＭＤＶ　　Ｃ２株（　Ｇａｎ　Ｈｏｎｏｇ
ｒａ−ｐｈ　Ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　
、第１０巻、９１〜１０７ページ、１９７１年）等を挙
げることができる。

（ｎ）ベクターとして用いる弱毒マレック病ウイルスゲ
ノムＤＮＡの調製：先ず、公知の常法に従ってウイルス
を培養の後、ウイルス粒子を採取する。例えば、ニワト
リやウズラ等の胚繊維芽細胞培養に種ウイルスを接種し
培養の後、得られるウイルス感染細胞から、該感染細胞
の溶解処理、次いで、低速遠心による細胞破片の除去、
超遠心によりウイルス粒子の採取、更に、密度勾配遠心
法によるウイルス粒子の精製、採取、及び乾燥の各工程
を経て、乾燥ウイルスを調製する．斯かるウイルス粒子
内のヌクレオイドに埋め込まれた状態で存在するゲノム
ＤＮＡの抽出と精製は、公知の常套手段により行う。尚
、一般に、核酸の抽出と精製は、核酸の不可逆的変性を
避けるため、ｐＨ３〜１０での実施が望ましい。例えば
、１００℃のＮａＣ１溶液を用いる熱食塩法、ドデシル
硫酸ナトリウム《以下ｒＳＤＳ，と略記》やデオキシコ
ール酸ナトリウムく以下ｒｓＤｃＪと略記）等を用いる
洗剤法、２相分配の原理に基づくフェノール抽出法、塩
酸グアニジンの濃厚液を用いる塩酸グアニジン法、Ｎａ
ＯＨ溶液やＮａ２Ｃ０３−ＮａＨＣ０３Ｍ街液等を用い
る約ｐ旧０でのアルカリ法、冷エタノールを用いるアル
コール沈澱法等を適宜、組合わせて採用することにより
ウイルスゲノムＤＮＡを調製することができる。

＜Ｉ［［）ベクターとして用いる弱毒マレック病ウイル
スゲノムＤＮＡの遺伝子ライブラリー及び制限酵素地図
の作成：公知又は市販の制限酵素、プラスミドと宿主細
胞《例えば、ｒ　ＡＴＣＣ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅｏｆ　
Ｂａｃｔｅｒｉａ−ＰｈａｇｅＳ−ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ　Ｊ　，第１６版、２４０〜２５５ページ、ＡＴ
ＣＣ１９８５年発行）等を用い、常法に従って行うこと
ができる。例えば、下記の順に各操作を行い、制限酵素
地図を作成する：ウイルスゲノムＤＮＡを制限酵素で消
化切断し、ウイルスＤＮＡ断片を調製する；ＤＮＡリガ
ーゼを用いて、該ＤＮＡ断片をブラスミドの制限酵素開
裂部位へ挿入連結する；該プラスミドを宿主細胞へ移入
し形質転換することにより、遺伝子としての各ＤＮＡ断
片をクローニングし、ウイルス遠伝子ライブラリーとす
る；斯かるライブラリーの各形質転換体から夫々、常法
によりブラスミドを抽出の後、これを制限酵素処理し、
ウイルスＤＮＡ断片を回収する；該ＤＮＡ断片をアガロ
ース・ゲル電気泳動にかけ、移動度に基づき各ウイルス
ＤＮＡ断片の分子量を算出し、その結果に基づき上記ラ
イブラリーを分類する；分類済のライブラリー中の代表
的なクローンを選別し、選別した各クローンから、プラ
スミドを抽出し、これを制限酵素処理した後、低融点ア
ガロース・ゲル電気泳動にかけ、クローニングしたウイ
ルス遺伝子ＤＮＡ断片を回収する；回収したＤＮＡ断片
は、フェノール抽出、エタノール沈澱等により精製の後
、ニックトランスレーション法にて放射能ラベルしたレ
プリカを作製し、これをプロープとする；該プローブを
用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性コ
ロニーを選別採取する；採取した各コロニーから、プラ
スミドを抽出し、これを種々の制限酵素で処理した後、
アガロース・ゲル電気泳動にかけ、該ゲルと上記プロー
ブを用いてサザーンハイプリダイゼーションを行う：斯
かるハイブリダイゼーションの結果、及び使用した制限
酵素を考慮し、ウイルスゲノムＤＮＡの制限酵素地図を
作成できる。

（ＩＶ）ウィルス・ベクターとしての弱毒マレック病ウ
イルスゲノムＤＮＡに於ける外来遺伝子の挿入連結部位
の探索と決定：この工程は、遺伝子産物の実用上の性能
と品質を確保すること、及び大量生産の達成と製造コス
トの低減を図ること、即ち、遺伝子発現産物の品質と量
産の確保を前提として行う．斯かる前提を満足させるた
め、外来遺伝子を挿入された弱毒マレック病ウイルスに
本来所有の非病原性及び宿主細胞感受性又は増殖能を保
持させ、同時に、挿入連結された外来遺伝子を十分に発
現させる必要がある。従って、この作業は、産業利用上
極めて重要であり、また、高度の洞察力と直感を要する
．公知の知見によれば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動法を用いる免疫沈降反応に基づき、既に４
０数種類の分子量３５０Ｋ〜１９Ｋ　（Ｋ＝ｘ１００Ｇ
）の蛋白質が、マレック病ウイルスには同定されている
。また、該ウイルスは、感染細胞に於いて、酵素阻害剤
に対する感受性が宿主細胞固有のものとは異なるＤＮＡ
ポリメラーゼやチミジンキナーゼを誘導することも知ら
れている．従って、これ等の蛋白質や酵素の産生に夫々
関与する４０数種の各構造遺伝予の領域を、外来遺伝子
の挿入結合部位として使用できる。換言すれば、斯かる
構造遺伝子の転写を促す各プロモータ配列の下流領域を
外来遺伝子の挿入結合部位として使用できる．例えば、
上記構造遺伝子のうち平均ｎＷの構造道伝子が同一オベ
ロン内で連係してポリシストロンを構成し、単一プロモ
ーターの下で制御された状態にあると仮定すると、マレ
ック病ウイルスゲノムには少なくとも４０／ｎ以上の整
数個のプロモーターが存在することになり、これ等全て
のプロモータ配列の下流領域を使用できる。特に、遺伝
子発現量の顕著性を考慮に入れと、糖蛋白Ａ抗原（以下
、’ｇＡＪと略記する）、糖蛋白Ｂ抗原、（Ｊ原、チミ
ジンキナーゼ、分子量約１３５ＫのＤＮＡ結合蛋白、分
子量約８６Ｋと約９２Ｋのウイルス主要特異蛋白、分子
量約３６Ｋ、約３９Ｋ及び約４４Ｋのリン酸化蛋白（　
Ａｄｖａｎ−ｃｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ前述》等の各遺伝子のプロモータ配列の下流領域の
使用が望ましい。そして、プロモーター配列及び構造遺
伝子領域を明確に把握し、外来週伝子を能率的かつ効果
的に挿入連結する上で、これ等の遺伝子の塩基配列の決
定は、制限酵素地図の作成と共に重要かつ有用である．
塩基配列の決定は公知の常法、例えば、マキサムーギル
バート法、ジデオキシチェーンターミネーター法（Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ａｃａｄｅｎ＋ｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　　［Ｕ
ＳＡ　］　、第７４巻、５４６３−５４６７ページ、１
９７７年；　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋
ｉｓｔｒｙ、第１５２巻、２３２−２３８ページ、１９
８６年）等により、実施できる．更にまた、該ウィルス
・ベクターは改造できる。例えば、転写活性を高めるた
め、斯かるプロモーター配列、又は該配列の上流ないし
は下流にエンハンサーとしての塩基配列を挿入すること
ができる。但し、外来遺伝子の挿入連結部位と該ベクタ
ーの改造は、上述の例示のみに限定されるものではない
。

（Ｖ）発現ベクターの構築二上記（ＩＶ）工程で決定し
た外来遺伝子の挿入結合部位を包含する遺伝子を発現さ
せるため、公知又は市販の制限酵素ブラスミドと宿主細
胞（　ｒ　ＡＴＣＣ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆＢａｃ
ｔｅｒ　ｉａ−Ｐｈａｇｅｓ−ｒロＨＡ　ＶｅＣｔＯｒ
ＳＪ　、前述）等を用い、常法に従い、発現ベクターを
構築する．例えば、前述（ｍＶ）のｇ八遺伝子内に外来
遺伝子を挿入連結する場合には、ｇ八発現ベクターを構
築する．斯かる構築は、上記（ＩＩＩ）と同様の要領で
行うことができる．即ち、上記＜ＩＩＩ）に記載のクロ
ーニングされた遺伝子のＤＮＡ断片とその制限酵素地図
とを照合し、遺伝子ライブラリーから、ｇＡ遺伝子を包
含すると考えられる形質転換体を選出し、これを使用し
て、次の順序で発現ベクターを構築する：培養した形質
転換体からプラスミドを抽出する；ブラスミドを制限酵
素処理した後、低融点アガロース・ゲル電気泳動にかけ
、上記（ＩＩＩ）と同様にして、ウイルスゲノムＤＮＡ
断片を回収する；該ＤＮＡ断片を、公知又は市販の発現
用ベクターに挿入連結した後、これを宿主細胞に移入し
形質転換させる：次いで、該形質転換体から、構築した
発現ベクターを抽出・回収する；発現ベクターと無機塩
との共沈澱物、例えば、リン酸イオンとカルシウムイオ
ンの共存下で形成される共沈澱物を調製する；この調製
物を呻乳動物細胞培養に接触させ（ＩＩＡ発現ベクター
をに導入する；斯かる細胞培養につき、組織病理学的手
法、例えば、市販の二次抗体を用いる蛍光抗体法等によ
りｇ＾の産生を確認する。尚、以上の各術式は、ｇＡ遺
伝子のみに限定されるものではない。

（Ｖｌ）外来遺伝子の種類：ウィルス・ベクターとして
用いる弱毒マレック病ウイルスが本来有する遺伝子以外
の遺伝子を外来遺伝子として使用できる．また、本発明
のウィルス・ベクターには、斯かる外来遺伝子から選ば
れる１種以上の遺伝子を組合わせ、同時に挿入連結する
ことができる。外来遺伝子としては、例えば、弱毒マレ
ック病ウイルス以外のウイルス、クラミジア、リケッチ
ア、マイコブラズマ、細菌、原虫、動物細胞、植物細胞
等が産生又は有する種々の構成成分、抗原、酵累、生理
活性物質等の遺伝子を外来遺伝子として使用できる。例
えば、イバラキ病、牛下痢一粘膜病、牛伝染性鼻気管炎
、牛流行熱、牛疫、アデノ７型、ロタ、馬インフルエン
ザ、***、豚コレラ、豚パルボ、鶏痘、鳩痘、ニュー
カッスル病、鶏伝染性喉頭気管支炎、鶏伝染性気管支炎
、鶏脳脊髄炎、犬伝染性肝炎、ジステンパー、猫汎白血
球減少症、猫白血病、猫汎白血球減少症、ミンク腸炎、
狂犬病、仮性狂犬病、伝染性ファブリキウス嚢病、イン
フルエンザ、バラインフルエンザ、ポリオ、日本脳炎、
腎症候性出血熱、黄熱、サイトメガ口、水痘、ムンプス
、麻疹、風疹、水痘、Ｂ型肝炎、成人Ｔ細胞白血病、エ
イズ等の各ウイルスが有する種々の遺伝子、例えば、感
染防御抗原、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ等の遠伝子
；更には、気腫痕、炭痘、豚丹毒、ボルデテラ・ブロン
キセブチ力、ヘモフイルス・バラガリナルムＡ型、レス
トスビラ・カニコーラ、レストスビラ・イクテロヘモラ
ジー、ボツリヌスＣ型、コレラ、ジフテリア、破傷風、
百日咳、結核、ガス壊死、肺炎、パラチフス、腸チフス
、発疹チフス、髄膜炎等の各種病原菌が有する種々の逍
伝子、例えば、毒素、構成蛋白質、酵素、感染防御抗原
、赤血凝集素、生理活性物質等の逍伝子を挙げることが
できる。但し、外来遺伝子は、上述の例示にのみ限定さ
れるものではない。

（■）外来遺伝子のクローニング：常套手段である上記
（Ｉ）及び（ＩＩ）の要領と同様にして行うことができ
る．即ち、異種ウイルスゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの調製
は上記（工）、また、該遺伝子のクローニングは上記（
ＩＩ）に従って行うことができる。但し、外来遺伝子が
ＲＮＡウイルスに由来の場合には、調製したウイルスゲ
ノムＲＮＡに相補的なＤＮＡ　（以下ｒｃＤＮＡ」とい
う）を公知の常法に従って合成し、斯かるｃＤＮＡを該
遺伝子のクローニングに供する必要がある。尚、ｃＤＮ
Ａの合成には、市販の逆転写酵素を使用できる。また、
発現ベクターに挿入連結する外来遺伝子ＤＮＡ断片を調
製する上で、外来遺伝子についての制限酵素地図の作成
と塩基配列の決定が望ましい．尚、制限酵素地図の作成
は上記（ＩＩＩ）、塩基配列の決定は上記（ＩＶ）に夫
々記載の方法により行うことができる． （■）組換え用ベクターの横築二公知の常法により行う
ことができる。即ち、上記（Ｖ）で構築した発現ベクタ
ーを制限酵素で開裂し、次に、ＤＮＡリガーゼを用いて
、上記《■》でクローニングした所望の外来遺伝子を該
開裂部位に挿入連結の後、斯かるベクターを宿主細胞に
移入し形質転換させることにより構築できる．尚、外来
遺伝子の挿入連結部位に関し、例えば、上記（Ｖ）のｇ
Ａ発現ベクターを用いて外来遺伝子を単独で発現させる
場合、ｇ八遠伝子の塩基配列を参考にし、そのプロモー
ター下流領域を占める構造遠伝子の開始コドンを開裂又
は除去し、この部位に外来遺伝子を挿入連結する．また
、ＩＪＡ遺伝子と外来遺伝子両者により融合蛋白を発現
させる場合には、ｇＡｍ遥遠伝子の領域を開裂し、外来
遺伝子を挿入連結する． ＜ＩＸ）組換えウイルスの作成一種々の公知手法．を組
合わせ、これに工夫を加味することにより行うことがで
きる。例えば、後述（Ｘ）の細胞培養に弱毒マレック病
ウイルスを接種し感染させた後上記《■》の組換え用プ
ラスミドと無機塩との共沈澱物を更に接種し、これ等両
者の混合感染を行う。次いで、市販の維持培地を添加し
、約３０〜３９℃にて約１５〜３０時間、培養の後、培
地を捨て、アガロースを添加混合した維持培地を感染細
胞に重層し、更に約３０〜３９℃にて約１〜３日間、培
養しプラークを形成させる。次に、組換えウイルスを単
離するため、各プラーク中心部のアガロースを穿孔して
採取した後、押印操作と同様の要領で、市販のメンプラ
ンフィルター表面に夫々、スタンプして移す．該フィル
ターは、公知のコロニーハイブリダイゼーションの要領
に従って、変性や中和処理等による各スタンプの固定化
ないしは焼付処理を行った後、公知のプラークハイプリ
ダイゼーションに供する。尚、この場合には、ニックト
ランスレーションにより放射能ラベルした外来遺伝子の
レプリカをブローブとして使用できる。そして、上記パ
イプ刃ダイゼーション陽性のプラークから採取したウイ
ルスを、組換えウイルスとして保管する．尚、上述例示
の組換えウイルスは、ＨＶＴ及びＭＤＶ由来の各プロモ
ーターを夫々有する組換え用ベクター群と、ＨＶＴ及び
ＭＤＶからなるウイルス群との間の相互の組合わせに基
づき、種々作成することができる。また、斯かる組換え
ウイルスがマレック病ウイルス抗原と外来遺伝子発現産
物を併せて発現することは、例えば、エライサ（ＥＬＩ
ＳＡ）や各種蛍光抗体法等により確認できる。更に、下
記（Ｘ）の細胞を用いて斯かる組換えウイルスを継代し
、各継代の培養液と感染細胞につき夫々、公知の免疫学
的試験、ウイルス学的試験、遺伝学的試験、組織病理学
的試験、動物試験等、例えば、「動物用生物学的製剤基
準（農林水産省告示第５９９号）」に規定の各種試験に
準拠して検定を行い、該ウイルスが安全性と有効性を兼
備していることを確認できる。

本発明のウィルス・ベクター及び組換えウイルスは夫々
、バイアル瓶又はアンプル等の容器中で密封された状態
で、液状又は乾燥の形態で提供でる。特に、該組換えウ
イルスは、下記（Ｘ）の要領による大量培養が可能であ
り、斯かる培養ウイルスは、公知の常法に従って各種製
剤に調製できる。これ等製剤は夫々、前述の国家規定に
準拠して各種試験を行い、各々の適格性を確認の後、不
活化ワクチン、生ワクチン、診断剤等として、上述の分
注包装形態により実用に供し得る。

（Ｘ）弱毒マレック病ウイルスとその組換えウイルスの
大量生産用の培養宿主及び培養法：培養宿主としては、
マレック病ウイルスの増殖が可能な限り、種々の細胞を
使用できる。特に、マレック病ウイルスは、鳥類由来の
細胞に感受性が高く斯かる細胞で良好に増殖するため、
健康な烏類やＳ　Ｐ　Ｆ　（　ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ−ｐ
ａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ　）鳥類に由来の細胞の使用
が好ましい。例えば、ＳＰＦニワトリ由来の胚繊維芽細
胞や胚腎、アヒル胚繊維芽細胞、シチメンチョウ胚繊維
芽細胞、ウズラ胚繊維芽細胞等の初代〜約５代継代細胞
培養の使用が望ましい。また、上述の培養宿主を用いる
該ウイルスの培養は、温度約３３〜３９℃に保温の条件
下で、公知の常法により行うことができる．例えば、培
養方式としては、靜置培養、回転培養、タンク培養等を
採用できる．また、培地として、市販、又は公知の動物
細胞培養用の培地、例えば、１９９培地（　ｏｒｒｃｏ
社［米国］製》、イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製》
等、公知材料と常套手段を適宜、組合わせて使用するこ
とにより行うことができる， 以下、本発明の具体例につき、実験例及び実施例を挙げ
て説明する．但し、本発明は、以下の実験例及び実施例
にのみ限定されるものではない。

実験例１ リン酸塩緩衝液（以下ｒＰＢｓＪという》の調製：　基
礎溶ｉ（ＮａＣＩ　ａ．ｏ　ｇ　／１　，ＫＣＩ　Ｏ．
２ｇ／ｊ　　）に、所望のモル濃度とＰＨになるよう、
同モルのＨａ２ＨＰＯ４及びＫＮ２ＰＯ４を夫々、量比
で溶解して調製する． 実験例２ トリプシン液の調製：トリブシン１　：２５０（ＤＩＦ
ＣＯ社［米国］製）２．５ｇを、実験例１に於いて調製
したＨ／７５ＰＢＳ（ｐＨ７．　２）に溶解して１．ｌ
ｌにした後、メンプランフィルターで枦過滅菌し使用に
供する。

実験例３ トリスｌ衝液の調製：トリス（ハイドロキシメチル）ア
ミノメタン１２１．　１４　ｇを蒸溜水８００ｍｌに溶
解し、濃ＨＣＩを滴下混合して所望のｐＨに調整した後
、更に蒸溜水を加えて１ｊにし、１Ｈトリス緩衝液を得
る．次いで、これを所望の濃度のトリス緩衝液になるよ
う蒸溜水で希釈・調整の後、使用に供する。以下、’　
Ｔｒ　ｉＳ−ＨＣＩ　」と略記する。

実験例４ ＨＶＴ　　Ｏｆ株（以下「ＨＶＴ」という）の培養：常
法に従って・、培養する。即ち、７個の９日齢卿化ウズ
ラ卵から摘出したウズラ胚繊維芽細胞（以下ｒＱＥＦ，
という）を、実験例２に記載のトリプシン液で消化し、
分散させる。次に、１０００ｒｐｎ＋　、５分間、低速
遠心しＱＥＦを採取し、これを維持培地、最終濃度５ｖ
／ｖ％仔ウシ血清添加のイーグルＭＢＭ培地（日水製薬
）に浮遊し、細胞数が２×１０６細胞／　ｍｌのＱＥＦ
浮遊液５００ｍｌを調製する。該ＱＥＦ浮遊液を５本の
１１容ルー瓶に１００ｍｌずつ分注の後、ウイルス感染
量が１．Ｏｘ１０６ＰＦＵ　＜７”ラ−ク形成単位）　
／　ｍｌ　ノＨ　Ｖ　Ｔ　　Ｏｆ株感染細胞浮遊液を種
ウイルスとして各ルー瓶毎に１ｍｌずつ接種し、ゴム栓
をして、３７゜Ｃの保温器内で２日間、培養する．細胞
変性、即ち、巨細胞形成が各々のルー瓶内の細胞培養単
層の９０％に達していることを検鏡により確認の後、培
養を終了する。次に、各ルー瓶中の培養液を除去した後
、Ｈ／７５　ＰＢＳ　（ｐＨ７．４）　１００の１を分
注すると共に、ゆるやかにｆｉ！！し、各ルー瓶内壁面
に付着して単層を形成している感染細胞を該ＰＢＳと接
触させることにより洗浄する。斯かる洗浄は３回繰返し
行う。

次いで、各ルー瓶に２０ｍｌのＨ／７５　ＰＢＳ　（ｐ
Ｈ７．４）を分注した後、ピベッティングを行うことに
より、ルー瓶内壁面から感染細胞を剥離させ浮遊させる
。

得た各ルー瓶の感染細胞はプールし、２０００　ｒｐｎ
＋、１０分間、低速遠心した後、その上清を捨て、沈渣
を採取する。採取した沈渣（約１ｍｌ）は、−７０゜Ｃ
の冷凍庫中に保存し、ＨＶＴ感染ＱＥＦ細胞として爾後
のＨＶＴゲノムＤＮＡの調製に供する。

実験例５ ＭＤＶ　　Ｃ２株（以下ｒＭＤＶＪという）の培養：実
験例１と同一の操作により、ＭＤＶ感染ＱＥＦ細胞を採
取した後、これを−７０℃の冷凍庫中に保存し、爾後の
ＭＤＶゲノムＤＮＡの調製に供する。

実施例Ｉ ＨＶＴゲノムＤＮＡの調製：実験例１で採取したＨＶＴ
感染ＱＥＦ細胞６；：、ＴＥＮ”Ｏｉ　（１０ｎ＋Ｈ　
Ｔｒｉｓ−ｔｉｃ　Ｉ　［ｐＨ７．　４］、１ｒａＨ　
ｘチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩Ｅ以下ｒＥＤＴ
Ａ」という］　、５０ｎ＋Ｍ　ＮａＣｌ）２０ｍｌを添
加混合し、細胞を再浮遊させ、スターラー上で５分間、
撹拌する．次に、該細胞浮遊液に２×細胞溶解液（１０
０　ｎＨ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ［ｐＨ７．４１、７．２ｍ
Ｈ　ＣａＣｌ２、２５０ｎ＋Ｈ　ＫＣＩ　１ｎ＋Ｈ　Ｅ
ＤＴＡ、ＩＷ／ｖ％デオキシコール酸ナトリウム、ＩＷ
／ｖ％ＭＰ−４０　［ノニデットＰ−４０　；シグマ社
〈米国〉製］　）　２０ｍｌ、ＤＮａＳｅ　Ｉ（宝酒造
■製）　５００　μｇ及びＲＮａｓｅ　Ａ　　（シグマ
社［米国コ製》１ｒＵｚを夫々添加混合し、３７℃で３
０分間、反応の後、２０ｍ１のトリクロ口・トリフルオ
ロエタンを加え、激しく振盪する．次に、４℃で、１５
００ｒｐｎ　、１０分間、遠心し、その上清を採取し、
これを５〜４０Ｗ／Ｗ％グリセロール密度勾配上に重層
し、４℃で、２７，０００ｒｐｒａ　，　７０分間、超
遠心《日立製作所製５５Ｐ　、ｏ一ターＮｏ．ＲＰＳ−
２８　）　Ｌ、ヌクレオカプシドを沈降させた後、該上
滑はパスツールピペットを用いて静かに除去する．一方
、沈渣に上述の秋細胞溶解液２００μ１を添加混合の後
０℃で５分間、スターラーにて撹拌する。得られた懸濁
液をエッペンドルフチューブに移した後、これに２００
μ１の１０■／ｍｌプロティナーゼＫ《シグマ社［米国
］製》、及び２ｘ　ＳＴＥ液＜１０ｈＨ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　［ｐＨ７．４］、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　，　２Ｗ
／Ｖ％ドデシル硫酸ナトリウム》６００μ１を添加混合
し、６５℃で３０分間、反応させる．反応終了の後、等
量の水飽和フェノールで１回、次に、混合有機溶媒（フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５
：２４：１）で２回、フェノール抽出を行い、水層を採
取して、これに２倍量の冷エタノールを添加混合の後−
２０℃で一夜、静置しＤＮＡをエタノール沈澱させる．
次いで、遠心によりＤＮＡを採取し、これを乾燥させる
。乾燥ＤＮＡは、５００μ１のＴＥ液（１０ｎ＋ＨＴｒ
ｉｓ−１１ｃｌ［ｐＨ８．ｏ］　、１ｔｎＭ　ＥＤＴＡ
）に再浮遊させ、ＨＶＴゲノムＤＮＡとして、爾後の使
用に供する。

実施例２ ＨＶＴゲノムＤＮＡの制限酵素断片のクローニングと遠
伝子ライブラリーの作成：上記ゲノムＤＮＡを種々の制
限酵素で切断し、各ＤＮＡ断片をコスミッドＥＩＨＣ７
９　　（ＢＲＬ，社［米国］製）を用いてクローニング
する．即ち、実施例１で得たＨＶＴゲノムＤＮＡ１μｇ
を、ＩＸＲＨ液（５０ｍＨ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ［ｐＨ７
．４］、１０ｍＨ　　Ｈ（ｌｃ＋２、Ｉｎ＋Ｈジチオス
レイトール［以下ｒ　ＤＴＴ，という］　、１００　ｎ
＋Ｈ　ＮａＣＩ　）と制限酵素旦ａｎｔＩ（ニッポンジ
ーン■製》１０単位からなる反応液１０μＡ中で消化さ
せる。これとは別途に、ｐＨＣ７９　１００■を、上記
組成の反応液５０μ１中で完全に旦ａｎ＋Ｈ■開裂させ
る。各反応液につき夫々、前述と同様にフェノール抽出
並びにエタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収する。この
２種類のＤＮＡを、前者：後者の重量比が１０：１の割
合で混合し、反応液（６０ｎＨ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐ
Ｈ７．６］、６，６ｎＨ　１４ａｃｌ２、１０ｒｎＭ　
ＤＴＴ、１ｒＱＭ　ＡＴＰ　，　Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ
［宝酒造■製コ１００単位）１０μ』中で、２０℃にて
２時間、反応させることにより、ＨＶＴゲノムＤＮＡ断
片をｐＨｃ７９のＢａｎ＋ＨＩ部位に連結する。

上記作業で得られた連結プラスミドを、受容細胞である
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨＳ株（ＢＲＬ社［米国］製）
に以下の要領で導入する：先ず、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨＳ
株を、＄培地＜　０．　５Ｗ／Ｖ％バクトイーストエキ
ストラクト、２１４／Ｖ％バクトトリプトン、０．５　
Ｗ／Ｖ％硫酸マグネシウム》１０ｍｌ中で、３０℃にて
一夜、振盪培養する．翌朝、該培養液１ｍｌを＄培地で
１００倍希釈した後、同様に３０℃で再培養を続け、光
学密度００５５ｏ＝０、４８に達したとき、培養液を氷
水中に１０分間置いた後、５，ＯＯＯｒｐｌｍ、１０分
間、遠心して培養菌体を沈降させ、集菌する。次いで、
これに１０ｍ１の形質転換用溶液Ｉ＜３ｈＨ酢酸カリウ
ム、１００＋＋Ｈ　ＲｂＣＩ、１０ｎ＋Ｈ　ＣａＣｌ　
、１５１４／Ｖ％グリセロール）を添加混合し、浮遊さ
せると共に、再び氷水中に１０分間置いた後、５，　０
００ｒｐｍ、１０分間、遠心して菌体を集める．該菌体
は、１ｍｌの形質転換用溶液■（１０ｎ＋Ｍ　ＰＩＰＥ
Ｓ　［同仁化学製］　、７５ｎ＋ＨＣａＣＩ　　、１０
ｎ＋Ｈ　ＲｂＣ１５Ｗ／Ｖ％グリセロール）に再浮遊し
た後、エッペンドルフチューブに２００μ』ずつ分注し
、−７０゜Ｃに保存する．このＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５株
は、受容細胞として下記の形質転換に用いる。即ち、該
受容細胞の浮遊液２００μ』に、上述の連結プラスミド
１μｐを添加混合し、０゜Ｃで３０分間、静置の後、熱
ショックの処理（４２℃、２分間）を行い、次いで、＄
培地８００μ１を添加混合して、更に、３０℃で６０分
間静置する．次に、遠心により集菌し、該菌体を最終濃
度２５μ『／ｍｌアンピシリン含有のし寒天培地７’！
／　−　ト（　１１４／ＶＸバクトトリフトン、０、５
Ｗ／Ｖ％ＮａＣ　ｌ、０．５１４／Ｖ％　イーストｘ．
＊スト−ｙク｝、１．５Ｗ／Ｖ％寒天》上に拡げた後、
３７゜Ｃ、一夜、培養して、受容細胞の形質転換を行う
。培養後、コロニーを形成している形質転換体を夫々、
つまようじを用いて、最終濃度２５μｔ　／　ｍｌアン
ピシリン含有し寒天培地プレート、及び最終濃度１０μ
ｇ　／　ｍｌテトラサイクリン含有し寒天培地プレート
の両者に移植し更に、３７℃にて一晩培養する．形質転
換体のうちＨＶＴゲノムＤＮＡを有する形質転換体は、
アンビシリン耐性、かつ、テトラサイクリン感受性とな
るので、これに該当する形質転換体を上記コロニー別に
選別採取し、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＢ懇Ｈエライブラリ
ーとする． また、制限酵素｝Ｉｉｎｄｌ［、及びｐｓＢを用い、上
記旦ａｍＨ■と同様に一連の操作を行い、ＨＶＴゲノム
ＤＮＡの各制限酵素断片を調製後、これ等の各断片をｐ
ＨＣ７９の各制限酵素対応部位にクローニングし、Ｈｉ
ｎｄｎ［ライブラリー及びＰｓｔＩ各ライブラリーを作
成しな．但し、Ｐｓｔ：［ライブラリーは、アン七シリ
ン感受性、かつ、テトラサイクリン耐性を指標として、
形質転換体を選別採取した． 実施例３ ＨＶＴの制限酵素地図の作成：コロニーハイプリダイゼ
ーション（「遺伝子操作マニュアル」、５１〜５４ペー
ジ、講談社サイエンティフィック　１９８２年発行》、
及びサザンハイプリダイゼイション（　ｒＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ、３８２〜３８９ページ、
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　１９８２年発行）に記載の手法に従って行う
。即ち、実施例２で得たＢａｎ＋ｔｌＩライブラリーの
１１２８種の各クローンからアルカリ抽出法（上述のｒ
Ｈｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ３６８〜３６
９ページ）により、プラスミドＤＮＡを抽出する。次い
で、抽出した各ＤＮＡをＢａｍＨＩで完全に消化の後、
アガロースゲル電気泳動にかけ移動度を測定することに
より、ｐＨｃ７９にクローニングされているＨＶＴゲノ
ムＤＮＡのＢａｎ＋Ｈ■断片の分子量を算出する。更に
、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＰＳｔ■により夫々、消化を行っ
た後、上述と同様に電気泳動にかけ、各制限酵素による
切断パターンを調べる。そして、これ等の結果に基づき
、Ｂａｎ＋ＨＩライブラリーを類似クローン毎に分類す
る。

分類された各グループから、代表的なクローンを選出し
、各クローン別にＢａｍＨ■消化の後、低融点アガロー
スゲル電気泳動にかけ、クローニングされたＨＶＴゲノ
ムＤＮＡ断片のみを回収する。

該ＤＮＡ断片は、実施例１に記載のフェノール抽出及び
エタノール沈澱により精製して後、ニツクトランスレー
ション（前述「遺伝子操作マニュアルＪ、８３〜８６ペ
ージ）により［３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識し、プローブ
として使用する。該ブローブを用いて、実施例２で得た
ＨｉｎｄＩ［［及びＰｓｔｉ各ライブラリーにつき、コ
ロニーハイブリダイゼーションを行う。コロニーハイブ
リダイゼーションが陽性のコロニーから、上記のアルカ
リ抽出法により、プラスミドＤＮＡを抽出する。次いで
、該抽出ＤＮＡを第１図に記載の種々の制限酵素で消化
した後、アガロースゲル電気泳動にかける。得られた電
気泳動済みゲルを使用して、サザンハイプリダイゼーシ
ョンを行い、どの制限酵素断片が上記プローブとハイブ
リダイゼーションしているかの判定に基づき、ＨＶＴの
制限酵素地図を作成した。

その結果を第１図に示す。

実施例４ ＨＶＴｇＡ抗原遺伝子の発現ベクターの梢築：各操作は
、実施例２及び実施例３に記載の方法に従って行う。即
ち、実施例３での解析と選別の結果ＨＶＴゲ／　ムＤ　
Ｎ　Ａノ３．　９ｋｂ及び３．　３ｋｂ旦ａｍＨＩ両断
片を有することが判明したプラスミドｐＢ５２をＢａｎ
＋ＨＩで部分消化の後、これを低融点アガロースゲル電
気泳動にかけ、７．２ｋｂ旦ａｎＨＩ断片を回収する。

次いで、この７．２ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片を、旦ａｌ
ｌＨＩで消化し開裂したブラスミドｐｓＶ２−ｎｅｏ　
（ＡＴＣＣ　３７１４９）のＢａｎ＋ＨＩ部位に連結・
挿入した後、これを実施例２の記載と同様に受容細胞Ｌ
並１ｉ　Ｄｔｌ５株に移入し形質転換させることにより
、プラスミドｐＳＶＢ５２−３を得た。その結果を第２
図に示す．尚、該ｐＳＶＢ５２−３の乾燥品は、実施例
３に記載のアルカリ抽出法により形質転換体から抽出及
び調製し、次の工程に供する。

実施例５ 呻乳動物由来細胞へのｐＳＶＢ５２−３の導入とＨＶＴ
９Ａ抗原の検出：　　５μｇ　ノｆ）ＳＶＢ５２−３を
、２ｘ　ＨＢＳ液＜　５０　ｎ＋Ｈ　ＨＥＰＥＳ　［同
仁化学製コ、２８０　ｎ＋Ｍ　ＮａＣＩ、１．５ｍＨ　
Ｎａ２ＨＰＯ４）　２００　μｊに溶解の後、２００μ
』の０．２５Ｈ　ＣａＣｌ２溶液を添加混合し、２０℃
で３０分間静置することにより、ＤＮＡとリン酸カルシ
ウムの共沈澱物を調製する。次に、公知の常法に従って
直径６ａｎのシャーレ内で２４時間培養したサル腎由来
ＬＬＣ−Ｍκ　（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７）細胞培養の培
養液中へ、この共沈澱物をマイクロピペットで滴下した
後、該シャーレを炭酸ガス保温器に入れ、更に２０時間
、培養する．得られた細胞培養は実験例２に記載のトリ
プシン液で消化し、シャーレ壁面から細胞を剥離した後
、実験例３の記載の従って低速遠心により細胞を採取す
る．次いで、採取して細胞を、最終濃度４００μｇ／ｍ
ｌ　０４１８　　（シグマ社［米国］製》及び最終濃度
５ｖ／ｖ％仔ウシ血清添加のイーグルＭＥＭ培地（日水
製薬）を用いて継代する。細菌ブラスミドｐｓＶＢ５２
−３が導入された補乳動物細胞は、抗生剤アミノグリコ
シド０４１８耐性に形質転換して、６４１８存在下でコ
ロニーを形成するので、これを指標として、継***始後
１０日月にトリプシン液を浸潤させたｒ紙を用いて、斯
かるコロニー毎に細胞をクローニングし、各クローン毎
に再び細胞培養する。次いで、各クローンの細胞培養に
ついて、公知の常法、アビジン・ビオチン蛍光抗体法（
　ｒＢＲＬ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｏｒ　ｌｎ＋ｍｕｎ
ｏｄｅｔｅ−ｃｔ　ｉｏｎ−＾ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　
Ｇｕｉｄｅ：Ｎ０．１０４４４」、ＢＲＬ社［米国コ発
行）に従って、ＨＶＴ！ＪＡ抗原を検出する．尚、一次
抗体にはＨＶＴ並びにＭＤＶの各ｇ＾抗原と反応するモ
ノクローナル抗体Ｈ−３４（Ｊｏｕ−ｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第６４巻、２５９
７　〜２６１０ページ、１９８３年）を、二次抗体には
抗マウスＩｇＧ　（ＢＲＬ社製）を夫々、用いる。その
結果、０４１８耐性細胞クローンのうち、約１７３のク
ローンに於いて細胞質内にＨＶＴｇＡ抗原の特異蛍光が
検出され、これ等のクローンでのＨＶＴｇＡ抗原の産生
が確認された（参考図第１図）。

実施例６ ＨＶＴｇＡ抗原遺伝子の塩基配列の決定：実施例４で得
たＨＶＴｇＡ抗原産生プラスミドｐＳＶＢ５２−３を制
限酵素Ｂａｎ＋ｔｌＩで消化し、低融点アガロースゲル
電気泳動にかけ、ＨＶＴゲノムＤＮＡの７．　２ｋｂＢ
ａｎ＋ＨＩ断片を回収する。該Ｂａｎ＋ｔｌＩ断片を更
に種々の制限酵素で消化し、得られるＤＮＡ断片を夫々
、実施例４に記載と同様の方法により、プラスミドｐｓ
Ｖ２−ｎｅｏの旦ａｎ＋Ｈ■サイトに挿入・連結する。

次いで、これ等の各ブラスミドを上記と同様の方法に従
ってＬＬＣ−ＨＫ２　，ｊ［［ｌ胞内へ導入しＨＶＴｇ
＾抗原の産生を確認することにより、｝ＩＶＴ（ＩＡ抗
原遺伝子領域が第１図に記載のＳｐｈＩ　〜旦抽Ｉ領域
内にあることを知ると共に、ＨＶＴ！ｌ］＾抗原の全遺
伝子を有するブラスミドｐＳＢＳ−１を得た。そして、
該旦仙Ｉ−Ｓｌ）ｈＩ断片を上記旦吋ＨＩ断片と同様に
して回収及び調製の後、これを用いてＨＶＴｇ＾抗原遺
伝子の全塩基配列を公知の常法、即ち、前述（ＩＶ）に
記載のジデオキシチェーンターミネーター法により、決
定した（第３ａ〜３１図）。

実施例７ ＮＤＶの１１Ｎ（赤血凝集素とノイラミニダーゼ》遺伝
子のクローニング：常法に従って、１０個の１０日齢発
育鶏卵の各漿尿腔にＮＤＶ　ＦＵＤＡＩ株（動物用生物
製剤基準協会［日本］から購入）の種ウイルス液を０．
５ｍｌずつ接種し、３７゜Ｃで２日間培養の後、各培養
卵から漿尿液を採取し、約５０ｍ１の原材料を得る。こ
れを１０，０００　ｇ、１５分間遠心し、その上清を採
取の後、これを４℃にて２１．００Ｏ　ｒｐｍ、９０分
間、超遠心（日立製作所製５５ＰローターＮｏ．　ＰＲ
一２１）にかけ、ＮＤＶ粒子を沈降させて採取する。

次いで、これをｌｍｌのＰＫｇ衝液（　０．ＩＨ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ［ａｌｌ７．４］　，　１２．５　Ｈ　Ｅ
ＤＴＡ　，　０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ＩＷ／Ｖ％ドデシ
ル硫酸ナトリウム）に浮遊しな後、１００μでの４ｍ＋
ｒ／ｏｎ！ブロテイナーゼを添加混合し６５゜Ｃで３０
分間作用させる。そして、実施例１の記載に従ってフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱を行い、ＮＤＶゲノムＲ
ＮＡを精製する。得た５μｇのＲＮＡを、ｉｏｏ　μｊ
の反応液（　５０　ｍＨ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　［ｐｈ
７．９　］　、１００　ｎ＋Ｍ　ＫＣＩ、１０醋ＭｇＣ
ｌ２、１０ｎ＋Ｈ　ＤＴＴ、ｉｎ＋８ヌクレオチド三リ
ン酸、３０単位ＲＮａｓｅインヒビタ−［宝酒造社■製
］、１７マーの合成プライマー２μｇ）を添加混合し、
６０゜Ｃで１５分間反応させた後、４２゜Ｃまで徐々に
温度を下げ、アニーリンクを行う。次いで、１０μｊの
３，　３００単位／　ｌＩ］ｌ逆転写酵素液を添加混合
の後、４２゜Ｃにて９０分間反応させる．反応終了後、
更に、反応液（５０ｎ＋Ｈ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ［ｐＨ　
７．２］、１０ｎ＋Ｈ　Ｈ（１３０４、０、ＩＩＩＨ　
ＤＴＴ　、５０μｊ　／　０１１ウシ血清アルブミン、
２０単位ＲＮａｓｅ　Ｈ　［宝酒造社■製コ、０．２単
位Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ［宝酒造社■製］　、
０．１５ｔｎＭ　　βニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、３０単位ＤＮＡポリメラーゼ）を添加混合し、
最終全容を４００μ１にし、１５℃で２時間反応させる
．この反応により合成されるＤＮＡはフェノール抽出の
後、エタノール沈澱させる。斯かる沈澱物を、１００μ
Ｊ）の反応液（　５０＋ｎｆ４　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　［
ｐＨ　７．６］　、１０ｒｉＨ　ＨｇＣＩ２、５ｒｎＨ
　ＤＴＴ　，　Ｏ．ｌａＭスペルミシン、０．Ｉｎ＋Ｍ
　ＥＤＴＡ、１ｉＭアデノシン５一三リン酸）に溶解の
後、１０μ１の１．００単位／　ｍｌ■４ボリヌクレオ
チドキナーゼを添加混合し、３７℃で３０分間、反応さ
せる。反応後再度ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノー
ル沈澱させる。次に、該沈澱物を、１００μ１の反応液
（３３曲Ｔｒｉｓ７＃酸綬衝液［ＤＨ　７．９］、６６
ｎ＋Ｍ酢酸カリウム、１０ｎ＋Ｈ＃酸マグネシウム、０
．　５１１１８　ＤＴ丁、０．　１　ｒａｇ／　ｍｌウ
シ血清アルブミン、０．５＋＋＋ｔ４デオキシヌクレオ
チド三リン酸）に溶解の後、これに１０μＡの４００単
位／［１１１　Ｔ４　０ＮＡポリメラーゼ液を添加混合
し、３７℃で１５分間、反応させる。反応終了後、ＤＮ
Ａをフェノール抽出し、次いでエタノール沈澱させ、ウ
イルスＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを得る。このｃＤＮＡ
１００ｎｇ、及び制限酵素肛匹■で予め開裂したプラス
ミドｐＵｃ　１９　（Ｇｅｎｅ、第２６巻、１０１ペー
ジ、１９８３年）と１００ｎ　ｇの両者を同時に、５０
μ４１の反応？ｉ（６０ｌＩＨ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　［
ｐＨ　７．６］　、６．６ｍＭ　ＭｇｃＩ２、１０ｍＭ
アテノシン５−三リン酸》に溶解した後、１０μ１の６
０，０００単位／ｍｌ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを添加混
合し、２０゜Ｃで２時間反応させ、ｃＤＮＡをｐｕｃ　
１９の旧ｎｃｌサイトに挿入連結する。次に、実施例２
の記載と同様にして、これを大腸菌ＪＭ８３　（ＡＴＣ
Ｃ　３５６０７）に移入し、形質転換させることにより
、ｃＤＮＡのクローニングを行う。各形質転換体クロー
ンには夫々、種々のサイズのｃＤＮＡがクローニングさ
れているので、実施例３に記載の要領と同様にして、各
クローンからｃＤＮＡを回収した後、その塩基配列を決
定する。塩基配列の決定は、実施例６に記載のジデオキ
シチェーンターミネーター法に従って行う。その結果、
ＮＤＶのＨＮ遺伝子の一部をコードするクローンｐＮＣ
１、ｐＮＣ２、及びｐＮＣ９を夫々、得た。次いで、Ｎ
ＤＶの全ｔｌＮ逍伝子からなるｃＤＮＡを作製するため
、各クローンの再構築を行う。即ち、実施例３に記載と
同様の方法により、これ等のクローンから夫々、ｃＤＮ
Ａを回収の後、上述と同様に７４　ＤＮＡリガーゼを用
いて各ｃＤＮＡ断片を連結し、ＨＮ遺伝子全領域のｃＤ
ＮＡを得る。これを上記の要領により、ｐＵｃ１９を用
いてクローニングする。以上の結果、ＮＤＶの全ＩＮ遺
伝子ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＨＮ−１を得た《第
４図》。また、実施例３に記載の方法によりＮＤＶの全
ＩＮ遺伝子ｃＤＮＡを回収し、これを用いて上述のジデ
オキシチェーンターミネーター法により、該１１Ｎ構造
遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を第５ａ〜５
ｄ図に示す。

実施例８ 組換えウイルス作出用のＨＶＴ（ＩＡ一外来遺伝子連係
ベクターの構築：実施例６で作成したＨＶＴ９八抗原全
逍伝子を有ずるプラスミドｐｓＢｓ−１を１００ｎｇ取
り、これを制限酵素Ｂａｎ＋Ｈ■で消化開裂した後、フ
ェノール抽出及びエタノール沈澱を行い、プラスミドを
回収する。次に、開裂両末端を平滑末端にするため、こ
れを１００μ１の反応液（５０ｎ＋ＭＴｒｉｓ−ｔｌｃ
Ｉ　　　［ｐＨ　　７．９コ　、　１０＋＋ｌＨ　　Ｈ
ｇＣｌ２　、　５０ｍＨ　　ＮａＣ１　、０．　１　ｒ
ａｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１ｎＭ　ＤＴＴ、ｉｎ
＋Ｍデオキシヌクレオシド三リン酸）に溶解し、１０μ
』の２００単位／ｍｌ　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ液を
添加混合の後、３７゜Ｃにて１０分間反応させる。反応
終了後、開裂したプラスミドＤＮＡを、フェノール抽出
並びびエタノール沈澱にて回収する。更に、開裂したプ
ラスミドＤＮＡをＢａｌ　３１消化し（実施例３に記載
のｒＨＯｌｅｃＵｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇＪ　、１３６
−１３９ページ）、ＨＶＴ（ｌ＾遺伝子の開始コドンＡ
ＴＧを除去する。次いで、この部位にｘｈｏエリン力一
を付加すると共に上述と同様の方法により、Ｔ４　０Ｎ
八ポリメラーゼを用いて両末端を修復し、平滑末端にす
る（実施例３に記載のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　Ｊ２４３−２４６ページ）。一方、実施例６で
得たｐＨＮ−１を制限酵素農工及びＥＣＯ　ＲＶで消化
の後、これを低融点アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｈ
Ｎ遺伝子を有する約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収する
。次いで、該ＤＮＡ断片を、上述のプラスミドＤＮＡの
平滑末端部位に挿入・連結の後、これを大腸菌，１８８
３株に移入し、形質転換することにより、プラスミ｝ｅ
ｐＨＶＴ−１を得た（第６図）。また、ＨＶＴｇＡ抗原
とＮＤＶＨＮ抗原とを融合蛋白として産生させるなめ、
実施例７で調製したｐＮＣ−９を制限酵素旧ｎｆＩで消
化後、Ｔ４０ＮＡポリメラーゼでその両端を修復し、次
いで、低融点アガロース電気泳動にかけ、約ｉ．ｉｈｂ
のＨＮ遠伝子ＤＮＡ断片を回収する。

一方、ｐｓＢｓ−１をＢａｍＨＩで開裂し、該開裂部位
をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで修復の後、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼを用い、この部位に上述のＨＮ遺伝子ＤＮＡ断
片を挿入・連結する。これを大腸菌ＪＭ８３株に移入し
、形質転換することにより、プラスミドｐＦＧＨ−Ｉ＋
を得た（第７図）。

実施例９ ＨＶＴ組換えウイルスの作出：直径６ａｎのシャーレ内
で実験例４と同様にして培養したＱＥＦ細胞培養に、種
ウイルスＨＶＴ　　０１株ＩＸ１０６ＰＦＵ／シャーレ
を接種した後、維持培地を添加し、３７゜Ｃの炭酸ガス
保温器中で２時間培養する。実施例６の記載と同様にし
て調製したｐｌｌＶＴ−１のリン酸カルシウム共沈澱物
を滴下の後更に、２０時間、培養を続ける。培養終了後
、維持培地を静かに除去し最終濃度０．８　ｗ／Ｖ％ア
ガロースを添加含有の維持培地６ｍ１／シャーレを重層
し、３７℃の炭酸ガス保温器中で４８時間培養すること
により、ＨＶＴのプラークを形成させる。次いで、斯か
るプラークからプラークハイブリダイゼーション法（［
遺伝子操作マニュアル」、６８〜７３ページ、前述）に
より組換えウイルスを単離する。即ち、先ず、プラーク
の直径に比べ少し大きい滅菌済コルクポーラーにて、重
層アガロースゲルを穿孔採取し、各ブラーク中の組換え
ウイルスを単離する。穿孔採取した各アガロースゲルは
、滅菌済のナイロンメンプランフィルター（日本ボール
社■製）上に押印の要領でスタンプする。そして、残り
の各アガロースゲルは各分離ウイルスとして、ウイルス
保存用安定化剤を含有の緩衝液（　１４／１５ＰＢＳ　
［１］Ｈ７．４　］、１０　Ｗ／Ｖ％サツ力ロース、３
１４／ν％Ｅ一アルギニン、Ｉ　Ｗ／Ｖ％ゼラチン加水
分解物》中に入れて−７０℃にて凍結保存する．次にス
タンプ済フィルターは常法に従ってＩＩＩ次、０．５Ｎ
　ＮａＯＨによる変性処理、１８　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
　［ｐＨ　７．５］による中性化、８０゜Ｃにて１時間
加熱し、各スタンプの焼付けを行った後、上記プラーク
ハイブリダイゼーションに供する。

尚、該ハイブリダイゼーション用１ローブとしては、実
施例３に記載の要領で調製した［３２Ｐ］一デオキシシ
チジン三リン酸で標識のＮＤＶ−ＩＮ遺伝子を使用する
。斯かるハイブリダイゼーションの結果に基づき、陽性
プラークを検出かつ選出しこれに対応する上記凍結保存
中の各アガロースゲルから、ＱＥＦ細胞培養を使用して
、組換えウイルスを単離する．その結果、ｍ換えウイル
スＨＶＴ０１Ｒ株を得た．上記と同様の方法に従って、
実施例８で得たｐＦＧＨ−Ｈを用いて組換えウイルスＨ
ＶＴ　　ＯＩＦ株を、後述の実施例１６で得たｐＨＤＶ
−１を用いて組換えウイルスＨＶＴ　　ＯＩＭＨ株を、
同じく実施例１６で得たｐＦＧｌｌ−１｛を用いて組換
えウイルスＨＶＴ　　ＯＩＦＭＨ株を夫々、作出した。

実施例１０ ＨＶＴ組換えウイルス株によるＨＶＴｇＡ及びＮＤＶＨ
Ｎ両抗原産生の検出と確認：実施例９で得な組換えウイ
ルスＨＶＴ　　ＯＩＲ株、ＨＶＴ　　０１Ｆ株、ＨＶＴ
　　ＯＩＭＨ株、及びＨＶＴ　　ＯＩＦＭＨ株の各株に
よるＨＶＴ！１Ａ及びの感染細胞浮遊液を、実験例４に
記載の方法に従って夫々、調製する。各浮遊液を蛍光抗
体法用スライドグラス上に滴下して拡げ、風乾燥後、冷
アセトンで１０分間固定し、検体スライドとする。次い
で、斯かる検体スライドを間接蛍光抗体法の下で検鏡し
、ＨＶＴのｇ＾並びにＮＤＶのＩＩＮ両抗原の有無を夫
々、確認する。即ち、検体スライド上に０．５ｍｌの一
次抗体を載せ、湿潤箱中で３７℃にて３０分間反応させ
、反応終了後、検体スライド上の感染細胞をＰＢＳで３
回洗浄し、次に二次抗体であるフルオレセインインチオ
シアネート標識の抗ニワトリＩ！ＩＩＧ　（　４染色単
位）　　０．５ｒｎｌを載せ、上記と同様に反応させた
後、洗浄する。斯かるスライドを、Ｍ街グリセリン液（
０．５Ｍ炭酸ナトリウムー炭酸水素ナトリウムｉ　［ｐ
Ｈ９．５］を１容と無蛍光特級グ刃セリン９容とを混合
して調製》を用いてカバーグラスで封入なの後、蛍光顕
微鏡（日本工学工業社製）により検鏡する。尚、一次抗
体としては、抗ＮＤＶＨＮニワトリ血清及び抗ＨＶＴ（
ＩＡニワトリ血清を夫々、使用する。その結果、実施例
９得た換えウイルスＨＶＴ　　ＯＩＲ株、ＨＶＴ　　Ｏ
ＩＦ株、ＨＶＴ　　ＯＩＭＨ株、及びＨＶＴ　　ＯＩＦ
ＭＨ株がいずれもＨＶＴｑＡ抗原とＮＤＶＨＮ抗原とを
同時に産生ずることを確認した．その確認の一部を、参
考図第２ａ〜２ｂ図、参考図第３ａ〜３ｂ図：及び参考
図第４ａ〜４ｂ図に示す． 実施例１１ ＭＤＶゲノムＤＮＡの調製：実験例５で調製したＭＤＶ
を用いることにより、実施例１に記載の方法と全く同様
にしてＭＤＶゲノムＤＮＡを調製した。

実施例１２ ＭＤＶゲノムＤＮＡの制限酵素断片のクローニングと遺
伝子ライブラリーの作成：実施例２の記載と同様にして
、Ｂａｍ　Ｉｔ　Ｉ、ｐｓｔ　Ｉ、及び旧ｎｄｌｌｒに
よるＭＤＶゲノムＤＮＡ断片を夫々、クローニングする
と共に、ＭＤＶ遺伝子ライブラリーを作成しな。

実施例１３ ＭＤＶの制限酵素地図の作成：実施例３の記載と同様に
してＭＤＶ制限酵素地図作成した。その結果を第８図に
示す。

また、斯かる制限酵素地図に基づき、実施例１２で作成
したライブラリーより形質転換体クローンを選出の後、
該クローンからＭＤＶゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ断片１
８．３ｋｂを有するプラスミドを回収し、これをｐＢａ
ｎ＋−８とする。

実施例１４ ＭＤＶ（ＩＡ抗原遺伝子の発現ベクターの構築：実施例
４と同様にして、プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏのＢａｎ＋
Ｈ■部位に、実施例１３で得たｐＢａｍ−ＢのＲａｍ　
ｔｌ　Ｉ断片１８．３ｋｂを挿入連結することにより、
プラスミドｐｓＶＢ−１２を構築した（第９図）．更に
、実施例１３で作成した制限酵素地図に基づき、実施例
２と同様にして、該ｐＢａｎ＋−ＢのＢａｎ　ｔｌ　Ｉ
断片１８．３ｋｂ領域から、Ｅｃｏ　ＲＩ　−　Ｐｖｕ
ＩＩＩｒ片２．２ｋｂを切出した後、この断片を実施例
４に記載の方法により、プラスミドｐＢＥＰ−２２を構
築しな．実施例１５ 捕乳動物由来細胞へのｐＢＥＰ−２２の導入とＭＤＶＣ
ＩＡ抗原の検出：実施例５に記載の方法と同様にして、
アビジン・ビオチン蛍光抗体法にて検出を行った。その
結果、ｐＢＥＰ−２２をＬＬＣ−Ｈκ２細胞に導入して
得たクローンによるＭＤＶｇＡ抗原の産生が、確認され
たく参考図第５図）。次いで、実施例６に記載と同様の
方法に従って、実施例１４で得たＭＤＶｇＡ抗原産生プ
ラスミドｐＢＥＰ−２２を、制限酵素で消化してＭＤＶ
遺伝子のＥｃｏＲＩ〜Ｐｖｕ　ｆｌ断片２．２ｋｂを切
出し、その塩基配列を決定した（第３ａ〜３ｋ図）。

実施例１６ 組換えウイルス作出用のＭＤＶ（ｌ八一外来遺伝子連係
ベクターの構築：実施例７で得なｐＨＮ−１及び実施例
１４で得たｐＢＥＰ−２２を用い、実施例７の記載と同
様にして、プラスミドρＭＤＶ−１を構築しな（第１０
図）。また、実施例７で調製したｐＮＣ−９及び実施例
１４で得なｐＢＥＰ−２２を用い、実施例８に記載の方
法に従って、ブラスミドｐＦＧＩＩ−Ｍを構築したく第
１１図）。

実施例１７ ＭＤＶ組換えウイルスの作出：実施例９に記載と同様の
方法により作出する。即ち、ＭＤＶ　　Ｃ２株とその宿
主細胞ＱＥＦを用い、実施例１６で得たｐＨＤＶ−１と
ｐＦＧＨ−Ｈの各プラスミドから夫々、組換えウイルス
ＭＤｖ　Ｃ２Ｒ株とＭＤＶ　　Ｃ２Ｆ株を、また、実施
例８で得たｐｌｌＶＴ−１　トｐＦＧＨ−Ｈから夫々、
組換えウイルスＭＤＶ　　Ｃ２ＨＨ株及びＭＤＶ　　Ｃ
２ＦＨＨ株を作出しな。

実施例１８ ＭＤＶ組換えウイルスによるＭＤＶｇＡ，及びＮＤＶＨ
Ｎ両抗原産生の検出と確認：実施例１０の記載と同様に
して、ＭＤＶ　　Ｃ２Ｒ株、ＭＤＶ　　Ｃ２Ｆ株、ＭＤ
Ｖ　　Ｃ２ＨＨ株、及びＭＤＶ　　Ｃ２ＦＨＨ株の各株
による感染ＱＥＦを用い夫々、間接蛍光抗体法により検
出と確認を行う．尚、一次抗体としては、抗ＮＤＶＨＮ
ニワトリ血清及び抗ＭＤｖｇ＾抗原ニワトリ血清を使用
する。その結果、上記の各株について、ＭＤＶｇ＾抗原
、及びＮＤＶＨＮ抗原の同時産生が、確認された。その
確認の一部を、参考図第６ａ〜６ｂ図に示す． 実施例１９ 組換えウイルス株を有効成分とする二価生ワクチンの試
作、及び斯かるワクチンの安全性と有効性の検定：実施
例９で得たＨＶＴ　　ＯＩＲ株、ＨＶＴ　　ＯＩＦ株、
ＨＶＴ　　ＯＩＭＨ株、及びＨＶＴ　　ＯＩＦＭＨ株の
各株、また、実施例１８で得たＭＤＶ　　Ｃ２Ｒ株、Ｍ
ＤＶ　　Ｃ２Ｆ株、ＭＤＶＣ２ＨＨ株、及びＭＤＶ　　
Ｃ２ＦＨＨ株の各株を夫々、種ウイルスに用いて、実験
例４の記載に従い、各ウイルスの感染細胞を調製する．
尚、各ウイルス株はＱ’Ｅ　Ｆ細胞培養を用いて１！Ｊ
容ルー懇５０本中で培養し、培養終了後の感染細胞は最
終濃度０．０２　Ｗ／ｖ％のＥＤＴＡ含有のトリプシン
液（実験例２）で剥離し分散させることにより採取する
。ＨＶＴ組換え株の感染細胞については、これを超音波
処理の後、その上清を採取することにより、マレヅク病
及びニューカッスル病二価生ワクチン原液約５００ｍｌ
を調製する。ＭＤＶ組換え株については、得られた染細
胞浮遊液約５００ｍｌを二価生ワクチン原液とする。尚
、各原液５０ｍ１をサンプリングし、下記の各試験に供
する。次いで、各原液を実施例９に記載のウイルス保存
用安定化剤をＭ街液で希釈し、ウイルス含量が１，００
０　ＰＦＵになるよう調整する。得られた５．１！の各
ウイルス液を夫々、１００　ｍｌ容バイアル瓶に分注し
、密栓の後、−７０℃で保存する。また、ＨＶＴ組換え
株の各ウイルス液については、分注後のバイアル瓶２０
本を凍結乾燥し、密封の後、４℃にて保存する。尚各分
注済バイアル瓶群から夫々、４本の検体を無作為抽出し
、上述の原液検体と共に各種試験に供する。即ち、これ
等検体につき、「動物用生物学的製剤基準（農林水産省
告示第５９９号）」に規定の［マレック病乾燥生ワクチ
ン」、［マレック病凍結生ワクチン」及び「ニューカッ
スル病生ワクチンＪに関する各種の試験を行い、生ワク
チンとしての安全性、有効性、均質性並びに保存性、即
ち、適格性を確認する。その結果、これ等の各分注製剤
は二価生ワクチンとしての適格性を備えていた。これ等
の各ワクチンは、ＨＶＴ　　ＯＩＲ株による液状ワクチ
ン（以下「液状ｒＨＶＴ」という）及び乾燥ワクチン（
以下「乾燥ｒＨＶＴ」という）；ＨＶＴ　　ＯＩＦ株に
よる液状ワクチン（以下「液状ｒＨＶＴ−ＦＪという）
及び乾燥ワクチン（以下「乾燥ｒ　Ｈ　Ｖ　Ｔ　−　Ｆ
　Ｊという）；ＨＶＴＯＩＭＨ株による液状ワクチン（
以下［液状ｒＨＶＴ−ＭＨ，という）及び乾燥ワクチン
（以下［乾燥ｒＨＶＴ−ＭＨＪという）；ＨＶＴ　　Ｏ
ＩＦＭＨ株による液状ワクチン（以下「液状ｒＨＶＴ−
ＦＭＨ，という）、及び乾燥ワクチン（以下「乾燥ｒｌ
｛ＶＴ　　ＰＭＨＪという），ＭＤＶ　　Ｃ２Ｒ株によ
る液状ワクチン（以下「液状ｒＭＤＶＪという）；ＭＤ
Ｖ　　Ｃ２．Ｆ株による液状ワクチン（以下「液状ｒＭ
ＤＶ−ＦＪという）；ＭＤＶＣ２ＨＨ株による液状ワク
チン（以下「液状ｒＭＤＶＨＨＪという）；ＭＤＶ　　
Ｃ２ＦＨＨ株による液状ワクチン（以下「液状ｒＭＤＶ
−ＦＨＨＪという）として、下記の臨床試験に供する。

実施例２０ 直接攻撃法による組換えウイルスニ価生ワクチンの免疫
原性とその効果：実施例１９で試作した各ワクチンの野
外に於ける効果を確認するため、臨床試験を行う：　１
日齢のＳＰＦニワトリ雛９０羽を調達し、該動物を各群
２０羽からなる４群、及び１０羽からなる１群の合計５
群に分け、次の通り、各ワクチンを筋肉内接種する：液
状ｒＨＶＴを第１群２０羽の各ニワトリ雛に２ｍｌ／羽
，乾燥ｒＨＶＴを第２群２０羽に２ｍｌ／羽，液状ｒ　
Ｍ　Ｄ　Ｖを第３群２０羽に１ｍｌ／羽，ＨＶＴＯＩ株
を種ウイルスに用いて実施例１９の記載に従って調製し
た液状生ワクチンＨＶＴ　　０１を第４群１０羽に２ｍ
ｌ／羽ずつ夫々、注射器にて下肢部に接種する。第５群
２０羽はワクチンを接種しない未接種対照群とする。こ
れ等動物は、各群毎に隔離して、飼育観察する。ワクチ
ン接種日から３週間後に、抗体価の測定より免疫原性を
検定するなめ、全ての雛の翼静脈がら夫々、個別に採血
し、各雛毎に血清検体１ｍｌを確保する。抗体価の測定
は、実験例１に記載のＨ／７５ＰＢＳで２倍階段希釈し
た各血清検体を使用し、ＨＶＴとＭＤＶについては実施
例１０及び１８に記載の間接蛍光抗体法で、一方、ＮＤ
Ｖについては０，５Ｖ／Ｖ％ニワトリ赤血球浮遊液と市
販のＮＤＶ石井株赤血凝集を用いる公知の赤血凝集阻止
テストにて行う．各動物の抗体価は、上記各測定で陽性
反応を呈した各血清検体の最高希釈倍数の各群の幾何平
均値を以て表示する。また、ワクチン被接種動物を強毒
ウイルスで攻撃し、ワクチンの効果判定を行うため、斯
かる採血時に、１群２０羽からなる第１、２、３、及び
５各群の動物を１０羽ずっ亜群に２分する，即ち、第１
群については、１０羽がらなる第１ａと第１ｂ各亜群に
２分する。この様に、各群を２分した動物のうち、第１
ａ、２ａ、３ａ及び５ａ各亜群１０羽、合計４０羽の動
物には夫々、強毒ＮＤＶ佐藤株を筋肉内接種する。接種
量は、該佐騰株の致死量である１０１ＣＩＤ５ｏ／羽と
する（■ＣＩＤ５ｏ：５０％組織培養感染量）。一方、
第１ｂ、２ｂ、３ｂ並びに５ｂ各亜群１０羽及び第４群
１０羽、合計５０羽の動物には夫々、強毒ＭＤＶ−ＪＭ
株を１０　ＰＦＵ／羽、筋肉内接種する。以上の通り強
毒ウイルスを接種することにより、攻撃した動物は各亜
群毎に隔離して飼育観察する。強毒ＮＤ■により攻撃し
た動物については、攻撃日から２週間の間の死亡率を集
計する。一方、強毒ＭＤＶで攻撃した各動物は、攻撃日
から５週間後に、麻痺、痙撃等の診断、剖検、病理組織
の検鏡各所見に基づき神経病変の陽性率を集計する。そ
の結果実施例１９で試作したｒｔｌＶＴ及びｒＨＤＶワ
クチンはいずれも、優れた免疫原性を有すると共に、感
染防御効果を発揮することが確認された（第１表）。ま
た、実施例１９で調製の他のワクチンについても、上記
方法により臨床試験を行い、いずれも上述と同様の効果
が確認された（第２〜４表）。

（以下余白） 第１表 生ワクチン　被験　抗体価（１）　　　攻撃試験（２）
接種群　　羽数　ＮＤＶ　　　ＨＶＴ　　　攻撃　病変
率液状ｒＨＶＴ 第１群ａ ｂ 乾燥ｒＨＶＴ 第２群ａ ｂ 液状ｒＭＤＶ 第３群ａ ｂ ＨＶＴ　０１ 第４群 未接種対照 第５群ａ ｂ ２９．９ ３０．４ ３３．１ Ｏ／１０ ０／１０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＭＤＶ　　　Ｏ／１０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＨＤＶ　　　Ｏ／１０ ０／１０ ＮＤＶ　　　１０／１０ ＨＤＶ　　　１０／１０ （１）抗体価：赤血凝集阻止テスト（ＮＯＶ）及び間接
蛍光抗体法（ＨＤＶ）による各群２０羽の幾何平均値（
但し、第４群ＨＶＴ　０１接種は１０羽）。

（２）攻撃試験：攻撃は攻撃ウイルスを意味する；病変
率の分母は各群の被験総羽数を、分子はＮＤＶ攻撃群で
は死亡羽数を、ＭＤＶ攻撃群では、麻痺・痙単の診断、
剖検、病理組識の検鏡各所見に基づく神経病変陽性羽数
を夫々意味する。

（注）下記の第２〜４表の脚注（１）及び（２）につい
ても、上記に同じ。

（以下余白） 第２表 生ワクチン　被験　抗体価（１）　　　攻撃試験（２）
接種群　　羽数　ＮＤＶ　　　ＨＶＴ　　　攻撃　病変
率液状ｒＨＶＴ−Ｆ 第１群ａ ｂ 乾燥ｒＨＶＴ−Ｆ 第２群ａ ｂ 液状ｒＭＤＶ一Ｆ 第３群ａ ｂ ３２．０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＭＤＶ　　　Ｏ／１０ ３１．２ ０／１０ ０／１０ ３５，３ ０／１０ ０／１０ ＨＶＴ　０１ 第４群 未接種対照 第５群ａ ｂ ０／１０ ＮＤＶ　　　１０／１０ ＭＤＶ　　　１０／１０ 第３表 第４表 生ワクチン　被験　抗体価（１）　　　攻撃試験（２）
接種群　　羽数　ＮＤＶ　　　ＨＶＴ　　　攻撃　病変
率生ワクチン　被験　抗体価（１）　　　攻撃試験（２
）接種群　　羽数　ＮＤＶ　　　ＩＩＶＴ　　　攻撃　
病変率液状ｒＨＶＴ一曲 第１群ａ　　１０ ｂ　　１０ 乾燥ｒＨＶＴ−ＭＨ 第２群ａ　　１０ ｂ　　１０ 液状ｒＨＤＶ一聞 第３群ａ　　１０ ｂ１０ ＨＶＴ　０１ 第４群　　１０ 未接種対照 第５群ａ　　１０ ｂ１０ ２４．０ ２８．５ ２０．３ く４ く４ く２０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＨＤＶ　　　Ｏ／１０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＭＤＶ　　　Ｏ／１０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＨＤＶ　　　Ｏ／１０ ＨＤＶ ０／１０ ＮＤＶ　　　１０／１０ ＭＤＶ　　　１０／１０ 液状ｒＨＶＴ−ＦＭＩＩ 第１群ａ　　１０ ｂ　　　１０ 乾燥ｒＨＶＴ−ＦＨＨ 第２群ａ　　１０ ｂ　　　１０ 液状ｒＭＤＶ−ＦＨＨ 第３群ａ　　１０ ｂ　　１０ ＨＶＴ　０１ 第４群 未接種対照 第５群ａ ｂ ２３．２ ２５．８ ３１．４ く４ く４ ＜２０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＨＤＶ　　　　Ｏ／１０ ＮＤＶ　　　Ｏ／１０ ＨＤＶ　　　Ｏ／１０ ＮＯν　　０／１０ ＨＤＶ　　　Ｏ／１０ １４ＤＶ ０／１０ ＮＤＶ　　　１０／１０ ＭＤＶ　　　１０／１０ ル皿ム生里上例玉 ウィルス・ベクターとして使用する弱毒マレック病ウイ
ルスは、非病原性であるため、優れて安全である。特に
、生ワクチンの有効成分として国の管理当局が公認のワ
クチン製造用株を使用する場合には下記が確保できる： 《１》斯かるワクチン製造用株、遺伝学的に安定であり
、かつ、非病原性であるため、生物学的製剤の製造工程
下でのバイオハザードの危険性が極めて低く、取扱い作
業が容易かつ能率的に行なえると共に、製品の安全性を
も確保できる；（２）宿主細胞として使用できるＳＰＦ
烏類に由来の初代細胞培養は、細胞株に比べ、大量入手
が容易で低廉であるため、遺伝子発現産物の大量生産が
可能であると共に、癌原性物質やその他の為害作用物質
等の迷入因子の混入する危険性が非常に低く、検定によ
る斯かる危険性の回避方法も確立されているため、極め
て安全であるので、該ベクターは生ワクチン等の生物学
的製剤の製造に好適である： （３）該ベクターの使用は、細菌類、酵母類、安全性が
不明の癌化した細胞株又はセルライン等に偏重した従来
の公知宿主域を広げるものであり、かつ、生物学的製剤
の原材料としての安全な宿主細胞の使用を促す； （４）本発明の組換えウイルスは、鳥類由来の細胞培養
を培養宿主として使用することにより、低コストによる
大量生産が可能である： （５）斯かる組換えウイルスは、自己抗原並びに複数の
異種抗原を同時に有するため、それ自体単独で、多価生
ワクチンや多機能ワクチン等の有効成分として使用可能
である。従って、各種抗原を別々に生産し混合すること
により調製される従来の混合ワクチンや多価ワクチンの
製造に比べ、製造工程が省力的並びに集約的であり、ま
た、製造コストが低く経済的であるため、予防接種等の
実用上、低廉で省力的かつ経済的なワクチンの提供が可
能となる； （６）複数の相互に異種の遺伝子発現産物を同時に製造
できるため、製造方式の集約化や合理化が可能となり、
それだけ為害作用物質等の迷入因子混入の確率が低くな
り、精製や品質管理も容易になるので、ワクチンのみな
らず遺伝子発現産物を有効成分とする他の動物用医薬品
、医薬品、診断断剤等の安全性、有効性及び均質性を共
に優れて確保できる．

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＶＴ　　０１株の制限酵素地図を示す。尚
、最上部はＨＶＴ　　Ｏｆ株ゲノムＤＮＡのｖＩ造配列
の概略を示し、各略記の意味は（　）内の通りである：
ＴＲＬ（ロング・ターミナル・リピート）；ＴＲＳ（シ
ョート・ターミナル・リピート）；；ＩＲＬ（ロング・
インターナル・リピート），ＩＲＳ（ショート・インタ
ーナル・リピート）；及びＵＬ　（，ロング・ユニーク
・リージョン）。 第２図は、ＨＶＴ・９Ａ抗原の発現ベクターであるｐｓ
ＶＢ５２−３の構築チャートを示す。 第３ａ〜３ｋ図は、ＭＤＶ　　Ｃ２株、及びＨＶＴ　　
Ｏｆ株の各ｇＡ遺伝子の全塩基配列と、これ等の各コド
ンに対応する全アミノ酸配列を示す。各行の上から順に
ＭＤＶ　　Ｃ２株９＾逍伝子の全塩基配列と全アミノ酸
配列、ＨＶＴ　　０１株ｇＡ遺伝子の全塩基配列と全ア
ミノ酸配列を夫々、表す。 第４図は、ＮＤＶ・ＩＮ遠伝子のクローニングと該遺伝
子を挿入連結したプラスミドｐＨＮ−１の構築チャート
を示す。 第５ａ〜５ｄ図は、各行の上から順にＮＤＶのＨＮ構遣
逍伝子の全塩基配列とそのコドンに対応するアミノ全酸
配列を夫々、示す。 第６図は、組換えウイルス作成用のＨＶＴＣＩＡ外来遺
伝子連係プラスミドｐＨＶＴ−１の構築チャートを示す
。 ・第７図は、融合蛋白産生の組換えウイルス作成用のＨ
ＶＴＱＡ一外来遠伝子連係プラスミドｐＦＧＨ−Ｈの構
築チャートを示す。 第８図は、ＭＤＶ　　０２株の制限酵素地図を示す。尚
、最上部はＭＤＶ　　Ｃ２株ゲノムＤＮＡの構造配列の
概略を示し、各略記の意味は第１図の通りである。 第９図は、ＭＤＶ−ＱＡ抗原の発現ベクターであるｐＳ
ＶＢ−１２の構築チャートを示す。 第１０図は、組換えウイルス作成用のＭＤＶ９Ａ−外来
遺伝子連係プラスミドｐＨＤＶ−１の構築チャートを示
す。 第１１図は、融合蛋白産生の組換えウィルス作成用のＭ
ＤＶ９八一外来遺伝子連係プラスミドｐＦＧＨ−Ｈの構
築チャートを示す． 参考図第１図は、ｐｓＶＢ５２−３が導入され、ｑＡ抗
原を産生するＬＬＣ−Ｈκ２細胞；アビジン・ビオチン
蛍光抗体法による検鏡写真． 参考図第２ａ〜２ｂ図は、組換えウイルスＨＶＴ　　Ｏ
ＩＲ株を、参考図３ａ〜３ｂ図は組換えウイルスＨＶＴ
　　ＯＩＦ株を、参考図第４ａ〜４ｂ図は組換えウイル
スＨＶＴ　　ＯＩＦＭＨ株を夫々感染させなＱＥＦ紹胞
培養；一次抗体として抗Ｈ■ＴｇＡニワトリ血清を用い
た間接蛍光抗体法の検鏡写真《参考図第２ａ、３ａ、及
び４ａ図）；一次抗体に抗ＮＤＶ曲ニワトリ血清を使用
した間接蛍光抗体法の検鏡写真（参考図第２ｂ、３ｂ、
及び４ｂ図）。 参考図第５図は、ｐＢＥＰ−２２が導入され、ｇＡ抗原
を産生するＬＬＣ−ＨＫ２細胞；アビジン・ビオチン蛍
光抗体法による検鏡写真。 参考図第６ａ〜６ｂ図は、組換えウイルスＭＤＶ　　Ｃ
２Ｒ株を感染させなＱＥＦ細胞；一次抗体として抗ＭＤ
Ｖ・ｇＡ抗原ニワトリ血清を用いた間接蛍光抗体法の検
鏡写真（参考図第６ａ図）；一次抗体に抗ＮＤＶ−ＨＮ
ニワトリ血清を使用した間接蛍光抗体法の検鏡写真（参
考図第６ｂ図）。 出願人　財団法大阪大微生物病研究会

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）弱毒マレック病ウイルスゲノムＤＮＡをウィルス
   ・ベクターとして用いることを特徴とする組換え遺伝子
   作成法。
2. （２）ウィルス・ベクターが、外来遺伝子クローニング
   ベクター、又は外来遺伝子発現ベクターである特許請求
   の範囲第１項に記載の組換え遺伝子作成法。
3. （３）ウィルス・ベクターとしての弱毒マレック病ウイ
   ルスゲノムＤＮＡに外来遺伝子を挿入連結する部位が、
   該ウィルスの遺伝子プロモーター配列の下流領域である
   特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の組換え遺伝子
   作成法。
4. （４）弱毒マレック病ウィルスの遺伝子プロモーター配
   列の下流領域に挿入連結された一種以上の外来遺伝子を
   有することを特徴とする組換え弱毒マレック病ウィルス
   。
5. （５）弱毒マレック病ウィルスが、マレック病生ワクチ
   ン製造用株である特許請求の範囲第４項に記載の組換え
   弱毒マレック病ウィルス。